định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Các độc tố được ly trích từ thức ăn có đậu phộng và được xác định nó giống như một chất chuyển hóa của loài nấm Aspergillus flavus, loại nấm này đã phát triển trên các hạt đậu phộng và

- -

TRẦN VĂN PHI LONG

ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2015

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA - -

TRẦN VĂN PHI LONG

ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần Thơ, 2015

i

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện ở trường Đại học Cần Thơ, tôi

đã học hỏi được nhiều kiến thức bổ ích cùng với những kỹ năng quý báu mà quý thầy cô đã truyền dạy tận tình Đặc biệt, trong quá trình thực hiện luận văn tôi đã gặp không ít trở ngại nhưng nhờ sự giúp đỡ và hướng dẫn nhiệt tình của quý thầy cô, sự động viên từ phía bạn bè, người thân đã giúp tôi hoàn thành luận văn của mình Với nhiều sự tri ân sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cám

ơn đến:

Quý thầy, cô trường Đại học Cần Thơ nói chung và Bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên nói riêng đã truyền thụ nhiều kiến thức quý báu về chuyên môn

Thầy Nguyễn Trọng Tuân – Trưởng bộ môn Hóa học – Cố vấn học tập

đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những kiến thức cần thiết và bổ ích liên quan đến đề tài

Công ty cổ phần chứng nhận và giám định Vinacert, chi nhánh Cần Thơ

đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện luận văn

Anh La Văn Thái - Trưởng phòng Hóa và chị Võ Thị Thúy An - Kỹ thuật viên sắc ký cùng với các anh chị chung phòng thí nghiệm đã chỉ bảo những kiến thức quý báu khi làm việc và hướng dẫn các kỹ năng thao tác trong thực hành thí nghiệm

Tập thể lớp Hóa dược khóa 37 đã quan tâm, chia sẻ nhiều kinh nghiệm học tập cũng như cuộc sống cho tôi trong suốt 4 năm qua

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện

Trần Văn Phi Long

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

3 Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

TS Nguyễn Trọng Tuân

iii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện: ………

2 Đề tài: Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

3 Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ phản biện

iv

TÓM TẮT

Một phương pháp đơn giản và hiệu quả đã được phát triển để xác định đồng thời các aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS/MS) Chất phân tích được chiết với dung dịch MeOH:H2O (4:1) từ mẫu rắn đã được xay mịn, được làm sạch bằng cột chiết pha rắn Quy trình định lượng sử dụng hệ thống HPLC-MS/MS, cột pha đảo C18 (50 mm x 2mm, 3,5 μm), pha động là H2O:ACN Dãy chuẩn với các nồng độ 0,75-6 ppb, các giá trị R2 đều lớn hơn 0,99 Các giá trị RSD

< 4% Độ đúng trong khoảng 87,8%-105,7% Giới hạn phát hiện (LOD) là 1 ppb và giới hạn định lượng (LOQ) là 3 ppb Kết quả trên cho thấy phương pháp có độ đúng và độ nhạy cao, có thể dùng để xác định ở mức hàm lượng vết của các aflatoxins Kết quả phân tích 30 mẫu thức ăn chăn nuôi có 8 mẫu (chiếm 23,33%) nhiễm aflatoxins và có 1 mẫu (chiếm 3,33%) có hàm lượng aflatoxin B1 vượt mức quy định cho gà con và không có mẫu nào vượt mức quy định cho gà trưởng thành

v

ABSTRACT

A simple and effective method was developed for the simultaneous determination of aflatoxins in feed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) Analytes were extracted in MeOH:H2O (4:1) from pureed solid samples, purified using Oasis cartridges Determination by using HPLC-MS/MS system, RP-column C18 (50 mm x 2 mm, 3.5μm), mobile phase was H2O:ACN The concentration of standard solutions is from 0.75 to 6 ppb, R2 values are greater than 0.99 RSD values are less than 4% respectively The recovery is from 87.8% to 105.7% The limit of detection (LOD) was 1 ppb and the limit of qualifycation was 3 ppb The results showed that the developed method is sensitive, accurate and can be used to determine the levels of aflatoxins The result analysis of 30 feed samples showed that there were only 8 samples (23.33%) infected aflatoxins,

1 sample (3.33%) exceeded the allowed limit with aflatoxin B1 for chicks and

no sample was out of regulation for mature chickens

vi

Năm học 2014 – 2015 Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài “Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ”

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

Đặt vấn đề 1

1.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

Tổng quan về aflatoxins 3

2.1 2.1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxins [1], [3], [4] 3

2.1.2 Nguồn gốc lây nhiễm aflatoxins [1] 4

2.1.3 Đặc điểm của Aspergillus flavus 4

2.1.4 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa các aflatoxins 6

2.1.5 Độc tính của aflatoxins [1], [5] 7

2.1.6 Một số tác dụng của aflatoxins 8

2.1.7 Con đường sinh tổng hợp aflatoxin B1 [3], [5] 14

2.1.8 Những giải pháp phòng và chống độc tố nấm mốc 17

2.1.9 Quy định về hàm lượng cho phép của Aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp chăn nuôi 18

Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) [6] 19

2.2 2.2.1 Giới thiệu 19

2.2.2 Phân loại 20

2.2.3 Quy trình chiết SPE 24

Đại cương về HPLC và hệ thống HPLC-MS/MS [7] 27

2.3 2.3.1 Đại cương về HPLC 27

viii

2.3.2 Hệ thống HPLC-MS/MS 29

Một số phương pháp nghiên cứu định lượng aflatoxins 30

2.4 2.4.1 Các phương pháp xác định bằng HPLC [8], [9], [10] 30

2.4.2 Phương pháp ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) [11] 32

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

Thời gian, địa điểm 33

3.1 Phương tiện nghiên cứu 33

3.2 3.2.1 Thiết bị 33

3.2.2 Dụng cụ 33

3.2.3 Hóa chất và thuốc thử 34

3.2.4 Cách pha các dung dịch, thuốc thử 34

Phương pháp nghiên cứu 35

3.3 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 35

3.3.2 Phương pháp phân tích 35

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 35

Hoạch định thí nghiệm 35

3.4 Tiến hành thí nghiệm 36

3.5 3.5.1 Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS [12], [13] 36

3.5.2 Tối ưu hóa quy trình chiết 38

3.5.3 Thẩm định quy trình phân tích 39

3.5.4 Tiến hành phân tích trên một số mẫu thật ở công ty Vinacert 44 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS 46

4.1 4.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy máy HPLC 46

4.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 50

Tối ưu hóa quy trình chiết 51

4.2 Kết quả thẩm định 53

4.3 4.3.1 Độ tuyến tính 53

ix

4.3.2 Độ đúng 53

4.3.3 Độ chính xác 54

4.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) 54

4.3.5 Giới hạn định lượng (LOQ) 54

Kết quả phân tích một số mẫu thức ăn hỗn hợp cho gà tại công ty 4.4 Vinacert 54

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

Kết luận 56

5.1 Kiến nghị 56

5.2 PHỤ LỤC 60

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số tính chất lý hóa quan trọng của aflatoxins 7

