H’mông đồng thời so sánh mối quan hệ di truyền giữa bò H’mông với một số quần thể bò khác của Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Phi, Châu Âu, và bò rừng Mỹ Bison bison.. Trình tự nucleotid
Trang 1PHÂN TÍCH ĐA DẠNG TRÌNH TỰ NUCLEOTID ADN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ
DI TRUYỀN CỦA BÒ H’MÔNG VỚI MỘT SỐ QUẦN THỂ BÒ KHÁC
Phạm Doãn Lân 1 , Nguyễn Trọng Bình 1 , Trần Xuân Hoàn 1 , Vũ Chí Cương 1 ,
Lê Đình Lương 2 và J.C Maillard 3
1
Phòng TN trọng điểm Công nghệ tế bào động vật -Viện Chăn nuôi - Thụy phương - Từ Liêm - Hà Nội
2
Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia - Hà Nội
3
Giám đốc CIRAD vùng Đông Nam Á
*
Tác giả liên hệ: Phạm Doãn Lân - Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật
Tel: (04).2.166.147 / 0914 366 975; Fax: (04) 8 389.775; Email: pdlanvn@yahoo.com
ABSTRACT Mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationships of H’Mong cattle
to other cattle populations
H’mong cattle is an local breed with unclear origin To assess the mitochondrial DNA sequence diversity and
phylogenetic relationship of H’mong cattle to various other cattle populations, we analyzed for partial (530bp) of
mtDNA D-loop sequences of 26 H’mong cattle samples in conjunction with previous published sequences from
Northeast Asian (Korea, Japan), Europe, Africa, India and American bison cattle The results showed that 14
haplotypes were observed in total of 26 analyzed cattle samples, indicating that the H’mong cattle population had
a high diversity of mtDNA In phylogenetic analysis, the H’mong cattle samples were clustered into two distinct
genetic lineages: taurine (Bos taurus) and zebu (Bos indicus) The H’mong zebu lineages are closely related to
Indian zebu cattle and are clearly separate from other cattle populations while the H’mong taurine lineages,
Eropean, African, Japanese and Korean cattle clustered together These results suggested that H’mong taurin
lineages are closely related to cattle of Northeast Asian and Europe
Keywords: Mitochondrial DNA diversity, phylogenetic relationship, Bos indicus, Bos taurus
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bò có vai trò chính trong sự phát triển của nền văn minh loài người và là một trong những loài
vật nuôi thuần hoá có ý nghĩa kinh tế nhất Có hai phụ loài chính đó là bò không có u (Bos
taurus) và bò có u (Bos indicus) đều được cho là bắt nguồn từ bò rừng Châu Âu (Bos
primigenius) đã tồn tại từ cách đây 8.000 - 10.000 năm và được thuần hoá riêng biệt (Epstein,
1971; Epstein và Mason, 1984; Machugh và cs, 1997; Loftus và cs, 1994)
Các giống bò hiện nay đều là các biến thể của hai phụ loài Bos indicus và Bos taurus Tính đa
dạng về di truyền, nguồn gốc, sự bảo tồn và lợi ích của các giống bò này đã được quan tâm
nghiên cứu nhiều trên Thế giới
Bò H’mông hay bò Mèo là một giống bò địa phương đặc trưng của tỉnh Hà Giang, chúng gắn
liền với đời sống và văn hoá của đồng bào dân tộc H’mông Cùng với người H’mông, bò
H’mông sinh sống bán cô lập ở độ cao cao trên 1.000 mét so với mặt nước biển do đó chúng ít
bị lai tạp bởi các giống bò khác Theo một số giả thiết cho rằng bò vàng Việt Nam có nguồn
gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos indicus) và bò vàng Trung Quốc không có u (Bos taurus) (Lê Viết
Ly và cs, 1999) Tuy nhiên, chưa có một bằng chứng nào ở mức độ phân tử về sự lai tạp và
nguồn gốc giữa hai dòng bò có u và bò không có u ở bò Vàng Việt Nam nói chung và ở bò
H’mông nói riêng được công bố
Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày: Một số kết quả phân tích sự đa dạng trình tự AND
vùng D-loop ty thể, xác định sự lai tạp giữa hai loại bò có u và bò không có u ở quần thể bò
Trang 2H’mông đồng thời so sánh mối quan hệ di truyền giữa bò H’mông với một số quần thể bò
khác của Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Phi, Châu Âu, và bò rừng Mỹ (Bison bison)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Hai mươi sáu cá thể bò H’mông được chọn ngẫu nhiên ở các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần và Hoàng Su Phì của tỉnh Hà Giang Trình tự nucleotid vùng D-loop ty thể của các mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi bò rừng Châu Mỹ được thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế (GeneBank)
