TỔNG QUAN vể các PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHẤT CHỐNG OXY hóa

Tới nay,nhiều trường Đại Học, Viện nghiên cứu đã triển khai ứng dụng các phươngphẩp nghỉên cứu, định ỉuợng gốc tự do và cẩc chất chống oxy hoá trong sỉnhhọc và y dược học.. ì333- Vai trò

Bộ Y TÊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

BOCỐ CSBO Et)C3

TỔNG QUAN VỂ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

CHẤT CHỐNG OXY HÓA

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA: 2003 - 2008)

- Người hướng dẫn : PGS.TS Lé Thành Phước

ThS Lê Đình Quang

- Nơi thực hỉện : Bọ mòn Hỏa Đạị Cương-Vồ Cơ

- Thời gian thực hiện

HÀ NÔI - 5/2008

Ẩiờ') tUẢJi (ỷf(

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Thầy giáo-Tiến sỹ Lê ThảnhPhước và Thầy giáo-Thạc sỹ Lê Đinh Quang, đã tận tình hướng dân tôi hoàn

thành khoá luận này

Đồng thời tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, các cô, cácanh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn; Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các

cô, chú trong thư viện ĐH Dược HN; thư viện Quổc Gia; thư viện khoa học kỹthuật, đã tạo diều kiện giúp đỡ tôi tìm những tài liệu quý giá trong quá trìnhlàm luận văn Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Đảng Uỷ nhà trường, các thầy

cô giáo đã tạo điều kiện cho tôi thoả sức học tập trong môi trường tốt nhất, và

cho tôi những bài giảng quý báu trong cả khoá học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè tôi,những người dã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt 5

GR : Glutathion reductaseGSÍTglutathionGSHPx:Glutathion peroxydaseNAD = Nicotinamid Adcnin DinuclcotidNADPH^Dihydronicotinamide adenine đinucieoũd phosphat

Oxh: Oxy hoáOxh-kh: Oxy hoá khửTAS: Total Antioxidant StatusTRAP: Total peroxy radical trapping antioxydanl parameter assay

1,1.2.1- Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể 3

1.1.2.3- Từ các phản ứng tạo gđc khác trong cơ thể 5

1.2.3- Cấc phối tử tạo phức khoá các ion kim loại 81.3- Các châ't có hoạt tĩnh chống oxy hoá trong tự nhiên 9

2121

22

222323

2.1.3.3- Phương pháp đo điện thế

2.1.3.4- Phương pháp chuẩn dô bằng 2,6'diclophcnolindophenol

2.1.3.5- Phương pháp oxy hoá khử theo DĐVN III

2.1.4- Selen

2. ] .4 í - Phương pháp phân tích khối lượng

2.1.4.2- Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-V1S

2.1.4.3- Phương pháp huỳnh quang

2.1.4.4- Phương pháp cực phổ

2.1.4.5- Phương pháp kích hoạt phóng xạ

2.1.5- Curcumin2.1.5.1“ Phương pháp sắc kỹ

2 ] 5.2- Phương pháp quang phổ

2.2- Các phương phấp đo gián tiếp các chất chống oxy hoá

2.2.1- Phương pháp cộng hương lừ điện lử (NMR) Yầ bẫy gốc (ESR)23

2.2.2.3- Đo MDA-các chất phản ứng được với acid thiobarbituric 26

2.2.2.4- Đo các aldehyd khác MDA

2.2.2.5- Đo các dien liên hợp

2.2.3- Đo những tổn thương của protein

2.2.4- Đơ các tổn thương của AND

2.2.4.1= Phương pháp điện di gel đơn tế bầo

(phương pháp comet, phương pháp "sao chổi")

2.2.4.2- Định lượng trực tiếp 8-oxo-đeoxyguanosin trong ADN

bằngHPLC2.2.5- Đo hoạt tính enzyme supeoxid đixmutase (SOD)