Bảng 2.2 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà 18

Bảng 2.3 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO năm 1995) 18

Bảng 2.4 Những quy định về hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước EU 19

Bảng 2.5 Các pha tĩnh trong SPE và các điều kiện tương ứng 25

Bảng 2.6 Các loại sắc ký trong HPLC và đặc điểm của mỗi loại 28

Bảng 3.1 Một số thông số cài đặt cho MS1 36

Bảng 3.2 Một số thông số cài đặt cho MS2 37

Bảng 3.3 Một số thông sô cài đặt cho MS3 37

Bảng 4.1 Thành phần và tỉ lệ pha động 50

Bảng 4.2 Điều kiện của MS 51

Bảng 4.3 Điều kiện phân mảnh ion 51

Bảng 4.4 Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của các chất 53

Bảng 4.5 Kết quả phân tích nồng độ aflatoxins trên các mẫu 55

Bảng 5.1 Kết quả thẩm định quy trình phân tích aflatoxins 56

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái nấm mốc A Flavus 5

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các aflatoxins 6

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của aflatoxin M1 và M2 6

Hình 2.4 Con đường chuyển hóa của Aflatoxin B1 12

Hình 2.5 Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1 16

Hình 2.6 Tương tác trong SPE pha thường 21

Hình 2.7 Tương tác trong SPE pha đảo 22

Hình 2.8 Tương tác trong SPE trao đổi ion 23

Hình 2.9 Tương tác trong SPE dạng kết hợp 23

Hình 2.10 Quy trình chiết pha rắn (SPE) 24

Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu 38

Hình 3.2 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất 38

Hình 3.3 Quy trình chiết pha rắn thứ hai 39

Hình 3.4 Cách tính giá trị S/N 43

Hình 3.5 Quy trình phân tích mẫu 45

Hình 4.1 Sắc ký đồ chuẩn AFs 0,75 ppb theo phương pháp 1 47

Hình 4.2 Sắc ký đồ chuẩn AFs 0,75 ppb theo phương pháp 2 48

Hình 4.3 Sắc ký đồ chuẩn AFs 0,75 ppb theo phương pháp 3 49

Hình 4.4 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất 52

Hình 4.5 Quy trình chiết SPE thứ hai 52

Hình 4.6 Độ thu hồi trung bình của các chất nhóm aflatoxins 53

Hình 4.7 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các chất nhóm aflatoxins 54

Methanol Acetonitril High performance liquid chromatography Mass spectrometry

High performance liquid chromatography tandem mass sectrometry

Ultraviolet Solid – phase extraction Liquid – liquid extraction Normal phase – HPLC Reverse phase – HPLC Partition – HPLC Ion exchange – HPLC Ion pair exchange – HPLC Limit of detection

Limit of qualifycation Quy chuẩn Việt Nam

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Đặt vấn đề

1.1

Độc tố nấm mốc là những chất độc tiềm ẩn nhưng với khả năng gây hại của chúng thì vô cùng nghiêm trọng Những loại thực phẩm bị mọc nấm và biểu hiện ra bên ngoài như có đốm trắng, vàng hoặc đen thì chúng ta dễ dàng nhận biết và loại bỏ chúng Tuy nhiên những loại thực phẩm như ngô, đậu phộng, đậu xanh, các loại ngũ cốc khi chỉ mới phát triển nấm hoặc chỉ vô tình nhiễm độc tố nấm mốc thì người ta vẫn sử dụng để làm bánh kẹo hay chế biến các dạng bột dinh dưỡng, sữa bột mà không hề hay biết rằng sử dụng những loại thực phẩm này lâu ngày gây sẽ gây tổn hại đến các bộ phận trong cơ thể, nhẹ thì bị viêm, suy giảm chức năng, nặng thì bị hoại tử, ung thư

Aflatoxins là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất được sản sinh

từ các loài nấm mốc trong tự nhiên Nó bao gồm một họ độc tố được sinh ra từ

nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus được tìm thấy rất nhiều ở khắp nơi trên Việt Nam Những loại thực phẩm thường nhiễm Aspergillus

flavus như đậu phộng, ngô, lúa mì và các loại hạt có dầu khác Đã có nhiều

nghiên cứu chứng minh aflatoxins gây tổn thương gan, thận; gây ung thư, hoại tử; làm giảm khả năng miễn dịch của cơ thể Trong rất nhiều loại aflatoxins trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất Chất độc aflatoxins còn được bài tiết qua sữa bò dưới dạng đã chuyển hóa nhưng vẫn còn khả năng gây ung thư Khi con người ăn thịt hay uống sữa của vật nuôi đã

ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxins thì khả năng độc tố đi vào cơ thể người là hoàn toàn có thể

Các cơ sở chế biến thức ăn chăn nuôi cũng lấy nguyên liệu từ hạt ngô, đậu phộng, khoai mì, các loại đậu đỗ không thể dùng cho người đem sản xuất thức ăn cho vật nuôi Nếu hàm lượng độc tố nấm mốc trong thức ăn cho vật nuôi quá cao, một mặt sẽ gây độc trực tiếp đến con vật, có thể gây ra vụ chết hàng loạt gây tổn thất về kinh tế; mặt khác, chất độc đi vào cơ thể vật nuôi và tích trữ một thời gian, nếu đang giai đoạn cho ăn thúc để bán thì lượng độc tố cao đó sẽ chưa kịp đào thải hết và đi sang con người Do đó cần phải có một phương pháp định lượng đơn giản, chính xác để xác định hàm lượng độc tố aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi, giúp kiểm soát lượng độc tố trong thức ăn cho vật nuôi tránh thiệt hại về kinh tế và ảnh hưởng đến sức khỏe con người Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều thiết bị phân tích được cải tiến để nâng cao hiệu quả phân tích Trong đó, kỹ thuật sắc ký lỏng

2

hiệu năng cao (HPLC) ghép khối phổ (MS) làm tăng tính chính xác, độ nhạy cũng như rút ngắn thời gian phân tích Việc phát triển một quy trình phân tích bằng hệ thống HPLC – MS/MS là cần thiết để có thể đáp ứng các yêu cầu định lượng aflatoxins Vì vậy đề tài “Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

1.2

- Thử nghiệm, lựa chọn quy trình chiết pha rắn phù hợp để làm sạch

và làm giàu mẫu trước khi đem tiến hành phân tích bằng HPLC

- Tiến hành thẩm định quy trình phân tích định lượng bốn loại aflatoxins (B1, B2, G1, G2) bằng HPLC - MS/MS