Tách chiết ADN và nhân ADN đặc hiệu (PCR)
Quy trình tách chiết ADN hệ gen từ các mẫu mô tai của 26 cá thể bò H’mông được thực hiện theo bộ kít tách QIAamp của hãng Qiagen (Đức)
Vùng ADN D-loop ty thể có kích thước 990 bp được nhân đặc hiệu bởi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự:
Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’
Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngược và 50-100 ng ADN khuôn Phản ứng PCR được thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN được biến tính ở
94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ được thực hiện ở điều kiện như sau: biến tính ở 92oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55oC trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút
Phản ứng giải trình tự
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch (QIAquick PCR Purification kit) của hãng Qiagen (Đức)
Phản ứng giải trình tự được thực hiện trực tiếp từ các sản phẩm PCR đã được tinh sạch với cả
2 mồi xuôi và ngược sử dụng bộ kít giải trình tự (DTCS-Quick Start Master Mix) của hãng Beckman Coulter và được tiến hành phân tích trên máy giải trình tự CEQ8000
Phân tích trình tự
Trình tự nucleotid vùng D-loop ty thể của các mẫu bò H’mông được so sánh với trình tự các
mẫu bò của Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) và
trình tự toàn bộ ADN ty thể của hai mẫu bò không có u và có u đối chứng với mã truy cập trên ngân hàng gen tương ứng là V00654 và NC-005971 sử dụng công cụ CLUSTALW trong phần mềm BIOEDIT và DNAsp
Khoảng cách di truyền giữa các trình tự vùng D-loop ty thể của các nhóm bò được tính theo phương pháp của Tamura và Nei (1993) Cây quan hệ di truyền (phylogenetic tree) được xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0 (Kuma và cs, 1994)
Trang 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sự đa dạng trình tự ADN vùng D-loop ty thể
ADN ty thể là một dạng vật liệu di truyền nằm ở ngoài nhân được di truyền theo dòng mẹ Chúng có tỷ lệ đột biến cao hơn 5-10 lần so với hệ gen trong nhân, đặc biệt vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có tỷ lệ thay đổi rất cao do đó thường được sử dụng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và nguồn gốc tiến hoá của các loài
Tiến hành giải trình tự ADN vùng D-loop ty thể của các mẫu bò H’mông chúng tôi thu được đoạn trình tự nucleotid có độ dài 530 bp (base pair) trên độ dài 990 bp của sản phẩm PCR Đoạn trình tự này có vị trí từ nucleotid 15813 đến 16343 của toàn bộ trình tự ADN ty thể được công bố bởi Anderson và cs (1982) với mã truy nhập trên ngân hàng gen Quốc tế là V00654
So sánh và phân tích trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò bao gồm: H’mông (26 mẫu); Hàn Quốc (4 mẫu bò vàng); Nhật Bản (9 mẫu bò đen), Ấn Độ (6 mẫu gồm các giống Harianna, Sahiwal, Tharparkar); Châu Phi (8 mẫu gồm các giống: Butana, Fulani, Kenana và N’Dama); Châu Âu (12 mẫu gồm các giống: Aberdeen Angus, Charolais, Friesian, Here ford, Jersey và Simantal) và 2 mẫu đối chứng của bò có u và không có u, kết quả cho thấy xuất hiện
39 kiểu di truyền đơn ty thể (haplotype) và có 50 điểm đa hình (polymorphic site) trên toàn bộ đoạn trình tự ADN được phân tích (530 bp) Trong số 26 mẫu bò H’mông được phân tích thì
có 14 kiểu di truyền ty thể được xác định, kết quả được trình bày ở Hình 1
Hình 1: Đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò phân tích Ký hiệu của các mẫu được thể hiện ở cột thứ nhất: EU (Châu Âu); AF (Châu Phi); JP (Nhật Bản); KR (Hàn Quốc); VN (Viêt Nam); IN (Ấn Độ) V00654
và NC005971- tương ứng là trình tự ADN ty thể chuẩn của mẫu bò không có u (Bos taurus) và bò có u (Bos
indicus) Ký hiệu (-) chỉ sự tương đồng giữa các nucleotid, (*) mất hoặc thêm nucleotid
Trang 4Qua Hình 1 cho thấy trình tự ADN vùng D-loop ty thể ở bò H’mông được tách biệt thành hai
