Xác định đa hình gen FCER2 liên quan đến đáp ứng corticoids ở bệnh nhân hen phế quản điều trị tại bệnh viện nhi trung ương

Thiệt hại do hen phế quản gây ra không chỉ là các chi phí trực tiếp cho điều trị mà còn là làm giảm khả năng lao động, gia tăng các trường hợp nghỉ học, nghỉ làm và ảnh hưởng đến hoạt độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỆNH NHÂN HEN PHẾ QUẢN ĐIỀU TRỊ TẠI

BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỆNH NHÂN HEN PHẾ QUẢN ĐIỀU TRỊ TẠI

BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ 60720405

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Dương Thị Ly Hương

2 PGS.TS Lê Thị Minh Hương

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè Nhân dịp này, tôi

xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS Dương Thị Ly Hương - Trưởng phòng khoa học

công nghệ hợp tác quốc tế, Phó Chủ nhiệm bộ môn Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y

Dược- Đại học quốc gia Hà Nội; PGS.TS Lê Thị Minh Hương - Phó giám đốc bệnh viện,

trưởng khoa dị ứng miễn dịch- Bệnh viện Nhi trung ương là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến đề tài nghiên cứu khoa học cấp Đại học Quốc gia: “Phân tích đa hình gen điều hòa đáp ứng thuốc corticoids trong điều trị bệnh hen phế quản ở trẻ em Việt Nam” đã cung cấp nguồn kinh phí giúp tôi thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn đến: PGS.TS Đinh Đoàn Long, TS Vũ Thị Thơm, Ths Phạm

Hồng Nhung, cùng các cán bộ công tác tại Khoa Y dược- Đại học quốc gia Hà Nội, NCS.Ths Nguyễn Thị Bích Hạnh cùng các bác sĩ, điều dưỡng y tá tại khoa dị ứng miễn

dịch, khoa điều trị tự nguyện C - Bệnh viện Nhi trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong

thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể các cán bộ Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2015

Học viên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chương 1: TỔNG QUAN……… 1

1.1 Tổng quan về bệnh hen phế quản 1

1.1.1 Định nghĩa……… 1

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của hen phế quản……… 1

1.1.3 Chẩn đoán hen phế quản ở trẻ……….……… 3

1.1.4 Phân loại hen……… 7

1.1.5 Điều trị dự phòng hen 7

1.2 Corticoid và vai trò của Corticoid trong điều trị hen phế quản 9

1.2.1 Cơ chế tác dụng của Corticoid……… 9

1.2.2 Vai trò của Corticoid trong điều trị hen phế quản……… 10

1.2.3 Các gen liên quan đến đáp ứng corticoid trong điều trị hen phế quản… 11 1.3 Đa hình gen FCER2……… 13

1.3.1 Dược lý di truyền và các khái niệm liên quan 13

1.3.2 Các phương pháp phân tích SNP……… 15

1.3.3 FCER2 và mối liên quan đáp ứng điều trị bằng Corticoid……… 16

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 20

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 21

2.2.1 Hóa chất……… 21

2.2.2 Thiết bị……… 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 22

2.3.1 Xác định đa hình gen……… 22

2.3.2 Đáp ứng thuốc Corticoid……… 28

2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê……… 31

2.3.4 Đạo đức trong nghiên cứu……… 31

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tính đa hình gen FCER2 trên các bệnh nhân hen phế quản đến khám 32

tại bệnh viện Nhi trung ương

3.1.1 Quy trình xác định tính đa hình gen FCER2……… 32

3.1.2 Tính đa hình gen FCER2……… 40

3.2 Mối tương quan giữa đa hình gen FCER2 với đáp ứng corticoid…… 44

3.2.1 Đặc điểm các bệnh nhân được đánh giá đáp ứng Corticoids……… 44

3.2.2 Kết quả đáp ứng thuốc……….……… 48

3.2.3 Mối liên quan giữa đa hình gen FCER2 với mức độ kiểm soát……… 49

3.2.4 Mối liên quan giữa đa hình gen FCER2 và đợt kịch phát hen………… 50

4.1 Về tính đa hình gen FCER2 trên bệnh nhân hen phế quản đến khám tại bệnh viện Nhi trung ương……… 52

4.1.1 Về quy trình xác định tính đa hình gen FCER2……… 52

4.1.2 Về tính đa hình gen FCER2 ……… 54

4.2 Về mối liên quan đa hình gen FCER2 với mức độ đáp ứng Corticoids 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 63

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

quản lý hen suyễn trẻ em)

23 TAE Tris base, acetic acid and EDTA

DANH MỤC BẢNG STT

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hen phế quản là một trong những bệnh phổi mạn tính phổ biến ở nước ta cũng như ở nhiều nước trên thế giới Bệnh do nhiều nguyên nhân gây nên và có xu hướng ngày càng tăng Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2004, trên thế giới có hơn 300 triệu người mắc hen phế quản với 6-8% là người lớn, hơn 10% ở trẻ em dưới 15 tuổi; ước tính đến năm 2025, con số này tăng lên đến 400 triệu người [35], [36] Tỷ lệ tử vong cũng tăng lên rõ rệt, hàng năm có khoảng 20 -25 vạn người tử vong do hen, hiện nay theo số liệu của

chương trình khởi động toàn cầu phòng chống hen (GINA) là 255.000 người [5], [25]

Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu thống kê đầy đủ, song theo công bố của một số tác giả, tỷ lệ trẻ em mắc hen phế quản ở Việt Nam cũng gia tăng nhanh chóng Năm 1997, tỷ lệ hen phế quản ở trẻ em dưới 15 tuổi là 2,7% [8], năm 2002 là 9,3% [11], năm 2005, 2006 lần lượt là 10,42% [15] và 8,74% [7] Thiệt hại do hen phế quản gây ra không chỉ là các chi phí trực tiếp cho điều trị mà còn là làm giảm khả năng lao động, gia tăng các trường hợp nghỉ học, nghỉ làm và ảnh hưởng đến hoạt động thể lực [9]

Corticoids khí dung là những thuốc được sử dụng phổ biến nhất và hiệu quả nhất trong điều trị hen phế quản mãn tính (Tantisira, 2009) [46], song tác dụng không mong muốn của corticoid tương đối nhiều khiến việc sử dụng corticoid bị hạn chế, đặc biệt ở trẻ em Ngoài

ra có một tỷ lệ không nhỏ trên lâm sàng không đáp ứng với thuốc điều trị Corticoid Có rất nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến đáp ứng điều trị bệnh hen phế quản Một trong những nguyên nhân đó là do sự khác biệt về di truyền ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc Trong hơn một thập kỷ qua đã có nhiều nghiên cứu về di truyền nhằm tìm ra các gen đích và các SNPs mục tiêu có liên quan chặt chẽ đến đáp ứng điều trị hen phế quản Phân tích các yếu tố di truyền liên quan đến đáp ứng với corticoid có ý nghĩa lâm sàng, bởi nó sẽ giúp phân loại bệnh nhân, và định hướng điều trị bằng corticoid sớm hơn, hoặc với liều thấp hơn trên những cá thể có đáp ứng tốt, nhằm mang lại hiệu quả điều trị tối ưu với tác dụng không mong muốn thấp nhất; hoặc chỉ định dùng các thuốc khác thay thế corticoid để kiểm soát hen trên những cá thể có kiểu gen không đáp ứng với corticoid

