ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR POLYMERASE CHAIN REACTION TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES Nguyễn Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG

PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES

Nguyễn Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà nội

1, Đại Cồ Việt, Hai Bà trưng Hà nội Fax: 4 868 2452, tokimanh@mail.hut.edu.vn

I MỞ ĐẦU

L monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với những hậu quả trầm trọng như

sảy thai, thai chết lưu và đẻ non đối với phụ nữ mang thai, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém Liều gây nhiễm của chúng rất thấp chỉ khoảng 102 CFU/g đối với người trưởng thành và 10 CFU/g đối

với trẻ em và phụ nữ mang thai [7, 8, 11, 13, 14, 16 và 17] Ở các nước phát triển, L

monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát nghiêm ngặt trong quản lý chất lượng

thực phẩm Tuy nhiên tại Việt nam, chưa có tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm nào kiểm soát tác nhân gây bệnh này và vì thế chưa có số liệu nào đề cập tình trạng nhiễm

L monocytogenes ngay cả đối với các thực phẩm không qua xử lý nhiệt và bảo quản

lạnh dài ngày [1]

Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm các bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hoá sinh để khẳng định sự hiện diện của một loài gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày đến vài tuần [3, 6, 8] Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã được thiết lập PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh và đặc hiệu mầm bệnh Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh

thực phẩm [4, 8 và 11] Với mục tiêu góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm, trong bài viết này, chúng tôi trình bày các khảo nghiệm xây dựng quy trình phát hiện nhanh L monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F LM-R như một công cụ kiểm

soát loài vi khuẩn nguy hiểm này

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật

Quy trình phát hiện được xây dựng trên chủng L monocytogenes 0704 do phòng thí

nghiệm vi sinh vật ENSAT, Trường Đại học Bách khoa Toulouse, Pháp cung cấp Các chủng thử nghiệm khác được dẫn ra trong bảng 1

Hoá chất

Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di trên gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp và 1000bp do Sigma cung cấp Các hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR do Amersham Phamacia Biotech cung cấp Các hoá chất sử dụng cho

phân tích trình tự gen (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, bộ kit tách dòng Topo TA Cloning

Kit, bộ kit tách và tinh sạch plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit) do Invitrogen

cung cấp, kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1 do Applied Biosystem cung cấp

Các hoá chất khác ở độ tinh khiết phân tích

Mồi cho phản ứng PCR

Dựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L monocytogenes đã được công bố trên

ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp [2]

Xác định tính đặc hiệu của mồi

Khả năng bắt cặp chính xác của mồi được khẳng định bằng cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger và cộng sự [15] và so sánh với trình tự các

gen đích hlyA của các L monocytogenes theo phần mềm BLAST Tính đặc hiệu của

mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn

DNA của vi khuẩn L monocytogenes và không phải L monocytogenes trong phản ứng

PCR

Phản ứng PCR

DNA khuôn từ L monocytogenes 0704 được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách

tách và làm sạch DNA với chloroform [4] hoặc xử lý nhiệt tế bào ở 1000C trong 10 phút Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 µM/mỗi loại) Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích hỗn hợp 25 µl với chu trình nhiệt gồm 940C - 3 phút, (940C 1 phút, 600C 1 phút, 720C 1 phút) x 30 chu trình, 720C - 5 phút và 40C - 5 phút Đánh giá kết quả phản ứng PCR dựa trên phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với 3 µl sản phẩm

Xác định độ nhạy của phương pháp

Canh trường nuôi qua đêm của L monocytogenes trên môi trường LEB được định

lượng, pha loãng tới các mật độ thích hợp Ly tâm thu sinh khối của 1 ml canh trường hòa tan trong 100 µl TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3 µl dịch tế bào đã qua xử lý nhiệt được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Đánh giá kết quả phản ứng PCR nhờ phân tích sản phẩm bằng điện di trên agarose 1%

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tách DNA bộ gen

DNA bộ gen từ L monocytogenes 0704

được tách và làm sạch dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn

gen mục tiêu hlyA với cặp mồi

LMF-LMR, Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch được thể hiện trong hình 1- giếng 2 cho thấy một băng DNA có kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế

Với mục đích thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR một cách đơn giản

hơn, huyền phù L monocytogenes được

Hình 1: Sản phẩm khuyếch đại với cặp mồi LM-F, LM-R từ khuôn DNA

của L monocytogenes

Giếng 1: marker DNA 100bp;

Giếng 2: PCR với DNA tinh sạch Giếng 3: PCR với DNA sau xử lý 500bp4

400bp4

3

xử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR

Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tách bằng xử lý nhiệt như trên được thể hiện ở hình 1, giếng 3