2.2.6- Đo các chất chống peroxide GSH và GSHPx

2.2,6.1- Xác định GSHPx theo phương pháp đo quang của

H.V.Bergmeyer2.2.Ó.2- Xác định GSHPx theo phương pháp của Paglỉa

vầ Valẽntihê

272727282829293030

31

2.2.6.3“ Định lượng GSH bằng phương pháp so màu 31

2.3- Định lượng hoạt tính chống oxy hoá toàn phần 33

ĐẶT VẤN ĐỂ

Đầu những năm 90 cửa thế kỷ qua, gốc lự do của oxy, các dạng oxy

hoạt động vầ cấc chất chống axy hoấ được đc cập nhiều trong các ngành y

sinh dược

Chất ctrếng chống oxy hoá íà những chất có thể phản ứng trực tiếp loại

bỏ các gốc tự do của oxy; hoặc vào cơ thể làm tăng vai trò hoạt động của cácchất chống oxy hoá khác Cho đến nay, các chất chống oxy hoá ngày càngđược nghiên cứu sử dụng làm thuốc dự phòng và điều trị các bệnh tim mạch,ling thư, lão heấ gốp phần bầõ vệ sức khoề, kcỡ dlìị tuổi thọ côn người

Để đánh giá ảnh hưởng của các tác nhân gầy bệnh, hiệu quả của thuốc

dự phòng và điều trị các bệnh trên, người ta thường dựa vào các chỉ tiêu xácđịnh gốc tự do và chất chống oxy hoá Do đó, phương pháp định lượng vàđánh giá hoạt tính sinh học các chất chống oxy hoá rất quan trọng Tới nay,nhiều trường Đại Học, Viện nghiên cứu đã triển khai ứng dụng các phươngphẩp nghỉên cứu, định ỉuợng gốc tự do và cẩc chất chống oxy hoá trong sỉnhhọc và y dược học Để có một cách nhìn hệ thống và toàn cảnh về các phương

pháp định lượng này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tong quan về các phương

pháp định lượng các chất chống oxy hoá” với hai mục tiêu:

1 Viết được tổng quan vê gốc tự do và các hệ chất chống oxy htìá

trong cơ thể, trong tự nhiên.

2 Hệ thông hoá được nguyên tắc của các phương pháp định lượng cức

chất cố hoạt tính chống oxy hoá.

1

PHẦN 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CHẤT CHốNG OXY HOÁ VÀ CÁC HỆ

CHẤT CHỐNG OXY HOẨ TRONG CO THỂTrong những năm gần đây, người ta đề cập nhiều đến gốc tự do^cácchất chống oxy hoá, Gốc tự do là những chất độc hại được sinh ra trong trongquá trình chuyển hoá ở trong cơ thế (gọi là gốc tự do nội sinh) hoặc có thể docác gốc tự do ở ngoài môi trường xâm nhập vào cơ thể (gọi là gốc tự do ngoạisinh) Gốc tự do nội sinh ở trong cơ thể hình thành từ: chuỗi hô hấp tế bàotrong ty thể, quá trình peroxyd hoá lipid (peroxydlipid = POL), từ các phản

ứng tạo gốc khác trong cơ thể Gốc tu do ngoại sinh do các gốc tự do ở ngoài

môi trường xâm nhập vào cơ thể hoặc do tác động cua mối trường như: do cáctia phóng xạ, các bức xạ, đo ô nhiêm môi trường (ngoại môi) gây ô nhiễm cơthể (nội môi) như ỉà: các hoá chất phi sinh học- thuốc trừ sâu, diệt cỏ,blcomycìn, các kim loại nặng, vi khuẩn, virus

Các chất oxy hoá đó có khả năng oxy hoá cao, phát sinh những phản ứng

dậy chuyền làm tổn hại đến tếhàOi lổ chức, gây ra nhiều loại bệnh tậi vầ lầm

tăng quá trình lão hoá của con người Gốc tự do oxy hoá gây ra các loại bệnh

ở một số cơ quan như: tim mạch- gây xơ vừa động mạch dẫn đến hậu quả nhồimáu cơ tim, suy tim, huyết áp cao, thiếu máu thận, suy gan, thiểu năng tuầnhoàn não; trong nhãn khoa- thoái hoá võng mạc, thoái hoá điểm vàng, đục

thuỷ tinh thể, các loại viêm ở mắt; bệnh tiểu đường; ung thư.