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy mối liên quan giữa đa hình gen với đáp

ứng corticoids trong điều trị hen phế quản Trong đó đã chứng minh đa hình gen FCER2 (mã hóa cho thụ thể gắn với IgE ái lực thấp) có liên quan đến liên quan chặt chẽ đến gia tăng đợt kịch phát bệnh hen suyễn khi sử dụng corticoids dạng hít [34], [42], [45], [46] Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được tiến hành nghiên cứu về mối tương quan đa hình gen với đáp ứng corticoids trong điều trị hen phế quản

Nhằm làm sáng tỏ mối quan hệ giữa di truyền học với tính đáp ứng điều trị bệnh hen phế quản trên đối tượng bệnh nhân là người Việt Nam, cũng là cơ sở cho việc tối ưu hóa hiệu

quả điều trị, giảm thiểu tác dụng không mong muốn, và giảm giá thành điều trị Đề tài “Xác

định đa hình gen FCER2 liên quan đến đáp ứng corticoid ở bệnh nhân hen phế quản điều trị tại bệnh viện Nhi trung ương” được thực hiện với các mục tiêu chính sau:

1 Xác định được tính đa hình gen FCER2 trên các bệnh nhân hen phế quản đến khám tại bệnh viện Nhi trung ương

2 Bước đầu phân tích mối liên quan giữa đa hình gen FCER2 với đáp ứng corticoid ở bệnh nhân hen phế quản điều trị tại bệnh viện nhi trung ương

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh hen phế quản

1.1.1 Định nghĩa

Theo chương trình khởi động toàn cầu phòng chống hen (GINA) (2014) hen phế quản là một bệnh lý đa dạng thường có đực điểm là viêm đường thở mạn tính Hen được định nghĩa bởi sự hiện diện của bệnh sử có các triệu chứng hô hấp như khò khè, khó thở, nặng ngực và ho, các triệu chứng này thay đổi theo thời gian và

về cường độ, cùng với giới hạn luồng khí thở ra dao động

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của hen phế quản

Trong cơ chế bệnh sinh của hen có 3 quá trình chủ yếu [3], [5]:

- Thứ nhất hình thành IgE: Quá trình này bắt đầu từ khi dị nguyên (DN) lọt vào cơ thể qua bất cứ đường nào: hô hấp, tiếp xúc, tiêu hóa, tiêm truyền, gặp đại thực bào (ĐTB) hoạt hóa đại thực bào tiết ra interleukin-1 (IL1) Chất này sẽ biệt hóa tế bào lympho T: Th0 Th2 (có yếu tố di truyền, cơ địa) Th2 tổng hợp các cytokin: IL3, IL4, IL13 Hai cytokin này biệt hóa lympho B thành tương bào sản xuất IgE IgE gắn vào bề mặt tế bào dưỡng bào, bạch cầu ái kiềm và bạch cầu ái toan

Yếu tố di truyền cơ địa Hoạt hóa

IL1

IL3, IL4, IL5, IL13 IgE

- Khâu thứ hai là sự kết hợp dị nguyên với IgE trên bề mặt dưỡng bào và

bạch cầu ái kiềm, giải phóng một loạt chất trung gian hóa học (Histamine, PAF – yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, ECF- yếu tố hóa ứng động bạch cầu ái toan, leukotrien, prostaglandin) Nhờ có yếu tố hóa ứng động bạch cầu ái toan, sự kết hợp của dị nguyên với IgE trên bề mặt bạch cầu ái toan, giải phóng một loạt các chất trung gian hóa học (MBP (Major Basic Protein), ECP (Protein cation bạch cầu ái toan),…) Các chất trung gian này tác động lên màng phospholipid có sự tham gia của phosphodiesterase A2 thành Arachidonic acid thông qua men 5 lipoxygenase (5LO) từ đó giải phóng các Leucotrienes và thông qua men Cycloxygenase giải

phóng các Prostagladin

- Khâu thứ ba do tác động của các trung gian hóa học, cytokines kể trên được giải phóng từ khâu thứ 2 xuất hiện viêm mạn tính đường thở gây co thắt phế quản

và gia tăng đáp ứng phế quản Từ đó biểu hiện thành các triệu chứng hen

Hình 1.2 : Sơ đồ biểu diễn cơ chế hen phế quản [5]

Co thắt phế quản Triệu chứng hen

IFN

IL10

IL4,

IL13 IFNγ, IL2

ECP, EPO, LTC4, PGD2 Histamine, Tryptase, …

1.1.3 Chẩn đoán hen phế quản ở trẻ

Chẩn đoán hen phế quản ở trẻ em khó hơn người lớn, các triệu chứng lâm sàng không rõ ràng, nguyên nhân khò khè, ho, khó thở ở lứa tuổi này rất phức tạp

và sự hợp tác của trẻ trong việc tiến hành các thăm dò chức năng hô hấp không được thực hiện… Các bước cần tiến hành đề chấn đoán hen phế quản trẻ em [1],[4] [5], [6],[10]:

Bước 1: Khai thác bệnh sử:

Trẻ xuất hiện các dấu hiệu: Ho, khò khè, khó thở, nặng ngực

- Những dấu hiệu này có xuất hiện nhiều lần, tái đi tái lại và thường xảy nặng hơn vào ban đêm làm trẻ thức giấc hay không?

- Trẻ có tiếp xúc với các yếu tố khởi phát hen không? Nặng hơn không?