Bảng 1 Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm

1 Listeria monocytogenes 0704 Phòng thí nghiệm vi sinh vật, ENSAT, Đại học Bách khoa

Toulouse, Pháp

2 Listeria spp Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM

3 Bacillus cereus BC1 Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM

4 Bacillus cereus BC2 Bảo tàng giống VSV, Viện công nghiệp thực phẩm, Hà nội

5 Bacillus subtilis FS-2 Viện công nghệ sinh học - công nghệ thực phẩm, Đại học

Bách khoa, Hà nội

6 Salmonella spp Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội

7 Salmonella typhi Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội

8 Staphylococcus aureus Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội

9 Vibrio cholerae serovar inaba Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội

10 Vibrio cholerae serovar

ogawa

Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội

11 E coli Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội Kết quả trên hình 1 cho thấy, trong cả hai trường hợp sử dụng DNA tinh sạch (giếng 2)

và DNA xử lý nhiệt (giếng 3) đều thu nhận được tín hiệu đoạn khuyếch đại có kích

thước nằm trong khoảng 400-500 bp Việc tách chiết DNA bộ gen của L monocytogenes bằng chloroform phải trải qua nhiều công đoạn, mất thời gian và hoá

chất, trong khi đó, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly DNA làm khuôn cho phản ứng PCR đơn giản, tốn ít thời gian và rẻ tiền, cho kết quả tương đương Do vậy, để tiến đến khả năng áp dụng cho các phân tích thông dụng, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly khuôn DNA được chọn để thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR

Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F, LM-R

Để khẳng định khả năng bắt cặp chính xác

của cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA của L monocytogenes, trình tự sản phẩm

PCR của cặp mồi này được xác định và so

sánh với trình tự gen đích hlyA của các L

monocytogenes

Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi LM-F,LM-R được gắn trực tiếp vào vectơ pCR4 - TOPO DNA plasmid chứa sản phẩm PCR được tách

dòng trong E.coli DH5α Tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmit tái tổ hợp (sử dụng bộ kit QIA prep Spin Miniprep Test Kit), kiểm tra sản phẩm trên agarose 1% Kết quả điện di cho thấy các plasmit của khuẩn lạc trắng có kích thước lớn hơn

so với đối chứng (không trình bày hình

500 bp „

400 bp „

Hình 2: Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp

bằng Eco RI

1: marker DNA 100 bp 2: sản phẩm PCR

3-6: các plasmid tái tổ hợp cắt với Eco RI

ảnh điện di) Sản phẩm PCR gắn trong plasmid được kiểm tra bằng cách cắt với EcoRI Kết quả xử lý plasmid tái tổ hợp với EcoRI được trình bầy trong hình 2 cho thấy đoạn

DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR Chúng tôi tiến hành xác định trình tự sản phẩm này

Trình tự sản phẩm PCR được xác định bằng thiết bị xác định trình tự tự động ABI 3100

Avant, kết quả trình bày tại bảng 2 Trình tự này được so sánh với trình tự hlyA của các

L monocytogenes đã được công bố Kết quả so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch

đại bằng cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 %

với trình tự hl yA của 53 chủng L Monocytogenes công bố (không trình bày kết quả) Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R đã thiết kế cho phép nhân chính xác đoạn gen hlyA của

L monocytogenes

Bảng 2 Trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi LM-F, LM-R

SEQUENCE 468BP 186A 81C 94G 107T AAAAGAGAGG GGTGGCAAAC GGTATTTGGC ATTATTAGGT TAAAAAATGT AGAAGGAGAG TGAAACCCAT GAAAAAAATA ATGCTAGTTT TTATTACACT TATACCAGTT AGTCTACCAA TTGCGCAACA AACTGAAGCA AAGGATGCAT CTGCATTCAA TAAAGAAAAT TCAATTTCAT CCATGGCACC ACCAGCATCT CCGCCTGCAA GTCCTAAGAC GCCAATCGAA AAGAAACACG CGATGAAAT CGATAAGTAT ATACAAGGAT TGGATTACAA TAAAAACAAT GTATTAGTAT ACCACGGAGA TGCAGTGACA AATGTGCCGC CAAGAAAAGG TTACAAAGAT GGAAATGAAT ATATTGTTGT GGAGAAAAAG AAGAAATCCA TCAATCAAAA TAATGCAGAC ATTCAAGTTG TGAATGCAAT TTCGAGCCTA ACCTATCCAG GTGCTCTCGT AAAAGCGA

Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F và LM-R trong việc phát hiện L monocytogenes, phản ứng PCR được thực hiện trên các khuôn DNA của các vi khuẩn

khác nhau Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR (hình 3) cho thấy chỉ có giếng 2 có tín hiệu của băng 468 bp, các giếng còn lại đều thể hiện kết quả PCR âm tính Như vậy,

cặp mồi LM-F, LM-R có khả năng phát hiện đặc hiệu L monocytogenes

Hình 3 Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F và LM-R

1 marker DNA 100bp 7 Bacillus subtilis FS-2

2 L monocytogenes 0704 8 Listeria spp

3 Salmonella typhy 9 Staphylococus aureus

4 Salmonella spp 10 Vibrio cholerae serovar inaba

5 Bacillus cereus BC1 11 Vibrio cholerae serovar ogawa

6 Bacillus cereus BC2 12 E coli

468bp„

5

Xác định điều kiện tối ưu cho PCR

Nồng độ Mg 2+

Phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ cuối cùng của Mg2+ từ 1,5 mM đến 4,0

mM Kết quả thể hiện trong hình 4 cho thấy phản ứng PCR với nồng độ Mg2+ từ 1,5

mM đã cho kết quả dương tính

Nồng độ dNTPs

Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ dNTPs từ 100 µM đến 250 µM Kết quả được thể hiện trong hình 5 cho thấy ở nồng độ dNTPs 100, 150, 200, 250 µM, PCR đều cho tín hiệu khuyếch đại (giếng 2, 3, 4, 5) Như vậy, dNTP 100 µM được chọn để thực hiện phản ứng PCR

Nồng độ mồi

PCR được thực hiện tại các nồng độ mồi khác nhau từ 0,1 đến 0,5 pmol Kết quả được thể hiện ở hình 6 Chỉ có giếng 5, 6 (hình 7) cho tín hiệu của vạch 468 bp, tương ứng với PCR

ở nồng độ mồi 0,4 pmol, 0,5 pmol Vậy nồng

độ 0,4 pmol /mồi có thể chọn cho phản ứng PCR dương tính

Như vậy, điều kiện phù hợp cho phản ứng

PCR với quy trình đã chọn để phát hiện L

monocytogenes với cặp mồi LM-F, LM-R là:

0,4 pmol /mồi; 100 µM dNTPs, Mg2+ 1,5 mM

Độ nhậy của phương pháp PCR phát hiện

L Monocytogenes

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng

độ dNTPs lên phản ứng PCR

Giếng 1: marker DNA 100 bp;

Giếng 2: 100µM Giếng 4: 200µM

Giếng 3: 150µM Giếng 5: 250µM

Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ mồi

lên phản ứng PCR

Giếng 1: marker DNA100 bp, Giếng 4: 0,3 pmol; Giếng 2: 0,1 pmol Giếng 5: 0,4 pmol;

Giếng 3: 0,2 pmol Giếng 6: 0,5 pmol

3468bp 3468bp

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ Mg 2+

lên phản ứng PCR

1: marker DNA 100 bp;

2: 1,5 mM 5: 3,0 mM 3: 2,0 mM 6: 3,5 mM 4: 2,5 mM 7: 4,0 mM 468bp4

Dịch tế bào được xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Pha loãng dịch vi khuẩn tới các nồng độ khác nhau (bảng 3), xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn 3

µl dịch sinh khối vi khuẩn sau khi xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết quả được thể hiện ở hình 7 cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với các mẫu

có mật độ tế bào ≥ 6x102 /phản ứng (giếng 5, 6, 7, 8) tương ứng với mật độ tế bào từ 2.104 CFU/ml

Bảng 3: Mật độ tế bào của các mẫu kiểm tra độ nhạy phản ứng PCR

Mật độ tế bào (CFU/phản ứng) 6x10

5

6x104 6x103 6x102 6x 10 6 6.10-1 Mật độ tế bào

(CFU/ml) 2x10

7

2x106 2x105 2x104 2x103 2x102 2x10

Như vậy, phương pháp PCR phát hiện L

monocytogenes của chúng tôi có độ nhạy

tương đương với kít thương mại BAXTM của Qualicon Inc., (104 CFU/ ml) nhưng

nhỏ hơn của Listeria monocytogenes

LightCycler của Roche (103 CFU/ ml) Các nghiên cứu đang được tiếp tục tiến hành để nâng cao độ nhạy của phương pháp Các khảo nghiệm phân tích vi khuẩn này ở mật

độ nhiễm thấp hơn cũng đang được kiểm tra trên mẫu thực phẩm gây nhiễm nhân tạo

IV.KẾT LUẬN

Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với

L monocytogenes, cho phép phát hiện vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes ở mật độ

6.102 CFU/phản ứng (2 104CFU/ml) Các điều kiện PCR được tối ưu hoá nhằm giảm tối đa chi phí cho phân tích Đây là nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phân tích

L monocytogenes đầu tiên tại Việt nam

Nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài trợ của dự án hợp tác nghiên cứu Vlir - HUT AP05\Prj3\Nr01 và một phần bởi đề tài KC 04-30 Các tác giả cám ơn TS