3Ò2+~e = Òĩ (I)

1 ì 2,1-Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể

Từ chuỗi hô hấp tế bào có 4 gốc tự do được hình thành là Q ~, 'Oz,

‘OH, H2OJ Nguyên nhân là 302 được tạo ra từ chuỗi vận chuyển hydro vàelectron:

không khí(oxy tam bội)

Xúc tác bởi: Các enzym vận chuyển hydro (Dehydrogenase) là NAD,

FAD, FMN; và các enzym vận chuyển electron (phức Fe2+, Fe3+)

Sau đó, phân tử 302 nhận từng electron:

Phản ứng tổng:

+ 4e + 4H+ = 2H70 + Năng lượng

Do rò rỉ, thẩm lậu, tự huỷ giữa các gốc:

Tốc độ phản ứng Penton » phản ứng Haber- weiss

Từ 6 phản ứng trên dây, xuất hiện 4 chất độc hại:

02 gốc xuất hiện đẩu tiên trong hô hấp tế bào, khỏng quá độc, nhưng

khơi mào cho các phản ứng sinh gốc khác

OH* là gốc nguy hiểm nhất (gốc đơn giản, khối lượng nhỏ, hoạt tínhmạnh)

H202 là phân tứ oxy hoố- khử mạnh, rất độc hại

l02 phân tử năng lượng cao, nguy hiểm

4 tiểu phân này gọi chung là các dạng oxỵ hoạt động đầu tiên (OXHĐ)

1.1.2.2- Từ quá trình peroxyd hoâ lipid (peroxydỉipid = POL)

Sơ đổ quá trình POL có thể tóm lược như sau;

Dồn đến phân cắt LH (như acid arachidonic); Hoạc dập tát phản ứng (7)

L* + R* L-R

(8)

Ngoài ra, còn có mạch đổng ly tiếp theo do peroxyd hoạt tính cao, tạo

phản ứng sinh gốc vượt qua màng:

L00*

gốc lipoperoxyđ

gốc hydroxydOOH*

Các gốc này lại đóng vai trò R' ban đầu khơi mào lại phản ứng đây chuyền

(7)

Chuỗi phản ứng (7), (8), (9) làm phá vỡ màng sinh học

1.123- Từ các phản ứng tạo gốc khắc trong cơ thể

R* +H 2 O -^RH + OH*(70 % cơ thể)

OH * tham gia vào quá trình PQL hoặc tham gia phản ứng:

H2N,

R' I + OH*-> R|-OH (10)Dẩn đến Hydroxyl hoá

+■ NO

NADPH L-Citrulin

Gốc NO1 sinh ra trong nội mạc mạch máu (gây giãn mạch) và trong

mọi tế bào (gây các chức năng khác )

> sản xuất năng lượng ATP

> Bảo vệ (tiêu huỷ virus; vi khuẩn; ký sinh trùng; các tế bào già, hỏng,

ung thư)

> Điều hoằ tính thấm các màng

Tuy nhiên, sự thẩm lậu, rò rỉ, dư thừa R* khỏi các quá trình hữu ích là

mặt trái gây nguy hại cho cơ thể

ỉ.1.4- Tác hai của gốc tự dơ [14]

Tất cả các phân tử sinh học đều có thế bị gốc tự do tấn công, nhưngphân lử lipid là dẻ nhất Màng tế bào rất giàu các acìd béo chưa no, là nhữngphân tử dễ bị cẩc gốc cố tinh oxy hoá tấn công Sự huỷ hoại cấu truc của Gẩcacid béo chưa no chính là quá trình pcroxidc hoá lipid (POL), sinh ra các gốcmới: L*„ LOO* .Bản thân các gốc LOO* có thể chuyển dịch điện lử tạo racác peroxid nội và phân huy thành những mảnh có số nguyên tử cacbon ngắnhơn, ở dạng andehyd độc hại như: hydroxynonenal, malonyldiandchyd, hoặceĩan, pcntan Quá trình phân huỷ này gây tiỗu huỷ màng tế bào, tạo ra các sảnphẩm aldehyđ độc hại Đây là mội kiểu gây lổn thương, viêm hoại lử dạc biệt

của phản ứng gốc íự do Quá trình này gán liền với tổn thương mô ở các bệnh

(như tổn thương gan do CC14, xơ vữa động mạch, tổn thương ở các khối u áctính )