- Áp dụng quy trình phân tích, định lượng 30 mẫu thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà được chọn ngẫu nhiên tại công ty cổ phần chứng nhận và giám định Vinacert – Chi nhánh Cần Thơ

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Song song đó, sự có mặt của đậu phộng trong khẩu phần ăn của gia súc ở Brazil thời gian này rất phổ biến và đó chính là yếu tố gây ra sự bùng nổ bệnh tật Các độc tố được ly trích từ thức ăn có đậu phộng và được xác định nó

giống như một chất chuyển hóa của loài nấm Aspergillus flavus, loại nấm này

đã phát triển trên các hạt đậu phộng và sản sinh ra các độc tố được gọi là

Aflatoxins, xuất phát từ chữ Aspergillus flavus toxin

Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất của aflatoxin và nó xuất phát

từ hai loại nấm phổ biến là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Tuy

nhiên còn một số loài nữa cũng có khả năng sản sinh ra aflatoxin là

Aspergillus nomius và Aspergillus tamarii

Việc ly trích ra được một chất độc từ chủng nấm A.Flavus cũng đã được

báo cáo từ hai nhóm nghiên cứu năm 1962 và sau đó cấu trúc hóa học của nó được xác định sớm bởi nghiên cứu của Asao và nghiên cứu của Chang

Mặc dù Aflatoxin được biết đến chưa đầy 15 năm nhưng mối nguy hiểm tiềm năng của nó đối với con người đã trở thành nỗi lo lắng thật sự Do đó, Aflatoxin đã trở thành một trong những độc tố vi nấm được nghiên cứu nhiều nhất Một số lượng lớn những nhà nghiên cứu đã tham gia vào công cuộc điều tra về vấn đề này và cho ra hàng loạt các kết quả mà nó còn tồn đọng trong suốt 20 năm qua

Trong những ngiên cứu gần đây về việc tách chiết aflatoxin, Nesbitt thu được hai loại: Aflatoxin B và Aflatoxin G Một dạng phát ra ánh sáng quỳnh quang màu xanh dương là Aflatoxin B (B = blue) và dạng còn lại phát ra ánh sáng màu xanh lá là Aflatoxin G (G = green) Hartley và những người bạn đồng nghiệp đã chỉ ra rằng Aflatoxins có thể tồn tại riêng rẽ gồm 4 hợp chất có

4

liên hệ gần gũi nhau là: Aflatoxin B1, B2, G1 và G2 Gần đây hơn, những chất

có liên quan được ly trích từ sữa của những con bò ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin được xác định là Aflatoxin M (Milk toxin) Mặc dù có tổng cộng 12 cấu trúc có cấu hình tương tự nhau và chúng được chỉ định là các dạng của aflatoxin nhưng giới hạn của aflatoxin được quy về 4 hợp chất trong tống số các nhóm và các chất chuyển hóa là: B1, B2, G1 và G2

2.1.2 Nguồn gốc lây nhiễm aflatoxins [1]

Các loại nấm mốc A.flavus và A.parasiticus có ở khắp nơi trên thế giới

ngoại trừ các vùng cực Sự phát triển và sản sinh ra các độc tố của chúng đòi hỏi điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, đặc biệt thịnh hành ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Tuy nhiên vẫn có thể tìm thấy ở những vùng lạnh hơn như ở Mỹ và Châu Âu Sự hình thành aflatoxins xảy ra trong suốt quá trình thu hoạch và bảo quản Nhưng cũng có trường hợp những cánh đồng

trồng trọt bị xâm nhập bởi A.flavus trước lúc thu hoạch do những con côn

trùng mang bào tử nấm đến, và kết quả là aflatoxins hình thành trước khi thu hoạch Aflatoxins có ở nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm có nguồn gốc thực vật nhưng chỉ trong một số loại nhất định như: Trong các loại hạt có dầu (đậu phộng, đậu Brazil, hạt hồ trăn, hạt giống bông, hạnh nhân, hạt

hồ đào, cái dừa khô) và một số ngũ cốc (bắp, gạo, lúa mì, lúa mạch, yến mạch,

bo bo) Aflatoxin cũng được tìm thấy trong hạt tiêu đỏ và quả sung ở Ấn Độ Khảo sát ở một số nước cho thấy có aflatoxin M1 trong sữa lỏng, sữa bột

và các sản phẩm từ sữa Mức độ aflatoxin M1 trong sữa tỷ lệ trực tiếp với aflatoxin B1 trong thức ăn của động vật Dư lượng AFB1 được tìm thấy trong gan và trong thịt gia cầm cũng như trong gan, thận và thịt của lợn AFB1 được chứng minh có trong trứng và trong mô của gà đẻ Điều này cho thấy phạm vi các loại thực phẩm bị nhiễm aflatoxin là rất rộng Một mặt là rau quả bị ô nhiễm trực tiếp từ các bào tử nấm; mặt khác sữa, thịt, trứng bị nhiễm aflatoxin trực tiếp từ trang trại hoặc do vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin và tạo thành những chất chuyển hóa của aflatoxin tích trữ trong cơ thể

2.1.3 Đặc điểm của Aspergillus flavus

2.1.3.1 Hình thái [4]

Aspergillus flavus là một loại nấm sợi rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi

lục Ở đỉnh các cuống, bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài

Aspergillus flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới

đất, trên các chất hữu cơ và các loại hạt nhất là các loại hạt có dầu Khi gặp điều kiện thuận lợi nó sẽ sinh sôi nảy nở, nhất là trên các loại hạt bị ẩm, thức

ăn chăn nuôi dạng phức hợp và ngay cả trên cỏ khô Trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2% – 17% bào tử của nó chiếm từ 50% - 100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vở cứng sâu tới 0.6m Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5%

Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong

nước, trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số cây trồng

Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán lớn nên phòng trừ nấm hại này

thường rất khó khăn Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực

như: lúa, ngô, sắn, trên một số loại hạt như: lạc, các loại đậu, vừng ,trên các loại sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng và ngay cả trên hoa quả tươi bị dập úa Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng và phát triển, chúng tiết ra độc tố aflatoxins

2.1.3.3 Độc tố aflatoxin do A flavus sản sinh [1]

Bộ khung giống nhau của 4 dạng chính aflatoxins gồm B1, B2, G1 và G2

được sinh ra từ Aspergillus, được quy định bởi cấu trúc di truyền của nó Nhìn chung, dòng Aspergillus flavus chủ yếu sinh ra dạng aflatoxin B1 Trong khi

đó Aspergillus parasiticus có độc tính cao và thường sinh ra các aflatoxin B1,

B2 và G2

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các aflatoxins Ngoài ra còn có hai dạng aflatoxin được tìm thấy trong sữa đó là aflatoxin M1 và M2, được xác định là chất chuyển hóa tương ứng của aflatoxin B1 và B2 Trong đó M1 là 4-hydroxy của B1 và M2 là 4-hydroxy của B2