Piveteau, ENSBANA, Cộng hòa Pháp về việc cung cấp chủng L monocytogenes và

các cơ quan khác đã cung cấp các chủng VSV thử nghiệm

SUMMARY

PCR applied in detection of pathogens is one of approaches to overcome the difficulty

of the conventional labor- and time-consuming analysis method used in actual food

borne pathogen analysis To reach the goal, the study of detection L monocytogenes by

468bp„

Hình 7 Sản phẩm PCR theo mật độ tế

bào

Giếng 1: marker DNA100 bp, Giếng 2: mẫu 7 Giếng 5: mẫu 4 Giếng 3: mẫu 6 Giếng 6: mẫu 3 Giếng 4: mẫu 5 Giếng 7: mẫu 2

7

PCR using newly desinged primers LM-F, LM-R for the amplicon of 468 bp was carried out

The nucleotide sequence of the amplicon was determined and achieved the homogeneity

of more than 98% with hlyA sequence of 53 L monocytogenes strains published in Gene bank showing the stringent annealing of the primers with target DNA of L monocytogenes LM-F, LM-R primers were found to be specific for L monocytogenes

in giving positive result uniquely with DNA from L monocytogenes but not with any non-L monocytogenes The PCR procedure consisted of 25 µl reaction mixture run with thermal cycles for the LM-F, LM-R of 940C for 3 min then 30 cycles of (940C for 1 min., 600C for 1 min., and 720C 1 min.) following by 720C for 5 min and finally 40C for 5 min PCR was optimized with concentrations of primers of 0,4 pmol /each, of dNTPs of 100 µM/each and of Mg2+ of 1,5 mM using DNA template released from

heat treated cells of L monocytogenes in order to lower the cost The detection limit of

the developed PCR was determined as 6.102 CFU/reaction (equivalent to 2.104/ml) It

was the first study for L monocytogenes detection by PCR in Vietnam and open

possibility to control and warning the deadly bacterium infection from food and environment

The authors express many thanks for the kind gift of L monocytogenes from Dr

Lebrihi, ENSAT, France and other species by various institutions This research was done under the support of project KC-30 and a grant from the VLIR-HUT cooperative research program AP05\Prj3\Nr01

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bộ Y tế, Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm năm 1999, 2000, 2001, 2002, 2003

2 Nguyễn Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích Listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn cao học, Đại học Bách khoa Hà nội,

11, 2004

3 Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm

và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục

4 Ausubel F M., Brent R., Kingston R R., Moore D D., Seigman J G., Smith J A.,

Struhl K (1995) Short protocols in Molecular biology, 3rd ed

5 Border, P.M., Howard, J.J., Plastow, G.S and Siggens, K.W (1990), “Detection

Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction ”, Lett Appl Microbiol 11, 158 - 162

6 FAO (1992), “Chapter 11 Listeria”, in Microbiologycal analysis, 119 - 130

7 Fsihi, H., Steffen, P and Cossart, P (2001), “Listeria monocytogenes”, Principles

of Bacterial Pathogenesis, ed E.A Groisman, Academic Press, San Diego, 751 -

803

8 Harrigan, Wilkie F (1998), Laboratory methods in Food microbiology, Academic

Press, 198 - 200

9 Holko, I., Urbanovas, J., Kantíková, M., Pástorová, K., Kmet, V (2002), “PCR

detection of Listeria monocytogenes in milk and milk products and differentiation

of suspect isolates ”, Acta Vet Brno 71, 125 - 131

10 Johnson, E A (2003), “Chapter 2 Bacterial Pathogens and Toxins in Foodborne

Disease”, in Food Safety: Contaminants and Toxins, ed J P F D’Mello, CAB

International, 25 - 45

11 Lou, Y and Yousef, A.E (1999), “Characteristics of Listeria monocytogenes important to food processors”, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed E.T

Ryserand E.H Marth, Marcel Dekker, Inc., New York, 131 - 224

12 Olsen J.E., Aabo S., Hill W., Noterman S., Wernars K., Granum P E., Pôpvic T., Rasmussen H N., Olsvik F (1995), Probe and polymerase chain reaction for

detection of food-borne bacterial pathogens, Inter J Food Microbiol 28, 1-78

13 Rocourt, J and Cossart, P (1997), “Listeria monocytogene ”, in Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, D.C, 337 -

352

14 Ryser, E.T and Marth, E.H (1991), Listeria, Listeriosis and Food Safety, Marcel

Dekker, Inc., New York

15 Sanger et al (1977), “DNA sequencing with Chan termination Inhibitors”, Academic, Science, USA, Vol 74, pp.54-62

16 Slutsker, L and Schuchat A (1999), “Listeriosis in humans”, Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed E.T Ryserand E.H Marth, Marcel Dekker, Inc., New York,

75 - 95

17 Swaminathan, B (2001), “Chapter 18 Listeria monocytogenes”, in Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ed M P Doyle, L R Beuchat, T J

Montville, ASM Press, Washington, D.C, 383 - 409