Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cây đạm trúc diệp lophatherum gracile brongn , poaceae

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dưới mặt đất đạm trúc diệp bằng phản ứng hóa học .... Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học và tác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06

Người hướng dẫn khoa học: TS Hà Vân Oanh

TS Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI - 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học của Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu, cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS

Hà Vân Oanh và TS Đỗ Thị Hà, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Dược liệu, Thực vật, Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội và các cán

bộ khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, thư viện Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình

và bạn bè đã khích lệ, động viên và chia sẻ giúp tôi đạt được những kết quả ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Phùng Thanh Long

ii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại của đạm trúc diệp Lophatherum gracile Brongn 3

1.2 Đặc điểm họ Lúa (Poaceae) 3

1.3 Tổng quan loài Lophatherum gracile Brongn 4

1.3.1 Đặc điểm thực vật 4

1.3.2 Thành phần hóa học 6

1.3.3 Tác dụng sinh học 16

1.3.4 Công dụng 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 21

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 22

2.2.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 28

2.2.4 Xử lý số liệu 30

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Thực vật 31

iii

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học loài đạm

trúc diệp 31

3.1.2 Đặc điểm vi học của cây đạm trúc diệp 32

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 34

3.2 Hóa học 36

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dưới mặt đất đạm trúc diệp 36

3.2.2 Chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất từ phần dưới mặt đất đạm trúc diệp 37

3.2.3 Định lượng polyphenol toàn phần trong phần dưới mặt đất đạm trúc diệp 46

3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 48

Chương 4 BÀN LUẬN 50

4.1 Về thực vật 50

4.2 Về thành phần hóa học 51

4.2.1 Định tính 51

4.2.2 Phân lập các hợp chất 52

4.2.3 Về kết quả định lượng hàm lượng polyphenol tổng số 53

4.3 Về tác dụng chống oxy hóa in vitro 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

CÁC BÀI BÁO CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration)

v

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resource)

TEAC Khả năng chống oxy hóa tương đương trolox (Trolox

equivalent antioxidant capacity)

đạm trúc diệp 17

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dưới mặt đất đạm trúc diệp bằng phản ứng hóa học 36 Bảng 3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu acid gallic 46 Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol toàn phần trong đạm trúc diệp 47 Bảng 3.4 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH 48 Bảng 3.5 Hoạt tính quét gốc tự do ABTS 49

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái cây đạm trúc diệp 31

Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ cây đạm trúc diệp 32

Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân cây đạm trúc diệp 33

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá cây đạm trúc diệp 34

Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu rễ cây đạm trúc diệp 34

Hình 3.6 Đặc điểm bột dược liệu thân cây đạm trúc diệp 35

Hình 3.7 Đặc điểm bột dược liệu lá cây đạm trúc diệp 36

Hình 3.8 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây đạm trúc diệp 39

Hình 3.9 Sắc ký đồ của hợp chất 1 và daucosterol 41

Hình 3.10 Sắc ký đồ của hợp chất 2 và β-sitosterol 42

Hình 3.11 Công thức hóa học của các hợp chất từ đạm trúc diệp 46

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định nồng độ acid gallic 47

viii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đạm trúc diệp (Lophatherum gracile Brongn.), còn gọi là trúc

diệp, cỏ lá tre hay cỏ củ; rễ gọi là toái cốt tử, trúc diệp mạch đông, mễ thân thảo hoặc sơn kê mễ là cây mọc hoang ở ven đường, rừng thưa, sườn núi, dọc các lối đi trong rừng Ở Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở Lạng Sơn, Phú Thọ, Thái Nguyên, Ninh Bình và các tỉnh Nam Bộ Ngoài ra cây còn phân bố ở Trung Quốc, Campuchia, Malaysia… Theo y học cổ truyền, đạm trúc diệp được dùng toàn cây hoặc phần rễ để chữa các bệnh do tâm nhiệt gây ra như sốt kèm khát nước, tiểu tiện đỏ, tiểu tiện khó khăn [9]

Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây đạm trúc diệp Việc tiến hành nghiên cứu toàn diện loài này sẽ đóng góp những dữ liệu khoa học nhằm sáng tỏ việc sử dụng cây thuốc này theo tri thức dân gian dưới góc nhìn

khoa học hiện đại Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành

phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cây đạm trúc diệp Lophatherum gracile Brongn., Poaceae”, với các mục tiêu:

- Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đạm trúc diệp

- Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cây đạm trúc diệp

Để đạt được mục tiêu đề ra, luận văn được tiến hành với các nội dung sau:

 Về nghiên cứu thành phần hóa học:

- Định tính sự có mặt của các hợp chất thường gặp trong dược liệu ở phần dưới mặt đất của mẫu nghiên cứu

- Định lượng polyphenol toàn phần trong cao ehanol 70% và các phân đoạn chiết từ cây đạm trúc diệp

- Chiết xuất, phân lập và nhận dạng 2 - 4 hợp chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của mẫu nghiên cứu

 Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa:

- Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao ethanol 70% và

các phân đoạn bằng phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH và phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do ABTS

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại của đạm trúc diệp Lophatherum gracile Brongn

Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” của

tác giả A Takhtajan năm 1997, họ lúa Poaceae có vị trí phân loại như sau:

Cây đạm trúc diệp thuộc chi Lophatherum, họ lúa Poaceae, có tên

khoa học là Lophatherum gracile Brongn [1], [4], [9], [13], [28]

1.2 Đặc điểm họ Lúa (Poaceae)

Cây cỏ hay cỏ hóa gỗ, sống hàng năm hay nhiều năm, thường mọc thành cụm Thân rạ, rỗng ở các gióng, đặc ở mấu, trừ một số loài thân đặc (Mía, Ngô) hoặc có thân rễ Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, phiến lá dài, gân lá song song, có bẹ lá và lưỡi nhỏ, không có cuống lá (trừ tre) Cụm hoa là bông, chùm hay cờ, gồm nhiều bông nhỏ, mỗi bông nhỏ có 1-10 hoa

Ở gốc mỗi bông nhỏ thường có 2 mày xếp đối diện với nhau (tương ứng với 2 lá bắc chung cho 1 bông nhỏ) Ở mỗi gốc hoa có 2 mày nhỏ xếp đối diện nhau: mày nhỏ trong có 2 gân (mày nhỏ gân chẵn), tương ứng với đài hoa Phía trong 2 mày nhỏ này còn có phiến rất nhỏ màu trắng là mày cực nhỏ (tương ứng với cánh hoa) Hoa thường lưỡng tính Bộ nhị thường 3-6 nhị, chỉ nhị dài, mảnh, dính vào giữa trung đới và cong xuống nên dễ bị gió lay động làm rơi hạt phấn ra ngoài, một đặc điểm thích nghi với lối thụ phấn nhờ gió, thường là giao phấn (nhị chín trước nhụy) Bộ nhụy gồm 2 lá

noãn, có 2 vòi nhụy, núm nhụy nhiều lông Quả thóc (loại quả đóng, có vỏ quả dính với hạt) Hạt có nội nhũ bột Phôi nằm một bên của nội nhũ [2], [53]

Họ lúa (Poaceae) là một trong những họ lớn, phân bố toàn cầu Họ

có tầm quan trọng bậc nhất trong số các thực vật có hoa, vì nó cung cấp lương thực cho con người (Lúa, Lúa mì, Kê ) , thức ăn cho động vật nói chung và gia súc nói riêng (nhiều loại cỏ thuộc họ lúa), nguyên liệu cho xây dựng ( Tre, Nứa, Vầu ), cho sản xuất đường mía và làm thuốc Việt Nam có 150 chi với khoảng 500 loài, chủ yếu là cỏ dại Một số loài được trồng như Mía, Sả, Ngô, Tre các loại

Họ lúa có 18 loài thường được dùng làm thuốc, trong đó 8 loài dùng trong công nghiệp Dược là Cỏ tranh, Cỏ mần trầu, Đại mạch, Lúa, Ngô, Sả, Tre, Ý dĩ Các loài khác dùng trong dân gian [2]