- Có tiền sử dị ứng (bố mẹ và bản thân không)

Bước 2: Khám lâm sàng: Toàn diện

- Phát hiện các dấu hiệu: Ho, khò khè, khó thở

- Các dấu hiệu thực thể: Nhịp thở nhanh, rút lõm lồng ngực, ran rít, ran ngáy

-Lồng ngực hình thùng (hen lâu ngày)

- Đánh giá phân loại theo mức độ nặng nhẹ theo lâm sàng sau đây:

chũm, không ăn, không bú được

Bước 3: Đánh giá khách quan:

gắng sức, cần sự hợp tác tốt của trẻ Rối loạn thông khí tắc nghẽn đường thở được đánh giá bằng các thông số sau:

- FEV1 < 80% so với lý thuyết

 FEV1 > 80% so với lý thuyết

 Chỉ số Tiffeneau (FEV1/VC ) > 80% so với lý thuyết

 FEF25-57 ≤ 60% so với lý thuyết

 MEF25 hoặc MEF50 ≤ 60% so với lý thuyết

- Test phục hồi phế quản: đo chức năng thở ra tối đa trong giây đầu tiên trước

và sau khi dùng salbutamol dưới dạng phun hít với liều lượng 200µg sau 10-20 phút Nếu FEV1 tăng trên 12% (hoặc trên 200ml) thì coi là test phục hồi phế quản dương tính chứng tỏ loại thông khí tắc nghẽn có đáp ứng với thuốc giãn phế quản: nghĩ đến hen

- Theo doi sự thay đổi PEF (lưu lượng thở ra đỉnh) Nghĩ đến hen khi:

+ PEF tăng 60l/phút hoặc ≥ 20% sau khi hít thuốc giãn phế quản so với trước khi hít thuốc giãn phế quản hoặc PEF thay đổi hàng ngày ≥ 20% và nếu đo 2 lần/ngày thì hơn nhau 10% có thể gợi ý hen

+ Ngoài ra có thể theo dõi PEF giảm hơn 15% sau 6 phút chạy hoặc gắng sức cũng lag một gợi ý theo dõi hen

- Có thể làm các xét nghiệm khác

+ Nếu như không thực hiện được hô hấp kế hay PEF có thể dựa vào dấu hiệu khò khè tái đi tái lại > 3 lần( mặc dù không bị cảm lạnh, không bị viêm xoang mũi dị ứng)

+ Có tiền sử bố mẹ hoặc bản thân bị hen hoặc các bệnh dị ứng khác

+ Tăng bạch cầu ái toan, IgE trong máu, test da với các dị nguyên dương tính

+ Đo nồng độ oxit nitơ (NO) trong khí thở ra: NO là một chất đánh dấu sinh học cho hiện tượng viêm do tăng bạch cầu ái toan trong đường hô hấp NO trong khí thở được dùng để định hướng chẩn đoán, đánh giá đáp ứng điều trị và theo dõi mức độ

kiểm soát bệnh hen Nồng độ NO trong khí thở ra ở bệnh nhân hen thường cao hơn trẻ bình thường [24]

Bước 4: Chẩn đoán xác định và chẩn đoán phân biệt:

a Chẩn đoán xác định : cần thăm khám cẩn thận và phân tích toàn diện

Cần phải nghĩ đến hen nếu trẻ có bất kỳ một trong các dấu hiệu và triệu chứng sau: + Khò khè rõ nghe được bằng tai hoặc ống nghe( tuy nhiên cũng lưu ý nếu nghe phổi bình thường cũng chưa thể loại trừ được hen)

+ Ho, đặc biệt ho nhiều về đêm

+ Khò khè tái phát nhiều lần

+ Khó thở tái phát nhiều lần

+ Nặng ngực tái đi tái lại nhiều lần

- Các triệu chứng trên thường xảy ra và nặng hơn về đêm và làm trẻ thức giấc khi: + Tiếp xúc với lông súc vật

+ Tiếp xúc với hóa chất

+ Thay đổi thời tiết

+ Tiếp xúc với bụi nhà

+ Uống thuốc (aspirin, thuốc chẹn beta)

+ Gắng sức, chạy nhảy đùa nghịch nhiều

+ Tiếp xúc với dị nguyên hô hấp như phấn hoa

+ Nhiễm virus đường hô hấp

+ Hít phải khói các loại như khói thuốc lá, bếp than, củi, dầu,…

+ Rối loạn cảm xúc mạnh như quá xúc động, quá buồn, quá vui,…

- Nếu trẻ có các biểu hiện dị ứng như chàm hoặc trong gia đình có người bị hen hoặc có các cơ địa dị ứng khác thì khả năng trẻ bị hen nhiều hơn

- Thay đổi chức năng hô hấp: đo chức năng thở ra tối đa trong giây đầu tiên trước (FEV1), FVC, PEF

- Test bì dương tính, bạch cầu ái kiềm và IgE tăng trong máu

- Điều trị thử với các thuốc giãn phế quản kích thích β2 +ICS có hiệu quả

b Chẩn đoán phân biệt

có triệu chứng xâm nhập, chụp X quang phổi có hình ảnh ứ khí khu trú một bên phổi, soi phế quản gắp được dị vật thì các triệu chứng mất đi

chứng khò khè giống hen Ngoài ra polyp mũi, các dị vật lỗ mũi cũng có khả năng gây triệu chứng khò khè tái phát Khám tai mũi họng , soi thanh quản phát hiện các

dị vật, dị tật tại mũi họng

quản, phế quản lớn, trẻ có triệu chứng ho, khò khè, khó thở kéo dài thường không đáp ứng với thuốc giãn phế quản Chụp X quang phổi thẳng, nghiêng, chụp cắt lớp lồng ngực thấy hình ảnh khối u chèn ép khí quản

nguyên nhân do giun đũa hoặc các nguyên nhân khác như: thuốc hoặc dị nguyên khác, tiến triển tốt và có thể tự khỏi

hen, cần thử test mồ hôi, ngoài ra trẻ còn có thể có biểu hiện rối loạn tiêu hóa, bệnh bắt đầu từ nhỏ và có tiền sử nhiễm khuẩn phổi nhiều lần

rối loạn vận động khí phế quản…cần kết hợp lâm sàng và các thăm dò siêu âm, chụp mạch, dựng hình, nội soi khí phế quản, để chẩn đoán

1.1.4 Phân loại hen

a Phân loại theo độ nặng [4], [5], [25]

Bảng 1.1 Phân loại hen theo mức độ nặng nhẹ

Bậc Triệu chứng Cơn cấp Triệu chứng

về đêm

FEV1 hoặc PEF (% theo

dự tính)

Dao động FEV1 hoặc PEF

và giấc ngủ

>2 lần/ tháng ≥80% 20-30%

3.Vừa dai dẳng Hàng ngày

Có thể ảnh hưởng đến hoạt động

b.Phân loại hen theo mức độ kiểm soát GINA

Bảng 1.2 Phân loại hen theo mức độ kiểm soát [4], [5],[25], [26], [27]

Chưa được kiểm soát

1 Triệu chứng ban ngày <2 lần/tuần > 2 lần/tuần

≥ 3 đặc điểm trong mức kiểm soát 1 phần ở 1 tuần bất kỳ

kiểm soát hen, mức độ nặng nhẹ của mỗi người bệnh Sẽ xử trí dựa trên mức độ kiểm soát và phân bậc nặng nhẹ (đối với trẻ trên 5 tuổi và người lớn) [4],[5]

