khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate từ trái quách (limonia acidissima l ) họ cam (rutaceae) ở tỉnh trà vinh

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu hướng tới phục vụ y học nhưng đa phần chưa gắn kết được giữa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất có trong cây quách

BỘ MÔN SƯ PHẠM HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Ngành Sư Phạm Hóa Học

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE TỪ TRÁI QUÁCH (Limonia acidissima L.)

HỌ CAM (Rutaceae) Ở TỈNH TRÀ VINH

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Ths Ngô Quốc Luân Đặng Huỳnh Giúp

Lớp Sư Phạm Hóa Học K37 MSSV: 2111811

Năm Học 2015

LỜI CẢM ƠN - -

Trong quá trình thực hiện luận văn, để có được kết quả như hôm nay ngoài sự

nổ lực của bản thân thì tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn nhiệt tình c ủa quý Thầy cô, sự cổ vũ, động viên to lớn từ gia đình và các bạn lớp sư phạm Hóa học khóa

37 Vì vậy với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Ngô Quốc Luân, Bộ môn Sư phạm Hóa học - Khoa Sư Phạm, trường Đại Học Cần Thơ Người đã tận tình truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu và đ ầy tâm huyết trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Quý Thầy cô Bộ môn Sư phạm Hóa học, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức hữu ích làm nền tảng cho tôi thực hiện đề tài và đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đến lúc hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Các anh chị, các bạn - những người đã đồng hành cùng tôi đã động viên, giúp

đỡ, góp ý cho tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua

Ba mẹ và gia đình cũng đã giúp đỡ tôi cả tinh thần và vật chất, luôn động viên, khích lệ tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: ThS Ngô Quốc Luân

2 Tên đề tài: “Góp phần khảo sát thành phần hóa học trái Quách (Limonia

acidissima L.), Họ Cam ở tỉnh Trà Vinh”

3 Sinh viên thực hiện: Đặng Huỳnh Giúp MSSV: 2111811

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

c Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Cán bộ hướng dẫn

Ngô Quốc Luân

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1

1 Cán bộ phản biện:

2 Tên đề tài: “Góp phần khảo sát thành phần hóa học trái Quách (Limonia

acidissima L.), Họ Cam ở tỉnh Trà Vinh”

3 Cán bộ hướng dẫn: Ngô Quốc Luân

4 Sinh viên thực hiện: Đặng Huỳnh Giúp MSSV: 2111811 Lớp Sư Phạm Hóa Học – Khóa 37

5 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày…….tháng……năm 2015

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2

1 Cán bộ phản biện:

2 Tên đề tài: “Góp phần khảo sát thành phần hóa học trái Quách (Limonia

acidissima L.), Họ Cam ở tỉnh Trà Vinh”

3 Cán bộ hướng dẫn: Ngô Quốc Luân

4 Sinh viên thực hiện: Đặng Huỳnh Giúp MSSV: 2111811 Lớp Sư Phạm Hóa Học – Khóa 37

5 Nội dung nhận xét:

e Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

f Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

g Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

h Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày…….tháng……năm 2015

Nguyễn Thị Thu Thủy

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Carbon 13)

1H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ proton)

BuOH : Buthan-1-ol (CH3CH2CH2CH2OH)

E : M : Ethyl acetate : Methanol

EtOAc : Ethyl acetate(CH3COOC2H5)

EtOEt : Diethyl ether (C2H5OC2H5)

EtOH : Ethanol (C2H5OH)

g : gram

Glc : Glucosyde

H : E : n-Hexane : Ethyl acetate

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correelation

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

J : hằng số ghép spin

kg : kilogram

m : multiplet (Mũi đa)

MeOH : Methanol (CH3OH)

MHz : Mega Hertz

mp : melting point (Nhiệt độ nóng chảy)

MPLC : Medium Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký cột trung áp)

MS : Mass Spectrum/Spectrometry (Phổ khối lượng)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

PĐ : Phân đoạn

PE : Petroleum Ether (Ete dầu hỏa)

ppm : part per million (Phần triệu)

q : quartet (Mũi bốn)

Rf : Retention factor

Rha : Rhamnoglucosyde

s : singlet (Mũi đơn)

t : triplet (Mũi ba)

TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký bản mỏng)

UV-Vis : Ultraviolet Visible Spectroscopy (phổ tử ngoại khả kiến)

δ : chemical shift (độ dời hóa học)

λmax : maximum absorption wavelength (bước sóng cực đại hấp thu)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 iii

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2 iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

DANH MỤC CÁC BẢNG xii

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN xiii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

I TỔNG QUAN VỀ CÂY QUÁCH 2

II.1 Mô tả cây 2

I.1.1 Khái quát phân lo ại thực vật 2

I.1.2 Mô tả 3

I.2 Nguồn gốc, phân bố và sinh thái 4

I.2.1 Nguồn gốc, phân bố 4

I.2.2 Sinh thái 4

I.3 Ứng dụng y học dân gian c ủa trái cây quách 4

II TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4

II.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

II.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

III TÍNH CẤP THIẾT, MỚI MẺ VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 14

IV MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 15

IV.1 Mục tiêu 15

IV.2 Đối tượng nghiên cứu 15

IV.3.2 P hạm vi nghiên cứu 16

V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

V.1 PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP HỢP CHẤT 16

V.1.1 Phương pháp chiết 16

V.1.2 Phương pháp sắc ký 16

V.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 17

V.2.1 Phương pháp đo các chỉ số vật lý 17

V.2.2 Phương pháp phổ 18

V.3 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 19 Chương 2 THỰC NGHIỆM 20

I NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 20

I.1 NGUYÊN LIỆU 20

I.1 Thu hái nguyên liệu 20

I.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 20

I.2 HÓA CHẤT 20

I.3 THIẾT BỊ 21

II ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRÁI QUÁCH 21

II.1 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT STEROID 21

II.2 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID 22

II.3 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT ALCALOID 22

II.4 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT SAPONIN 22

II.4.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin 22

II.4.2 Dựa vào các phản ứng đặc trưng 23

II.5 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT TANIN 23

II.6 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT GLYCOSIDE 23

II.7 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT COUMARINE 24

III ĐIỀU CHẾ CAO THÔ, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT 25

III.1 ĐIỀU CHẾ CÁC CAO THÔ 25

III.2 CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT TỪ CAO EtAOc 27

III.2.1 Cô lập 27

III.2.2 Tinh chế 28

II.2.1.1 Phân đọan FE2 28

II.2.2.2 Phân đoạn FE3 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

I KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 32

II NHẬN DANH CÁC TINH CHẤT CÔ LẬP 33

II.1 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH VẬT LÝ CỦA CÁC CHẤT CÔ LẬP .33

II.1.1 Chất LAFE02 .33

II.1.2 Chất LAFE03 .33

II.2 BIỆN LUẬN PHỔ NGHIỆM VÀ NHẬN DANH CẤU TRÚC 33

II.2.1 Chất LAFE02 .33

II.2.2 Chất LAFE03 .36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

I KẾT LUẬN 45

II KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .49

PHỤ LỤC Phụ lục 1.1: PHỔ 1H-NMR CỦA LAFE02 PL1 Phụ lục 1.2: PHỔ 1H-NMR GIÃN RỘNG CỦA LAFE02 PL2 Phụ lục 1.3: PHỔ 13C-NMR CỦA LAFE02 PL3 Phụ lục 1.4: PHỔ 13C-NMR GIÃN RỘNG CỦA LAFE02 PL4 Phụ lục 1.5: PHỔ DEPT CỦA LAFE02 PL5 Phụ lục 1.6: PHỔ HMBC CỦA LAFE02 PL6 Phụ lục 1.7: PHỔ HMBC GIÃN RỘNG CỦA LAFE01 PL7

Phụ lục 1.9: PHỔ HSQC CỦA LAFE02 PL9 Phụ lục 2.1: PHỔ 1H-NMR CỦA LAFE03 PL10 Phụ lục 2.2: PHỔ 1H-NMR GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL11 Phụ lục 2.3: PHỔ 1H-NMR GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL12 Phụ lục 2.4: PHỔ 13C-NMR CỦA LAFE03 PL13 Phụ lục 2.5: PHỔ 13C-NMR GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL14 Phụ lục 2.6: PHỔ DEPT CỦA LAFE03 PL15 Phụ lục 2.7: PHỔ DEPT GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL16 Phụ lục 2.8: PHỔ HMBC CỦA LAFE03 PL17 Phụ lục 2.9: PHỔ HMBC GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL18 Phụ lục 2.10: PHỔ HMBC GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL19 Phụ lục 2.11: PHỔ HMBC GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL20 Phụ lục 2.12: PHỔ HMBC GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 .PL21 Phụ lục 2.13: PHỔ HSQC CỦA LAFE03 PL22 Phụ lục 2.14: PHỔ HSQC GIÃN RỘNG CỦA LAFE03 PL23

