Tình hình gây bệnh tiêu chảy cấp và tính đề kháng kháng sinh do vi khuẩn Salmonella tại bệnh viện nhi đồng 2

Tuynhiên với tình hình sử dụng kháng sinh một cách không kiểm soát như hiện nay đã dẫntới một loạt các hệ quả mà ngày nay con người đang phải vất vả khắc phục nó, có thểthấy ngay đó là v

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi do mắc cácbệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp) Tiêu chảy là bệnh thường gặp

ở mọi lứa tuổi và ở các nước đang phát triển có mật độ dân số cao Các chuyên gia

về tiêu hóa nhi cảnh báo, Việt Nam là một trong những quốc gia đứngđầu trong khu vực Đông Nam Á có trẻ em nhập viện vì tiêu chảy cấpvới tỷ lệ 55% Khảo sát tại các Bệnh Viện nhi cho thấy, trẻ từ 6 đến

24 tháng tuổi nhập viện do tiêu chảy cấp chiếm khoảng 70% Theothống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hằng năm trên thế giới cókhoảng 1,3 tỷ đợt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, trong đó 1,5 – 2,5triệu trường hợp tử vong Bệnh tiêu chảy gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sứckhoẻ, tình trạng dinh dưỡng, và làm tổn thất về kinh tế cho gia đình và xã hội

Trong những vi khuẩn gây tiêu chảy thì Salmonella là vi khuẩn thường gặp có

thể gây hậu quả nghiêm trọng Bệnh lây qua đường tiêu hóa, có đặc điểm lâm sàng làsốt kéo dài và gây nhiều biến chứng, và một trong những biến chứng quan trọng là xuấthuyết tiêu hóa và thủng ruột

Kháng sinh là một vũ khí quan trọng để chống lại các vi sinh vật gây bệnh Tuynhiên với tình hình sử dụng kháng sinh một cách không kiểm soát như hiện nay đã dẫntới một loạt các hệ quả mà ngày nay con người đang phải vất vả khắc phục nó, có thểthấy ngay đó là vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc, làm cho hiệu quả điều trị không cao

Vì tầm quan trọng và ý nghĩa to lớn của việc sử dụng kháng sinh hợp lý, chúng takhông nên sử dụng kháng sinh một cách tùy tiện khi có triệu chứng nhiễm khuẩn, màcần tới ý kiến của người có chuyên môn

Từ những thực tiễn nói trên nhằm góp phần cho lĩnh vực khảo sát tình hình tiêu

chảy và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp, chúng tôi xin thực hiện

đề tài :

“Tình hình gây bệnh tiêu chảy cấp và tính đề kháng kháng sinh do vi khuẩn

Salmonella tại bệnh viện nhi đồng 2” với mục tiêu như sau:

• Mục tiêu tổng quát:

Khảo sát tình hình gây bệnh tiêu chảy cấp và tính đề kháng kháng sinh do vi

khuẩn Salmonella spp tại bệnh viện nhi đồng 2.

• Mục tiêu cụ thể:

Xác định tỷ lệ vi khuẩn Salmonella phân lập được trên bệnh phẩm của bệnh

nhân tiêu chảy

Xác định mức độ nhạy cảm, tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella

phân lập được

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 VI KHUẨN SALMONELLA:

1.1.1 Đại cương:

Vi khuẩn salmonella đã được nghiên cứu từ hàng trăm năm nay, tuy nhiên trong

mấy chục năm trở lại đây, chúng được các nhà khoa học quan tâm bởi sự gia tăng các

bệnh tiêu chảy ở người do salmonella gây ra Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng khắp

trong tự nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, các loài động vật, gia súc, gia

cầm Salmonella có thể tồn tại bên ngoài một tuần cơ thể sống Bệnh thường gặp nhất

do Salmonella gây ra là gây tiêu chảy, ngoài ra còn có phó thương hàn và thương hàn.