Các ADN cũng bị các gốc có tính oxy hoá mạnh tấn công, khi gốc nàyhình thành ở gần sát phân tử ADN Những nucleobase tìm thấy ở trong nướctiểu của ngươi lơ bằng chứng có sư tấn công liên tục của các gốc tư do và phân

tử ADN Dù được sửa chữa với hiệu quả rất cao, một số tổn thương này vần cốthể được tích tụ lại, sau một thời gian lượng tích tụ lại đủ để dẫn tới đột biến

và từ đó mà sinh ra ung thư

1.2- Các hệ chất chống oxy hơá củii cơ thể [12]

Hê thống báo vệ của cơ thể bao gồm: enzym, các chất chòng oxỵ hoáphi enzym và phối tử tạo phức khoắ ion kim loại

1.2.1- Các enzym nội bào

Mn $0D (superoxyd dismustase chứa Mn/ ty thể) có tác dụng loại ọ2

nhưng lại sinh ra H202:

02- + Oj- + 2H- H202 + 02 ( I I )

- CuZn SOD (superoxyd dismustase chứa Cu, Zn/ bào tương) loại 02 lừ

ty thể thoát ra bào tương

Phản ứng (11) có hằng số vận tốc rất lớn K = lử5 lit.moỉ I.S_I do cổ xúctác SOD (tốc độ phán ứng tăng lên hàng triệu lần)

= Catalase (Fe3+) tác dụng khi [H2OJ > LO'8 mol/1:

LOOH 4- 2GSH GSHPi LOH + GSSG + 2HzO (14)Hằng số tốc độ của phản ứng này là K=10B M/s Với khả năng toại bỏcao như vậy rtôn khi cơ thể giàu lượng GSH, hoạt độ enzym GSHPx cao thìcác pcroxid lịpid bị chuyển hoàn toàn về acid béo ban đầu Như vậy trong hệthống chống peroxid có hai chất chống oxy hoá quan trọng là GSH và GSHPx

1.2.2- Các chất phi enzym phân tử nhỏ (bẩy gốc tự do)

- Các chất chống oxh của cơ thể thuộc nhóm này (nằm trên màng tế bào) bao

gồm: vitamin E (a - tocoíerol), (3 - caroten, vỉtamin A, cocnzym QI(J

7

-to- Ị3- caroten + Nhiệt vó hại thoất ra

1.2.3- Các phôi tử tạo phức khoá các ion kim loai

Các ion kim loại nặng như Fe2+, Fe'\ Cu+, Cu2\ có kha năng làm xúctác các phản ứng tạo ra các gốc tự do Trong cơ thể có một số phối tử có khảnăng tạo phức với ion kìm loại nầy, làm mất khả nàng xúc tác đó Các chất tácdụng theo cơ chế này là :

- Trạnsfẹrm ( prọíẹịn vận chuyển Fe 3 7 huyết tượng)

- Lactoíerin c phức Fe2+/ trong địch (sữa nước mắt, nước mũi))

" Feritin ( phức dự trữ Fe/ bào tương)

- Ceruloplasmin; protein chứa Cu dạng phức bền, oxy hoá Fe2+ —»

1,3- Các chất có hoạt tính chống oxy hoá trong tự nhiên

1.3.1- Vitamin E - alpha- tocopherol [6]

OH QH

V^oCHỌH1

cà chua, khoai tây Trong động vật chỉ có một lượng rất nhỏ

13.23- Vai trò

Vitamin c tham gia vào nhiều quá trình chuyển hoá của cơ thể Ví dụ:

