TCGCTGCGTTCTTCATCGATGCAAGAACCAAAAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAAGTAA TAATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGC CCACCGCCAAAGCAAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGC
Trang 1B GIÁO D C VÀ ÀO T O B Y T
VI N S T RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG NG
-* -TH C TR NG NHI M N M PH I B NH NHÂN
HIV/AIDS, LAO PH I VÀ HI U QU I U TR C HI U
T I CÁC B NH VI N T NH NGH AN (2013-2014)
Chuyên ngành: Ký sinh trùng và Côn trùng y h c
Mã s : 62.72.01.16
TÓM T T LU N ÁN TI N S Y H C
HÀ N I, 2015
VI N S T RÉT-KÝ SINH TRÙNG-CÔN TRÙNG TRUNG
NG
Ng i h ng d n khoa h c:
1 TS.
2 PGS.TS.
Ph n bi n 1:
Ph n bi n 2:
Ph n bi n 3:
Lu n án s c b o v tr c H i ng ch m lu n án c p Vi n
t i Vi n S t rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TW vào h i gi , ngày tháng n m
Có th tìm hi u lu n v n t i:
1 Th vi n Qu c gia
2 Th vi n Vi n S t rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ng
Trang 2DANH M C CÁC T VI T T T
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (H i ch ng suy gi m
mi n d ch m c ph i)
HIV Human Immunodeficiency Virus (vi rút gây suy gi m mi n
d ch ng i)
NXB Nhà xu t b n
PCR Polymerase Chairn Reaction (Ph n ng chu i Polymerase)
PV Preventive value (hi u qu can thi p)
TLM T l m c
TT Tình tr ng
XN Xét nghi m
YTNC Y u t nguy c
BV B nh vi n
T V N
B nh n m ph i ch y u do các loài Aspergillus spp và Candida spp B nh ph bi n các n c kém phát tri n nh : ông
Nam Á, Châu Phi các n c có i u ki n v sinh kém, môi tr ng
s ng ch t ch i, m t, t l m c t 5 -10%, có n i > 10% dân s
B nh th ng g p ng i có h i ch ng suy gi m mi n d ch và s
d ng các thu c c ch mi n d ch dài ngày, ng i nhi m HIV/AIDS vì v y vi c phòng b nh và i u tr h t s c khó kh n và
ph c t p
T i Ngh An, cho n nay ch a có m t công trình nghiên
c u nào v b nh n m ph i, nh ng các y u t nguy c (YTNC) m c
b nh n m ph i r t cao t i c ng ng V i nh ng lý do trên tài:
Th c tr ng nhi m n m ph i b nh nhân HIV/AIDS, lao ph i và hi u
qu i u tr c hi u t i các b nh vi n t nh Ngh An (2013-2014), ã
c th c hi n nh m các m c tiêu nghiên c u sau:
1 Xác nh th c tr ng nhi m n m ph i b nh nhân HIV/AIDS t i B nh vi n H u ngh a khoa, b nh nhân lao ph i t i
B nh vi n Lao và Các b nh ph i t nh Ngh An (2013 -2014).
2 ánh giá hi u qu i u tr c hi u nhi m n m ph i b ng Fluconazol và Amphotericin B.
tài g m 112 trang: t v n 2 trang; T ng quan tài li u 31 trang; i t ng và ph ng pháp nghiên c u 21 trang; K t qu nghiên
c u 30 trang; Bàn lu n 26 trang; K t lu n 2 trang; Ki n ngh 1 trang
G m: 20 b ng s li u và 21 hình, 12 ph l c
CH NG I:
T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Khái ni m v n m y h c
N m (fungi) là nh ng sinh v t có nhân và thành t bào th c
s , d d ng (heterotrophic), sinh s n b ng bào t T bào n m không
có di p l c t , không có kh n ng di chuy n do có thành và vách t bào N m phân b r ng rãi trong t nhiên, ph n l n s ng ho i sinh trong t, s ít có kh n ng ký sinh gây b nh cho ng i và ng v t
N m y h c (Medical mycology) nghiên c u n m ký sinh
ng i, nghiên c u v sinh b nh h c Hi n nay, các nhà khoa h c trong và ngoài n c u th ng nh t phân chia các n m thành hai
nhóm chính là: Nhóm 1: N m da và n m ngo i biên; Nhóm 2: N m
n i t ng nh n m máu, n m ph i, n m d ch não t y Ngoài ra còn
có m t s cách phân lo i b nh n m b ng t n th ng lâm sàng và v
Trang 3trí ký sinh, nh : N m da niêm m c, n m tóc, n m ph i, n m sinh d c,
n m tiêu hóa, n m máu
1.2 S l c l ch s nghiên c u b nh n m ph i
1.2.1 Trên th gi i
B nh n m ã c bi t n t lâu, ngay t th i Hypocrat ã