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của aflatoxin M1 và M2

7

2.1.4.2 Tính chất lý hóa [1], [2]

Aflatoxins tan tự do trong dung môi có độ phân cực trung bình (chloroform, methanol), đặc biệt trong dimethyl sulfoxide (DMSO) Ở trạng thái tinh khiết, aflatoxin rất bền với nhiệt độ, nó tương đối không bền khi tiếp xúc với ánh sáng và tia UV Hầu như không có sự phân hủy nào của aflatoxins xảy ra dưới điều kiện nấu ăn thông thường do nhiệt độ nóng chảy của chúng rất cao và trong các quá trình khử trùng Tuy nhiên, có báo cáo rằng việc rang đậu phộng ở nhiệt độ rất nóng làm giảm aflatoxin

Bảng 2.1 Một số tính chất lý hóa quan trọng của aflatoxins Aflatoxins Công thức phân

tử

Khối lượng phân

tử

Nhiệt độ nóng chảy (oC)

Trên cơ thể tất cả các loài động vật được nghiên cứu, gan là mục tiêu nghiên cứu chính Dấu hiệu đầu tiên có aflatoxin trên động vật thể hiện qua sự chán ăn và sụt cân Hoại tử tế bào gan, thoái hóa tổ chức các mô mỡ ở gan và nghẽn ống dẫn mật là những bệnh lý phổ biến nhất Bên cạnh gan, nhiều bộ phận khác cũng chịu các tác dụng của aflatoxin nhiều hơn hoặc ít hơn Sự tắt nghẽn phổi, hoại tử cơ tim và thận cũng được quan sát thấy trong quá trình thử nghiệm trên động vật Hầu hết các thử nghiệm trên động vật cho kết quả LD50của liều đơn chỉ gồm AFB1 là 0.5 đến 10 mg/kg trọng lượng cơ thể Độc tính của aflatoxin cũng được kiểm chứng trên các tế bào được nuôi cấy bằng công

8

nghệ nuôi cấy mô LD50 của AFB1 đối với tế bào phôi thai gà là 5μg/ml và 0,05 μg/ml đối với tế bào phổi của người AFB1 gây độc trên cả tế bào gan người đã trưởng thành

2.1.5.2 Trên người

Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwarshiorkor được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố aflatoxins Trẻ đã ăn mỗi ngày 70 – 100 gam bột lạc bị nhiễm aflatoxins với hàm lượng 0,5 – 1 ppm, ăn kéo dài trong

10 tháng Đến khi trẻ 4 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả hai trẻ

Một trường hợp xảy ra ở Malaysia năm 1990 với 40 người bị ảnh hưởng

và 13 trẻ em tử vong sau khi ăn mì bị nhiễm hàm lượng cao aflatoxin và acid boric Mức độ aflatoxin cao được tìm thấy trong khắp các bộ phận của cơ thể khi khám nghiệm tử thi như: gan, phổi, thận, tim, não và lá lách

2.1.6 Một số tác dụng của aflatoxins

2.1.6.1 Khả năng gây ung thư [1]

Khả năng gây ung thư của aflatoxin được đề cập đầu tiên vào năm 1961 khi Lancaster và cộng sự chỉ ra sự ung thư gan trên chuột khi ăn những thức

ăn có nguồn gốc từ đậu phộng có liên quan mật thiết với căn bệnh gà tây X Sau đó, trong nhiều lần thử nghiệm ở một số phòng thí nghiệm trên động vật linh trưởng trừ con người, AFB1 được chứng minh là chất gây ung thư gan mạnh nhất được biết

Sự tương quan giữa hàm lượng aflatoxin trong chế độ ăn uống và tỷ lệ ung thư gan đã được chứng minh bởi Wogan và cộng sự trên chuột Fisher đực với hàm lượng aflatoxin trong chế độ ăn từ 1 đến 100 μg/kg Kết quả là 10%

bị ung bướu sau 104 tuần ở hàm lượng 1 μg/kg, 100% bị ung bướu ở hàm lượng 100 μg/kg sau 54 tuần

AFB1 là chất gây ung thư trên cá hồi cầu vồng với mức nồng độ rất thấp Chỉ 20 ppb AFB1 trong chế độ ăn hằng ngày, sau 9 tháng tỷ lệ ung thư gan lớn hơn 50% Nghiên cứu tính gây ung thư gan của AFB1 trên vịt có 8 trong số 11 con bị ung thư gan sau 14 tháng với hàm lượng 30 ppb trong khẩu phần ăn Tác dụng gây ung thư của AFB1 cũng được nghiên cứu trên động vật linh trưởng ngoại trừ con người Một con khỉ cái bộc phát ung thư gan sau khi ăn tổng cộng 500 mg AFB1 trong vòng 6 năm Trong số hai con khỉ được thử

9

nghiệm với AFB1 trong vòng 5 năm ở Viện nghiên cứu dinh dưỡng quốc gia Hyderabad, Ấn Độ, con đực đã phát triển ung thư gan trong khi con cái chỉ bị

u đường mật

Reddy đã chứng minh việc cho ăn gián đoạn trong khẩu phần ăn có chứa

200 μg/kg AFB1 cũng gây ung thư gan với tỷ lệ 6/6 con chuột chù cái và 3/6 con chuột chù đực sau 74 đến 172 tuần

Mặc dù các thử nghiệm trên động vật đều lấy gan làm mục tiêu thử nghiệm chính cho AFB1 nhưng các khối u vẫn được tìm thấy trên các vị trí khác ngoài gan Sieber và cộng sự cũng đã thu được những khối u ác tính trên một số loài khỉ với liều lượng AFB1 trung bình tổng cộng là 709 mg trong vòng 114 tháng Có 13 trong số 35 con vật bị mổ xác để kiểm tra, chỉ có 5 khối u ở gan được tìm thấy (2 khối u ở tế bào gan và 3 khối u ở màng trong mạch máu) Ung thư dạ dày và u tuyến nhầy cũng được tìm thấy Một tỷ lệ cao các khối u ác tính ở biểu mô thận thu được trên những con chuột đực Wistar

ăn khẩu phần ăn có chứa hàm lượng AFB1 là: 1,0; 0,5; 0,25 mg/kg thức ăn trong 147 ngày Thêm những khối u khác cũng được tìm thấy ở lưỡi và cuống họng

Aflatoxin G1 cũng được chứng minh là chất gây ung thư rất mạnh Nó đã được báo cáo trong một nghiên cứu cho chuột uống nước có AFG1 với hàm lượng 3 μg/ml Kết quả là 21 trong số 26 con chuột có khối u trên gan sau khi dùng tổng cộng 6 mg AFG1 Trong số 26 con chuột này có 6 con xuất hiện khối u trên thận