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Thân cây quách 3

Hình 1.2: Lá, hoa và trái quách 3

Hình 1.3: Trái và ruột quách chín 3

Hình 2.1: Trái quách thu hái .20

Hình 2.2: Qui trình điều chế các cao thô từ nguyên liệu 26

Hình 2.3: Tinh thể và vết TLC của LAFE02 31

Hình 2.4: Tinh thể và vết TLC của LAFE03 31

Hình 2.5: Cấu tạo khung LAFE02 34

Hình 2.6: Cấu trúc hóa học của LAFE02 35

Hình 2.7: Cấu tạo khung lupan 37

Hình 2.8: Một số tương quan HMBC trong c ấu trúc khung lupan 39

Hình 2.9: Cấu trúc hóa học của LAFE03 44

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Một số hợp chất trong cây quách đã được cô lập 5

Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột MPLC cao FE (32,7 g) 27

Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FE2 (0,3g) 28

Bảng 2.3: Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FE2.4 (90mg) 29

Bảng 2.4: Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FE3 (0,2g) 30

Bảng 2.5: Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FE3.3 (80mg) 31

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong trái quách 32

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của LAFE02 .34

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT c ủa LAFE03 39

Bảng 3.4: So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của LAFE03 và lupeol 42

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN

Bài luận văn gồm các phần sau đây:

Mở đầu Nêu lí do chọn đề tài và mục tiêu của đề tài

Chương 1 Tổng quan về cây Quách và một số nghiên cứu về cây Quách

Chương 2 Thực nghiệm tập trung vào các nội dung chính sau:

Từ nguyên liệu chính là trái Quách được thu hái ở huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh sau nhiều công đoạn xử lý để điều chế bột trái Quách

Tiến hành định tính các nhóm hợp chất chính có trong trái Quách Kết quả cho thấy trong trái Quách có sự hiện diện của các nhóm hợp chất sau: steroid, flavonoid, alkaloid, glycoside, terpenoid, saponin, tanin, coumarine trong trái quách

Từ bột trái Quách tiến hành điều chế cao ethyl acetate Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên cao ethyl acetate và các phân đoạn kết hợp với sắc ký lớp mỏng để cô lập được hai chất sạch

Chương 3 Kết quả và biện luận

Việc nhận danh và xác định cấu trúc dựa trên các tính chất vật lý (màu sắc, dạng tinh thể, Rf , t°nc) và từ các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) kết hợp so sánh với tài liệu đã công bố Kết quả nhận danh chất cô lập được là (-)-epicatechin thuộc nhóm flavonoid ứng dụng làm thuốc chống viêm trong dược học và quercitrin là chất kháng virus, kháng viêm hiệu quả

Chương 4 Kết luận và kiến nghị

Khẳng định lại các kết quả nghiên cứu và kiến nghị cho những nghiên cứu tiếp theo

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

MỞ ĐẦU

Cây quách là loài cây gần như gắn với đời sống đồng bào dân tộc Khơ-me Cây quách cho trái ăn được, người dân thường dùng chế biến các món giải khát và rượu với hương vị đ ặc biệt, có giá trị dinh dưỡng tốt cho sức khỏe Ngoài ra theo kinh nghiệm dân gian, người ta có thể dùng trái quách còn xanh làm thuốc chữa tiêu chảy, trái chín có tác dụng chống táo bón, lá cây quách có thể chữa viêm phế quản

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu hướng tới phục vụ y học nhưng đa phần chưa gắn kết được giữa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất có trong cây quách

Tại Việt Nam, việc sử dụng trái quách chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian, chưa có công trình nào nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học, cũng như thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất nhằm hướng đến việc sử dụng dược liệu một cách hiệu quả, đúng liều lượng và có cơ sở khoa học