- Tham gia tạo colagen và một số thành phần khác tạo nên mồ liên kết ởxương, răng, mạch máu Do đó nếu thiếu vitamin c, thành mạch máu không

bền gây ehảỹ máu chân răng hơặe màng xương, sưng nướu rang, răng dễ

rụng

- Xúc tác cho quá trình chuyển Fe3+ thành Fe2+ nên giúp hấp thu sắt ở tátràng (vì chỉ có Fe2+ mới được hấp thu) Vì vậy, nếu thiếu vitamin c sẽ gâythiếu máu do thiếu sắt

- Chống oxy hoá bằng cách trung hoà các gốc tự do sản sinh ra từ cácphẳn ứng chuyến hoấ, nhờ cỉỗ bẳo vệ được tính toản vẹn của màng tế bào (kếthợp với vitamin A và E)

Ỉ1

ì333- Vai trò:

- Các dần chất AavorìOiđ có khả năng đập tất các gốc tự đo như HO*,ROO', Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra

cạnh AND thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, huỷ hoại

tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá,

- Tạo phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc

tác của nhiểu phản ứng oxy hoá

- Báo vệ tế bào, ngăn ngừa các nguy cơ nhu xơ vữa động mạch, tai biến

- Curcumin có khả năng loại bỏ gốc tự do và các loại men gây ung Ihư

có trong thức ăn, nước uống Nó giup cơ thể vừa phòng ngừa vừa chống ungthư một cách tích cực [33] Curcumin còn cổ khả năng kháng nấm, khángkhuẩn rất cao, nó cổ thể chặt đứt một trong các mắt xích của quá trình nhiễm

HIV Ngoài ra, nó còn có thể giải độc và bảo vệ tế bào gan, làm lãng hồngcẩu, hạ mỡ máu, trị trứng cá và giảm rụng tóc Nó là chất chống viêm vàchống oxy hoá điển hình [34].

- Vẻ mặt sinh học /?-caroten là tiền chất quan trọng nhất của vitamin

A /í-caroten được sủ dụng như viamin A, nhưng không gay tích íuỹ độc

- /?-caroten còn có tác đụng chống oxy hoá, ngăn ngừa ung thư

- Trong cồng nghiệp thực phẩm /?-caroten dược dùng làm phẩmmàu

1.3.6- Lycopen [16]

ỉ 3.6.2- Nguồn gấc

Là một chất có trong thành phẩn của dầu gấc, xoài, cà chua, cà rốt

13.63- Vai trò

- Lycopen là một chất có hoạt tính chống oxy hoá mạnh

- Có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ung Ihư, đặc

biệt là ung thư tuyến tiền liệt

- Lycopcn còn được sử dụng như một chất màu thực phẩm

13

Ngoài ra, còn có một số các nguyên tố vi lượng, dược liệu và các chếphẩm từ dược liệu có hoạt tính chống oxỵ hoấ như selen hữu cơ (trong nấmmen bia, cây xấu hổ, nhàu ); Các họ hợp chất Bioílavonoid như:Ginkgoĩlavon, proanthocyanidin trong cây Bạch quâ (Ginkgo biloba);Proanthocyanỉđin trong đỉch chỉết pycnogenoỉ từ vỗ cầy thổng, nho; Ruiin

trong hoa hoè; Polyphenol thuộc catechin trong chè xanh; Plavonoid trong

nhân trần; Allicin trong tỏi

PHẦN 2: NGUYÊN TẮC CỬA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁCCHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHốNG OXY HOÁ

Các chất chống oxy hoấ trong tự nhiên đã được phát hiện và sử dụng từrất lâu Một số chất đã được chiết xuất từ thiên nhiên ở dạng tinh khiết Một sốchất lại được bán tổng hợp từ các hợp chất hoá học Cấu trúc, tính chất, cácphương pháp định tính, định lượng của các chất này đã được xác định khá rõ

và được ghi trong hầu hết các dược điển và bách khoa toàn thư Tuy nhiên,còn rất nhiều các chất chống oxy hoá khác chưa được biết đến Tính chất vàkhả năng chống oxỵ hoá chưa được nghiên cứu đầỵ đủ Việc chiết tách vàphân lập các chất này không phải lúc nào cũng thực hiện được Quá trình địnhlượng chúng gặp rất nhiều khó khãn Trong trường hợp đổ, các nhà dược họcthường định lượng hoạt tính sinh học của chúng một cách gián tiếp qua hệenzyme hoặc các chỉ số sinh hoá Do vậy, định lượng các chất chống oxỵ hoá