1.3 Tổng quan loài Lophatherum gracile Brongn

1.3.1 Đặc điểm thực vật

1.3.1.1 Mô tả

Cây đạm trúc diệp còn gọi là trúc diệp, cỏ lá tre hay cỏ củ, trúc diệp

mạch đông; rễ gọi là toái cốt tử Cây có tên khoa học là Lophatherum

gracile Brongn., họ lúa (Poaceae) [4], [9], [13]

Đạm trúc diệp là loại cỏ sống lâu năm, thân dài 0,6-1,5m, thẳng đứng hay hơi bò Rễ phình thành củ, hình chùm Lá mềm, xếp cách nhau, hình bầu dục dài, nhọn đầu, tròn hay hình nêm ở gốc, trông giống như lá tre, nhẵn ở mặt dưới, có lông trên gân ở mặt trên, mép nhẵn, bẹ lá nhẵn, dài, mềm nhẵn hay có lông ở mép, lưỡi bẹ ngắn Cụm hoa hình bông (chùy) thưa dài 15-45cm Bông chét hình mũi mác, cuống dài mảnh mang một hoa lưỡng tính và 8-9 mày nhỏ rỗng và cuộn lại Nhị 2-3, bao phấn hình dải, bầu hình thoi Quả thóc hình thoi, tròn, rời trong các mày nhỏ, phôi dài [1], [4], [9], [13], [28]

1.3.1.2 Đặc điểm sinh thái

Cây mọc ở ven đường, rừng thưa, sườn núi, dọc các lối đi trong rừng, và là cây ưa ẩm, ưa sáng Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11 [4], [9] , [13]

1.3.1.3 Đặc điểm phân bố

Ở Việt Nam, cây đạm trúc diệp phân bố từ Lạng Sơn, Phú Thọ, Thái Nguyên, Ninh Bình vào các tỉnh Nam Bộ Trên thế giới, cây còn phân bố ở Trung Quốc, Campuchia, Malaysia, Indonesia và Phillipin [4], [9], [13]

1.3.1.4 Đặc điểm vi phẫu lá

Biểu bì trên và dưới có từng quãng tế bào to chứa nước xen lẫn với từng quãng tế bào biểu bì nhỏ, có lỗ khí và lông che chở đơn bào ngắn, đầu nhọn Mô mềm gồm những tế bào hình nhiều cạnh có thành mỏng Nhiều

bó gỗ xếp rời nhau theo hình vòng cung gần biểu bì dưới Mỗi bó

libe-gỗ gồm có vòng nội bì bao bọc xung quanh, libe ở giữa có vòng mô cứng bao bọc, gỗ nằm sát libe có 3 mạch gỗ to xếp thành hình chữ V, đặt trong

mô mềm gỗ Xen kẽ với các bó libe-gỗ này có nhiều bó libe-gỗ nhỏ hơn Nhiều đám mô cứng rời nhau, nằm sát biểu bì trên và dưới ở phiến và gân

lá Ở biểu bì dưới đám mô cứng ứng với bó libe-gỗ nhỏ, có khi nối liền 1 số

bó libe-gỗ ở giữa với biểu bì dưới [3]

1.3.1.5 Đặc điểm bột dược liệu

Bột lá: Màu vàng lục Soi kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì trên và dưới gồm tế bào hình chữ nhật, hay gần vuông, thành lượn sóng, mang lông che chở và lỗ khí Biểu bì dưới có tế bào thành lượn sóng nhiều và nhiều lỗ khí hơn biểu bì trên Lỗ khí hình thoi ngắn, khe lỗ khí hai đầu phình to, giữa thắt lại hình qủa tạ Lông che chở gồm hai loại: lông đơn bào dài, đầu thuôn nhọn, gốc hẹp và nhô lên, ít gặp; lông đơn bào ngắn, đầu thuôn nhỏ, gốc phình to, có nhiều trên các đường gân Sợi dài đầu thuôn nhọn, có loại màng hơi dày khoang rộng; có loại thành dày, khoang hẹp

Sợi mô cứng hình thoi, thành dày (ít gặp) Tế bào hình chữ nhật, thành dày Mảnh mạch mạng, mạch xoắn [3]

