BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu NUÔI CẤY VI SINH VẢT VÀ LY TRÍCH ENZYME ĐỂ CHUYỂN HÓA LIPID

Hình 1: Sự sinh trưởng của vi sinh vật đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không códầu...43Hình 2: Sự sinh trưởng của vsv ở đất chưa nhiễm dầu ở cồn Ấu, cần Tho khi nuôi trong môi trườ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THO

KHOA CÔNG NGHỆ

0O0

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

ĐỂ TẢI:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu NUÔI CẤY VI SINH VẢT VÀ LY TRÍCH ENZYME ĐẺ CHUYỂN HÓA LIPID

GVHD:

TS LÊ THANH PHƯỚC

ThS NGUYỄN THỊ PHI OANH

học, tạo điều kiện tốt giúp em hòan thành luận văn tốt nghiệp.

Cô Nguyễn Thị Phi Oanh đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức ban đầu

về đề tài và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Chúng em xin chân thành cám ơn các thầy, cô ở bộ môn Hóa và bộ môn Sinh, khoaKhoa Học, trường Đại Học cần Thơ đã tận tình giúp đỡ chúng em về phương tiện nghiêncứu cũng như kiến thức

Chân thành cám ơn thầy Chơn, anh chị ở bộ môn Sinh - Hóa, khoa Nông Nghiệp,trường Đại Học cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng em hoàn thànhluận văn

Chúng em xin cảm ơn cô Thoa và các anh, chị học viên cao học đang làm việc tạiphòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học đã giúp đỡ chúng em trong quátrình thực hiện đề tài

Và người mà chúng em ngàn lần biết ơn đó là cha mẹ, người luôn sát cánh động viên

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em hoàn thành luận văn

Cần Thơ, Ngày 27 tháng 11 năm 2008

Đào Thị Phương Thảo Lê Thị Thùy Linh

MUC LUC

oOo

-LỜI CẢM TẠ MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH TÓM LƯỢC Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

I

Giới thiệu lipase 3

1.1 Lipase 3

1.2 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lipase 4

1.3 Phương pháp tách và làm sạch lipase trong nghiên cứu 4

1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzym 7

II Lipid 8

II 1 Khái niệm 8

11.2 Phân loại 8

11.3

Tính chất vật lý và hóa học của lipid 9

III Nguyên liệu sản xuất một số lipase quan trọng 15

III 1 Lipase từ động vật 17

111.2

Lipase từ thực vật 18

111.3 Lipase từ vi sinh vật 18

IV ứng dụng của lipase 23

IV 1 Lipase trong công nghiệp chất tẩy rửa 23 IV 2 Lipase trong công nghiệp thực phẩm

1.2 Nguyên liệu 25

1.3 Dụng cụ và thiết bị 27

I 4 Hóa chất 28

II Phương pháp nghiên cứu 28

II 1

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu 28

11.2

Nuôi cấy vi sinh vật đất 30

11.3 Khảo sát sự chuyển hóa của lipid với xúc tác lipase 38

11.4 Kết tủa lipase thô 39

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

I Kiểm tra chất lượng nguyên liệu 41

II Sự hiện diện của vi sinh vật thủy phân dầu trong đất 43

II 1 Sự sinh trưởng của vi sinh đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không có dầu 43

II.2.Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường agar có hoặc không có dầu .47

11.3 Định lượng acid sinh ra do sự thủy phân dầu từ lipase của vi sinh vật 49 11.4 Mật số vi sinh vật 55

11.5 Enzyme do vi sinh vật sinh ra tham gia quá trình thủy phân lipid 56

III Sự chuyển hóa của lipid với xúc tác lipase 58

IV Chế phẩm enzym thô từ vi sinh vật 64

IV 1 Thu chế phẩm enzym thô 64

IV.2 Thử hoạt tính enzym thô 64

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66

I Kết luận 66

II Đe nghị 66

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

-oOo -Bảng 1: Một số nguồn enzym và enzym quan trọng 16

Bảng 2: Kết quả dùng KOH để trung hòa acid béo tự do trong dầu 41

Bảng 3: Thể tích HC10.1 M để trung hòa KOH 0.1 N thừa 41

Bảng 4: Thể tích Na2s203 0.0 IN dùng để chuẩn độ lượng Iod thừa 42

Bảng 5: Tổng hợp chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa và chỉ số Iod của các loại dầu 42