Bảng 1.3: Xử trí dựa trên mức độ kiểm soát hen

Kiểm soát tốt

Duy trì, tìm bậc kiểm soát thấp nhất

Chưa được kiểm soát Tăng bậc đến khi kiểm soát được

Ghi chú: * ICS - glucocorticosteroid hít; ** Kháng thụ thể hoặc ức chế tổng hợp

Bậc điều trị

Giáo dục sức khoẻ về Hen

Kiểm soát môi trường

2 tác dụng dài

Glucocorticoid dạng uống ( liều thấp nhất)

Kháng Leucotrien

Theophyllin phóng thích chậm ICS liều thấp cùng

Theophylin phóng thích chậm

1.2 Corticoid và vai trò của Corticoid trong điều trị hen phế quản

1.2.1 Cơ chế tác dụng của Corticoid

Cơ chế tác dụng của Corticoid trong hen phế quản: Giảm tổng hợp

Leucotrien và Prostaglandin) Gia tăng tác dụng thuốc giãn phế quản kích thích β2 Giảm tính thấm thành mạch làm giảm tiết dịch nhầy [2], [32]

Các corticoid không có tác dụng giãn phế quản và việc dùng chúng trong điều trị hen phế quản chủ yếu là giảm viêm đường hô hấp Các thuốc này có tác dụng tốt trong các cơn cấp tính, khi tắc nghẽn đường dẫn khí không đỡ hoặc nặng hơn mặc dù đã dùng thuốc giãn phế quản với liều tối đa Corticoid cũng được đưa lên hàng đầu trong điều trị hen phế quản mạn tính, đặc biệt khi mà chế độ điều trị trước không có tác dụng và các triệu chứng nặng thêm, tái phát thường xuyên hơn [38]

1.2.2 Vai trò của Corticoid trong điều trị hen phế quản

Corticoids khí dung là những thuốc được sử dụng phổ biến nhất và hiệu quả nhất trong điều trị hen phế quản mãn tính [46], song tác dụng không mong muốn của corticoid tương đối nhiều khiến việc sử dụng corticoid bị hạn chế, đặc biệt ở trẻ

em Những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng corticoid đường hô hấp là hiệu quả và an toàn nhất do ít tác dụng phụ và đạt nồng độ tại chỗ cao trong phế quản

Có nhiều chế phẩm corticoid, tùy từng mức độ nặng mà lựa chọn và lựa chọn liều phù hợp với bệnh nhân [5], [23], [25]

Theo GINA (2006) [25] và hướng dẫn điều trị hen phế quản ở trẻ em của bộ

y tế [4] Thuốc điều trị hen có thể dùng tại chỗ (hít, khí dung), uống hoặc tiêm Tuy nhiên thuốc dùng tại chỗ có nhiều ưu điểm, trong đó thuốc corticosteroid dạng hít là thuốc dự phòng hen có hiệu quả nhất hiện nay Corticoid dạng hít bắt đầu được sử dụng điều trị dự phòng hen phế quản từ bậc 2 Bước 2 là điều trị khởi đầu cho hầu hết các trường người bệnh hen đến khám có triệu chứng hen dai dẳng mà chưa điều trị corticosteroid

Đối với trẻ dưới 5 tuổi: Vì trẻ dưới 5 tuổi có những đặc điểm riêng về sinh lý

bệnh cũng như diễn biến tự nhiên của bệnh khác với trẻ lớn, cần có sự phân tích toàn diện theo quyết định của thầy thuốc cho từng trẻ, không cứng nhắc theo một công thức chung cho tất cả những trẻ này Glucocorticosteroid dạng hít được khuyến cáo sử dụng điều trị dự phòng ban đầu bắt đầu ngay ở bước 2 với liều thấp, một số trường hợp có thể cho đơn liều (một liều duy nhất) trong ngày [4]

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của các chế phẩm corticoid với bệnh nhân hen phế quản Theo nghiên cứu RCT của Husby và cộng sự năm

1993 là một mốc quan trọng liên quan đến việc sử dụng corticosteroid dạng hít trong điều trị các bệnh đường hô hấp nghiêm trọng So sánh đáp ứng của một liều duy nhất 2 mg budesonide hít với giả dược cho trẻ em nhập viện vì viêm thanh quản nặng, báo cáo cải thiện lâm sàng nhanh chóng (trong vòng 2 giờ điều trị) ở những bệnh nhân dùng budesonide [30] Một nghiên cứu RCT đã tiến hành trên mười bảy thử nghiệm được công bố (470 người lớn và 663 trẻ em và thanh thiếu niên) (1966-

2006) lấy từ các cơ sở dữ liệu khác nhau (MEDLINE, EMBASE, Cochrane Controlled Trials Register) Sau 2 đến 4 giờ của nghiên cứu, các thử nghiệm được

sử dụng nhiều liều ICS có tỷ lệ nhập viện đã được quan sát giảm nhiều hơn (OR: 0.30, 95% khoảng tin cậy [CI], 0,16-0,55) khi so sánh với giả dược Bệnh nhân được điều trị với ICS cũng cải thiện lâm sàng nhanh hơn so với giả dược hoặc corticosteroid đường toàn thân (SCS), tăng xác suất ra xuất viện sớm (OR: 4,70, 95% CI: 2,97-7,42; p = 0,0001) [39]

1.2.3 Các gen liên quan đến đáp ứng corticoid trong điều trị hen phế quản

Corticoids khí dung là những thuốc được sử dụng phổ biến nhất và hiệu quả nhất trong điều trị hen phế quản mãn tính (Tantisira, 2009) [46], song tác dụng không mong muốn của corticoid tương đối nhiều khiến việc sử dụng corticoid bị hạn chế, đặc biệt ở trẻ em Ngoài ra có một tỷ lệ không nhỏ trên lâm sàng không đáp ứng với thuốc điều trị Corticoid Có rất nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến đáp ứng điều trị bệnh hen phế quản Một trong những nguyên nhân đó là do sự khác biệt

về di truyền ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc Trong hơn một thập kỷ qua đã có nhiều nghiên cứu về di truyền nhằm tìm ra các gen đích và các SNPs mục tiêu có liên quan chặt chẽ đến đáp ứng điều trị hen phế quản Phân tích các yếu tố di truyền liên quan đến đáp ứng với corticoid có ý nghĩa lâm sàng, bởi nó sẽ giúp phân loại bệnh nhân, và định hướng điều trị bằng corticoid sớm hơn, hoặc với liều thấp hơn trên những cá thể có đáp ứng tốt, nhằm mang lại hiệu quả điều trị tối ưu với tác dụng không mong muốn thấp nhất; hoặc chỉ định dùng các thuốc khác thay thế corticoid