1.3.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công bố về thành phần hóa học của

loài Lophatherum gracile Brongn., Poaceae Tuy nhiên, trên thế giới đã có

một số nghiên cứu về thành phần hoá học của loài này

Từ năm 1970 đến nay, người ta đã tìm thấy hơn 20 hợp chất

flavonoid từ cây đạm trúc diệp, gồm có 3′-methoxyl-luteolin galactopyranosiduronic acid (1 → 2) -α-L-arabinopyranosid, 7-methoxyl-

6-C-β-D-apigenin-8-glucosid, 7-methoxyl-luteolin-6-C-2″-glucuronylglucosid, afzelin, apigeini-6-C-2″-glucuronylglucosid, apigenin-6-C-2″-

glucuronylxylosid, apigenin 6-C-β-D-galactopyranosiduronic acid

(1 → 2)-α-L-arabinopyranosid, apigenin-6-C-glucose-8-xylcose,

diosmetin-6-C-2″-glucuronylxylosid, luteolin, 6-C-2″-glucuronylglucosid, 6-C-2″-glucuronylxylosid, luteolin-6-C-5″-glucuronylxylosid, luteolin 6-

luteolin-C-α-L-arabinopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid, luteolin galactopyranosiduronic acid (1 → 2)-α-L-arabinopyranosid, luteolin 6-C-β- D-glucopyranosiduronic acid (1 → 2)-α-L-arabinofuranosid, lutonarin,

6-C-β-D-orientin, is6-C-β-D-orientin, swertisin, swertiajaponin, salcolin A, salcolin B, tricin,

tricin 7-O-β-D-glucopyranosid, tricin 7-O-neohesperidosid, vitexin và

cis-5-p-CoQA, trans-5-p-CoQA, 4-FQA [24], [58]

Về hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong đạm trúc diệp, theo tác giả Diaz P và cộng sự đã công bố năm 2012 cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong cao chiết nước phần lá đạm trúc diệp lần lượt là 68,19 ± 0,52 μg /mg (tính theo

μg acid gallic /mg cao khô) và 170,88 ± 2,83 μg/mg (tính theo μg quercetin /mg cao khô) [23] Tuy nhiên, theo nghiên cứu năm 2013 của Li S và cộng

sự, hàm lượng polyphenol toàn phần trong phần trên mặt đất đạm trúc diệp

là 10.61 ± 0.56 mg GAE/g dược liệu [37]

Bảng 1.1 Các flavonoid trong cây đạm trúc diệp

[58]

27 Isovitexin [57],

[58]

Bảng 1.2 Một số hợp chất khác trong cây đạm trúc diệp

1 Arundoin

[30], [42] [64],

2 Cylindrin

[42]

18 4-FQA

1.3.3 Tác dụng sinh học

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài

Lophatherum gracile Brongn., Poaceae

1.3.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 1997, Andrew J.Kirby và Richard J.Schmidt đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của 10 vị dược liệu trong bài thuốc điều trị eczema

PSE 222 Kết quả ghi nhận toàn cây Lophatherum gracile là một trong

những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [32]

Theo Ge Q và cộng sự, các polysaccharid từ Lophatherum gracile

có tác dụng chống oxy hóa, ức chế hoạt tính của các gốc superoxid, DPPH, hydroxy, đồng thời làm giảm tác dụng xúc tác cho phản ứng oxy hóa của các kim loại có khả năng tạo phức chelat [25]

Bên cạnh đó, các hợp chất có mặt trong đạm trúc diệp như luteolin, orientin và isoorientin có tác dụng chống oxy hóa thông qua khả năng quét gốc tự do DPPH, ONOO-

(peroxynitrit), NO (nitric oxid), ROS (total reactive oxygen species) Trong đó, nồng độ thể hiện khả năng quét gốc tự

do DPPH 50% dao động từ 1,64-6,69µM so với chất đối chứng acid ascorbic (IC50 = 16,88µM), gốc NO dao động 1,24-1,74 µM so với Carboxy-PTIO (IC50 = 2,35 µM), gốc ONOO- dao động 0,35-0,56 µM so với L-penicillamine (IC50 = 2,98µM), gốc ROS dao động 1,16-2,72 µM so với chứng dương trolox (IC50 = 8,98 µM) [22]