Hằng năm, trên thế giới có khoảng 16 - 33 triệu người mắc bệnh thương hàn,trong đó 5 - 6 nghìn người tử vong Vào năm 2005, sốt thương hàn gây ra bởi

Salmonella typhi đã xảy ra ở Congo, khiến 214 người bị thiệt mạng. Theo thống kê,

mỗi năm ở Mỹ có khoảng 40.000 trường hợp nhiễm khuẩn salmonella Ở Đan Mạch

1995 có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella spp Trên thế giới, ước tính mỗi năm ngộ độc thực phẩm mà nguyên nhân là từ salmonella xảy ra ở 1.4 triệu người. Hoa Kỳ,

Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợp ngộ đôc thực phẩm.

Vi khuẩn salmonella qua thức ăn vào miệng, đi qua dạ dày và xuống ruột non,

sau đó vi khuẩn chui qua niêm mạc ruột, xâm nhập vào các mạch bạch huyết sinh sản

và phát triển tại đó

Trong báo cáo đăng trên tạp chí Khoa học của Mỹ số ra mới nhất, các nhà khoa

học cho biết vi khuẩn Salmonella khi gây nhiễm tế bào mục tiêu sẽ tuân thủ theo trình

tự ba bước

Thứ nhất, hình thành một hình mũi kim nhọn trên bề mặt để xây dựng sự tiếp xúc với tế bào mục tiêu; thứ hai, một số protein chuyên dụng sẽ thông qua hình mũi kim nhọn này để di chuyển tới tế bào mục tiêu, phá hoại màng tế bào của tế bào mục

tiêu và tạo ra một “lỗ hổng;" thứ ba, tế bào vi khuẩn Salmonella sẽ thông qua “lỗ hổng”

này để phóng protein mang tính độc vào tế bào mục tiêu

1.1.3 Triệu chứng:

Các triệu chứng khi bắt đầu mắc bệnh do Salmonella thường xảy ra trong vòng

12-72h sau khi tiếp xúc

Các triệu chứng thường gặp bao gồm:

1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh:

Đa số nguyên nhân gây tiêu chảy nhiễm khuẩn salmonella lây qua đường ăn

uống, hay do trẻ mút tay hoặc đồ chơi khi tay hay đồ chơi bị nhiễm bẩn

Sử dụng các loại thức ăn chưa nấu chín như rau sống, tiết canh, gỏi cá, nem sống, nem chua, hay ăn kem, thức uống không rõ nguồn gốc Đây là những thực phẩm tiềm ẩn nhiều nguy cơ chứa vi khuẩn, … ăn vào với số lượng ít hay nhiều cũng rất dễ gây bệnh

Vi khuẩn Salmonella cũng lây qua việc tiếp xúc với thú vật bị nhiễm bệnh, đặc

biệt là gia cầm, lợn, trâu bò, chuột và thú nuôi như loài bò sát, gà con, vịt con, rùa, chó

và mèo

Sử dụng những nguồn nước bị nhiễm Salmonella mà chưa được xử lý.

1.1.5 Đặc điểm của vi khuẩn Salmonella:

1.1.5.1 Lịch sử và phân loại:

Salmonella do Daniel E Salmon (1850 – 1914) phát hiện ra năm 1885 Năm 1880

Grafhy đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên

phân lâp được Salmonella typhi vào năm 1884

Trước năm 1986, dựa vào phản ứng sinh hóa, người ta chia Salmonella làm 3 loại: S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis

Năm 1987, theo Miror và cộng sự thuộc trung tâm nghiên cứu Salmonella thế giới thì Salmonella được chia thành 2 loại chính là: Salmonella enterica (gây bệnh) và Salmonella bongori (không hay ít gây bệnh) Salmonella bongori rất hiếm chỉ có dưới

10 loại, còn Salmonella enterica có hơn 2500 khác nhau và được chia làm 6 nhóm dưới

loài Việc đặt tên được dựa theo vùng địa lý, nơi phân bố hoặc người phát hiện rachúng, một số chủng khác được đặt tên theo cấu trúc kháng nguyên

Phân loại:

- Giới Bacteria.

- Ngành Proteobacteria.

- Lớp Enterobacteriaceae.

- Giống Salmonella lignieres 1900.