mô t các tri u ch ng b nh do n m da gây nên, các hi u bi t v sinh,
b nh h c v n m h t s c s khai Cu i th k 20, u th k 21, cùng
v i s phát tri n v t b c v khoa h c k thu t, các nhà khoa h c trên
th gi i ã nghiên c u v nhi u l nh v c chuyên sâu v n m nh : K
thu t mi n d ch, k thu t PCR, mi n d ch h c ã b sung kho tàng
ki n th c h t s c sâu s c v c n nguyên gây b nh n m ph i
Argunov D.A và CS (2015), ã tìm ra c ch nhi m n m
Aspergillus spp Barrs V.R và CS (2014), nghiên c u phát hi n n m
Aspergillus spp b ng k thu t mi n d ch kháng nguyên kháng th
Barrs V.R và CS (2014), Dubey và CS (2015), phát hi n ra IL-1 và
IL-1 có kh n ng ng n ch n xâm nh p c a n m Aspergillus spp i
v i t bào hô h p Wei X và CS (2015), ng i s d ng các thu c c
ch mi n d ch dài ngày ã làm t ng kh n ng nhi m n m Aspergillus
fumigatus ng hô h p h n nh ng ng i không s d ng.Ozkan S.,
Cotts R.H.(2015), ã phát hi n ra c ch mi n d ch ch ng l i
Aspergillus fumigatus xâm nh p và gây b nh ng i,S.H Mirhendi
n m 2001, ã s d ng k thu t PCR v i gen m i ITS1 và ITS4, phát
hi n c 6 loài n m Candida spp Margit Hummel và CS (2004), ã
s d ng k thu t PCR l ng ch n oán A fumigatus K t qu
nghiên c u c a ông ã m ng cho các nhà khoa h c sau này s
d ng ph ng pháp PCR l ng phát hi n ADN c a A fumigatus
nh : Skladny và CS (1999), Becker và CS (2000), Loeffler và CS
(2002) Hi n nay, k t qu c a nhi u công trình nghiên c u các nhà
khoa h c ã cho th y c n nguyên ch y u gây n m ph i là
Aspergillus fumigatus và Candida albicans, ngoài ra b nh nhân
HIV/AIDS còn có th nhi m m t s loài khác
1.2.2 T i Vi t Nam
T i Vi t Nam, các công trình nghiên c u v n m ph i m i
ch xu t hi n t u th k 20 b i các nhà khoa h c Pháp và m t s ít
công trình c a ng i Vi t Vi c nghiên c u còn nhi u h n ch
n c ta, ngày nay các k thu t cao ã c ng d ng ngày càng
nhi u ch n oán nhi m n m ng i b nh c ng nh các s n ph m
nông nghi p, các ch ph m ông d c nh : K thu t PCR và gi i
trình t gen nh các nghiên c u c a ào Thi n v i nghiên c u mô hình hóa v i các lo i n m m c, Cao Bá L i, Nguy n Kh c L c và
Ng c Ánh ã s d ng các k thu t PCR v i gen m i là ITS1,
ITS4 v i Enzyme phân c t h n ch MSP I và gi i trình t gen nh
loài n m ng sinh s n, n m máu, n m d ch não t y
1.3 D ch t h c b nh n m ph i
Tác nhân gây b nh n m ph i th ng g p do Aspergillus spp, Histoplasma capsulatum, Candida spp, Cryptococcus spp nh ng ph
bi n nh t là b nh n m ph i do A fumigatus, A niger và C albicans.
Hình th c lây b nh có th do ti p xúc tr c ti p, có th theo
ng hô h p do hít th không khí có bào t n m N m Aspergilus
spp ch y u qua con ng hô h p do hít th không khí có bào t
n m Bình th ng trong không khí có nhi u bào t n m nh t là khu
v c ch n nuôi chim, v t, gà
Kh i c m th là ng i, th ng g p ng i nhi m HIV/AIDS, ái tháo ng, sau i u tr lao ph i, ng i s d ng Corticoid kéo dài, ng i có c u trúc ng hô h p b d d ng b t
th ng, ng i s ng trong môi tr ng m t ch t ch i m t v sinh, thi u ánh sáng m t tr i
1.4 Ch n oán nhi m n m ph i
- D a vào các tri u ch ng lâm sàng nh : Ho th ng ho ra máu khan, ho ra máu t i, s t, khó th , t c ng c Ti n s có ti p xúc v i y u t nguy c nh ch n nuôi gà v t, gia c m
- Xét nghi m nuôi c y n m trong môi tr ng Saboraud chon
l c, b nh ph m là d ch r a ph qu n, tìm th y các khu n l c n m ây
là tiêu chu n vàng ch n oán V i u n m ph i k t h p v i ch p X-quang có hình nh kh i u hình l c l c i n hình, không xâm l n
1.5 i u tr và phòng b nh n m ph i
1.5.1 i u tr
V i c i m c a t bào n m có thành vách ng n cách v i nhân và n m là loài d d ng vì v y các thu c i u tr r t khó xâm