để kiểm soát hen trên những cá thể có kiểu gen không đáp ứng với corticoid [48]

Các gen liên quan đến con đường corticoid có thể kể đến là: gen CRHR1 (corticotropin-releasing hormone receptor 1) gen mã cho thụ thể kết cặp G-protein liên kết với các neuropeptide thuộc họ hoocmon giải phóng corticotropin đã được chứng minh liên quan đến việc sản xuất corticosteroid nội sinh [20], [43], [46], [48]; gen TBX21 (mã hóa yếu tố ảnh hưởng đến sự sản xuất lympho T) liên quan đến việc phát triển quá trình gây viêm và phản ứng quá mẫn tại đường hôp hấp trong bệnh hen phế quản [44], gen FCER2 (mã hóa thụ thể gắn với IgE ái lực thấp) có

liên quan đến gia tăng đợt kịch phát bệnh hen suyễn khi sử dụng ICSs [34],[42], [45], [48]; gen GLCCI1 (glucocorticoid-induced transcript 1) mã hóa sự phiên mã gây ra bởi glucocorticoid 1 liên quan đến việc tăng bạch cầu ái toan [31], [42], [47];

DUSP 1 (dual specificity phosphatase-1) đƣợc gọi là MAP kinase phosphatase-1

(MKP1) có tác dụng thông qua quá trình phosphoryl hóa và ức chế mitogen dẫn đến kích hoạt kinase (MAPKs) do đó giảm biểu thị của yếu tố sản xuất cytokine tiền viêm có vai trò trong quá trình đáp ứng với corticoid [33]; STIP1( Stress induced phosphoprotein 1) có khả năng cải thiện tình trạng phổi ở bệnh nhân hen phế quản dùng ICSs [29]; gen NR3C1 có liên quan tới sự nhạy cảm với các glucocorticoid Điều hòa đáp ứng của glucocorticoid (GCs) đều qua trung gian bởi các thụ thể glucocorticoid (GR) [37]

Hình 1.3: Sơ đồ biểu diễn vị trí tác động của các gen lên cơ chế hen

Nhìn chung, các nghiên cứu về di truyền liên quan đến đáp ứng với corticoid

ở bệnh nhân hen phế quản cho thấy có nhiều biến thể di truyền có mối quan hệ chặt chẽ với đáp ứng thuốc, có thể giúp ích cho việc tiên đoán hiệu quả điều trị [48] Tuy nhiên số lƣợng bằng chứng lâm sàng của mỗi gen là khác nhau: Các gen TBX21, STIP, NR3C1, DUSP1, CRHR1 không đƣợc lặp lại và đến gần với lâm sàng, gen

FCER2 có nhiều bằng chứng lâm sàng chứng mình có liên quan đến đợt tăng các đợt kịch phát trong điều trị hen phế quản

1.3 Đa hình gen FCER2

1.3.1 Dược lý di truyền và các khái niệm liên quan

Dược lý di truyền dựa trên thành tựu phát triển của ngành sinh học, sinh lý, hóa sinh và dược lý Trên thế giới dược lý di truyền đã được nghiên cứu và ứng dụng trên lâm sàng Nhưng ở Việt Nam chưa được nghiên cứu để ứng dụng và phát triển Để hiểu hơn về dược lý di truyền đề tài tìm hiểu một số khái niệm liên quan:

- Đa hình đơn nucleotide- viết tắt: SNP (Single nucleotide polymorphisms): Mỗi gen là một đoạn ngắn trong chuỗi xoắn kép ADN, tạo nên một bộ gen của con người Đoạn ngắn đó lại là một chuỗi rất nhiều các base, hầu hết các biến động về một gen giữa các cá thể chỉ do sự khác nhau của 1 base trong gen đang xét Đó chính là tính đa hình đơn nucleotid (SNP) Ví dụ: một SNP có thể thay đổi trình tự

DNA: AGCCT đến AGTCT [22]

SNP là những biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người, xảy ra khoảng một lần trong mỗi 100 đến 300 cặp base Hiện nay đã có hơn bốn triệu SNPs đã được xác định trong hệ gen của con người SNPs xảy ra khi một cặp nucleotide bị thay thế Vì vậy, SNPs sự khác biệt duy nhất cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [22]

Hình 1.4: Mô tả Single nucleotide polymorphisms (SNP)

Đột biến tại 1 nucleotid có thể dẫn đến những trường hợp sau:

- SNP tại các đoạn trình tự mã hóa có thể dẫn đến thay đổi trình tự axit amin hoặc độ dài chuỗi polypeptit nếu một bộ ba nucleotid (codon) kết thúc bị biến đổi

- SNP không thuộc các trình tự mã hóa nhưng vẫn có thể chi phối đến mức độ biểu hiện của các gen, ảnh hưởng đến sự biểu hiện của sản phẩm protein

- Nhiều SNP thuộc các vùng mã hóa hay không mã hóa các gen không gây ảnh hưởng đến cấu trúc hay sự biểu hiện hoạt động của các gen

Các nhà di truyền học phân tử hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản

đồ các SNP có liên quan đến bệnh tật, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể [49]

Phần lớn các loại thuốc gây phản ứng phụ bất lợi cho cơ thể thường được chuyển hoá nhờ những loại enzym đa hình Những enzym này được mã hoá bởi một gen (hay một số gen) có tính đa hình, thường là đa hình đơn nucleotid (SNP)

- Định luật Hardy Weiberg [12]

+ Nội dung: Trong một quần thể ngẫu phối kích thước lớn, nếu như không có áp lực của các quá trình đột biến, di nhập cư, biến động di truyền và chọn lọc thì tần số các alen được duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác và tần số các kiểu gen (của một gen gồm hai alen khác nhau) là một hàm nhị thức của các tần số alen, được biểu diến bằng công thức sau:

Các cơ thể đồng hợp và dị hợp có sức sống ngang nhau, được truyền gen cho các thế hệ sau ngang nhau

Không có áp lực của quá trình đột biến và quá trình chọn lọc tự nhiên hoặc

Nếu sự giao phối ngẫu nhiên, thì các tần số kiể gen có quan hệ với các tần số

Bất luận các tần số kiểu gen ban đầu như thế nào, miễn sao các tần số alen ở hai giới là như nhau, chỉ sau một thế hệ ngẫu phối các tần số kiểu gen đạt tới

Khi quần thể ở trạng thái cân bằng thì tích của tần số đồng hợp tử bằng bình phương một nửa tần số dị hợp tử