- Loài S.bogori và enterica.

1.1.5.2 Hình thái:

Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Salmonella là nhóm trực khuẩn Gram âm (khi nhuộm bằng kỹ thuật Gram thì vi khuẩn

bắt màu đỏ hồng ), hình que, kích thước khoảng 0.5x3µm, hiếu khí và kị khí tùy ý, Có

tiêm mao, có thể di động trừ S.gallinarum, không tạo bào tử.

Hình 1.1: Vi khuẩn salmonella sau nhuộm gram

1.1.5.3 Đặc điểm nuôi cấy:

- Nuôi cấy được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí, thích hợp ở 370Cnhưng có thể phát triển được từ 6- 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở

pH từ 6-9

- Trên BA không dung huyết

- Trên BSA: tạo khóm đen

- Trên HE: khóm xanh, một số loài có tâm đen, có vòng ngoài trong

- Trên XLD: khóm hồng tâm đen

- Trên môi trường MC, SS: tạo khúm tròn, hơi lồi, có hoặc không có tâm đen cóvòng trong do vi khuẩn không lên men đường lactose.

- Trong môi trường đặc vi khuẩn cho 2 loại khúm:

+ Khúm S: dạng nhẵn, tròn, hơi lồi, bóng

+ Khúm R: dạng gồ ghề, không đều, mặt dẹt, khô

- Trong canh cấy:

+ Khúm S: làm đục đều môi trường

+ Khúm R: mọc thành màng rơi xuống đáy

1.1.5.4 Tính chất sinh hóa:

- Lên men glucose, manitol Không lên men lactose, sucrose

- Sinh hơi trừ Salmonella typhi.

- Indol (-), urease (-) , di động (+), MR (+), VP (-), Citrat (+), OPNG (-) Một số

tính chất khác thay đổi tùy vào một số loài Salmonella.

Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O):

Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng làmột lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài

là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tốcủa Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Khángnguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lipopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệucủa kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau: kháng nguyên

O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnhhơn LPS.

Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉgặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm Khángnguyên bền với nhiệt ở 1000C

Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K – kapsule) :

Bản chất hóa học của vỏ vi khuẩn là polypeptid hoặc polysaccharide Vỏ của vikhuẩn gây miễn dịch không mạnh nhưng khi gắn với tế bào vi khuẩn vỏ vẫn gây được

miễn dịch Kháng nguyên vỏ được dùng để phân loại các chủng Salmonella.

Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) :

Được tổng hợp từ các acid amin dạng D (dạng ít gặp trong tự nhiên) Do đó việc

xử lý kháng nguyên của các tế bào miễn dịch không thuận lợi và đáp ứng kháng thểkhông mạnh Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các kháng thể đặc hiệu, lông sẽ bị bấtđộng, vi khuẩn không thể di chuyển được Kháng nguyên lông được dùng để phân loại

một số chủng Salmonella.

1.1.5.6 Tính chất gây bệnh:

Nhiễm khuẩn Salmonella thường có những biểu hiện lâm sàng chính sau:

 Sốt thương hàn:

Chủ yếu do S.typhi, S.paratyphi A và S.schottmulleri Vi khuẩn xâm nhập

đường tiêu hóa vào niêm mạc ruột đến hạch lympho và phát triển tại đây Đây là thời kì

ủ bệnh

Sau khi tăng sinh, một số vi khuẩn tự ly giải, phóng thích nội độc tố, một sốtheo hệ lympho vào máu gây nhiễm khuẩn huyết Từ máu, vi khuẩn đi khắp cơ thể gây

ra các ápxe khu trú, thường nhất ở bàng quang hay túi mật rồi vào ống tiêu hóa

Số lượng vi khuẩn phải đủ nhiều mới gây bệnh thương hàn lớn hơn 107 và thờigian ủ bệnh càng ngắn khi vi khuẩn xâm nhập càng nhiều

Sau 10-14 ngày ủ bệnh, xuất hiện sốt kèm theo lạnh run Sốt tăng dần trong tuầnđầu, sau đó giữ ở mức 38-39oC trong 2 tuần lễ Bệnh nhân suy nhược, chán ăn, mệtmỏi, gan, lách to, xuất hiện ngoài da, bạch cầu giảm.