Aflatoxin M1 gây ung thư trên tế bào gan của cá hồi và chuột nhưng không mạnh bằng AFB1 thử trên hai loài này

Aflatoxin B2 có hoạt tính yếu hơn khi thử nghiệm gây ung thư trên tế bào gan ở chuột, liều sử dụng cao hơn 100 lần so với AFB1

2.1.6.2 Tác dụng gây quái thai [1]

Butler và Wigglesworth đã nghiên cứu tác dụng của AFB1 trên những con chuột mang thai và thấy rằng việc cho uống AFB1 gây chậm phát triển thai nhi Các con vật được cho sử dụng độc tố ở giai đoạn mang thai sớm cho thấy có sự giảm nhẹ khối lượng nhau thai Độc tố được sử dụng sau khi thụ tinh 16 ngày cho thấy hiện tượng quái thai phát triển nghiêm trọng Một mặt làm giảm khối lượng thai nhi và thứ hai là gây nhiều tổn thương khác trên con vật mang thai Trong một nghiên cứu theo dõi của Butler, ông thấy rằng việc giảm khối lượng chỉ là một sự liên quan gián tiếp trong nhiều tổn thương ở

dị hình và chết cao Cũng như Butler đã tìm thấy thì có nhiều tổn thương trên con mẹ Sự dị tật xảy ra khi xử lý sớm là thiểu não, cấu trúc sọ vô tổ chức ở cuối ống thần kinh, một số tăng trưởng chậm và lệch dây

Một số nghiên cứ khác trên phôi thai gà cho thấy AFB1 và một số chất chuyển hóa liên quan có khả năng gây quái thai trên phôi thai đang phát triển

Sự phù nề và chậm tăng trưởng cũng thể hiện rõ ràng sau khi tiêm một mũi có chứa độc tố vi nấm vào túi khí Tuy nhiên, Hintz và cộng sự cũng nghiên cứu tác dụng gây quái thai của aflatoxin trên lợn cái được cho ăn thức ăn có chứa

450 ppb AFB1 nhưng không phát hiện dị tật trên heo con Vì vậy họ nói rằng AFB1 chỉ có khả năng gây quái thai trên một số loài thực nghiệm Sự khác nhau trong con đường chuyển hóa aflatoxin giữa những con vật khác nhau có thể tạo ra sự đặc biệt như vậy

2.1.6.3 Tác dụng gây đột biến [1]

AFB1 được biết là một tác nhân gây đột biến mạnh Nghiên cứu đầu tiên

là gây ra sự dị tật trên nhiễm sắc thể bằng aflatoxin bởi Lylli Ông thí nghiệm

trên một loại cây giống Vicia faba, thực hiện ở nhiệt độ 21oC trong 3 giờ với hỗn hợp 67 mM aflatoxin Ông nhận thấy rằng aflatoxin gây ra sự gia tăng đáng kể sự phân bào bất thường Những bất thường bao gồm các đoạn nhiễm sắc thể bị đứt gãy ngẫu nhiên Bạch cầu của người được nuôi cấy với điều kiện aflatoxin tương tự tạo ra nhiều bất thường về nhiễm sắc thể với tần suất cao

Sự đứt gãy nhiễm sắc thể là một dạng bất thường phổ biến nhất nhưng lại không được tìm thấy

Nhiều thử nghiệm khác cho thấy rằng tỷ lệ các tế bào có những dị thường trong nhiễm sắc thể phụ thuộc vào nồng độ của độc tố và thời gian thực hiện AFB1 gây ra sự biến đổi trong quá trình phiên mã DNA của Bacillus subtilis và gây đột biến trên những tế bào sinh dưỡng (không phải bào

tử) của Neurospora crassa và Chlamydomonas reinhardii Aflatoxin cũng được chứng minh gây ra những đột biến gen lặn gây chết trên Drosophila

melanogaster Khi được áp dụng trực tiếp để kiểm tra thử trên Salmonella typhimurium, aflatoxin không cho tác dụng sinh học nhưng khi ủ aflatoxin với

11

hệ thống microsome trên gan người hoặc trên chuột cùng với S typhimurium

tạo ra những đột biến đảo đoạn trên vi khuẩn Những nghiên cứu này cho thấy rằng sự chuyển hóa aflatoxin cũng cần thiết cho sự biểu hiện hoạt tính sinh học

Độc tính của chất chuyển hóa của aflatoxin đối với vi khuẩn giảm bớt khi thêm DNA hoặc RNA vào hệ thống thử nghiệm Liên kết được tìm thấy có tác dụng hơn khi DNA được thêm vào thay vì RNA Một vài nghiên cứu cho thấy rằng chất chuyển hóa của aflatoxin B1 phản ứng tạo liên kết cộng hóa trị với acid nucleic Những nghiên cứu sau đó của Garner, của Swenson và cộng

sự cho thấy rằng AFB1 được chuyển hóa bởi gan chuột thường hoặc chuột

hamster trong thử nghiệm in vivo và chuyển hóa bởi microsome gan người trong thử nghiệm in vitro tạo thành một hợp chất có hoạt tính khá mạnh Nó có

thể là chất gây ung thư tối ưu, aflatoxin B1-2,3-oxide

2.1.6.4 Tác dụng trên hệ miễn dịch [1]

Một trong những tác dụng rất dễ thấy của aflatoxin là làm suy yếu hệ miễn dịch Aflatoxin được báo cáo là làm tăng các bệnh nhiễm trùng thêm dữ dội như bệnh khuẩn salmon, nấm cây trồng, các bệnh aspergillus, bệnh trùng cầu manh tràng và căn bệnh Marek

Ở gà, aflatoxin gây ức chế sự đáp ứng miễn dịch của kháng thể và thoái hóa tuyến ức và kết cấu bìu, đó là những yếu tố quyết định cơ bản của khả năng miễn dịch Richard và Thurston nhận thấy afaltoxin làm giảm sự thực

bào của bào tử nấm Aspergillus fumigatus Michael và cộng sự thấy rằng

aflatoxin làm giảm hiệu lực của hệ lưới nội mô của gà (Reticuloendothelial system – RES)