Tần số của các thể dị hợp không vượt quá 50% và giá trị cực đại này chỉ xảy

ra khi p=q=0,5 Lúc này các thể dị hợp chiếm một nửa số cá thể trong quần thể

Để kiểm tra mức độ phù hợp của tần số các kiểu gen quan sát được với tần số lý thuyết tính theo cân bằng Hardy Weinberg có thể kiểm nghiệm bằng thống kê theo

locut có 2 alen (3 kiểu gen) thì có bậc tự do bằng 1 [13]

1.3.2 Các phương pháp phân tích SNP

Trên thế giới hiện nay có nhiều phương pháp phân tích SNP được phát triển như kĩ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), kĩ thuật sử dụng đầu dò ADN (DNA- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (single strand conformational polymorphism, viết tắt

là SSCP), giải trình tự, sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance

liquid chromatography, viết tắt là DHPLC), chip ADN (SNP microarray) [12], [49]

Trong các phương pháp phân tích SNP, phương pháp giải trình tự có ưu điểm

là xác định được trình tự chuỗi DNA dài, có thể xác định được các điểm đột biến khác trong vùng gen được khuếch đại

Phương pháp giải trình tự Sanger dựa vào hoạt động của enzyme ADN

nhómOH ở vị trí C số 2 và 3 trên phân tử đường pentose) trong quá trình tổng hợp ADN Khi ADN polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại, cụ thể là: Enzyme ADN polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodiester ở chuỗi polynucleotid đang hình thành với các nucleotid kế tiếp), khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các đoạn AND chênh lệch nhau 1 nucleotid Điện di các đoạn ADN này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêng biệt (ddATP, ddCTP, ddTTP) sẽ được 4 bản điện di khác nhau Các băng AND xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP Dựa vào đó để đọc trình tự DNA [41]

1.3.3 FCER2 và mối liên quan đáp ứng điều trị bằng Corticoid

FCER2 là gen mã hóa cho thụ thể gắn với IgE ái lực thấp gen FCER2 nằm trên nhiễm sắc thể 19, từ vị trí: 7.688.758- 7.702.146 theo chiều ngược, kích thước gồm 13,390 bases Vị trí được biểu diễn hình 1.5

Hình 1.5: Biểu diễn vị trí gen FCER2

trong các nghiên cứu gen dược đã được tiến hành trước đây Rs28364072 đột biến nằm ở vùng intron vị trí 2206 thay T bằng C tính từ nucleotid số 7 theo chiều 3’ exon 9 của gen FCER2 [34], [45] Các alen C có liên quan với nồng độ IgE tăng cao

ở bệnh nhân hen suyễn Đột biến thay T bằng C của gen FCER2 đã được chứng minh có liên quan với việc tăng nguy cơ các đợt kịch phát với những bệnh nhân dử dụng ICSs

Nghiên cứu Tantisira và cộng sự (2007) tiến hành thử nghiệm lâm sàng trong

4 năm đánh giá mối liên quan 10 SNPs (rs889182, rs2287867, rs12980031, rs8110128, rs4804773, rs7249320, rs2277989, rs4804773, rs7249320, rs2277989, rs1042428, rs28364072, rs4996974) với tăng IgE và tần suất các đợt kịch phát ở

311 trẻ hít budesonide trong chương trình quản lý trẻ hen suyễn (CAMP) Kết quả cho thấy rs28364072 liên quan với việc tăng nguy cơ các đợt kịch phát với những bệnh nhân dử dụng corticoid dạng hít: Nguy cơ tương đối tăng các đợt kịch phát ở nhứng bệnh nhân đột biến CC: 3.95 (95% CI:1,64 - 9,51) ở trẻ em da trắng và 3,08 (95% CI: 1,00 - 9,47) ở trẻ em người Mỹ gốc Phi [45] so với nhóm có kiểu gen không phải đồng hợp đột biến CC

T2206C tới đợt hen cấp (số lần tái khám khẩn cấp tại khoa hoặc bệnh viện) sử dụng

dữ liệu từ hai quần thể của trẻ em hen điều trị bằng ICS: Nghiên cứu gen dược học của các thuốc hen suyễn ở trẻ em: nghiên cứu tác động của thuốc chống viêm (n = 386) và nghiên cứu BREATH (n = 939) Kết quả: Các đột biến T2206C có liên quan với tăng nguy cơ hen suyễn liên quan thăm bệnh viện trong cả hai nghiên cứu thuần tập (OR: 1,91, 95%CI: 1,08-3,40), và phân tích meta với các kết quả của nghiên cứu Tantisira và cộng sự (2007) cho kết quả rất có ý nghĩa (OR: 2.38, 95%CI: 1,47-3,85; p = 0,0004) Dựa trên bảng câu hỏi kiểm soát hen cho thấy đột biến rs28364072 có liên quan với tăng nguy cơ không được kiểm soát hen (OR: 2,64, 95%CI: 1,00-6,98) và tỷ lệ phải tăng liều corticoid hàng ngày (OR: 2.46, 95% CI: 1,38-4,39) Từ các kết quả cho thấy kết luận: Có mối liên quan mật thiết giữa đột biến rs28364072 với tỷ lệ tái nhập viện, kết hợp thêm các chỉ số cho thấy sự kém hiệu quả khi điều trị với ICS như: các triệu chứng hen (khó thở, hạn chế hoạt động ban ngày, thức giấc ban đêm), tăng liều hàng ngày ICS Đột biến rs28364072

có thể là một yếu tố hữu ích dự báo đáp ứng với steroid của bệnh nhân nhi hen phế quản [34]

Theo nghiên cứu Szalai và cộng sự (2014) phân tích đa hình rs28364072 trên hai quần thể Roma(458 người) và Hungari (397 người) bằng kỹ thuật RT- PCR cho kết quả tần số allen C khá tương đồng giữa hai quần thể: 0,248 ở quần thể Roma; 0,246 ở quần thể Hungari [42]

Nghiên cứu dịch tễ được tiến hành trên nhiểu quần thể dân số khác nhau, phân bố theo vùng địa lý để xác định tần số allen C, được tham khảo trên trang Web [50]:

http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Explore?r=19:7689899-7690899;v=rs28364072;vdb=variation;vf=8609645

Kết quả cho thấy sự tương đồng tần số allen C theo quần thể lớn phụ thuộc vào vùng địa lý Tần số allen C được nghiên cứu trên quần thể người Kinh tại Hồ Chí Minh, Việt Nam (tần số các alen T và C lần lượt là 0,64 và 0,36 ), một số chủng tộc người ở Trung Quốc (người Hán ở Bejing tần số các alen T và C lần lượt là 0,67

và 0,33; người Hán ở phía Nam tần số các alen T và C lần lượt là 0,61 và 0,39) Tần số cũng khá tương đồng với các quần thể người thuộc khu vực Nam Á (Pakistan tần số các alen T và C lần lượt là 0,61 và 0,39; Bangladesh tần số các alen