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của trái cây quách, để làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu và tìm ra những hoạt tính mới Qua đó, có thể đưa ra khuyến cáo chung khi sử dụng loại dược liệu này về liều lượng dùng, cách dùng… góp phần nâng cao giá trị và kiến nghị bảo tồn loài cây này như một loại dược liệu tại Việt Nam

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học của trái quách

- Cô lập được ít nhất một hợp chất sạch và xác định cấu trúc

Chương 1

TỔNG QUAN

I TỔNG QUAN VỀ CÂY QUÁCH

I.1 MÔ TẢ CÂY

I.1.1 Khái quát phân loại thực vật [2]

Tên khoa học: Limonia acidissima L

Giới thực vật (Plantae)

Ngành: Hạt kín (Angiospermatophyta) hay ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Hai lá mầm (Dicotyledoneae) hay lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)

Bộ: Bồ hòn (Sapindales)

Họ: Cam (Rutaceae) Phân họ: Aurantioideae

Chi: Limonia L

Loài: Limonia acidissima L Tên đồng nghĩa: Feronia Limonia (L.) Swingle

Tên Việt Nam: cây quách, cây cần thăng, cây gáo

Tên nước ngoài: Wood Apple, Elephant Apple, Monkey Fruit or Curd Fruit (Anh); Bal, Bael (Assamese); Koth Bael (Bengali); Kothu (Gujarati); Kaitha, Kath Bel ho ặc Kabeet (Hindi); Kawis ho ặc Kawista (Javanese); Kvet (Khmer); Belada Hannu / Byalada Hannu, balulada hannu (Kannada); Belingai (Malaysia); Vilam Kai (Malayalam); KavaTH (Marathi); Kaitha hoặc Kaintha (Oriya); Billa; Kapittha; Dadhistha; Surabhicchada; Kapipriya; Dadhi; Puspapahala; Dantasatha; Phalasugandhika; Cirapaki; Karabhithu; Kanti; Gandhapatra; Grahiphala; Kasayamlaphala (Sanskarit); Divul (Sinhalese); Vilam Palam (Tamil); Vellaga Pandu

I.1.2 Mô tả [2]

Cây thân gỗ cao tới 6-8 m, thân cây nứt dọc sâu màu xám và có vỏ xù xì Lúc cây còn non thân cây nhẵn màu trắng xanh, phân cành dài gãy khúc nhưng dễ uốn, có gai ở nách lá và có lông thưa

Lá cây quách là dạng lá kép lông chim một lần lẻ, mang bảy lá phụ dạng thuôn bầu dục, mọc đối, không có cuốn phụ và lá có màu xanh lục

Hoa nhỏ xếp dày dạng chùm đơn ở nách lá hay ở đầu cành, màu trắng

Quả mọng hình cầu (đường kính khoảng 5-10 cm), màu xanh xám Vỏ quả dày hóa gỗ, nhẵn, cứng và giòn Bên trong vỏ chứa thịt quả, hạt và các sợi gân

Thịt quả của trái còn non có màu trắng, vị rất chát Trái vừa chín rụng thịt quả có màu vàng nhạt, mùi thơm dịu, có vị chua chua và ngọt nhẹ nhưng vẫn còn hơi chát Đặc biệt khi quả chín rục, vỏ quả có màu bạc trắng, mềm và thịt quả chuyển sang màu nâu đen (như màu me chín), mùi thơm nồng, có vị ngọt dịu gần như không còn vị chát

Hình 1.1 Thân cây quách Hình 1.2 Lá, hoa và trái quách

Hình 1.3 Trái và ruột quách chín

I.2 NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI [2]

I.2.1 Nguồn gốc, phân bố

Cây quách phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á nhiệt đới như Ấn Độ, Srilanca, Myanma, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam

Ở Việt Nam cây mọc chủ yếu ở những vùng đất cát pha, khô cần như các tỉnh: Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Vĩnh Long, Cây quách hiện nay có nhiều ở Trà Vinh, nó được trồng chủ yếu là để lấy bóng mát và lấy trái

