Nghiên cứu khoa học những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”

Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv.. Phản ứng PCR để nhân các vùng không mã hoá của cpD

Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004 464-468

Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ

di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv

Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nguyễn Hoàng Nghĩa

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Đặt vấn đề

Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng mà nguyên nhân chủ yếu vẫn là hậu quả của việc tàn phá môi trường sống và thu hẹp diện tích rừng

tự nhiên

Cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv còn gọi là cây Lim, họ phụ Vang

Caesalpinioideae, họ Đậu Leguminosae Lim xanh là loài cây gỗ quý, nổi tiếng từ lâu

đời, có giá trị kinh tế cao và hiện vẫn đang được ưa chuộng trên thị trường [1]

Lim xanh có phân bố trải dài suốt từ Quảng Ninh đến Quảng Bình trong đó có các xuất xứ nổi tiếng như Cầu Hai, Chân Mộng (Vĩnh Phú), Ba Vì, Sơn Tây (Hà Tây), Mai Sưu (Hà Bắc) hoặc Hữu Lũng (Lạng Sơn) song đến nay khó tìm thấy những quần thụ lim rộng lớn mà chỉ còn một số cá thể rải rác [12] Hiện nay Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã sưu tầm và bảo tồn cây Lim xanh từ nhiều xuất xứ khác nhau Câu hỏi được đặt ra là liệu các xuất xứ này có trùng lặp nhau hay không?, chúng ta có cần thiết phải bảo tồn nguồn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ hay không?

Những năm gần đây các chỉ thị phân tử được dùng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại ở nhiều loại cây Trong số đó, chỉ thị RAPD được sử dụng rộng rãi nhất, bởi kỹ thuật này đơn giản và ít tốn kém RAPD đã được sử dụng để xác định giống [4,5] và

mối quan hệ phát sinh loài ở Citrus [6]

Việc sử dụng chỉ thị ADN lục lạp (cpDNA) trong phân tích phát sinh loài đã mang lại những kết quả rất lý thú bởi tính bảo thủ của nó trong thiên nhiên, tần số đột biến thấp hơn ADN nhân và có kích thước nhỏ Sự đa hình của ADN lục lạp được sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định mối quan hệ địa lý hoặc đa dạng di truyền các loài [3,10] Phản ứng PCR để nhân các vùng không mã hoá của cpDNA với các mồi lục lạp phổ biến, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng các enzym cắt hạn chế để tìm đa hình đã

được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài ở Citrus

Trong bài này, chúng tôi trình bày những kết quả về sử dụng chỉ RAPD và cpDNA trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh nhằm đưa ra khuyến cáo về việc bảo tồn nguồn gen đối với loài cây quan trọng này

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu

Chín mẫu xuất xứ Lim xanh (Thanh Hoá, Ba Vì, Hà Bắc, Đông Giang, Lang Hanh, Nghệ An, Cầu Hai, Tam Đảo, Quảng Ninh) do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp

Hoá chất chuẩn được mua từ các hãng Sigma và Amersham (Mỹ)

Các mồi RAPD (C1, C7, C9, B1, B4, B9) được mua từ hãng Operon - Mỹ Các mồi

lục lạp (cpDNA) trnH-trnK, PsbC-trnS được mua từ hãng Fermentas theo trình tự đã

công bố [9]

Phương pháp

Nghiên cứu đa dạng loài

Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành như đã công bố [2] Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh

bằng hệ thống Thermal Imaging System FTI-500, Pharmacia Biotech

Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp Phản ứng PCR của ADN genome các xuất xứ Lim xanh với hai cặp mồi cpDNA (20 nucleotide) được tiến hành với tổng thể tích là 25 μl/mẫu gồm: ADN tổng số (12 ng), dNTP (0,2 mM), mồi cpDNA (10 ng), MgCl2 (1,5 mM), Taq polymerase (2 đơn vị) và 2,5 μl đệm 10xPCR Chu trình nhiệt: 920C 2 phút;

10 chu kỳ gồm các bước: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút; 20 chu kỳ gồm các bước sau: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút 10 giây; cuối cùng kéo dài ở 720C 10 phút [7,8] Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím

Phân đoạn ADN duy nhất nhận được từ sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được cắt

bằng các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I và sau đó điện di trên gel agarose 1,5

%, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh

Phân tích số liệu

Các số liệu được đưa vào xử lý bằng chương trình NTSYS pc (Rohlf F J, 1993) [11]

để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý

tiếp trong NTSYS - SIMQUAL và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Phân tích đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim xanh bằng các chỉ thị RAPD