và hoạt tính sinh học của nó thường sử dụng 3 phương pháp lớn là: Định lượngtrực tịếp có sử dung các phương pháp vật Ịỷ hóa học, và hoá Ịỷ (phượng phápnày áp dụng cho các chất đã phân lạp); phương pháp đo gián tiếp qua hoạt tínhenzyme và chỉ số sinh hoá; và phương pháp đo tổng hoạt tính chống oxy hoấ

2.1- Định lượng trực tiếp -sử dụng các phương pháp hoá lý

2.1.1- a - Tocoferol [17] [30] [36] [41] [42]

2.1.1.1- Phương pháp đọ quang

Các a -tocoferol (AT) có phổ hâp thụ đặc hiệu trong vùng tử ngoại Phổ

của tất cả các AT đã dược R.R.Riđge-way và W.J.Cuthberlson vàJ.D.Drummond nghiên cứu và xác định AT có cực đại hấp thụ đạc trưng ởvùng 258-300 nm Phương pháp đo bảng quang phổ có thể dùng để định tính

và định lượng các tơcoíerol trong các chế phẩm dược chế tạo từ tocoĩerol tônghợp, vì vậy phổ hấp thụ tử ngoại của ÀT và họ chất acetat của nó đã dược đưavào dược điển; AT có sóng cực đại (trong etanoỉ) ở 294 nm

15

M.Koĩlcrcũng dùng phương pháp quang phổ để định lượng AT trong máu.

2.1.1.2- Phương pháp cực phổ

Phương pháp đo bằng cực phổ các tocolerol đã được L.TSmith,

I.M.Kollhoff và S.WâW20flek bàn tới trong một số eông trình từ nầm

dã dùng chất đệm gồm anilin 0,1 M và acid pecloric trong methanol 50% làmchất nền AT bị oxh tại anot thành quinol tương ứng Quá trình oxh của điệncực khống thuận nghịch trên sẽ dẫn đến sự mở vòng croman Một số các tácgiả khác đã dùng phương pháp cực phổ để xác định các tocoĩeryl quinol tươngứng bàng cách oxh tocoferol trong môi trường cồn bằng sắt (III) clorua.Phứỡng phấp cực phố tiến hành trong dung dịch dệm anilin-acid pccloric cốpH= 6,24 (0,025 M) với Ethanol 75% Đó là một quá trình điện cực trao đổihai điện tử thuân nghịch, trong đó tocoĩeryl quinol đươc khử thànhhydroquinol tương ứng Ung dụng phương pháp cực phổ vào thực tế, các tácgiả đã so sánh những dẫn xuất khác nhau của croman và cumaran trong khuônkhổ nghiên cứu các hợp chất dị vồng

Phương pháp đo bằng cực phổ tương đối công phu, nhung rất đặc trưng vìcho phép ta xác định được từng chất nhất định qua điện thế oxy hoá khử của

nó Tuy nhiên ta không thể phân biệt được quinon của p và y tocoterol bằng

cực phổ vì thế bán sóng oxy hoá khử của chúng gần nhau

2.1.1.3- Chuẩn độ ampe

L.I.Smith, I.M.Kolthff và LT.Spillane đã đưa ra phương pháp địnhlượng AT dựa trên sự biến đổi thế năng theo lượng dung dịch chuẩn độ oxhcho vào để oxh AT Điểm tương dương trong phép định lượng được xác địnhbằng giao điểm của hai đường coi như sự thay đổi dòng điện trước và sauđiểm tương đương,

Các tác giả đã sử dụng vàng clorua làm dung dịch chuẩn độ oxh Việcdinh lượng được tiến hành trọng mội trường đệm benzgat pH=4ị2: Trọng môi

hợp nhất cho định lượng là í 10'' đến 3.10 lM Sai số của phương pháp là

±0,3% Như vậy, với độ chính xác này chỉ có thổ tiến hành định lượng đượcdung dịch tương đối tỉnh khiết, ví đụ trong chế phẩm được dụng