nhóm: nhóm H’mông 1 với các mẫu từ VN1 đến VN9 có trình tự của dòng bò không có u
(Bos taurus); nhóm H’mông 2 với các mẫu từ VN10 đến VN14 có trình tự của dòng bò có u
(Bos indicus) Trong số 26 mẫu bò H’mông được phân tích ngẫu nhiên Kết quả cho thấy, có
14 mẫu thuộc dòng bò có u và 12 mẫu thuộc dòng bò không có u (Hình 2) Điều đó cho thấy
rằng tính đa dạng ADN ty thể của quần thể bò H’mông là tương đối cao
Khoảng cách và mối quan hệ di truyền
Khoảng cách di truyền trung bình giữa các quần thể bò được ước lượng dựa trên phương pháp
của Tamura-Nei Kết quả được thể hiện ở Bảng 1
Bảng 1: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò bao gồm cả bò rừng Mỹ
theo Tamura-Nei
Qua Bảng 1 cho thấy, khoảng cách di truyền giữa bò rừng Mỹ và các quần thể bò khác (Châu Âu, Châu Phi, Ấn Độ, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản) đều lớn hơn 0,1 Trong khi đó,
khoảng cách di truyền giữa bò Ấn Độ, H’mông 2 (thuộc dòng bò có u) và các quần thể bò
thuộc dòng không có u (Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu Phi, H’mông 1) lớn hơn 0,05
Khoảng cách di truyền giữa quần thể bò Châu Âu, Châu Phi, Nhật Bản, Hàn Quốc và H’mông
1 dao động trong khoảng 0,007–0,013 Khoảng cách di truyền giữa nhóm bò H’Mông 1 và bò
có u Ấn Độ là 0,004
Cây phân loài di truyền ở hình 2 cho thấy quần thể bò H’mông nhóm 1 và Châu Âu, Châu
Phi, Hàn Quốc, Nhật Bản đều thuộc dòng bò không có u và có mối quan hệ gần nhau đồng
thời chúng tách biệt so với bò có u Ấn Độ và bò rừng Mỹ Trong khi đó nhóm bò H’mông 2
có mối quan hệ di truyền rất gần với quần thể bò có u Ấn Độ
Mặc dù kết quả tính khoảng cách di truyền trên Bảng 1 cho thấy, giữa nhóm bò H’mông 1 và
bò Châu Âu, Hàn Quốc, Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần nhau hơn so với nhóm bò
Châu Phi tương ứng là (0,007-0,01) và (0,012) nhưng ở cây phân loài di truyền (Hình 2)
không cho thấy có sự tách biệt hẳn giữa các nhóm bò Châu Phi và H’mông 1, Châu Âu, Hàn
Quốc và Nhật Bản
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với Kim và cs (2003), khi nghiên cứu mối quan hệ di
truyền của một số giống bò của Hàn Quốc cũng không cho thấy sự tách biệt giữa bò Hàn
Quốc, Châu Âu và Châu Phi Trong khi đó, Mannen và cs (1998) khi nghiên cứu nguồn gốc
của giống bò đen Nhật Bản (Bos taurus) dựa trên phân tích trình tự ADN ty thể đã cho thấy sự
tách biệt giữa bò Châu Âu với bò Châu Phi Trong đó, một số cá thể bò đen của Nhật Bản có
mối quan hệ di truyền gần gũi với bò của Châu Âu
Trang 5Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng đã cho rằng hầu hết các giống bò ngày nay có nguồn
gốc thuần hoá từ 3 khu vực khác nhau: Khu vực Tây Á là nguồn gốc của bò có u (Bos indicus)
bao gồm các giống bò có u Ấn Độ hiện nay, vùng Cận Đông và Châu Phi là nguồn gốc của bò
không có u -Bos taurus (Bradley và cs, 1996; Loftus và cs, 1994; Troy và cs, 2001) Cho dù
các giống bò Châu Phi hiện nay chúng có đặc điểm hình thái là dạng trung gian của hai phụ
loài Bos indicus và Bos taurus tuy nhiên nguồn gốc xuất hiện ban đầu ở Châu Phi được cho là
bò Bos taurus
Hình 2: Cây phân loài di truyền của 67 mẫu bò ở Việt Nam (VN), Hàn Quốc (KR), Nhật Bản (JP), Ấn Độ (IN), Châu Âu (EU), Châu phi (AF), 5 mẫu bò rừng Châu Mỹ (Bison) và 2 mẫu bò có u và không có u đối chứng
tương ứng là V00654, NC00597
JP U87635
KR AF409056
JP U87639
JP U87637 VN8
JP U87634 Bos taurusV00654 VN22
VN5 VN13
JP U87640
EU L27726
EU L27734
EU L27735
KR AF409055
EU L27718
EU L27727
EU L27725
KR AF409057
EU L27713 VN23 VN19 VN1 VN15
EU L27724
AF L27730
AF L27728
AF L27721 VN11
KR AF409054
AF L27714 VN4 VN20
IN L27723 VN18
IN L27722
IN L27736
IN L27733 Bos indicusNC005971 VN2
VN43 VN6 VN9 VN10 VN16 VN26 Bison U12946 Bison U12936 Bison U12959
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
0.06
Bò không u
Bos taurus
Bò có u Bos indicus
Bò rừng Mỹ
Bison bison
Trang 6Theo tác giả Phillips (1961) và Payne (1995) thì các giống bò bản địa của Trung Quốc và Việt
Nam là sự lai tạp giữa bò có u (Bos indicus) và bò không có u (Bos taurus) Thực vậy nhận