Năm 2013, Sha Li và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của 223 cây thuốc thông qua phương pháp FRAP (ferric-reducing

antioxidant power) và TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Kết quả cho thấy: cao chiết nước toàn cây đạm trúc diệp tương đương 71.63± 1.96 mol Fe(II)/g đối với phương pháp FRAP và 40.12 ± 1.37 mol Trolox/g đối với phương pháp TEAC [37]

1.3.3.2 Tác dụng chống viêm

Theo nghiên cứu của Jae Sue Choi và cộng sự, luteolin có tác dụng chống viêm thông qua ức chế sản xuất NO (nitric oxid) ở tế bào RAW

264.7 gây viêm bằng lipopolysaccharid [22] Các hợp chất apigenin,

vitexin, isovitexin trong đạm trúc diệp cũng có tác dụng tương tự [21]

Nghiên cứu in vitro của Sylvia Lamy và cộng sự cũng cho thấy tác dụng chống viêm của luteolin thông qua ức chế biểu hiện của IL-β, NF-κB, và ức

chế biểu hiện của emzym COX-2, do đó có tác dụng chống viêm [33]

1.3.3.3 Tác dụng khác

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, các flavonoid trong cây đạm trúc diệp có khả năng cải thiện diễn biến một số bệnh lý như bệnh alzeimer [21], [22], đái tháo đường [21], [45] và chống virus hợp bào hô hấp (Respiratory syncytial virus, RSV) [50] Tác dụng chống virus hợp bào hô hấp của các flavonoid trong cây đạm trúc diệp được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Tác dụng chống RSV của một số flavonoid trong cây

đạm trúc diệp

STT Hợp chất IC 50

(µg /mL)

CC 50 (µg /mL) SI

- Ribavirin (tinh khiết > 99%) là chất chứng dương

- Kí hiệu “–’’: không phát hiện được [50]

1.3.4 Công dụng

Theo y học cổ truyền, đạm trúc diệp có vị ngọt, nhạt, tính hàn, quy vào hai kinh tâm và tiểu trường, có tác dụng lợi tiểu tiện, thanh tâm hoả, trừ phiền nhiệt Đạm trúc diệp được dùng để chữa tâm phiền, tiểu tiện đỏ, tiểu tiện khó khăn Chú ý: phụ nữ có thai uống nhiều dễ gây đẻ non [4], [9]

Từ xưa đến nay, dân gian sử dụng đạm trúc diệp làm thuốc chữa sốt, thông tiểu trong các bài thuốc phối hợp như:

- Bệnh sốt có khát nước: dùng đạm trúc diệp 30g, sắn dây 15g, sắc uống

- Đau mồm, giảm niệu: dùng đạm trúc diệp 12g, sinh địa 20g, cam thảo 6g, sắc uống

- Tiểu tiện ra máu: dùng đạm trúc diệp 15g, rễ cỏ tranh 15g, sắc uống [4]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là cây đạm trúc diệp thu hái tại

xã Tiến Thắng, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – HN (số hiệu PTL01) Giấy chứng nhận mẫu lưu tiêu bản được đính kèm ở Phụ lục 1

- Nguyên liệu sau khi thu hái được tách riêng phần trên mặt đất và dưới mặt đất, sau đó sấy ở 50°C tới khô, bảo quản trong túi PE và bao bì kín, trước khi chiết xuất được xay thành bột thô

- Bào chế cao khô ethanol 70% và các phân đoạn để định lượng

polyphenol toàn phần và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro: 5,0 kg

dược liệu khô phần dưới mặt đất của đạm trúc diệp được chiết hồi lưu với EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 3 giờ) Lọc, gộp dịch chiết và cô dưới áp suất giảm đến cao khô ethanol 70% (210,0 g)

- Chết tách các phân đoạn: cao khô ethanol 70% được hòa trong nước

và lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan,

dicloromethan và ethyl acetat Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu

được các cao chiết phân đoạn tương ứng gồm cao n-hexan (30,9 g),

dicloromethan (9,4 g), ethyl acetat (7,2 g) và cặn nước (134,9g)