Cách tiến hành: Cho dung dịch tocoíerol đã xử lý tới nồng độ thích hợp trong

môi trường đệm benzoat vào bình định lượng, sục khí trơ vào rồi nhỏ dungdịch chuẩn độ từ buret xuống Điện thế điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt bắt đẩu từ-0,075V (Điện cực calomen chuẩti-SKE) Sau mỗi lần nhỏ, khuấy dung dịchbằng luồng khí trơ và đọc độ lệch của điện kế

Để xác định điểm tương đương ta ghi trên đồ thị những giá trị dòngđiện, hiểu thị bằng mm độ lệch của điện kế tương ứng với môi ml thuốc thửoxh cho vào sau khi đã khuấy đều Giá trị điểm tương đương xác dinh ở giaođiểm của 2 đường thẳng

2,ỉ.1.4- Phương pháp sắc ký

Sắc ký cột được dùng đổ tách các tocoferol tinh khiết của chất có trongthiên nhiên và để loại những thành phẩn cản trở khi định lượng M.Koficr đãghi tất cả những loại phương pháp sắc ký khác nhau dùng để tinh chế, cácdịch tocoferol đậm đặc và sắc ký cột được tiến hành trước mỗi lần định lươngchất liệu thiên nhiên Nhôm oxid hoạt tính yếu được dùng làm chất hấp phụ,chất này được xử lý bằng cách trộn nhôm oxid đã làm mất hoạt tính bằngnước với nhôm oxid đã được nung Cột hấp phụ có chiều dàỉ iOcm và đưdng

kính lem Đung dị ch eủa phần dầu không M phòng hoầ eố chúa Í0£9feĩ0l

được chuyển vào cột có sấn ete dâu hoâ Tocolerol được giữ lại trên cột, còncarotenoiđ thì đi qua cột Dùng benzen để phản hấp phụ tocoíerol Bằng cáchdơn giản này đã loại được carotenoid là chất có thể gây trở ngại trong phươngpháp oxh cũng như trong phương pháp Furter-Meycr sẽ được bàn đến sau này.Sắc ký trên nhòm oxid có thể tách được hết các tocoíeryl quinon ra khỏi các

toooícrol đơn dộc Quinon được hấp phụ mạnh vầ có thể giẫi phóng trước tiên

bàng metanol Theo quan sát của Kofler thì ổ -tocoíerol được

17

nhất trên nhôm oxid và qua sự phản hấp phụ nó bị mất đi khá nhiều, tiếp theo

là ỵ và /ỉ-tocoferol, còn yếu nhất là AT kết hợp Có thể giảm bớt sự hao hụt

tocoíerol do oxy hoá bằng cách xử lý đất sét bằng thiếc (II) clorua

F.Brown đẫ đứa ra phướng pháp sắc ký phân chìa tocoferoỉ trên giấy.Dùng dung dịch vaselin 2,5% làm dung môi chạy sắc ký, phát hiện bằng dungdịch sắt(III) clorua và ơ,or dipyridyl Giá trị R ; của AT ỉà 0,5; của p và Ỵ-

tocoferol là 0,72 và của s -tocoferol là 0,84.

2.1.1.5- Phương pháp so màu theo M.Furter và RMeyer.

Phương pháp đo màu của Furter và R.Meyr là phương pháp được dùngnhiều nhất Cách định lượng này dựa trên sự đo cường độ màu da cam sinh ra

do tác dụng của acid nitric đậm đặc trên dung dịch tocoferol trong cồn Phản

ứng này đặc trưng và có thể dùng để định lượng tocoferol trong dầu thực vật

cổ chứa khoảng lOOmg tocoferol Người ta dùng phản ứng này có kết quả khi

khảo sát tocoferol trong dầu mầm, hạt Phương pháp này có thể dịnh lượng AT

trong hỗn hợp và tổng số hàm lượng các tocoleroỉ khác (fi,y và ồ tocoícrol)