Trước khi có kháng sinh, biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủngruột Biến chứng khác là viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, thận.Biến chứngxuất hiện muộn như viêm thần kinh ngoại biên, điếc, rụng tóc, thiếu máu tán huyết, đặcbiệt ở người thiếu Glucose 6 phosphate dehyrogenase

 Nhiễm khuẩn huyết với sang thương khu trú:

Thường do vi khuẩn S.choleraesuis gây ra Vi khuẩn vào đường miệng, xâm

nhập máu, đến các cơ quan gây sang thương khu trú ở phổi, xương, màng não…,thường không có bệnh lý ở ruột

 Viêm ruột:

Là biểu hiện thông thường, do S.typhimurium gây ra Sau khi ủ bệnh 8-48 giờ,

xuất hiện nhức đầu, sốt nhẹ, ói, tiêu chảy, có bạch cầu trong phân Bệnh khỏi sau 2-3ngày

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH:

1.2.1 Lịch sử và phân loại về kháng sinh:

Kháng sinh là loại thuốc đặc biệt, do A.Fleming phát hiện ra Nó ngăn chặn hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi khuẩn hoặc các vi sinh vật có mầm bệnh Chất khángsinh giúp cho chúng ta có thể chống lại các bệnh tật và được sử dụng trong việc điều trịnhiều căn bệnh

Có nhiều loại kháng sinh khác nhau:

- Kháng sinh đặc hiệu: tác động lên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định

- Kháng sinh phổ rộng: có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác nhau

- Kháng sinh phổ hẹp: có hoạt tính đối với một hay một số ít vi khuẩn

Kháng sinh có nhiều nguồn gốc khác nhau:

- Kháng sinh tự nhiên (natural antibiotic) là kháng sinh do vi sinh vật tiết ra, có tác dụng gây hại hay giết chết vi sinh vật khác mà không gây hại hay ít gây hại cho cơ thể con người khi dùng thường xuyên

- Kháng sinh tổng hợp (antibiomimetic) là những hóa chất do con người tổng hợp nên, có tác dụng gây hại hay giết chết vi sinh vật mà không gây hại hay ít gây hại cho cơ thể con người

- Kháng sinh bán tổng hợp (semi-synthenticantibiotic) do vi sinh vật tiết ra nhưng con người đã làm thay đổi cấu trúc hoa học để có tác dụng diệt khuẩn

 Phân loại:

Dựa trên đặc điểm dược lý, người ta có thể xếp kháng sinh theo các họ sau đây:

- Họ β-lactamines như penicillium, Ampicillin, Cephalothin, Cefuroxime…

- Họ Aminoglycosides như Gentamycine, Amikacin, Netilmycin…

- Họ Macrolides như Erythomycin, Spiramicin, Oleandomycin… và các thuốc tương tự

- Họ polypeptides như Polymycin, Coslitin…

- Họ Sulfonamides như Sulfathiazol, Trimethoprime-Sulfamethoxazone…

1.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh:

 Ức chế sự thành lập vách tế bào:

Kháng sinh thuộc nhóm này: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin,

Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cùng bên ngoài gọi là vách tếbào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ởbên trong tế bào Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của kháng sinh,các vi khuẩn Gram (+) biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast) và vikhuẩn Gram (-) có vách không hoàn chỉnh (spheroplast) những hình thức này làm cho

tế bào bị vỡ trong điều kiện có trương lực bình thường

Giai đoạn đầu thuốc gắn vào thụ thể PBPs (penicillium binding protein) của tếbào làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan

Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa các men tự tiêu gây ra sự lygiải của tế bào ở môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương, những tế bào

bị biến thành protoplast hay spheroplast chỉ được bao bọc bởi một màng nên rất dễ bịvỡ

 Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào:

Kháng sinh gắn vào màng bào tương của vi khuẩn gây rối loạn quá trình thẩm thấu chọn lọc do đó cân bằng thẩm thấu bị phá vỡ, làm mất chức năng của màng tế bàolàm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion thoát ra ngoài làm vi khuẩn chết