Trung bình mỗi mồi cho 5,2 đến 9,7 phân đoạn (hình 1) Tổng số 428 băng đa hình/428 băng nhận được từ các phản ứng PCR ADN genome từ 9 xuất xứ với 6 mồi RAPD Như vậy là tỷ lệ đa hình đạt 100% Số phân đoạn đa hình ở từng mồi là rất cao, đạt 47-87 phân đoạn

Mồi C7 cho số phân đoạn đa hình thấp nhất cũng đạt 47 phân đoạn ở 9 xuất xứ, mồi C1 và B1 cho số phân đoạn đa hình cao nhất, 87 phân đoạn

ở 9 xuất xứ Lim xanh, số phân đoạn trung bình từ 5 đến 11 Xuất xứ Nghệ An cho số phân đoạn trung bình thấp nhất (5 phân đoạn), xuất xứ Hà Bắc cho số phân đoạn trung bình cao nhất (11 phân đoạn) Cả chín xuất xứ đều cho số phân đoạn đa hình bằng số phân đoạn đếm được, nghĩa là tỷ lệ phân đoạn đa hình ở 9 xuất xứ Lim đều đạt 100% Như vậy, bước đầu dựa trên các chỉ thị RAPD chúng tôi có nhận xét là các xuất xứ

Lim xanh rất đa dạng về mặt di truyền

Bảng 1 Tỷ lệ đa hình của 9 xuất xứ Lim xanh với chỉ thị RAPD

Ký

hiệu Xuất xứ Tổng số băng đếm được Tổng số băng đa hình Số băng tb ở mỗi xuất xứ Tỷ lệ băng đa hình(%)

Phân tích sự đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim bằng chỉ thị ADN lục lạp

Kết quả PCR-cpDNA với mỗi mồi lục lạp đều nhận được một phân đoạn ADN duy

nhất có kích thước mong muốn Sản phẩm với cặp mồi trnH-trnK cho phân đoạn ADN

có độ dài 1750 bp (hình 2a) còn với cặp mồi psbC-trnS thì cho phân đoạn có kích thước

1600 bp Sản phẩm PCR-cpDNA của cặp mồi trnH-trnK với 9 xuất cây Lim xanh được cắt bởi các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I với mục đích tìm ra các vị trí cắt của

các enzym này ở các xuất xứ khác nhau Từ đó có thể nhận được đa hình giữa các xuất

xứ Kết quả minh họa ở hình 2b

Từ kết quả ở các hình ảnh thu được cho thấy sau khi cắt với 3 enzym đã thu được 72 phân đoạn từ sản phẩm cắt, trong đó có 54 phân đoạn đa hình

Enzym Tag I cắt gen lục lạp của một xuất xứ duy nhất đó là Quảng Ninh và ở một vị

trí cắt duy nhất (1600 bp)

Enzym Hha I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 4 vị trí (thứ tự như sau vị trí 1: 1500

bp, vị trí 2: 1000 bp, vị trí 3: 700 bp, vị trí 4: 600 bp) Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo có vị trí cắt như nhau, đó là vị trí cắt 2, 3, 4 ở xuất xứ

Ba Vì, Đông Giang, enzym Hha I cắt gen lục lạp vị trí 2 và 4; còn xuất xứ Nghệ An và

Quảng Ninh, enzym này cắt ở vị trí 1, 2, 3

Enzym Hinf I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 6 vị trí (vị trí 1: 700 bp, vị trí 2: 600

bp, vị trí 3: 500 bp, vị trí 4: 200 bp, vị trí 5: 100 bp, vị trí 6: 80 bp) Enzym này cắt gen lục lạp các xuất xứ Ba Vì, Đông Giang ở cả 6 vị trí nêu trên Các xuất xứ Thanh Hoá,

Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo, enzym này cắt ở 5 vị trí 1, 2, 3, 4, 5 Tuy

nhiên, enzym Hinf I không cắt bất kỳ một vị trí nào trên gen lục lạp của 2 xuất xứ

Quảng Ninh và Nghệ An

Như vậy, các kết quả phân tích chỉ thị cpDNA cho thấy các xuất xứ Lim xanh rất khác nhau về mặt di truyền tế bào chất

3.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh

Các phân đoạn đa hình dựa trên phân tích RAPD và cpDNA được ghi nhận dựa trên

sự có mặt hay vắng mặt của chúng Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là

0 Các số liệu này được xử lý bằng chương trình NTSYS-pc để phân tích mối tương quan giữa các đối tượng nghiên cứu Dựa trên ma trận số liệu được thiết lập, chúng tôi tiến hành xác định mối tương quan di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh

Dựa vào các hệ số giống nhau về di truyền Jaccard thu được, một sơ đồ về quan hệ

di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh được thiết lập (hình 3) Từ sơ đồ nhận được chúng tôi thấy rằng quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Lim là rất xa nhau 100% các xuất xứ

có hệ số di truyền nhỏ hơn 0,5 Hai xuất xứ Lang Hanh và Cầu Hai được coi là gần nhau nhất về quan hệ di truyền (tuy nhiên hệ số Jaccard cũng chỉ đạt 0,43)

Hai xuất xứ Quảng Ninh và Nghệ An có mối quan hệ di truyền xa nhất so với các xuất xứ còn lại (hệ số Jaccard là 0,17)

Kết luận

Trong tổng số 428 phân đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD sử dụng 6 mồi với 9 xuất xứ cây Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình Điều này cho thấy các mồi RAPD được nghiên cứu cho sự đa hình cao ở các xuất xứ Lim xanh

Phân tích các vị trí cắt đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế trong sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cũng cho thấy chỉ thị ADN lục lạp cho mức độ đa hình cao

Các phân tích đa dạng di truyền dựa trên hệ số di truyền giống nhau Jaccard giữa các xuất xứ cây Lim xanh bằng các số liệu về chỉ thị RAPD và ADN lục lạp đã cho thấy các xuất xứ này rất đa dạng về di truyền

Từ các kết luận trên, chúng tôi đi đến khuyến cáo về sự cần thiết phải bảo tồn vốn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ vì các xuất xứ được nghiên cứu rất xa nhau về di truyền

Tài liệu tham khảo

1 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Một số loài cây bị đe dọa ở Việt Nam Nxb Nông

nghiệp Hà nội 147 tr

2 Nguyễn Đức Thành, 1999 Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong

nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà

Nội: 1205-1215

3 Demesure B., Sodzi N., Petit RJ., 1995 A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and

chloroplast DNA in plants Mol Ecol 4:35-38

4 Deng ZN et al, 1995 Identification of in vivo and in vitro lemon mutants by RAPD markers J Hortic Sci, 70:117-125

5 Deng ZN et al, 1995 Parentage determination of some citrus hybrids by

molecular markers Proc Int Soc Citricul 2:849-854

6 Federici CT et al, 1998 Phylogenetic relationship within the genus Citrus

(Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis Theor Appl Genet, 96:812-822

7 Gielly L., Taberlet P., 1994 The use of chloroplast DNA to resolve plant

phylogenies: non-coding vs RbcL sequences Mol Biol Evol, 11: 769-777

8 Mohanty A et al, 2001 Chloroplast DNA study in wild population and some

cultivars of Prunus avium L Theor Appl Genet, 103: 112-117

9 Nicolosi E et al, 2000 Citrus phylogeny and genetic origin of important

species as investigated by molecular markers Theor Appl Genet, 100:

1155-1166

10 Olmstead RG., Palmer JD., 1994 Chloroplast DNA systematics: a review of

methods and data analysis Am J Bot 81: 1205-1224

11 Rohlf FJ., 1993 NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system,

Version 1.80 Applied Biostatitics Inc., New York

12

Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Chương

trình NCCB trong KHTN Chúng tôi xin cám ơn GS TSKH Lê Xuân Tú đã đọc và góp ý cho bản thảo

Summary

The use of RAPD and chloroplast DNA markers in the study of

genetic relationship of Erythrophleum fordii Oliv From different

origins

Quach Thi Lien, Nguyen Đuc Thanh

Institute of Biotechnology –VAST

Nguyen Hoang Nghia

Forest Science Institute of Viet Nam

Genetic relationship of nine Erythrophleum fordii Oliv origins were investigated

using RAPD and cpDNA markers The RAPD analysis using random amplified polymorphic primers reveled 428 Polymorphic bands All the bands were polymorphic among the investigated origins Non-coding regions of cpDNA were amplified using

chloroplast universal primers trnH-trnK and PsbC-trnS, and polymorphisms were subsequently generated by digestion of the PCR products with TaqI, HhaI and HinfI

endonucleases Eleven restriction sites were detected and 54 polymorphic bands of the total number 72 bands were obtained

The coefficients of genetic similarity between the investigated origins based on RAPD and cpDNA data were rather low (from 0,17 to 0,43) showing the genetic

divergent of the E fordii origins Our results indicated an necessary to protect all of the

E fordii investigated