I.2.2 Sinh thái

So với các loại cây khác, cây quách dễ trồng, cây phát triển nhanh mà có thể không c ần bất cứ một loại phân bón nào Cây thường được trồng bằng hạt để có bộ rễ chắc, ít đổ ngã

Cây quách trồng kho ảng 6-7 năm tuổi thì cho trái, mỗi năm cho một vụ trái, bắt đầu ra hoa vào khoảng tháng 3 và quả chín rộ vào khoảng tháng 11-12 hàng năm I.3 ỨNG DỤNG Y HỌC DÂN GIAN CỦA TRÁI CÂY QUÁCH

Trái quách còn xanh làm thuốc chữa tiêu chảy, trái chín có tác dụng chống táo bón Thịt quả có tính kích thích ăn uống, giúp tiêu hóa dễ dàng, có lợi cho người bệnh thận và có tính kháng sinh

Ruột trái quách được ngâm rượu dùng làm thuốc bổ, nếu dùng theo giờ giấc và liều lượng nhất định sẽ giúp cường gân cốt, bổ thận, nhuận tràng, dễ tiêu

II TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

II.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

Qua các tài liệu công bố được tìm thấy thì cây quách đã được nghiên cứu về thành phần hóa học từ những năm 1986 cho đến gần đây (2009), các nhà hóa học đã báo cáo phát hiện được khoảng 33 hợp chất tự nhiên từ loài này:

- Năm 2009, Ki Hyun Kim và các công sự công bố đã phân lập được 5 hợp chất

là limodissimin A ((R)-8-(2-hydroxy-3-methylbut-3-enyl)-7-(2-methylene-2H-

-hydroxypropan-2-yl)-8,9-dihydro-2H-furo[2,3-h]chromen-2-one và 2,2-dimethyl chromenocoumarin.[9]

- Năm 1991, Parthasarathi Ghosh và các cộng sự công bố đã phân lập được 3 hợp chất đó là acidissiminol; acidissiminin epoxide và N-benzoyltyramine từ trái quách.[11]

- Năm 1989, Jonh K.Macleod và các cộng sự công bố đã phân lập được 2 hợp chất đó là obacunone và acidissimin.[8]

- Năm 1986, Musa H Abu Zarga đã công bố phân lập được 15 hợp chất là umbelliferone, geranyl umbelliferone, marmesin, xanthotoxine, luvangetin, suberosin,

epoxysuberosin, suberenol, dihydrosuberenol, crenulin, crenul atin, β-sitosterol, lupeol,

limonoid limonin và 4-methoxy-1-methyl-2-quinolone.[5]

Ngoài ra còn có một số công bố về hoạt tính sinh học khá thú vị của cao chiết từ cây quách, nhất là khả năng kháng vi sinh mạnh, chống viêm nhiễm…

II.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Ở Việt Nam, mới tìm thấy một công trình duy nhất của Nguyễn Văn Mười và các cộng sự (2009) nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng và khả năng chế biến nước quách lên men, chưa có công bố nào về thành phần hóa học.[7]

Như vậy, về thành phần hóa học, theo những tài liệu đã công bố từ những năm

1986 cho đến gần đây (2009), các nhà hóa học đã tách được khoảng 25 hợp chất từ

cây quách (Limonia acidissima L) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Một số hợp chất trong cây quách đã được cô lập

ST

CTPT Khối lượng mol phân tử

Tài liệu

III TÍNH CẤP THIẾT, MỚI MẺ VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Qua những tài liệu đã được thể hiện trong phần tổng quan cho thấy, cây quách

quách còn ít (chỉ khoảng 34 hợp chất) Do vậy, đề tài tiến hành bước đầu khảo sát thành phần hóa học trái quách để làm cơ sở khoa học ban đ ầu cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm sớm đưa cây quách trở thành một vị thuốc có giá trị, cũng như đóng

góp thêm những hiểu biết về thành phần hóa - thực vật của con người về loài Limonia

acidissima L mọc chủ yếu ở những vùng đất cát pha, khô cằn như các tỉnh: Trà Vinh,

Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Vĩnh Long, qua đó nâng cao giá trị sử dụng

và khuyến khích bảo tồn loài thực vật này

Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học trên trái quách là 1 bộ phận

của bộ dữ liệu hóa thực vật toàn diện của cây quách (Limonia acidissima L.) nhất là

cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây quách

IV MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

IV.1 MỤC TIÊU

- Mục tiêu chính của đề tài là nghiên cứu thành phần hóa học của trái cây quách ở tỉnh Trà Vinh để làm phong phú dữ liệu hóa thực vật và có thể tìm thêm những chất có cấu trúc mới trên loài cây này

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học, đặc biệt là ho ạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và hợp chất thu được dưới dạng tinh khiết (nếu đủ lượng hợp chất cô lập) để tìm ra các chất có hoạt tính mạnh ho ặc mới nhằm hướng đến việc ứng dụng chữa bệnh

- Góp phần nâng cao kiến thức, kỹ năng làm công tác nghiên cứu khoa học cho sinh viên - đội ngũ lao động tri thức kế thừa trong tương lai

IV.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trái quách (Limonia acidissima L.) ở tỉnh Trà Vinh

IV.3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

IV.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và xử lý mẫu

- Điều chế các cao chiết

- Lập báo cáo, tổ chức nghiệm thu

IV.3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Chỉ nghiên c ứu trên trái quách ở thời điểm già và chín (kho ảng 5 đến 6 tháng tuổi), như người dân thường sử dụng

- Lấy mẫu mùa nắng ở địa bàn huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh, một trong những nơi thích hợp phát triển trồng nhiều cây quách

- Bước đầu nghiên cứu chủ yếu là thành phần hóa học, phân lập kho ảng 1-2 hợp chất tinh khiết, tùy cấu trúc mà chọn thử hoạt tính sinh học phù hợp

V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

V.1.2 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại chất ra riêng thành từng loại chất tinh khiết

 Sắc ký bản mỏng

dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ

Bình sắc ký là chậu, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy P ha tĩnh là một lớp mỏng silicagel khoảng 25 nm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng

Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân c ực khác nhau Sử dụng khoảng 1 l dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản

để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau,

đi phía sau mức dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp phụ của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

 Sắc ký cột

Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Absorption chromatography)

Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu ho ặc dính lên bề mặt của pha tĩnh Các chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển qua pha tĩnh, chúng sẽ tách nhau ra

Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silicagel Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên đây là pha tĩnh có tính rất phân cực V.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

V.2.1 Phương pháp đo các chỉ số vật lý

- Đo Rf trong phép sắc ký bản mỏng

- Đo điểm chảy

- Đo độ quay cực riêng…

Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử Các thông số của phổ

1H-NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin – spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó

 PHỔ 13C-NMR

Cho thông tin về khung carbon của phân tử Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong kho ảng thang chia độ rộng (0-250 ppm) (có thể đến 600 ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của carbon đó

Phổ 13C-NMR DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời cả 2 phổ 1H-NMR và 13C-NMR Kỹ thuật này cho các tín hiệu carbon gắn với 1, 2 ho ặc 3 hydro

 PHỔ HSQC VÀ HMBC

Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C

ngang qua 1 nối hóa trị

Phổ HMBC cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị

 PHỔ COSY

Cho thông tin về sự tương tác giữa H và H gắn trên cùng 1 carbon

V.3 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH [12-17]

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá khả năng kháng sinh của mẫu cao chiết hoặc tinh chất Quá trình được thực hiện trên phiến vi lượng

96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991); Larry McKane và Judy Kandel (1996)

Chương 2

THỰC NGHIỆM

I NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

I.1 NGUYÊN LIỆU

I.1.1 Thu hái nguyên li ệu

Mẫu thực vật được dùng trong đề tài là trái quách già và chín (kho ảng 5 đến 6

tháng tuổi) được thu hái tại huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh

Thời gian thu hái: tháng 5/2014

I.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, lo ại bỏ phần sâu bệnh Toàn bộ trái quách được tách ra, phơi khô trong bóng râm rồi sấy lại ở 50°C Sau khi sấy khô rồi được xay thành bột mịn Đây là nguyên liệu dùng trong đề tài