Kháng sinh thuộc nhóm này: Amphotericin B, Colistin, Imidazole, Nystatin,Polymycins

+ Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vi nấm bằng cách ứcchế sự tổng hợp lipid của màng tế bào

 Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép ADN

(nhóm Quionolones), ức chế sao mã ARN (nhóm Rifampicin) và ức chế tổng hợp các nucleotide (nhóm Sulfamid và Trimethoprim)

1.2.3 Sự kháng thuốc:

Là khả năng đề kháng của vi khuẩn còn sống sót lại kháng sinh đã sử dụng làm kháng sinh mất dần tác dụng ở những lần điều trị sau này

Đề kháng kháng sinh bao gồm 2 loại:

- Đề kháng giả: có biểu hiện nhưng do bản chất của vi khuẩn

- Đề kháng thật chia ra 2 nhóm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu nhận:

+ Đề kháng tự nhiên: do bản chất của vi khuẩn và qua trung gian nhiễm sắc thể.+ Đề kháng thu nhận: do vi khuẩn trước đây nhạy cảm với kháng sinh sau một thời gian tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh hoặc do vi khuẩn nhận gen đề kháng kháng sinh từ vi khuẩn khác bằng hình thức vận chuyển vật liệu di truyền như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp

Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể do một số cơ chế :

- Thay đổi tính thấm đối với kháng sinh:

Dựa vào việc làm biến đổi màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến làm thay đổi khả năng kháng sinh thấm vào hoặc thoát ra khỏi tế bào và làm cho kháng sinh không đến được vị trí phù hợp

- Biến đổi cấu trúc đích đối với kháng sinh:

Dựa vào việc làm giảm hoặc ngăn cản sự tiếp cận của kháng sinh đối với

vị trí đích

- Tạo ra enzyme phá hủy kháng sinh:

Vi khuẩn tạo ra enzyme phá hủy hoặc biến đổi phân tử kháng sinh và làmcho kháng sinh mất tác dụng

- Thay đổi con đường biến dưỡng:

Vi khuẩn vượt qua các giai đoạn chuyển hóa bị kháng sinh ức chế, như ở

là vi khuẩn siêu kháng thuốc Vấn đề kháng thuốc không phải là mới, nhưng đã trở nênnguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại tránh khỏi cảnh quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh (năm 1942)

Tỷ lệ phế cầu khuẩn đề kháng với penicillin đang gia tăng nhanh chóng (ví dụ: Hàn Quốc đến nay đang báo cáo mức độ kháng 70%) Tương tự, vấn đề kháng thuốc

của Shigella và Salmonella spp đối với cả ba kháng sinh “đầu tay” (Ampicillin,

Trimethoprime-Sulfamethoxazone, Nalidixic acid) đã gia tăng đến mức những tác nhânnày thường không mang lại hiệu quả

Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh Có nhiều loại kháng sinh mới cũng đã bị kháng với tỉ lệ cao, khiến việc dùng thuốc kém hiệu quả và chi phí chữabệnh tăng lên

Một số vi khuẩn kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm thuốc Cephalosporin thế hệ 3,

4 với tỷ lệ kháng từ 66-83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh Aminosid vàFluoroquinolon tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60% Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%,tăng gần gấp đôi so với tỷ lệ này năm 2006 (18,4%)

Vào năm 1989 có 1% S.typhi được phân lập tại Việt Nam đã kháng thuốc

(Ampicillin, Chloramphenicol, Trimethoprime-Sulfamethoxazone, tetracyclin), đến

1993 có 85% S.typhi kháng các kháng sinh này Từ năm 1992 việc sử dụng

fluoroquinolon bắt đầu rộng rãi, và chẳng bao lâu đã phát hiện được trường hợp khángquinolon ở đồng bằng sông Cửu Long Năm 1997 có đến 20% các trường hợp đã đềkháng

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU:

2.1.1 Mẫu nghiên cứu:

- Bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân ở các khoa lâm sàng gửi tới khoa Vi sinh tại bệnhviện nhi đồng 2

- Thông tin về độ tuổi, giới tính của bệnh nhân phải được ghi vào phiếu xétnghiệm

- Có sự liên quan chặt chẽ giữa Khoa Điều trị và Phòng Vi sinh để ghi nhậnthông tin đầy đủ chính xác

- Lam kính hiển vi.