Bảng 6: Lượng lipase sinh ra ở các mẫu sau 24 và 48 giờ 51

Bảng 7: Hoạt độ của lipase do vsv tạo ra (U/ ml) khi nuôi cấy trong môi trường có dầu và không dầu sau 24 và 48 giờ 53

Bảng 8: Mật số vsv theo thời gian (OD 600 nm) 55

Bảng 9: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 30 phút 56

Bảng 10: Thể tích NaOH 0,05 M dùng để chuẩn độ các mẫu nuôi cấy với các loại dầu sau 60 phút 57

Bảng 11: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 60 phút 57

Bảng 12: Thể tích NaOH 0.05 M dùng để chuẩn độ các loại dầu và hoạt độ của lipase ngoại bào sau 30 phút 58

Bảng 13: Họat tính của lipase ngoại bào theo thời gian được định lượng bằng NaOH 0.05M 59

Bảng 14: Họat độ lipase ngoại bào theo thời gian 59

Bảng 15 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 1 ở các thời điểm khảo sát 62

Bảng 16 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu lb ở các thời điểm khảo sát 62

Bảng 17 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 2 ở các thời điểm khảo sát 63

Bảng 18 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 4 ở các thời điểm khảo sát 63

Bảng 19: Hàm lượng lipase ngoại bào thô thu được ở các mẫu 64

Bảng 20: Hoạt độ của lipase thô ngoại bào sau 30 phút 64

Hình 1: Sự sinh trưởng của vi sinh vật đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không có

dầu 43Hình 2: Sự sinh trưởng của vsv ở đất chưa nhiễm dầu ở cồn Ấu, cần Tho khi nuôi trong

môi trường có các loại dầu đã sử dụng 44Hình 3: Sự sinh trưởng của vsv ở các mẫu đất Ben Tre khi nuôi trong môi trường dầu

tưcmg ứng 45Hình 4: Sự sinh trưởng của vsv ở mẫu đất chưa nhiễm dầu 46Hình 5: sự sinh trưởng của vsv ở các mẫu đất đã nhiễm dầu qua sử dụng trên môi trường

có và không bổ sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ 47Hình 6: Sự sinh trưởng của vsv đất cồn Ấu, cần Tho trên môi trường có và không bổ

sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ 48Hình 7: Sự sinh trưởng của vsv ở các mẫu đất đã nhiễm dầu chưa sử dụng trên môi

trường có và không bổ sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ 49Hình 8: Màu đối chứng của acid với chất chỉ thị màu heliantin 50Hình 9: Sự chuyển màu trên bề mặt môi trường nuôi cấy vsv trong các mẫu đất ở cằnThơ khi có hoặc không có sự hiện diện của dầu với chất chỉ thị heliantin 51Hình 10: Sự chuyển màu trên bề mặt môi trường nuôi cấy vsv trong các mẫu đất ở Bến

Tre khi có hoặc không có sự hiện diện của dầu với chất chỉ thị heliantin 51Hình 11: Họat độ của lipase ngoại bào theo thời gian đối với dầu chưa sử dụng 60Hình 12: Họat độ của lipase ngoại bào theo thời gian đối với dầu đã sử dụng 60Hình 13: Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng của mẫu nuôi cấy từ dầu chưa sử dụng (dầu

lb và 2) 61Hình 14: Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng của mẫu nuôi cấy từ dầu đã sử dụng (dầu 1

và 4) 62

TÓM LƯỢC

Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật từ những mẫu đất nhiễm dầu, dầu mỡ

đã qua sử dụng và chưa sử dụng ở hai tỉnh cần Thơ và Bến Tre để ly tríchlipase thô nhằm thực hiện chuyển hóa lipid, chúng tôi nhận thấy hệ vi sinh vậttrong các mẫu đất khảo sát có khả năng thủy phân các loại dầu này Tuy nhiên,

hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đã nhiễm dầu có khả năng thủy phân dầu caohơn hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đối chứng Vi sinh vật trong các mẫu đất

có mật số cao ở 72 giờ khi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung dầu.Trong các mẫu khảo sát, nhìn chung, lipase do vi sinh vật trong các mẫuđất đã nhiễm dầu tổng hợp có hoạt tính cao sau 24 giờ nuôi cấy Lipase do visinh vật được nuôi trong môi trường có bổ sung dầu tổng họp vẫn hiện diệntrong tế bào (lipase nội bào), một phần được tiết ra môi trường nuôi cấy thamgia vào quá trình thủy phân lipid (lipase ngoại bào) Hàm lượng lipase thôngoại bào thu được là 20, 29, 24 và 16 mg/ml tương ứng với hoạt độ 56.7, 94,5,65.0 và 94,5 u/ml khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường có các mẫu dầu 1,