I.2 HÓA CHẤT

 Ethanol 96o, Việt Nam

 Silicagel 60 F254, Scharlau, đường kính hạt 0.04 - 0.06 mm

 n-hexan, Trung Quốc

 Methanol, Trung Quốc

 Chloroform, Trung Quốc

 Ethyl acetate, Trung Quốc

Hình 2.1 Trái quách thu hái

 Máy đánh siêu âm

 Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S

 Bếp điện dùng để nướng bản mỏng Blacker®

 Bình cô quay loại 50, 100, 250, 500, 1000 mL

II ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRÁI QUÁCH

II.1 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT STEROID

Cân 1g bột khô, cho vào 20 mL CHCl3 và ngâm trong 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch trong là mẫu thử

Thuốc thử:

- Salkowsky: H2SO4đđ (1 mL)

- Libermann-Burchard: (CH3CO)2O (20 mL), H2SO4đđ (1 mL)

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 mL các thuốc thử theo thành ống nghiệm Để yên quan sát

- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dương tính

- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dương tính

II.2 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID

Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50 mL EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

Thuốc thử: HClđđ + Mgbột + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa, dung dịch FeCl3 1%

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa

II.3 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT ALCALOID

Cân 5g bột khô ngâm với 80 mL HCl 1% trong 4-6 giờ Lọc lấy dịch trong làm thuốc thử

- Thuốc thử Wasicky: Có kết tủa hình bông sao là dương tính

- Thuốc thử Bouchardat: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dương tính II.4 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT SAPONIN

II.4.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin

Cơ sở của phương pháp: Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc

Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500 mL chứa sẵn 100 mL nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 mL Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, , 10 mL dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 mL Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt

Chỉ số bọt được tính theo công thức:

Trong đó: CSB: Chỉ số tạo bọt

i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1cm

Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin

II.4.2 Dựa vào các phản ứng đặc trưng

Cân 5g bột khô, thêm vào 50 mL EtOH 70° và đun cách thủy sôi trong 5 phút rồi lọc Cô cạn dưới áp suất kém đến cặn khô Cặn khô này dùng làm mẫu thử

Thuốc thử: Libermann-Burchard: (CH3CO)2O, H2SO4đđ

Tiến hành: Hòa mẫu bằng 1 mL (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5 mL H2SO4 đđ Nếu xuất hiện vòng ngăn cách:

- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpenoid

- Có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

II.5 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT TANIN

Cân 5g bột khô, thêm vào 100 mL nước cất, đun sôi trong 10 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

Thuốc thử:

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nước

- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nước

Tiến hành: Lấy 2 mL dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu hiệu dương tính

- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen (do tạo phức) là dấu hiệu dương tính

CSB = 100.(10/i)

II.6 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT GLYCOSIDE

Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE Tiếp theo chiết với EtOH 50% Dịch lọc được loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện Sau đó loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô Hòa tan cao này bằng EtOH 90% và lấy dung dịch này làm mẫu thử

Thuốc thử:

- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1 mL) + dung dịch NaOH 10% (1 mL) + dung dịch NH4OH 25% từ từ từng giọt

- Fehling:

 Dung dịch A: CuSO4.5H2O (40g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít

 Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít

Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau

Tiến hành: Lấy 1 mL mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1 mL các thuốc thử

- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu bạc là dấu hiệu dương tính

- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dương tính

II.7 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT COUMARINE

Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50 mL EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch

- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2 mL mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2 mL dung dịch Na2CO3 10% và 4 mL H2O Nếu dung dịch trong ố ng chuyển sang màu

đỏ thẫm là dương tính

III ĐIỀU CHẾ CAO THÔ, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT

III.1 ĐIỀU CHẾ CÁC CAO THÔ

Bột trái quách (1,8 kg) được tận trích với ethanol 96 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH dạng sệt có khối lượng 150 g

Đem cao EtOH chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng

dần: n-hexane, EtOAc

Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với 3 lít n-hexane đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao n-hexane có khối lượng 12,4 g

Phần không tan trong n-hexane được chiết với 4 lít EtOAc Lọc lấy phần dịch

tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOAc có khối lượng 32,7 g

Quá trình thực hiện được tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.2

Hình 2.2: Qui trình điề u chế các cao thô từ nguyên liệu

- Chiết với n-hexane (3 lít)

- Cô cạn dưới áp suất thấp

Bột trái quách (1,8 kg)

- Chiết với EtOAc (4 lít)

- Cô cạn dưới áp suất thấp