2.1.3 Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:

- Salmonella Shigella Agar (SS): môi trường chọn lọc dùng để phân lập

Salmonella spp và Shigella spp từ môi trường nuôi cấy tăng sinh.

- Selenit Cytine: môi trường dùng để tăng sinh vi khuẩn Salmonella trong mẫu

bệnh phẩm đồng thời ức chế các loại vi khuẩn Gram (+)

- Muller Hinton Agar (MHA): môi trường dùng để thực hiện kháng sinh đồ

- Nutrient Agar (NA): môi trường giữ chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ

2.1.4 Các môi trường dùng để định danh trực khuẩn Gram (-):

- KIA, Simon Citrat, Mannitol, LDC, ADH, Ure-Indol…

- Thuốc thử Kovac

- Bộ ngưng kết dùng để định danh Salmonella: polyvalent OMA, polyvalent

OMB, polyvalent OMC…

2.1.5 Đĩa kháng sinh:

STT Tên kháng sinh Ký hiệu Nồng độ đĩa kháng

sinh (µg)

Giới hạn(mm)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Các chủng Salmonella đã được phân lập tại bệnh viện Nhi Đồng 2.

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu:

Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên bệnh nhi bị tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella spp

2.2.3 Khảo sát đặc điểm mẫu:

2.2.3.1 Thời điểm lấy mẫu:

- Lấy sớm, khi mới bị bệnh

- Lấy mẫu phân khảo sát trước khi dùng kháng sinh

• Những mẫu bệnh phẩm không được nhận:

- Lấy mẫu qua 2 giờ mà không được bảo quản trong môi trường chuyên chở

- Tăm bông bị khô.

- Lượng mẫu lấy quá ít

- Chứa trong lọ đựng phân không do phòng thí nghiệm cung cấp

- Những mẫu phân không ghi các thông tin cần thiết trên nhãn

2.2.3.2 Cách lấy mẫu phân:

Lấy mẫu phân từ bệnh nhi có nghi ngờ nhiễm khuẩn Lấy phân tươi, tốt nhất làvùng có nhiều nhầy máu, sau đó cho phân vào lọ đựng phân của phòng thí nghiệm rồiđem đến phòng thí nghiệm

Có thể lấy tăm bông quệt vào phân nhầy máu, cho vào môi trường chuyên chởđem đến phòng thí nghiệm (có thể giữ hơn 48 tiếng)

Khi mẫu phân được đưa đến phòng thí nghiệm ta tiến hành các bước sau :

• Khảo sát đại thể:

+ Quan sát mẫu phân và ghi vào phiếu xét nghiệm

+ Trạng thái của phân : phân lỏng, đặc hay sệt

+ Phân có nhầy máu hay không

+ Màu sắc phân : vàng, xanh, nâu đen…

• Khảo sát vi thể:

+ Làm phết phân soi trực tiếp bằng nước muối 0,85%

+ Trên tấm lam nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý 0,85% Dùng que tre lấy 1 ít phânrồi đánh tan đều trong nước muối sinh lý.

+ Dùng lamelle đậy nhẹ nhàng lên phết phân vừa làm để tránh bọt khí trongphết phân

+ Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính X10 hay X40 tìm bạch cầu, hồng cầu.Soi phân tìm bạch cầu, hồng cầu, lưu ý cần xem có sự hiện diện của nấm men, hạt

mỡ, sợi cơ kém tiêu hóa để bác sỹ lâm sàng có phương pháp điều trị hợp lý

Trong mẫu phân thấy xuất hiện bạch cầu, hồng cầu thì tiến hành cấy tìm sự hiện

diện của vi khuẩn Salmonella còn những mẫu không có sự hiện diện của bạch cầu,

hồng cầu thì không cấy

Bạch cầuHồng cầu

Hình 2.1: kết quả soi tươi mẫu phân2.2.4 Các phương pháp cấy:

2.2.4.1 Phương pháp cấy tăng sinh:

Mục đích: Nhằm tăng sinh số lượng Salmonella có trong mẫu bệnh phẩm.