nh p vào bên trong t bào n m Vi c i u tr ph i theo nguyên t c:
M t là: Ch i u tr khi xác nh rõ nguyên nhân gây b nh; Hai là:
i u tr tri t , ti t c n; Ba là: K t h p i u tr n i khoa và ngo i
khoa n u c n thi t
i v i t t c các b nh nhân n m ph i, tr c khi i u tr c n c n
c vào: K t qu kháng sinh ch n lo i thu c có tác d ng t t
nh t; Th tr ng c a ng i b nh, vì h u h t các lo i thu c kháng n m
Trang 4u r t c v i gan và th n, n u th tr ng ng i b nh quá g y y u thì
không th ch n Amphotericin B vì thu c này r t c và hay có tác
d ng ph
1.5.2 Phòng b nh n m ph i
Vi c phòng các b nh n m ph i c n tuân th nguyên t c sau:
- C t t m t trong các m t xích d ch t h c c a b nh: i u
tr tri t , ti t c n các ca b nh n m ph i Tránh l m d ng kháng
sinh, l m d ng Corticoid Kh c ph c các y u t b t l i không cho
n m phát tri n
- Ngoài các bi n pháp v y t n u trên, c n ph i h p ng b
các bi n pháp v xã h i h c nh : Giáo d c s c kh e, cung c p các
ki n th c c n thi t c b n v b nh n m ph i k c ph ng pháp
phòng b nh ch ng c a ng i dân Nâng cao n ng l c phát hi n
b nh cho các c s y t Nghiên c u sâu v các lo i thu c kháng n m
có hi u qu và hi u l c i u tr cao, ít c cho ng i s d ng
CH NG II:
I T NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U
2.1 i t ng, a i m, th i gian nghiên c u
2.1.1 i t ng nghiên c u: B nh nhân HIV/AIDS ang
i u tr t i B nh vi n H u ngh a khoa t nh Ngh An B nh nhân
i u tr lao ph i, xét nghi m BK (-) ang i u tr t i B nh vi n Lao
và các b nh ph i t nh Ngh An B nh nhân có k t qu nuôi c y n m
trong môi tr ng Sabouraud (+) Các m u b nh ph m n m ph i (+)
b ng ph ng pháp nuôi c y n m trong môi tr ng Sabouraud
2.1.1.1 Tiêu chu n ch n m u
- Tiêu chu n ch n m u b nh nhân HIV/AIDS: B nh
nhân có tên trong danh sách i u tr HIV/AIDS t i B nh vi n H u
ngh a khoa t nh Ngh An Có y các tiêu chu n ch n oán
c a m t b nh nhân HIV/AIDS , c th : V i b nh nhân nhi m HIV
ng i l n trên c s xét nghi m kháng th kháng HIV: M t ng i
c xác nh là nhi m HIV khi có m u huy t thanh d ng tính c
ba l n xét nghi m kháng th kháng HIV b ng ba lo i sinh ph m khác
nhau v i nguyên lý ph n ng và ph ng pháp chu n b kháng
nguyên khác nhau (theo quy nh c a B Y t ) Thông th ng nhi m
HIV d a vào các tiêu chu n ch n oán lâm sàng và c n lâm sàng
- Tiêu chu n ch n b nh nhân i u tr lao ph i có BK (-) t i
B nh vi n Lao và các b nh ph i t nh Ngh An: B nh nhân có các
tri u ch ng lâm sàng lao ph i i n hình nh : Ho, s t nh , s t v
chi u, g y y u sút cân ã lo i tr các c n nguyên nhi m khu n khác
nh : Ph c u khu n, viêm ph i mãn tính, viêm ph i thùy Xét nghi m BK (-), hi n ang i u tr b ng phác ch ng lao
- Tiêu chu n ch n oán b nh nhân nhi m n m ph i
Hi n nay, vi c xét nghi m ch n oán nhi m n m có r t nhi u
k thu t nh ng k thu t nuôi c y trong môi tr ng Sabouraud (+) v n
là tiêu chu n vàng Vì v y, trong tài c ng s d ng k thu t này
M t b nh nhân c ch n oán n m ph i khi có các i u
ki n sau: Có y tiêu chu n ch n oán là b nh nhân HIV/AIDS,
b nh nhân lao ph i có BK (-) Nuôi c y n m trong môi tr ng Sauboraud ch n l c, v i b nh ph m là d ch r a ph qu n mà (+)
2.1.1.3 Tiêu chu n lo i tr :
- i v i b nh nhân tham gia nghiên c u: B nh nhân
không t nguy n tham gia nghiên c u; Ng i m c b nh tâm th n,
ng i có c a d ng, b nh lý v tim m ch; Không ch n nh ng
b nh nhân quá y u (HIV/AIDS giai o n cu i cùng tiên l ng x u, không s c kh e n i soi l y d ch r a ph qu n, b nh nhân lao ph i
có BK (-) ã suy hô h p và tiên l ng x u n tính m ng) không th
l y d ch r a ph qu n c; Không ch n nh ng b nh nhân lao ph i
mà tr c ó có BK (+) ã c i u tr phác ch ng lao m t th i gian d n n BK (-)