Aflatoxin B1 được cấy vào màng bụng của chuột, nơi có đại thực bào và sợi nguyên bào Nó ức chế sự hấp thu và sự kết hợp tri-leucine và uridine trên

cả hai loại tế bào, làm suy yếu khả năng thực bào của đại thực bào Chang và Hamilton cũng nhận thấy aflatoxin làm suy giảm khả năng thực bào trên gà đồng thời làm suy yếu sự vận động của các chất và giảm khả năng giết vi khuẩn Tác dụng của aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trên sự cảm ứng của interferon bằng virus cúm trong tế bào đơn lớp được nghiên cứu bởi Hahon và cộng sự Trong số 4 loại aflatoxin là chất có hại nhất đối với tất cả các tế bào sinh trưởng và khả năng tồn tại của những tế bào trong môi trường nuôi cấy Khi virus cúm được thử nghiệm bằng cách sử dụng những tế bào đã được xử

lý với aflatoxin trước đó, nó có tác dụng giống như người kiểm soát Tốc độ

12

phát triển của virus trong các tế bào có aflatoxin và trong các tế bào bình thường tương đương nhau nhưng mức nồng độ virus đạt được cao hơn gấp 2 đến 4 lần lượng virus được nuôi cấy trong môi trường có aflatoxin Độ lớn của virus phát triển tỷ lệ với nồng độ của aflatoxin Các nhà nghiên cứu cho rằng aflatoxin gây tác dụng bất lợi đối với sự cảm ứng interferon thông qua chức năng của phân tử cảm ứng, sự hoạt động hay trì trệ của gen interferon, sự sao

mã hay dịch mã của RNA interferon

2.1.6.5 Hoạt tính của những chất chuyển hóa từ Aflatoxins [1], [3]

Aflatoxins được chuyển hóa đầu tiên bởi các enzyme microsome, các enzyme này nhiều nhất là ở gan Vì vậy không có gì ngạc nhiên khi gan là cơ quan mục tiêu để thử độc tính gây ung thư của aflatoxins

Hình 2.4 Con đường chuyển hóa của Aflatoxin B1

Aflatoxin M1

1

Aflatoxin M1 (AFM1) là chất chuyển hóa sinh học đầu tiên được xác định Butler và Clifford tìm ra một chất có độc hiện diện trong gan chuột khi chỉ cho ăn một loại aflatoxin B1 duy nhất Điều đó cho thấy rằng AFB1 đã được chuyển hóa trong gan Allcroft và cộng sự sau khi tách độc tố từ nước tiểu của cừu được cho ăn AFB1 đề nghị lấy tên là aflatoxin M

Khả năng gây độc của AFM1 tương đương với AFB1 tuy nhiên độc tính gây ung thư và gây đột biến nhỏ hơn đáng kể so với AFB1

protein trong in vivo gây ra tác dụng độc hại nghiêm trọng

Aflatoxicol

3

Aflatoxicol rất đặc biệt vì nó không được hình thành từ phản ứng chuyển hóa của enzyme trong gan mà do một NADP liên kết với enzyme dehydrogenase của cytosol, nó cũng có hoạt tính của một enzyme 17-ketosteriod dehydrogenase Aflatoxicol chỉ là một chất chuyển hóa từ aflatoxin

trong in vitro và nó được biết là nhạy cảm với các hormone Hơn nữa đây là

một phản ứng thuận nghịch và có thể cung cấp một “bể chứa” cho AFB1 và các chất chuyển hóa của nó

Độc tính của dạng chuyển hóa này được đo lường bằng khả năng gây

chết đối với loài S typhimurium trong sự hiện diện của các phần ty thể của

chuột, nhận thấy rằng độ mạnh của nó thấp hơn AFB1 nhưng cao hơn AFM1

Aflatoxin P1

4

Aflatoxin P1 là chất chuyển hóa chính được tìm thấy trong nước tiểu của khỉ rhesus được tiêm một mũi đơn AFB1 vào bụng AFP1 được tạo thành bởi NADPH, một hệ thống enzyme có chức năng oxi hóa của microsome trong gan Nó không có độc tính trong hệ thống thử nghiệm trên phôi gà con cũng

như không có tác dụng gây chết trên S typhimurium

Aflatoxin Q1

5

Aflatoxin Q1 chiếm khoảng 1/3 các chất chuyển hóa được tạo thành từ AFB1 bởi microsome của gan khỉ và gan người Hsieh và cộng sự thu được AFQ1 có độc tính thấp hơn 18 lần so với AFB1 và không gây đột biến trên vi

khuẩn trong thí nghiệm với S typhimurium

Các dạng có hoạt tính cao của Aflatoxin B1

14

với liên kết cộng hóa trị với acid nucleic, sự trao đổi chất, khả năng gây đột biến của các chất chuyển hóa Trong một báo cáo, Garner và các đồng sự của ông có đề xuất rằng “gan là nhất, không phải tất cả” Các loài động vật có khả năng chuyển đổi AFB1 thành một chất chuyển hóa có độc không xác định, có thể được thử nghiệm trong thí nghiệm gây đột biến trên vi khuẩn Ông nhận thấy rằng sản phẩm chuyển hóa này có thể là 2,3-oxide tồn tại thoáng qua và được alkyl hóa trong DNA vi khuẩn Bằng chứng gián tiếp cho sự epoxide hóa này là một phản ứng chuyển hóa rất quan trọng do Swenson thu được khi thực hiện tách 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy-AFB1 sau khi thủy phân bởi acid nucleic được chiết từ gan chuột đã tiêm AFB1 và từ acid nucleic đã xử lý với AFB1 trong microsome của chuột và người Điều giả định trước đó là một bằng chứng mạnh mẽ của dạng 2,3-oxide và trong sự tương tác với DNA được kết luận rằng epoxide của AFB1 là tác nhân gây đột biến trên vi khuẩn và là tác nhân gây ung thư

Từ đó có thể thấy rằng AFB1-epoxide và AFB2 được coi là những dạng hoạt động của AFB1 trong khi những dạng khác được coi là những sản phẩm giải độc Tuy nhiên AFM1 và Aflatoxicol vẫn có độc tính khá cao và có khả năng gây ung thư

2.1.7 Con đường sinh tổng hợp aflatoxin B1 [3], [5]

Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp aflatoxin:

Norsolorinic acid  averatin  averufin  versicolorin A  versiconal hemiacetal acetate  versiconal  versicolorin A  sterigmatocystin  aflatoxin B1

Con đường sinh tổng hợp aflatoxin B1 được tóm tắt như sau:

- Sinh tổng hợp acid norsolorinic:

Polyketide là viên gạch cấu trúc cơ bản tạo AFB1 liên quan đến quá trình kéo dài một đơn vị hexanoate bởi enzyme polyketide synthase mà enzyme này

là do tập hợp của 7 đơn vị acetyl từ malonyl CoA mà không qua sự khử ketone tạo noranthrone Việc tổng hợp acid norsolorinic là giai đoạn trung gian bền vững sau quá trình oxi hóa noranthrone từ enzyme oxidase

- Việc chuyển từ norsolorinic acid thành averatin nhờ enzyme ketoreductase

- Từ averatin sau một số quá trình tạo thành versicolorin A

15

- Từ versicolorin A tổng hợp sterigmatocystin: thông qua một số phản ứng enzyme gồm: phản ứng oxi hóa, khử ketone, decarboxyl hóa và methyl hóa

- Từ sterigmatocystin chuyển thành aflatoxin: Sterigmatocystin được chuyển thành O-methylsterigmatocystin nhờ enzyme O-methyltransferase Sau