T và C lần lượt là 0,62 và 0,38) nhưng khác biệt lớn với một số chủng tộc ở châu Phi, châu Âu Kết quả được biểu diễn minh họa ở hình 1.5:

Hình 1.5: Biểu đồ biểu diến tần số allen C của rs28364072 theo các quần thể

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Bệnh nhi 6 -15 tuổi tham gia vào đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số yếu

tố liên quan đến đáp ứng corticosteroid dạng hít ở trẻ hen phế quản” do NCS Nguyễn Bích Hạnh tiến hành tại bệnh viện Nhi trung ương, đáp ứng những tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau:

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân nghiên cứu:

- Trong độ tuổi từ 6 – 15 tuổi

- Chưa được dự phòng hen(bệnh nhi mới) hoặc bỏ điều trị dự phòng ít nhất

1 tháng

- Đến khám vì tình trạng hen chưa kiểm soát

- Thực hiện đúng các kỹ thuật thăm dò chức năng theo hướng dẫn

- Được sự đồng ý của cha mẹ hoặc người giám hộ tự nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ: một trong các tiêu chuẩn sau

- Bệnh nhi bị hen đang có bệnh nặng toàn thân đi kèm

- Bệnh nhi đang có cơn hen kịch phát nặng

- Có các bệnh kèm theo: tim bẩm sinh, hội chứng thận hư, viêm cầu thận mãn, đái tháo đường

Đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến đáp ứng corticosteroid dạng hít ở trẻ hen phế quản” được tiến hành theo các bước: Các bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu sẽ được phân loại theo bậc GINA, can thiệp điều trị dự phòng theo GINA bằng corticoid dạng hít, đánh giá lại sau 4 tuần mức độ kiểm soát hen chia thành mức độ đáp ứng khác nhau theo GINA (thầy thuốc đánh giá), test ACT (gia đình và bệnh nhân nhi tự đánh giá) Đề tài tiến hành phân tích các yếu tố như gen, lâm sàng, cận lâm sàng và tìm mỗi liên quan giữa mức độ đáp ứng và các yếu tố trên

Để xác định tính đa hình gen FCER2, tất cả 80 mẫu máu của các bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ trên đều được lấy vào nghiên cứu

Để bước đầu phân tích mối liên quan giữa đa hình gen FCER2 với đáp ứng corticoid, Có 33 bệnh nhân được đánh giá mức độ đáp ứng corticoid sau 4 tuần khám lại

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Scientific

code: 15701500GM, hãng Affymetrix

2.2.2 Thiết bị

- Hệ thống điện di Cole-Parmer (Code 97623-06, Mỹ)

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)

- Tủ lạnh sâu Panasonic (Model MDF-U334-PE, Nhật Bản)

- Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Code: D78532, Đức)

- Máy lắc VELP Scientifica (Code F20220176, Châu Âu)

- Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ)

- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus(Eppendorf, Đức)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định đa hình gen

Nghiên cứu được tiến hành theo 7 bước sau:

a Xử lý mẫu

Cách lấy mẫu: 1.5 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống

chuyên dụng chứa sẵn EDTA chống đông (tối thiểu 300µl máu/ ống) Mỗi ống máu

đủ cho 1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân

Cách bảo quản: Tại địa điểm thu nhận, mẫu được bảo quản trong điều

kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn ính học đến phòng thí nghiệm của bộ môn y dược học cơ sở -

khi được sử dụng

Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã bệnh nhân, tên,

tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi

DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash

Buffer; Thu DNA

Các bước iến hành:

1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng

2 Lắc đều ống máu Chuyển 250µl mẫu vào ống ly tâm vô trùng

3 Thêm 25 µl OB Protease Solutionvà 250 µl BL Buffer Vortex trong 10 giây

4 Ủ 650C trong 10 phút Chú ý: Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây

5 Thêm 260 µl Ethanol 100% Vortex trong 20 giây

6 Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành

và nắp ống

7 Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube2ml

8 Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)

14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tub

15 Thêm 700 µl DNA Wash Buffer

16 Ly tâm trong 1 phút ở10.000g

17 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

18 Lặp lại các bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer

19 Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm

khô cột

20 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới

21 Thêm 100 µl Elution Buffer(đã làm ấm đến 650C) Ủ 650C trong 5 phút

22 Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

23 Thêm 50 µl Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

24 Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

25 Thu và bảo quản DNA ở -200C

c Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra theo hai phương pháp:

- Kiểm tra chất lượng DNA thông qua điện di

Nguyên lý: Phương pháp điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức

kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền

Sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đề Bản gel sẽ giúp phân tách các phân tử và thuốc nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí phân tử trên gel sau khi điện di Tốc độ di chuyển của DNA trong điện trường sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA, điện tích, mức độ xoắn và dạng phân tử Như vậy khi so sánh kích thước các mẫu DNA với thang chuẩn sẽ đánh giá được chất lượng DNA [16]

Tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose

Cho 0.7 g Agarose pha trong 100 ml đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho

sẵn răng lược để tạo các giếng nhỏ Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra đặt bản gel vào bể điện di ở tư thế nằm ngang Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1-2mm

Bước 2: Tra mẫu DNA

màu khác nhau: bromophenol xanh và xylene cyanol FF để theo dõi trực quan của

di cư DNA trong điện với ưu điểm theo dõi màu sắc của di chuyển DNA trong điện

di DNA, không che DNA trong gel tiếp xúc với ánh sáng UV) tra vào các giếng nhỏ trong gel Một lượng DNA chuẩn 5 µl Lambda DNA/HindIII Marker cũng được tra vào gel để làm chỉ thị phân tử

Bước 3: Chạy điện di

Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 60V trong 60 phút DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào dừng điện di Bản gel được lấy nhẹ khỏi khuôn soi dưới ánh sáng tử ngoại

Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di sáng, rõ, có 1 băng

duy nhất tương ứng với băng 23,1 kb của Lambda DNA/HindIII Marker

- Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang

Nguyên lý: Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định

Để tính nồng độ DNA cần xác định giá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260nm (A260) do acid nucleic hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm

do sự có mặt của base purine và pyrimidine 1 đơn vị A260 tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi [21]

Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA, ngoài bước sóng 260nm người

ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do đó

[21]

Tiến hành: Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:

+ Đo Blank: đo với môi trường dùng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA + Đo mẫu DNA

Các mẫu được đo ở bước song 260 nm và 280nm, mỗi mẫu DNA được đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu Thực nghiệm trên được tiến hành tại Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQGHN

sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus

d Khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs28364072

Nguyên lý: Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại DNA Nguyên lý của kỹ

thuật là dùng enzyme polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ 1 DNA khuôn ban đầu Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm,

4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase Gồm 3 giai đoạn chính [13], [16]:

Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95°C) để tách hai mạch của chuỗi