- V i các m u n m nuôi c y trong môi tr ng Saboraud:
Lo i tr các m u n m t p nhi m n m trong không khí trong quá trình
v n chuy n, b o qu n m u
2.1.2 a i m nghiên c u
- Ch n b nh nhân t i B nh vi n H u ngh a khoa t nh
Ngh An, B nh vi n Lao và Các b nh ph i t nh Ngh An
- Nuôi c y n m: T i Labo vi sinh B nh vi n H u ngh a
khoa t nh Ngh An, là Labo t tiêu chu n an toàn sinh h c c p II
- Th c hi n k thu t PCR và gi i trình t gen nh danh loài n m: T i Labo công ngh cao Vi n Công ngh sinh h c, Vi n
Hàn lâm Khoa h c Vi t Nam
2.1.3 Th i gian nghiên c u
Nghiên c u c th c hi n trong 2 n m, t 2013 2014
2.2 Ph ng pháp nghiên c u
Nghiên c u c thi t k b ng 2 ph ng pháp: Nghiên c u
mô t có phân tích và nghiên c u th nghi m lâm sàng (th nghi m phác i u tr n m ph i i t ng nhi m n m ph i)
Trang 52.2.1 Ph ng pháp nghiên c u mô t có phân tích
C m u t i thi u cho i u tra c t ngang m t t l nhi m n m ph i
i t ng HIV/AIDS và i t ng i u tr lao ph i có BK (-) [7]
n = Z21 / 2 (1 2 )
d
p p
Trong ó:
n: C m u t i thi u; P: T l nhi m n m ph i c tính c a
qu n th , ch n p = 0,20 (theo Bùi Th Tám 1999, t l nhi m n m
ph i i t ng HIV/AIDS và b nh nhân lao có BK (-) dao ng
20,0%); Z1- /2: H s tin c y, ng v i tin c y 95% thì Z1- /2= 1,96;
d: Sai s tuy t i mong mu n c a p, ch n d = (0,05) 5%
V i các giá tr ã ch n, c m u tính toán cho m t nhóm i
t ng nghiên c u là 245, làm tròn 250, g m 250 b nh nhân
HIV/AIDS và 250 BN lao ph i có BK (-), t ng s 500 b nh nhân cho
c hai nhóm i t ng Trong th c t ã th c hi n c 501 m u
nghiên c u
Cách ch n m u
Ch n s b nh nhân có các tiêu chu n ch n oán, sao
cho c m u nghiên c u: 250 b nh nhân HIV/AIDS, 250 ng i
lao ph i có BK (-)
2.2.2 Ph ng pháp nghiên c u can thi p th nghi m lâm
sàng không i ch ng
- C m u nghiên c u : Toàn b s b nh nhân trong m u
nghiên c u mô t c t ngang, n u có nhi m n m ph i u c ch n vào
m u nghiên c u th nghi m lâm sàng
- Phác i u tr n m ph i:
+ Phác s d ng thu c Fluconazol: Áp d ng cho t t c
các b nh nhân nhi m n m ph i Li u s d ng Fluconazol, li u 150
mg/24 ngày x 14 ngày Thu c do Công ty Standa VN J,V, Co, Utd
s n xu t S lô 050213; Ngày s n xu t: 150213; H n s d ng:
150516 B o qu n n i khô ráo, trong kho ng 8 -24ºC
- Phác s d ng thu c Amphotericin B: Áp d ng cho
b nh nhân tái nhi m và b nh nhân i u tr phác 1 th t b i:
Amphotericin B, li u 0,7 mg/kg/24 gi x 14 ngày Thu c do Công ty
Cipla Ltd, India s n xu t S lô V30030 Ngày s n xu t: 01/2013;
H n s d ng: 12/2015 B o qu n n i khô ráo, trong kho ng 8 -24ºC
- V t li u nghiên c u: D ng c khám n i khoa, kính hi n
vi, lam kính, la men, máy n i soi l y d ch r a ph qu n, kính hi n
vi, t l nh, t m Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700 AB -Applied Biosystem, M ), máy ly tâm l nh Mikro 22R (Hettech, c), máy soi và ch p gel Dolphin Doc (Wealtec, M ), b i n
di, ng ng d ch r a ph qu n dung tích 30 ml B kít tách ADN
t ng s (QIAGEN, M ), gel agarose, dung d ch TBE 0.5%, dung
d ch Enzyme gi i h n MSP I (Fermentas) Dung d ch NaCL 8 và
các hóa ch t c n thi t khác Thu c i u tr Fluconazol, Amphotericin B; H s b nh án c a b nh nhân t i các b nh vi n; Labo vi sinh m
b o là labo an toàn sinh h c c p II
2.3 Các k thu t c s d ng trong nghiên c u
2.3.1 K thu t khám sàng l c b nh nhân
i v i b nh nhân HIV/AIDS, c n c k t qu khám lâm sàng ánh giá tình tr ng nhi m trùng c h i các c quan ph t ng B t
bu c ph i có k t qu 3 l n xét nghi m máu, nh l ng t bào TCD4
m b o ch c ch n là b nh nhân HIV/AIDS, có trong danh sách
i u tr HIV/AIDS b ng ARV i v i b nh nhân lao ph i có BK (-),
c n có y tiêu chu n ch n oán lao ph i, nh ng BK (-) ã lo i