đó nhờ một đoạn gen chuyển O-methyltransferase thành Aflatoxin B1

Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1 được thể hiện ở Hình 2.5

16 Hình 2.5 Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1

- Kiểm soát và khử côn trùng, sâu mọt trong kho:

Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa sự phá hại của sâu mọt, côn trùng trong nguyên liệu và sự phát triển của nấm mốc Điều này được giải thích bởi hai lý do:

Hoạt động trao đổi chất của con trùng sử dụng chất hữu cơ trong nguyên liệu, hô hấp sinh ra nước làm cho môi trường dự trữ thức ăn ngày càng ẩm thêm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển

Côn trùng sâu mọt đục khoét hạt, di chuyển trong nguyên liệu mang theo những bào tử nấm trên mình nó phát tán trong nguyên liệu Theo tài liệu FAO (1979) thì côn trùng sâu mọt có thể làm tăng sự phát triển của nấm mốc lên từ 10-30%

- Sử dụng hóa chất để ngăn chặn nấm mốc xâm nhập vào thức ăn:

Có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn Hợp chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid propionic và các muối của

nó Theo tài liệu FAO Rome (1979) thì hợp chất này ngăn chặn nấm mốc cho kết quả đầy hứa hẹn

- Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi amoniac:

Sự khử độc bằng amoniac (NH3) dưới áp suất cao đã được Dollear và Gardner (1966) thực hiện ở áp suất 1,5-3 bar để khử độc bánh dầu phộng và bánh dầu hạt bông Sự phá hủy gần như hoàn toàn aflatoxin trên đậu phộng và phương pháp này đã được ứng dụng ở Mỹ năm 1969 như là một phương pháp

xử lý bánh dầu, bông vải Ở Pháp, phương pháp này được thử trên bánh dầu phộng từ năm 1972 bởi Prevol Tuy nhiên phương pháp xử lý này làm tổn hại đến acid amin chứa lưu huỳnh trong thức ăn

- Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi chất hấp phụ bề mặt:

18

Giải pháp khác ít tốn kém hơn mà cũng có thể cho kết quả tốt, đó là việc

sử dụng các chất hấp phụ để kết dính các độc tố và thải ra ngoài theo phân, làm giảm độc tính của chúng đối với cơ thể Nếu thức ăn thường xuyên bị nhiễm độc tố nấm mốc mà không có điều kiện phân tích kiểm tra thì nên sử dụng chất kết dính độc tố là giải pháp dễ thực hiện và hiệu quả

Có thể lên men các sản phẩm sau thu họach theo nguyên lý ức chế các vi sinh vật khác có thể ức chế sinh tổng hợp aflatoxin hay hấp thu aflatoxin Cũng có thể sử dụng các tác nhân vật lý như tia gamma, tia cực tím và các tác nhân hóa học để trích ly hoặc làm thay đổi cấu tạo phân tử mycotoxin Tuy nhiên những phương pháp này có những hạn chế vì đòi hỏi chi phí lớn, kém hiệu quả kinh tế

2.1.9 Quy định về hàm lượng cho phép của Aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp chăn nuôi

- Quy định của Việt Nam:

QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT do Cục Chăn nuôi biên soạn, Vụ Khoa học, Công nghệ và Môi trường trình duyệt và được ban hành theo Thông tư số 81/2009/TT-BNNPTNT ngày 25 tháng 12 năm 2009 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Nội dung: Quy chuẩn này quy định giới hạn về hàm lượng kháng sinh, hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà (gà sinh sản, gà thịt)

Bảng 2.2 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà

- Tiêu chuẩn của FAO:

Bảng 2.3 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ

19

Bắp và khô dầu phộng (cho bò, heo,

gia cầm trưởng thành vỗ béo)

- Tiêu chuẩn của các nước ở EU:

Bảng 2.4 Những quy định về hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn gia

súc, gia cầm ở các nước EU

ăn quy về độ ẩm 12% (ppb)

Thức ăn hỗn hợp cho bò (ngoại trừ bò sữa, bê và

cừu con)

50

Quy định của Việt Nam cũng giống như của Châu Âu về hàm lượng aflatoxin B1 tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho gà con là 10 ppb, cho

- Ưu điểm:

Với SPE, các vấn đề liên quan đến quá trình chiết lỏng-lỏng (LLE) có thể được cải thiện như sự tách pha không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng nhiều dung môi hữu cơ SPE sử dụng hiệu quả hơn LLE vì dễ dàng thực hiện,

20

nhanh chóng và có thể tự động hóa Dung môi chiết sử dụng tương đối ít và thời gian thực hiện cũng được rút ngắn Với LLE cần nhiều lần chiết để đạt được độ thu hồi cao trong khi SPE có thể chỉ cần một bước

- Nhược điểm:

Cơ chế tạo hỗn hợp trong SPE có thể xảy ra, sự hấp phụ không thuận nghịch của một số chất phân tích trên cột, đòi hỏi kỹ thuật hiện đại và phức tạp hơn

SPE thường sử dụng để chuẩn bị mẫu lỏng với chất tan ít hoặc không bay hơi Đồng thời, SPE cũng có thể dùng chuẩn bị mẫu rắn – hòa tan vào dung môi thích hợp trước khi chiết với SPE Các sản phẩm SPE thật sự hữu ích cho quá trình chiết, cô đặc và làm sạch mẫu Chúng có cấu tạo đa dạng bởi nhiều chất hấp phụ cũng như kích cỡ khác nhau Việc lựa chọn một sản phẩm phù hợp với mỗi chất hay mỗi mẫu phân tích là rất quan trọng

2.2.2 Phân loại

2.2.2.1 SPE pha thường

SPE pha thường với chất phân tích phân cực, có mẫu nền (pha động) ít hoặc không phân cực và một pha tĩnh phân cực Pha tĩnh cấu tạo bởi silica liên kết với các nhóm chất phân cực như -CN, -NH2, -diol…Sự lưu giữ chất phân tích dưới điều kiện pha thường là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của chất phân tích và nhóm chức phân cực trên bề mặt chất hấp thu Tương tác này bao gồm liên kết hydrogen, tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, tương tác lưỡng cực – cảm ứng… Dung môi giải ly thường có độ phân cực cao hơn so với dung môi trong mẫu nền ban đầu

21

Hình 2.6 Tương tác trong SPE pha thường

2.2.2.2 SPE pha đảo

SPE pha đảo gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình (mẫu nền) và pha tĩnh không phân cực Chất phân tích thường không phân cực hoặc kém phân cực Pha tĩnh được tạo bởi những hạt silica tạo liên kết với gốc -alkyl hoặc –aryl Sự lưu giữ chất phân tích hữu cơ từ dung dịch phân cực trên pha tĩnh SPE chủ yếu là do lực tương tác giữa liên kết carbon – hydrogen của chất phân tích và nhóm chức không phân cực trên bề mặt của silica Lực tương tác không phân cực – không phân cực còn được gọi là lực khuếch tán hay lực Vander Waals Để giải ly chất phân tích dung môi giải ly thường không hoặc ít phân cực