Ngày thứ nhất:

Sau khi soi kính hiển vi xác định mẫu cần cấy ta tiến hành cấy mẫu bệnh phẩmvào môi trường Selenit Ủ ống Selenit đã cấy trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ

2.2.3.2 Phương pháp cấy phân lập:

Mục đích: Phương pháp cấy phân lập phương pháp cấy 3 chiều dùng để tách rờitừng tế bào vi khuẩn ra khỏi hỗn tạp vi sinh trong mẫu bệnh phẩm trên môi trường nuôicấy Từ một tế bào ban đầu sau một thời gian nuôi cấy sẽ tạo ra một khóm khuẩn lạc

Ngày thứ hai:

Cấy chuyển vi khuẩn Salmonella từ môi trường tăng sinh Selenit sang môi

trường SS Ủ môi trường SS đã cấy trong tủ ấm ở 370C trong 24h

Ngày thứ ba:

Đọc kết quả vi khuẩn mọc trên môi trường SS thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc

trưng tròn, tâm đen có vòng trong là Salmonella Một số trường hợp khuẩn lạc Salmonella không có tâm đen Chọn khuẩn lạc Salmonella tròn có vòng ngoài trong,

tâm đen, dùng pipet lấy vài khuẩn lạc điển hình cho vào nước cất vô trùng chứa sẵntrong ống nghiệm Lắc đều để đồng nhất dung dịch Tiến hành thử nghiệm sinh hóa để

định danh Salmonella.

2.2.5 Thử nghiệm sinh hóa:

 Xác định khả năng lên men đường Glucose, Lactose, sinh hơi, sinh H2S:

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) được sử dụng để thử nghiệm đồng thời khảnăng sử dụng nguồn cacbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh hơi, sinhH2S, chỉ thị màu là phenol red.

• Cách thực hiện và kết quả:

Dùng pipet hút một lượng vi khuẩn, nhỏ vài giọt lên bề mặt môi trường sau đóđâm sâu xuống đáy môi trường Ủ ở 370C trong 24 giờ

Kết quả trên môi trường KIA có đặc tính :

- Đỏ/vàng: vi khuẩn lên men glucose, không lên men lactose (+/-)

- Sinh hơi: môi trường bị nứt hay bị đẩy lên

- Sinh H2S môi trường có màu đen

Hình 2.2: Kết quả thử nghiệm Salmonella trên môi trường KIA

 Khả năng lên men đường mannitol và di động:

+ Môi trường mannitol-motility được sử dụng để thử nghiệm đồng thời khả

năng lên men đường mannitol và khả năng di động của vi khuẩn Salmonella, chỉ thị

màu phenol red, môi trường thạch bán lỏng

• Cách thực hiện và kết quả:

+ Dùng pipet một lượng dịch vi khuẩn, đâm sâu xuống môi trường không nhỏ vikhuẩn lên bề mặt môi trường tránh trường hợp gây di động giả Ủ ở 370C trong 24giờ

+ Đọc kết quả môi trường chuyển sang màu vàng do vi khuẩn lên men mannitol(+) Môi trường đục do vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy di động (+)

 Khả năng biến dưỡng Citrat

+ Simmon Citrat có chất chỉ thị màu bromothymol blue có màu vàng ở PH<6,0,màu xanh lục ở PH trung tính, màu xanh dương ở PH>7,6

• Cách thực hiện và kết quả:

+ Dùng pipet hút một lượng dịch vi khuẩn, nhỏ vài giọt lên bề mặt môi trường

Ủ ở 370C trong 24 giờ

+ Đọc kết quả môi trường có màu xanh dương thì Citrat (+), do vi khuẩn

Salmonella có khả năng lên men Citrat.