tr h t các nguyên nhân khác gây b nh ph i C n k t h p v i khai thác b nh s
2.3.2 K thu t nuôi c y n m trong môi tr ng Sabouraud
- K thu t l y d ch r a ph qu n; K thu t nuôi c y n m trong môi tr ng Saboraud; K thu t PCR-RFLP v i gen m i là
ITS1-ITS4 và enzyem phân c t h n ch MSP I và gi i trình t gen
nh danh loài n m
D ng c : Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700 AB
-Applied Biosystem, M ), các máy móc thi t b v t t c n thi t khác
C p m i s d ng là IT1 và ITS4 ã c ch n t ng ng v i t ng loài n m
2.3.3 Ti n hành k thu t PCR
Theo quy trình c ak thu t PCR
2.3.4 Gi i trình t và x lí s li u
S n ph m PCR sau khi ki m tra c tinh s ch b ng ph ng pháp thôi gel (DNA elution) s d ng b kit AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Qu c) N u m u có 2 b ng DNA s n ph m PCR thì ti n hành thôi gel m i m t b ng DNA riêng r và thu t ng b ng gi i trình t
S n ph m PCR sau khi tinh s ch c gi i trình t tr c ti p, s d ng m i
Trang 6ITS1 Trình t các chu i nucleotide c x lý b ng các ph n m m chuyên
bi t, g m SeqEd1.03, AsemblyLIGNv1.9c và h ch ng trình
MacVector8.2 (Accelrys Inc) trên máy tính Macintosh So sánh i chi u và
x lý s li u các chu i thu nh n và Ngân hàng gen (Genbank) b ng ch ng
trình GENEDOC2.7 Trình t nucleotide vùng ITS c a các ch ng n m
Candida spp c so sánh thành ph n nucleotide, xác nh loài b ng cách
truy c p Ngân hàng gen (BLAST: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và
xem xét m i quan h ph h ngu n g c, s d ng ch ng trình MEGA5.0
ph ng pháp k t n i li n k NJ (Neighbor-JoiningNJ) v i h s tin t ng
1000 bootstrap (Tamura et al., 2011)
2.4 i u tr n m ph i
T t c các b nh nhân c ch n oán nhi m n m ph i u
c i u tr b ng phác phù h p do B Y t ban hành c th :
Phác s d ng Fluconazol li u 150 mg/24 gi x 14 ngày Phác
s d ng Amphotericin B: Áp d ng cho b nh nhân tái nhi m và b nh
nhân i u tr phác Fluconazol th t b i:
2.5 Các ch s ánh giá
2.5.1 ánh giá tình tr ng nhi m n m ph i
- T l nhi m n m ph i chung; T l nhi m các nhóm b nh
nhân HIV/AIDS, b nh nhân i u tr lao ph i có BK (-); T l nhi m
b nh nhân giai o n HIV, giai o n AIDS; T l nhi m theo gi i;
Theo nhóm tu i; Theo ngh nghi p; T l nhi m t ng loài n m ph i
- Sau khi ánh giá tình tr ng nhi m n m ph i có phân tích
ánh giá s t ng quan gi a các y u t nguy c (YTNC) có liên quan
trên v i tình tr ng n m ph i, thông qua l p b ng 2x2 tính toán t
su t chênh OR, v i OR = a.d/b.c, OR 2, p < 0,05 s k t h p có ý
ngh a th ng kê gi a YTNC nhi m n m ph i và và tình tr ng nhi m
n m ph i
2.5.2 Các ch s v hi u qu i u tr và tình tr ng tái nhi m
n m ph i
PV% =
1
2 1
p
p p
x 100(%) Trong ó : PV (Preventive value
- PV) Hi u qu i u tr ; pt: T l nhi m n m tr c i u tr ; p2: T l
nhi m n m sau i u tr 15 ngày
- Các ch s ánh giá tình tr ng tái nhi m n m ph i: ánh
giá hi u qu i u tr sau s d ng phác 15 ngày, ánh giá tình tr ng
tái nhi m n m ph i sau 3, 12 tháng i u tr
2.6 Ph ng pháp x lý và phân tích s li u
S li u nh l ng thu th p c nh p b ng ph n m m EPIDATA, phân tích b ng ph n m m Stata 8.0
2.7 o c nghiên c u
Tuân th nghiêm ng t các quy nh trong nghiên c u y sinh, nh : Nói rõ m c ích nghiên c u cho ng i b nh Ch c nghiên c u ng i t nguy n Gi bí m t v tình tr ng s c kh e c a
ng i b nh i u tr tri t cho các i t ng tham gia tài c thông qua H i ng Y c c a các b nh vi n tri n khai nghiên c u
Ch ng 3:
K T QU NGHIÊN C U 3.1 Th c tr ng nhi m n m ph i b nh nhân HIV/AIDS, b nh nhân lao ph i có BK (-) t i B nh vi n t nh Ngh An (2013 -2014)
3.1.1 Th c tr ng nhi m n m ph i b nh nhân HIV/AIDS
Có khu n l c Không có khu n l c