22

Hình 2.7 Tương tác trong SPE pha đảo

2.2.2.3 SPE trao đổi ion

SPE trao đổi ion thường dùng cho các chất phân tích mang điện tích trong dung dịch Cơ chế lưu giữ chủ yếu dựa trên lực hút tĩnh điện của nhóm chức mang điện tích trên chất phân tích và nhóm chức mang điện tích trên bề mặt liên kết với silica Để hợp chất lưu giữ bằng cơ chế trao đổi ion thì pH của mẫu nền phải làm cho chất phân tích và nhóm chức trên bề mặt silica mang điện tích Một dung dịch có pH mà cho chất phân tích hoặc nhóm chức phân cực trên silica trở về trạng thái trung hòa điện thì có thể dùng như chất giải ly Bởi vì khi một trong các nhóm chức này ở trạng thái trung hòa thì lực hút tĩnh điện giữa chúng sẽ mất đi và hợp chất được giải ly Ngoài ra, dung dịch có tính ion hóa mạnh hoặc chứa các ion có thể thay thế chất phân tích cũng được dùng để rửa giải

24

2.2.3 Quy trình chiết SPE

Trong những dạng thí nghiệm phổ biến nhất, các ứng dụng của SPE thường liên quan đến bốn bước Mỗi bước đều phải được tối ưu hóa trong quá trình xây dựng phương pháp

Hình 2.10 Quy trình chiết pha rắn (SPE)

2.2.3.1 Bước 1: Quá trình chuẩn bị (Conditioning)

Bước này được thực hiện trước khi cho mẫu vào cột, được gọi là bước hoạt hóa cột Bằng cách sử dụng một lượng dung môi nhất định “C” để hoạt hóa, điển hình là methanol (MeOH) hoặc acetonitril (ACN) Bước này có 2 vai trò chính: Thứ nhất, nó loại bỏ bất kỳ một tạp chất nào vô tình nhiễm vào, có thể là do cột tiếp xúc với các hóa chất trong phòng thí nghiệm Thứ hai, nó cho phép chất hấp phụ được hòa tan và dễ dàng khuếch tán vào cột Sự hòa tan là rất quan trọng với cột pha đảo vì việc để khô thường cho thấy sự sụt giảm đáng kể trong lưu mẫu của chất phân tích kỵ nước Ngoài ra, việc thay đổi trạng thái khô dẫn đến không lặp lại độ thu hồi Về mặt này, pha tĩnh có gắn nhóm polymer như Bond Elut Plexa (Agilent Technologies) với sự cân bằng tính thân nước và kỵ nước ở bề mặt, có thể để khô mà vẫn duy trì được hiệu suất Plexa là một chất hấp phụ hình cầu với các hạt phân tán đơn lẻ cho phép

có khả năng lặp lại và một bề mặt được hydroxy hóa tránh sự liên kết giao thoa nhiều chất có điểm chung của nền mẫu

Sau khi thực hiện điều kiện trên, người ta rửa bỏ dung môi hoạt hóa thừa bằng một dung môi cân bằng “D”, thường là nước hoặc dung dịch đệm để làm

25

cân bằng cột trước khi cho mẫu qua Đối với những thiết bị SPE có độ dày cột nhỏ như SPE dạng đĩa, bước này ít quan trọng và có thể bỏ qua

2.2.3.2 Bước 2: Cho mẫu qua cột (Loading sample)

Đối với cột pha đảo RP-SPE, chất phân tích được hòa tan trong một dung môi yếu “L” sau đó được cho từ từ vào cột Đối với cột trao đổi ion, có thể sử dụng dung môi tương tự nhưng độ mạnh của ion dung dịch mẫu phải càng yếu càng tốt Để cho mẫu vào cột có thể dùng pipette hay ống tiêm hoặc được bơm vào cột Phương pháp thứ hai thuận tiên hơn cho lượng mẫu lớn hơn 50 mL như trường hợp phân lập chất hữu cơ vi lượng từ các mẫu nước môi trường Kích thước cột và lượng mẫu phải phù hợp để không làm quá tải sức chứa của cột Sức chứa hay lượng chất mà cột có thể lưu giữ phải đảm bảo sao cho chất phân tích có thể được lưu giữ lại tất cả Bởi vì ngoài chất phân tích còn có nền mẫu và các chất giao thoa với chất phân tích cũng được giữ lại trên cột Mẫu được cho qua cột xuyên suốt và không để cột bị khô Trong quá trình cho mẫu qua cột, tốc độ dòng chảy không được kiểm soát một cách chính xác như trong

hệ thống HPLC nhưng cũng có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi chân không, tốc độ tiêm hay tốc độ từ máy bơm Tốc độ dòng cho phép là từ 2-4 mL/phút

Bảng 2.5 Các pha tĩnh trong SPE và các điều kiện tương ứng

Dung môi rửa giải

hexane;

CHCl 3 /hexa -ne

Methanol ethanol Pha thường

ethanol Pha đảo

(-CH 2 -) 17 CH 3 ; (-CH 2 -) 7 CH 3 ; PS-DVB, DVB

Kỵ nước (không phân cực mạnh)

H 2 O;

; ACN/H 2 O

MeOH ACN

H 2 O;

; ACN/H 2 O

MeOH ACN

ACN

-Ionic;

acidic

Nước hoặc dung dịch đệm (pH=pKa+

2)

-Dung dịch đệm (pH=pKa-2); -pH mà tại đó chất phân tích trung tính; -Dung dịch đệm có ion mạnh Trao đổi

2)

-Dung dịch đệm (pH=pKa-2); -pH mà tại đó chất phân tích trung tính; -Dung dịch đệm có ion mạnh Trao đổi

-Dung dịch đệm (pH=pKa+2); -pH mà tại đó chất phân tích trung tính; -Dung dịch đệm có ion mạnh Trao đổi

ion dương

(mạnh)

Alkyl sulfonic acid;

Aromatic sulfonic acid

Ionic;

basic

Nước hoặc dung dịch đệm (pH=pKa- 2)

-Dung dịch đệm (pH=pKa+2); -pH mà tại đó chất phân tích trung tính; -Dung dịch đệm có ion mạnh

2.2.3.3 Bước 3: Loại tạp (washing)

Bước này tiến hành loại bỏ tạp ra khỏi cột mà vẫn giữ lại được chất phân tích bằng một dung môi “R” có độ mạnh vừa phải Lý tưởng nhất là chọn một dung môi có độ mạnh và thể tích sử dụng phù hợp Nếu sử dụng một dung môi quá mạnh hoặc thể tích dung môi rửa quá nhiều sẽ làm mất đi một phần chất