2.1.2 Hóa chất

- Các dung môi hóa chất: javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn , EtOH, nước cất, Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussiat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, (CH3CO)2O, dung dịch gelatin 1%, CHCl3, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%, thuốc thử Folin-Ciocalteau DPPH, ABTS, kali persulphate đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập (EtOH 70%,

n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM) và aceton (Ac)) đạt tiêu chuẩn công nghiệp

- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063

mm, Merck) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Kính hiển vi, kính lúp soi nổi

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA60

- Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Memmert, tủ sấy Binder-FD115, Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), Máy siêu âm Power sonic 405, cột thủy tinh các loại

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm-800nm, hãng Shimadzu

- Máy đo độ nóng chảy Kofler micro-hotstage

- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là TMS

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Quan sát và mô tả hình thái thực vật của cây

- Phương pháp hình thái so sánh được áp dụng để nghiên cứu phân loại loài trên cơ sở các mẫu nghiên cứu, có sự so sánh và đối chiếu với các tài liệu phân loại thực vật cùng với các chuyên gia phân loại thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi bột rễ,

thân lá của loài nghiên cứu, quan sát các đặc điểm, chụp ảnh và mô tả tiêu bản [11]

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ

Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [12], [8]

- Chuẩn bị dịch chiết ethanol: Cho 20 g dược liệu vào bình nón dung

tích 100 ml, thêm 50 ml EtOH 700, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết n-hexan: Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung

tích 50 ml, đổ ngập n-hexan, ngâm qua đêm, lọc Dịch lọc dùng để làm các

phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết nước: 20 g dược liệu cho vào bình nón dung tích

100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

a) Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm dung dịch

H2SO4 2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào:

- Ống 1: TT Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

- Ống 2: TT Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu

- Ống 3: TT Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng

cam đến đỏ

b) Định tính glycosid tim

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 h Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 250 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc cỏ mỏ dung tích 250 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với CHCl3:MeOH (4:1) mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml

anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu tím đỏ giữa 2 lớp chất

- Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 800 Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện dung dịch màu đỏ

- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 800 Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam

c) Định tính anthranoid

Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100

ml, thêm 10 ml dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong

vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml n-hexan Lấy 1 ml dịch n-hexan cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, lắc kỹ,

Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ ở lớp KOH

d) Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm

một ít bột magie kim loại Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 − 5 giọt) Để yên một vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu đỏ cam

- Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt

NaOH 10%, quan sát xem có kết tủa hay không, sau đó thêm nước, quan sát màu của dung dịch Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết

ethanol Thêm vào 2 − 3 giọt dd FeCl3, Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu lục, xanh, hoặc nâu

e) Định tính coumarin

- Phản ứng mở và đóng vòng lacton:

+ Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết ethanol, ống 1 thêm 0,5

ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên

+ Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội Quan sát hiện tượng + Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều, quan sát và

mô tả hiện tượng

- Phản ứng với thuốc thử diazo: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết

ethanol, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch

f) Định tính saponin

- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to sạch 2 ml dịch chiết nước,

thêm 10 ml nước cất Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

- Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết ethanol cho vào bình nón và

thêm 10 ml H2SO4 loãng Đun sôi cách thủy vài phút Để nguội, chiết với cloroform Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm

Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, đỏ, xanh lá hoặc tím

- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết cloroform ở trên

cho vào 1 ống nghiệm rồi cô tới cắn Cho vào cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 450

rồi thêm 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện màu hồng đến tía

g) Định tính tanin

Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết nước, làm các phản ứng

sau:

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho vào ống nghiệm dịch chiết 2 −

3 giọt dd FeCl3 5% Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh lá đến xanh đen

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2 − 3 giọt dung dịch gelatin

1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

- Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết đạm trúc diệp 2

− 3 giọt dung dịch chì acetat 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

- Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết đạm

trúc diệp 2 − 3 giọt đồng acetat Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

h) Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước đạm trúc diệp một ít tinh thể

Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

i) Định tính acid amin

Lấy 2 ml dịch chiết đạm trúc diệp vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2 –

3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu tím.

j) Định tính đường khử

Lấy 2 ml dịch chiết nước đạm trúc diệp, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu đỏ gạch

k) Định tính polysaccharid

Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:

Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4 ml dịch chiết đạm trúc diệp và 5 giọt thuốc thử Lugol Phản

ứng dương tính khi xuất hiện mài nâu đỏ

l) Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết

dung môi Phản ứng dương tính khi xuất hiện vết mờ trên giấy lọc

m) Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến

khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 450

nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ

n) Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi cách thủy đến

cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu xanh

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất trong đạm trúc diệp

- Phương pháp chiết xuất: Dược liệu được chiết hồi lưu ở 80oC với dung môi ethanol 70% trong thời gian 3h x 3 lần; tỉ lệ dược liệu/dung môi

là 1:10; phân đoạn bằng dung môi công nghiệp theo thứ tự tăng dần độ

phân cực: n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat [6]

- Phương pháp phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột, tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo YMC [5]

- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất: Dựa trên kết quả phân tích các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố

2.2.2.3 Định lượng polyphenol toàn phần trong đạm trúc diệp

Phương pháp định lượng polyphenol tổng số: sử dụng thuốc thử Ciocalteau, đo quang ở bước sóng 760 nm, so sánh với acid gallic, sử dụng

Folin-kỹ thuật đường chuẩn, dựa theo Dược điển Việt Nam IV [3] Phương pháp định lượng như sau:

- Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg acid gallic,

cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH, siêu âm cho tan hoàn toàn Bổ sung MeOH tới vạch, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng

1000 µg /ml Dung dịch gốc được dùng để pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 200-1000 µg /ml

- Dung dịch mẫu thử: đối với cao tổng và cao phân đoạn

dicloromethan, nước: cân chính xách khoảng 100 mg cao chiết, cho vào bình định mức 10ml, thêm MeOH, siêu âm cho tan hoàn toàn Thêm dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc kích cỡ 0.45 mm, thu được dung dịch thử dùng để pha dung dịch đo quang

Đối với phân đoạn ethyl acetat: cân chính xác khoảng 50 mg cao chiết, cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH tới vạch, siêu âm cho tan hoàn toàn, lọc qua màng lọc kích cỡ 0.45 mm, thu được dung dịch thử để pha dung dịch đo quang

- Dung dịch đo quang: Cho 100 µl dung dịch thử/ dung dịch chuẩn +

200 µl thuốc thử Folin-Ciocalteau + 1,8ml nước cất, lắc kỹ và để yên 5 phút Thêm 4 ml Na2CO3 7% và bổ sung nước cất vừa đủ 10,0 ml Ủ ở nhiệt độ phòng 90 phút rồi đem đi đo quang ở 760 nm

Y: độ hấp thụ quang của dung dịch thử ở 760 nm

a,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn

m: khối lượng cao dược liệu (mg)

x: độ ẩm cao (%)

2.2.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH :

Mẫu nghiên cứu : cao chiết ethanol 70% và các phân đoạn tương

Pha các dung dịch thử trong methanol có nồng độ thích hợp

Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

Quercetin được sử dụng làm chứng dương

2.2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do ABTS:

Mẫu nghiên cứu : cao chiết ethanol 70% và các phân đoạn tương

Dung dịch thao tác phản ứng ABTS•+ được pha loãng từ dung dịch gốc trong đệm phosphate 7.4

Tất cả các mẫu thử đều được pha loãng đến nồng độ thích hợp Sau đó, 20 µL dung dịch mẫu thử được trộn với 980 µL dung dịch thao tác Hỗn hợp này được ủ tại nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ánh sáng của hỗn hợp này tại bước sóng 734 nm

Khả năng quét gốc tự do (SA) được tính theo công thức:

SA (%) = 100 x (A chứng – A thử) / A chứng

Trong đó:

A : mật độ quang

Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính IC50

Trolox được sử dụng làm chất chứng dương

2.2.4 Xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu của Microsoft Excel và Graphpad Prism

Kết quả thí nghiệm được biểu thị dưới dạng M ± SD Sử dụng phương pháp nội suy tuyến tính để tính giá trị IC50 trong thí nghiệm đánh

giá khả năng quét gốc tự do DPPH và ABTS [10]