DNA xoắn kép

Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp

của mồi vào sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như thành phần và số lượng của mồi

Giai đoạn kéo dài: Tại 720 C DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate

Sau đó các sản phẩm của chu kỳ thứ nhất được làm nguyên liệu cho chu kỳ thứ hai, nhiệt độ lại được nâng lên để bước vào giai đoạn biến tính Rồi phản ứng cứ tiếp tục và cho đến chu kỳ cuối cùng Số lượng phân tử DNA đích được tăng lên gấp đôi sau mỗi chu kỳ Sau n chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp

Bảng 2.1: Điều kiện phản ứng khuếch đại đoanh gen mang SNP RS28364072

Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng

- 35 chu kỳ:

Buffer (+MgSO4) 10X 1X + 950C-30 giây

Có 8 mẫu được PCR sử dụng cả mồi xuôi và mồi ngược để kiểm tra lại kết quả đọc kiểu gen và đưa ra khuyến cáo mồi tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo

e Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR

Sử dụng phương pháp điện di, nguyên lý và cách tiến hành tương tự như điện

di kiểm tra chất lượng DNA sau khi tách chiết Điện di trên giá thể là agarose pha

trong đệm TAE 1X

+ Điều kiện điện di: Điện di trên đệm TAE 1X, hiệu điện thế 70 V trong 60 phút + Thể tích mẫu điện di: 5 µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, 5 µl Ruler 100 bp Plus DNA Ladder

Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di sáng, rõ, có 1 băng duy nhất tương ứng với băng 818 bp của Ruler 100 bp Plus DNA Ladder

f Giải trình tự DNA

Nguyên lý: phương pháp giải trình tự Sanger dựa vào hoạt động của enzyme

DNA polymerase và dideoxynucleotide (ddNTP) tham gia vào quá trình tổng hợp DNA Khi DNA polymerase xúc tác kéo dài mạch DNA mới gặp nucleotide không

có nhóm 3’OH (dideoxynucleotide), phản ứng tổng hợp dừng lại và tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau 1 nucleotide Điện di các đoạn DNA giúp xác định được trình tự DNA [41]

Tiến hành: 20 µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi

tinh sạch và giải trình tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia) Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9

g Phân tích và đánh giá kết quả:

Dựa vào pic tại vị trí đột biến để xác định kiểu gen, các cá thể nghiên cứu có

thể mang một trong ba kiểu gen: Đồng hợp kiểu dại, đồng hợp đột biến hoặc dị hợp

Dựa trên kiểu gen đã được xác định thông qua giải trình tự, tiến hành phân tích và xác định tính đa hình dựa trên các thông số:

- Haplotype: Liên kết giữa các SNP/genome tạo thành một nhóm, tương đối phổ biến, có xu hướng theo khu vực dân và có tính di truyền [17], [22]

- Tần số kiểu gen: để tính tần số kiểu gen của một locut gen, ta tính số cá thể mang kiểu gen cần tính rồi chia cho tổng số cá thể trong quần thể [12], [22]

- Tần số allen: Tần số alen của một gen được biểu thị bằng tỉ lệ giữa số alen được xét trên tổng số alen của gen đó có trong quần thể tại một thời điểm xác định

Giả sử locut có 2 alen A,a Tần số hai alen, f(A) và f(a), thường được ký hiệu

là p và q Với locut có hai alen, ta dùng công thức tính tần số alen sau đây [12], [22]:

p = f(A) = (2 x số đồng hợp tử AA + số dị hợp tử Aa) : (2 x tổng số cá thể)

q = f(a) = (2 x số đồng hợp tử aa + số dị hợp tử Aa) : (2 x tổng số cá thể)

- Dựa trên kết quả giải trình tự sẽ tính được tần số phân bố của các SNP và đối chiếu với công thức di truyền quần thể Hardy-Weinberg Mức độ khác biệt giữa các tần số các alen và kiểu gen thu được trong thí nghiệm và với số liệu mong đợi

2.3.2 Đáp ứng thuốc Corticoids

Mức độ đáp ứng với thuốc Corticoids được lấy từ nghiên cứu: “Nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến đáp ứng corticosteroid dạng hít ở trẻ hen phế quản” do NCS.Ths Nguyễn Thị Bích Hạnh tiến hành tại bệnh viện nhi trung ương

+ Thuốc sử dụng:

Điều trị dự phòng hen theo Gina – sử dụng corticosteroid dạng hít – sử dụng thuốc Flixotide (fluticasone propionate 125 µg): Liều thấp: 250 µg (2 liều xịt: sáng 1 nhát, tối 1 nhát); liều trung bình: 500 µg (4 liều xịt: sáng 2 nhát, tối 2 nhát); liều cao: 750 µg (6 liều xịt: sáng 3 nhát, tối 3 nhát)

Để đánh giá mức độ đáp ứng thuốc, Nguyễn Thị Bích Hạnh đã dùng hai bộ công cụ là đánh giá theo mức độ kiểm soát GINA và test ACT Dựa trên kết quả thu đƣợc, có thể so sánh mức độ đáp ứng thuốc giữa hai bộ công cụ

+ Phân loại hen theo mức độ kiểm soát GINA (bảng 1.2)

Chƣa đƣợc kiểm soát

1 Triệu chứng ban ngày <2 lần/tuần > 2 lần/tuần

≥ 3 đặc điểm trong mức kiểm soát 1 phần ở 1 tuần bất kỳ

6 Đợt kịch phát hen Không ≥ 1 lần/năm

Có 3 mức độ kiểm soát: Kiểm soát hoàn toàn, Kiểm soát một phần và nhóm chƣa đƣợc kiểm soát

+ Phân loại mức kiểm soát hen theo ACT (Asthma control test):

 Với trẻ trên 12 tuổi:

Hình 2.1: ACT đánh giá kiểm soát hen với trẻ trên 12 tuổi

Cách tính điểm:

 < 20 điểm: Hen chưa được kiểm soát

toàn

vấn cả trẻ và bố mẹ

Hình 2.2: Test ACT đánh giá kiểm soát hen với trẻ từ 4 đến 11 tuổi (dành cho trẻ)

Hỏi bố mẹ các câu hỏi:

Hình 2.3:Test ACT đánh giá kiểm soát hen với trẻ từ 4 đến 11 tuổi (dành cho bố mẹ)

Cách tính điểm: Cộng điểm 4 câu hỏi do trẻ trực tiếp trả lời (có thể giải thích cho trẻ) và 3 câu hỏi của cha mẹ hoặc người chăm sóc trẻ

Nếu < 19 điểm: Tình trạng hen của trẻ chưa được kiểm soát,

Nếu 20-27 điểm: Tình trạng hen của trẻ đang được kiểm soát tốt