Hình 3.1 T l m u n m (+) nuôi c y trong môi tr ng Sabouraud b nh nhân HIV/AIDS
Nh n xét:
T l m u nuôi c y có k t qu (+) (có khu n l c) là 11,1% (t c là t l nhi m n m ph i là 11,1%)
B ng 3.3 T l nhi m n m ph i theo gi i b nh nhân HIV/AID
S m u nuôi c y S m u (+) T l (%)
Nh n xét:
Không có khác bi t v t l nhi m n m ph i gi a nam và n
b nh nhân HIV/AIDS (10,7% so v i 12,5%, p > 0,05)
- T l nhi m theo ngh nghi p
88,9%
11,1%
11,1%
Trang 7B ng 3.4 T l nhi m n m ph i theo ngh nghi p b nh nhân HIV/AIDS
Nh nghi p Tình tr ng nhi m n m ph i
S m u nuôi c y S m u (+) T l (%)
Nh n xét:
Không có khác bi t t l nhi m b nh nhân là cán b v i
b nh nhân làm nông nghi p, v i (10,0% so v i 11,2%, p > 0,05)
- T l nhi m n m ph i các b nh nhân giai o n nhi m
HIV và giai o n AIDS
B ng 3.5 T l nhi m n m ph i các b nh nhân giai o n nhi m HIV và giai o n AIDS
Nhóm giai o n nhi m HIV Nhóm giai o n AIDS
Giá tr p
S m u
nuôi c y
S (+)
T l (%)
S m u nuôi c y
S (+)
T l (%)
Nh n xét:
Có s khác bi t v t l nhi m n m ph i gi a 2 nhóm nhi m HIV
và nhóm giai o n AIDS (1,8% so v i 35,2%, p < 0,01)
- K t qu tách chi t DNA t ng s t các m u n m nghiên
c u: T 28 m u n m, DNA t ng s c a t t c các m u ã c tách
chi t theo ph ng pháp ã mô t , k t qu cho th y có hi n th v t sáng
trên th ch agarose 1% nhu m ethidium bromide, ch ng t trong m u
tách chi t có DNA thu nh n t h gen c a m u n m nuôi c y M u
nghiên c u và DNA t ng s c a các m u nghiên c u c kí hi u nh
li t kê B ng 3.7
- K t qu th c hi n PCR thu o n DNA c a vùng gen ITS
Hình 3.2 K t qu i n di s n ph m PCR vùng gen ITS t
các m u n m nghiên c u, thu nh n b ng c p m i ITS1-ITS4
M TL4 H1-01 H2-02 H3-01 H4-01 H5-01 H6-01
2 kb
M TL4 H1-01 H2-02 H3-01 H4-01 H5-01 H6-01
2 kb
M H1-02 H1-04 H1-05 H2-01 H2-03 H2-04 H3-02 H3-03 H3-04 H4-02 H4-03 H4-05
2 kb
0,54kb
~300bp
M H1-02 H1-04 H1-05 H2-01 H2-03 H2-04 H3-02 H3-03 H3-04 H4-02 H4-03 H4-05
2 kb
0,54kb
~300bp
M H 5 - 0 2 H 5 - 0 3 H 5 - 0 4 H 6 - 0 2 H 2 - 0 4 K T
2 k b
0 , 5 4 k b
~ 3 0 0 b p
M H 5 - 0 2 H 5 - 0 3 H 5 - 0 4 H 6 - 0 2 H 2 - 0 4 K T
2 k b
0 , 5 4 k b
~ 3 0 0 b p
Nh n xét:
S n ph m PCR thu c t p trung vào lo i có kích th c kho ng 300 bp Nh v y, c p m i ITS1-ITS4 ã cho k t qu s n
ph m PCR thu c t DNA t ng s tách chi t t các m u n m trong nghiên c u này là phù h p
- K t qu gi i trình t và phân tích chu i gen ITS c a các loài n m gây nhi m
Danh sách m u, k t qu PCR, chu i gen gi i trình t , k t qu truy c p Ngân hàng gen và xác nh k t qu cu i cùng xác nh loài,
c th ng kê trình bày B ng 3.7, Hình 3.3
- Th ng kê t l , thành ph n loài n m ph i
S xác nh c tên loài
S chu i b r i ho c không
có s n ph m
Hình 3.3 T l m u n m có k t qu xác nh tên loài
Nh n xét: T l m u n m cho k t qu xác nh tên loài sau
khi gi i trình t gen và phân tích ph h là 71,4% (20/28 m u) K t
qu c th c a t ng m u nh B ng 3.7
B ng 3.7 T l , thành ph n loài n m ph i b nh nhân HIV/AIDS
l ng T l (%)
Aspergillus spp (02 A fumigatus, 01 A cristatus) 03 10,7
Cladosporium spp (01Cladosporium sphaerospermum, 01 Cladosporium halotolerans)
28,6%
71,4%
Trang 8Nh n xét:
Trong t ng s 20/28 m u ã giám nh loài, ch y u t p
trung là: Penicillium oxalicum (07 m u); Aspergillus fumigatus (02
m u); S còn l i c giám nh thu c v các loài khác nhau
- K t qu phân tích ph h các loài n m phân l p t i Vi t
Nam d a trên chu i gen ITS
Hình 3.4 K t qu phân tích ph h các loài n m i t ng
HIV/AIDS
Nh n xét:
Hình 3.4 trình bày cây ph h bi u th m i quan h gi a các
loài n m gây nhi m cho th y: Các ch ng n m phân l p và phân tích
trong nghiên c u này, tùy theo m c khác nhau v m t phân lo i