định này phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên quần thể bò H’mông (tỷ lệ bò có
u chiếm 53,8%) cũng như kết quả nghiên cứu của Xin Cai và cs (2006) ở 18 giống bò bản địa trên toàn lãnh thổ Trung Quốc thì bò không u chủ yếu tập trung ở phía Bắc với tỷ lệ 81,8-100% ở các giống và được cho là do du nhập từ Mông Cổ trong khoảng thời gian giữa
3766-3122 năm trước Công Nguyên Trong khi đó bò không có u chủ yếu tập trung ở phía Nam Trung Quốc với tỷ lệ 63,3-100% ở các giống
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Qua phân tích sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể trên quần thể bò H’mông cho thấy tính đa dạng di truyền ADN ty thể là tương đối cao
Quần thể bò H’mông có nguồn gốc từ sự lai tạp của hai dòng bò không có u (Bos taurus) và
có u (Bos indicus), tỷ lệ bò có u chiếm 53,8%
Dòng bò không có u ở quần thể bò H’mông có mối quan hệ di truyền gần với bò không u của Hàn Quốc, Nhật Bản (có nguồn gốc du nhập từ bò không u phía Bắc Trung Quốc) và Châu
Âu, trong khi đó dòng bò có u có mối quan hệ di truyền gần gũi với bò có u Ấn Độ
Kết quả nghiên cứu đã bước đầu cung cấp bằng chứng ở mức độ phân tử cho thấy phù hợp với
nhận định rằng bò Vàng Việt Nam có nguồn gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos indicus) và bò Vàng Trung Quốc không có u (Bos taurus)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Anderson, S., de Bruiji, M H., Coulson, A R., Eperon, I C., Sanger, F., and Young, I g, (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA Conserved features of the mammalian mitochondrial genome J Mol Boil 156, pp 683-717
Bradley, D G., Machugh, D E., Cunningham, P and Loftus, R T, (1996) Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle Poc Natl Acad Sci USA 93, pp 5131-5135
Epstein, H., (1971) The origin of domestic animals of Africa Aficana Publishing Corporation, New York Vol.1, pp 185-555
Epstein, H., and Mason, I L, (1984) Evolution of domesticated animal Edited by I L Mason Long man, New York, pp.6-27
Kim, K I., Lee, J H., Lee, S S and Yang, Y H, (2003) Phylogenetic relationships of Northeast Asian cattle to other cattle populations determined using mitochondrial DNA D-Loop sequence polymorphism Biochem Gentic 41, pp 91-98
Kuma, S., Tamura, K and Nei, M, (1994) Molecular evolutionary genetic analysis software for microcomputers Comput.Appl.Biosci 10, pp 189-191
Lê Viết Ly., Hoàng Kim Giao., Mai Văn Sánh., Võ Văn Sự., Lê Minh Sắt, (1999) Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam Tập I: Phần gia súc Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội
Loftus, R T., Machugh, D E.,Bradley, D G., Sharp, P M and Cunnigham, P, (1994) Evidence for two independent domestications of cattle Proc.Natl Acad Sci USA 91, pp.2757-2761
Trang 7Machugh, D E., Shriver, M D., Loftus, R T.,Cunningham, P and Bradley, D G (1997) Microsatellite DNA
variation and the evolution, domestication and phylogeography of taurine and zebu cattle (Bos Taurus and Bos indicus) Genetic 146, pp.1071-1086
Mannen, H., Tsuji, S., Loftus, R T and Bradley, D G, (1998) Mitochondrial ADN variation and evolution of
Japanese black cattle (Bos taurus) Genetic 150, pp 1169-1175
Payne WJA, (1995) Diffusion of cattle throughout of Asia in tropical cattle: origins, breeds and breeding policy Black well Sciences Ltd., Oxford, pp 15-22
Phillips W, (1961) World distribution of the major types of cattle J Heredity 86, pp 248-249
Tamura, K., and Nei, M, (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Mol Biol Evol 10, pp 512-526
Troy, C S., Machugh, D.E., Balley, J F., Magee, D A., Loftus, R T., Cunnigham, P., Chamberlain, A T., Sykes, B C., and Bradley, D G, (2001) Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle Nature 410, pp 1088-1091
Xin Cai., Hong Chen., Chuzhao Lei., Shan Wang., Kai Xue and Bao Zhang, (2006) mtDNA diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos Taurus and Bos indicus in China Genetica, DOI 10.1007/s10709-006-9129-y
Người phản biện: Ths Trần Thị Thu Thủy Ths Nguyễn Thị Quỳnh Châu