dựa trên diễn biến khác nhau của các phản ứng màu kể trên trong môi trườngethanol và chioroíorm Trong môi trường chloroform, AT không tác dụngnhưng trái lại, các tocoferol khác thì lại phản ứng được Từ sự khác nhau về

mật đô quang ờ bước sóng khoảng 500 nm (quang kế Pulfrich thì dùng kính

lọc S50) ta có thể định lượng được AT

2.11,6- Định lương tơcoýeroĩ bỗng huỳnh quang theo M.Koỷỉer

Việc định lượng dựa trên sư đo cường độ huỳnh quang của sản phẩmngưng tụ của o-tocoferyl quinon với o-phenỵlenđiamin Sự ngưng tụ xảy ra

nhanh nhất và hoàn toàn đối với a -tocoferyỉ quinon; /ỉ-tocoferyl quinon tác

dụng chậm và cường độ huỳnh quang đo được chỉ bằng một nửa so với dẫn

chất củâ AT Sự chiiyển ỵ và 1- Íôcõíêrôỉ thanh đần chất phãhẳzifi không

phải là dễ dàng Người ta đã ước định dược rằng tác dụng sình học của từng

tocofero] tương ứng với cường độ huỳnh quang của chúng Phương pháp này

có ưu điểm lán ỉà nhạy và có tính dặc trung 1 micro gam tocoíerol trong 5ml

đã cho ta một huỳnh quang có thổ nhìn rõ được Phương pháp này có thể dùng

để định lượng AT trang eấe hợp ehấí thiên nhiên vầ định lượng ĩoeofc-rol trang

máu, để theo dõi mức đô thay đổi tocoíerol trong máu của bệnh nhân xơ cứngđộng mạch

Nguyên tắc của phương pháp: Chất cần thử được xà phòng hoá, phần

khồng xà phòng hoá được chiết bằng ete dầu hoả và cặn có chứa locolerol saukhi bốc hơi cte đẩu hoả sẽ được oxy hoá trong môi trường cthanol bằng ạcidnỉirỉc Theo cách này ihì iocoferoỉ sẽ chuyến thành o-qutnon, chất nãy ngừng

tu với o-phenylcndiamin trong môi trường acid acetic kết tinh và cho dẫn chấtphenazin Dân chất phenazin được tách ra khỏi các chất không cần thiết khácbằng sắc ký cột nhôm oxid Sau khi chuyển vào methanol, đo cường độ huỳnh

quang xanh vàng Xác định kết quả dựa theo đường chuẩn xây dựng từ dl-

a-tocoferol tổng hợp được dùng làm chất mẫu

2.1 J 7 - Đinh lượng tocoịerol hằng phương pháp oxy hoá khử theo M.Koýỉer

Tocoferol ỉà chất dẻ bị oxh, cho nên cứ thể định lượng bằng phươngpháp oxy hoá khư Nhiều tác giả khác nhau đã dùng hàng loại các chất để làmthuốc thử oxh Một trong những phương pháp đẩu tiên định lượng tocoíerol đãđược P.Karrer và H.Keller nghiên cứu, dựa trên cách định lượng bàng do điệnthế các dung dịch tocoferol trong cồn bằng vàng cỉorua Tuy nhiên, việc địnhlượng rất lâu, vì điện thế ổn định rất chậm Một số dược điển nước ngoài đãgiới thiệu cách định lượng bằng oxh, dùng các muối suníat làm dung dịch oxhchuẩn và diphenyỉamin làm chỉ thị L Smíth, I.Kolthoff và Spillan đề nghịđịnh lượng bàng dung dịch bạc nitrat trong amoniac

I.Scuđi và R.Bush đã oxy hoá tocoíerol bằng vàng clorua, tách qulnon ra

và sau khi chuyển thành hydm qui non lại oxy hoá bằng 2,6 điclorophcnolindophenol A.Emmerie và Ch.Engel đã dùng thuốc thử oxy hơá là sắt (III)clorua Hợp chất sắt (II) sinh ra tác dụng với đipyridin tạo ra một phức chất

19