mà có nh ng s s p x p khác nhau trong cây ph h , cho phép s b
k t lu n chúng thu c v 10 loài n m khác nhau, trong ó có m t s
ch ng thu c v các chi Aspergillus spp; Fusarium spp; Arthrinium
spp; Penicillium spp; Candida spp là các loài n m gây b nh nguy
hi m trên ng i và th ng xu t hi n cùng v i s suy gi m mi n d ch
do virus HIV (Yew và CS 2014)
3.1.3 Th c tr ng nhi m n m ph i b nh nhân lao ph i BK (-)
- T l nhi m n m ph i b ng ph ng pháp nuôi c y trong
môi c y n m trong môi tr ng Sabouraud: Vi c theo dõi, ghi chép
c i m khu n l c n m m c c ti n hành liên t c 27 ngày, m i
H 1 -0 5 -A -fu m i
H 3 -0 4 -A -fu m i
A -fu m i-F J 7 9 1 1 4 3
F u s a r-s o la n i-K C 9 1 7 3 6 7
H 2 -0 2 -F -s o la n i
H 4 -0 5 -P -o x a l
H 6 -0 1 b -P -o x a l
H 6 -0 1 -P -o x a l
H 6 -0 2 b -P -o x a l
H 6 -0 2 -P -o x a l
P -o x a l-K P 1 3 2 4 9 3
H 6 -0 3 -P -o x a l
H 2 -0 1 -A -c ris
A -c ris t-K M 3 8 8 8 5 4
H 3 -0 1 -S -b re v i
S c o p -b re v i-K P 1 3 2 7 3 8
A rt-s a c c h -K F 1 4 4 9 1 9
A rt-p h a e o -K J 1 5 2 1 7 5
A rt-a ru n -K F 1 4 4 9 1 9
H 1 -0 1 -A -a ru n
N ig ro s p o ra L H 2 5 2 -H Q 8 3 2 8 2 8
H 1 -0 2 -N ig ro s p o ra
H 3 -0 3 -2 4 8 b p
H 5 -0 2 -N ig ro s p o ra
H 1 -0 4 -C la -h a lo to le r
C la d o -s p J A 2 -K F 4 1 7 5 7 8
K T -C la -s p h a e ro
C la d o -s p h a e -J X 9 6 6 5 7 9
T L 4 -C -g la b ra ta
1 0 0
8 9
9 0
1 0 0
6 9
1 0 0
8 7
8 3
1 0 0
5 7
5 6
7 5
4 9
1 0 0
9 9
9 8
1 0 0
6 4
7 8
9 9
0 0 2
ngày c và ghi k t qu 1 l n, t ng h p k t qu t ng h p nh Hình 3.5 sau:
Có khu n l c Không có khu n l c
Hình 3.5 T l m u nuôi c y n m có khu n l c (k t qu +)
Nh n xét: T l m u nuôi c y n m trong môi tr ng
Sabouraud có khu n l c m c là 19,2% (48/250)
- T l nhi m n m theo nhóm tu i
B ng 3.10 T l nhi m n m ph i theo nhóm tu i
Nhóm tu i S m u nuôi c yTình tr ng nhi m n m ph iS m u (+) T l (%)
Nh n xét: T l nhi m n m ph i nhóm < 60 tu i th p h n
nhóm tu i 60, (15,6% so v i 23,5% p < 0,05)
- T l nhi m theo ngh nghi p
B ng 3.11 T l nhi m n m ph i theo ngh nghi p
Ngh nghi p Tình tr ng nhi m n m ph i
S m u nuôi
Nông, lâm
Nh n xét: T l nhi m n m ph i i t ng là cán b th p
h n i t ng làm nông, lâm nghi p (15,6% so v i 20,0%, p > 0,05)
- T l nhi m n m theo gi i
80,8%
19,2%
19,2%
Trang 9B ng 3.12 T l nhi m n m ph i theo gi i
S m u nuôi c y S m u (+) T l (%)
Nh n xét: Không có s khác bi t v t l nhi m n m ph i
b nh nhân nam và n (20,0% so v i 18,0%, p > 0,05)
- M t s y u t liên quan n tình tr ng n m ph i: B ng
cách tính toán OR, k t qu Có liên quan gi a ti p xúc tr c ti p v i
gia c m và ti n s i u tr lao ph i v i nhi m n m ph i v i (OR =
2,24, p < 0,05), (OR = 1,97, p < 0,05)
- T l , thành ph n loài n m ph i qua xét nghi m b ng k
thu t PCR RFLP
005 008 010 016 018 020 020 024 025 026 027 030 104 105 108 125 127 128 137 139 140 142 146 147
Hình 3.6 K t qu Tách chi t DNA genome
c a các m u ã c nuôi c y trong môi tr ng Sabouraud
Nh n xét: DNA h gen c a các dòng t bào u ã tách
chi t, th hi n là các ng ch y u có m t b ng DNA kích th c
l n, rõ nét
- K t qu xét nghi m PCR b ng m i ITS1 và ITS4
Hình 3.7 Hình nh i n di trên gel th ch b ng m i ITS1 và ITS4
250
bp 10000 1000 500
250
bp 10000 1000 500
Nh n xét: Các m u xét nghi m cho k t qu rõ nét.
- i n di trên gel acrylamid 8%
Hình 3.8 Hình nh i n di trên gel acrylamid 8%
Nh n xét:
Các m u u thu c s n ph m PCR là các b ng DNA rõ nét, i u này ch ng t DNA genome có ch t l ng t t, m i và
ch ng trình ch y PCR là phù h p T t c các s n ph m PCR này
u c c t ki m tra b ng Enzyme c t h n ch MSP I xem xét
chúng thu c loài n m Candida nào?
B ng 3.15 T l , thành ph n loài n m ph i sau khi phân c t b ng Enzyme MSP I l n 1
Nh n xét: T l C albican 31,94%, C tropical 10,64%, còn
l i không lên b ng ho c lên b ng không c t, không xác nh
- K t qu so sánh gi i trình t gen v i gen m u Candida spp
Ch ng 18 454
AGAAATGACGCTCTTTCAGGCCTGCCCTTTGGAATACCAAAAGGCGCAATGTGCGTTCCAAGATT TATGATTCACGAATATCTGCGATTCATATTACTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCATGCGAGAA CCAAGAAATCCGTTGTTGAAAATTTTGACTATTGTAATAATAAATCAAGTTTGACTGGAAATAAA AAGTTTGGTTTTTTATAACCTCTGGCGGAGGATTGCTCCCGCCACCAAAAAAATTTGTTCCATAAA AAACACCTGTGGTGCCATTAAACAAATCATAATGATCCTTCCGCAGTTCCCTACCGAAGGTTGTTG TTTT
Ch ng 20 - 485
TTGAATTTGAGGTCAAACTTTGAGATATACTGGGGAGTCGCCGCGGAGGGAAAGAATGGTAGACA
AACACCAAACCCAGCGGTTTGAGGGATTTTGACCCTCAAACAGGCATGCCCTCGGGAATACCAGA
250
bp 10000 1000 500
Trang 10TCGCTGCGTTCTTCATCGATGCAAGAACCAAAAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAAGTAA
TAATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGC
CCACCGCCAAAGCAAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATG
ATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG.
Ch ng 27- 498
GATCATCGACGTCGCAGAGAGAATAAAAGCCTATCCATTAGTTTATACCTGCTTTCTTTCAAGG
AAAGAAACCAGCGTATCGCTCAACACCAAACCCGAAGGTTTGAGGGAGAAATGACGCTCAAAC
AGGCATGCCTTTTCCCAATACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAT
ATCTGCAATTCATATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATC
CGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAGTTAATCAAGTTGACAATTAAATAAAAATTTGGTTGAGTTT
AATCTCTGGCAGGCCGTGGGCCCACCAAAGCAAAGTTTTCAAAAAAAAGAAAAACACATGTGT
TCACCTACGAAGGGTTCGGTTTTGGGGGAGGGGGCGCGGGCTTTTGATGT
Ch ng 50 - 517
ATTTCACGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAAAGTTTGAAGATATACGTGGTGGACGTCGGC
CGCAAGGAAAGTTTTTGGTTAGACCTAAGCCATTGTTCCGCGATCCCGCCTTAACACTACCGTCT
TTCAAGCAAACCCAAGTCGTATTGCTCAACACCAAACCCAGCGGTTTGAGGGAGAAACGACCC
ACGAATATCTGCAATTCATATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAA
GAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAAGTAATAATCTGGTGTGACAAGTTAATAAAAAAT
TGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGCCCACCGCCAAAGCAAGTTTGTTTCAAAG
AAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG
GATTTTTTTTTTTTT
Nh n xét: i v i m u 48 chúng tôi v n tìm th y trình t
dành cho v trí c t c a enzyme c t h n ch MSP I làCC GG Nh ng
th c t thì s n ph m PCR l i không b c t b i Enzyme này m c dù
s n ph m PCR ã c làm s ch tr c khi c t i u này có th d do
trình t dành cho i m c t c a MSP I có th b methyl hóa ho c b
t bi n nh , kh ng nh i u này c n có nghiên c u sâu h n
- K t qu so sánh gi i trình t gen v i gen m u Aspergillus spp
T ng s có 28/48 m u lên b ng không c t và không xác nh,
ã c ti n hành ch y PCR l n th 2 v i gen m i ITS1- ITS4 c a
Aspergillus spp và phân c t b ng Enzyme MSP I k t qu nh sau:
B ng 3.16 T l , thành ph n loài n m ph i
sau khi phân c t b ng Enzyme MSP I l n 2
Nh n xét: Trong t ng s 28 m u không có m u nào lên b ng
và b phân c t b i enzyme MSP I Nh v y không có m u nào nhi m
Aspergillus spp.
3.2 Hi u qu i u tr c hi u
3.2.1 Hi u qu i u tr n m ph i b ng Fluconazol
B ng 3.17 Hi u qu sau 15 ngày i u tr b ng Fluconazol b nh nhân HIV/AIDS và b nh nhân lao BK (-)
Nhóm i t ng
Tình tr ng b nh n m ph i tr c và sau
i u tr 15 ngày b ng Fluconazol Gía tr p
Tr c
i u tr
Sau i u tr
Hi u qu (%)
Nh n xét:
nhóm b nh nhân HIV/AIDS t l kh i b nh là 19/28, hi u
qu i u tr là 67,9% Nhóm b nh nhân lao ph i có BK (-), t l kh i
b nh r t cao 45/45, hi u qu i u tr 100,0% Hi u qu i u tr b ng Fluconazol chung cho c hai nhóm HIV/AIDS và nhóm lao ph i có
BK (-) là 87,67% Có s khác bi t v t l kh i gi hai nhóm i
t ng lao ph i có BK (-) và HIV/AIDS (100,0% so v i 67,9% v i p
< 0,01)
- Tình tr ng tái nhi m n m ph i sau 3, 12 tháng i u tr
b ng Fluconazol b nh nhân lao ph i có BK (-)
B ng 3.18 Tình tr ng tái nhi m n m ph i sau 3, 12 tháng
i u tr b ng Fluconazol b nh nhân lao ph i có BK (-)
Th i gian sau i u tr
Tình tr ng tái nhi m n m ph i b nh nhân
lao ph i có BK (-)
Nh n xét:
Sau i u tr 3, 12 tháng không có b nh nhân nào tái nhi m
n m ph i (0/45), v i các t l tái nhi m tái nhi m là 0,0% và 0,0%