4, 2 và lb, theo thứ tự

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐÈ

Chất xúc tác sinh học - enzyme là những họp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao.Với bản chất là protein, enzyme xúc tác các phản ứng đến cùng tạo ra 100% sản phẩm,đồng thời không tạo ra sản phẩm phụ, tốn ít năng lượng nhất và thân thiện với môitrường Ngày nay, gần 4000 enzyme đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó khoảng

200 loại được sử dụng trên thị trường Phần lớn enzyme trong công nghiệp có nguồn gốc

từ vi sinh vật Vào những năm 1960, tổng enzyme bán được chỉ có vài triệu đô la hàngnăm, nhưng đến nay thị trường đã phát triển ngoạn mục do những hiểu biết về sản xuấtchất xúc tác sinh học và quá trình lên men, các phương pháp ly trích được cải tiến và nhucầu sử dụng enzyme ngày càng cao Hơn nữa, đặc tính xúc tác enzyme không giống nhau,

do đó số enzyme hiện nay có mặt trên thị trường cũng tăng gấp nhiều lần [17]

Trên thế giới, khoảng 60% trong số enzyme công nghiệp được sản xuất ở Châu Âutrong đó 75% của tổng enzyme công nghiệp (gồm cả lipase) có hoạt tính thủy phân [17]

Ở Việt Nam, việc ứng dụng enzyme làm chất xúc tác trong công nghiệp vẫn còn rấtmới Trước đây các enzyme thường được trích từ động vật và thực vật nên quy trình sảnxuất còn gặp nhiều khó khăn và giá thành khá đắt Trong 30 năm gần đây, các nhà khoahọc đã và đang quan tâm đến nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền là enzyme từ visinh vật Nguồn enzyme này có những ưu điểm như: vi sinh vật tổng họp enzyme có tốc

độ sinh trưởng nhanh, enzyme ly trích có hoạt tính cao, nguyên liệu dùng để sản xuất rẻtiền, dễ kiếm, nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết và có thể thực hiện ở qui

mô công nghiệp

Lipase là một nhóm của enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân củatriglycerol và xúc tác một số phản ứng của transeter hóa dưới những điều kiện nhất định[8] Lipase cũng tham gia vào chu trình hòa tan các chất hữu cơ không hòa tan trong tựnhiên và tổng họp được những sản phẩm có giá trị cao, có lợi thế hơn những sản phẩmtruyền thống Chu kỳ của những vật liệu này gọi là “công nghệ làm sạch”, là những vậtliệu tổng họp sử dụng và tái sử dụng đã và đang mang lại sự gia tăng rất lớn những sản

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

phẩm dự trữ cần thiết cho những hoạt động của con người Nhóm lipase này tham gia vào

sự chuyển hóa sinh học của những cơ chất kỵ nước tạo thành những sản phẩm hữu ích Sửdụng những lipase tạo ra từ vi sinh vật để xử lí và phân hủy chất béo và dầu ở dạng thô,được xem là một chiến lược rất thú vị, những sản phẩm mới này có ưu thế trong ứng dụngcông nghiệp, nó có khả năng phân hủy mỡ và dầu trong nước thải và khử quá trình xử lí

sơ bộ [18]

Trong những năm gần đây, lipase được sử dụng nhiều trong công nghiệp như: bộtgiặt, công nghiệp giấy, tổng họp chất hữu cơ Trong tương lai, triển vọng ứng dụng cácthuộc tính vốn có của lipase sẽ được phát huy xa hơn nhờ vào thành tựu của công nghệsinh học và công nghệ hóa học

Lipase có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật, tuy nhiên phần lớn các

lipase thương mại thì có nguồn gốc từ vi sinh vật (R.Sharma et aỉ, 2001) Các vi sinh vật

tổng họp lipase hiện diện trong nước thải công nghiệp, trong đất ở những nơi sản xuất dầu

ăn, đất nhiễm dầu (Sztajer et al., 1998) Trong môi trường đất, vi sinh vật có khả năng

tổng họp lipase rất phổ biến (W.H Ko, I.T.Wang & P.J Ann, 2005), đây là nguồn nguyênliệu rẻ tiền và dễ tìm

Với những ưu điểm và khả năng ứng dụng của lipase, mục tiêu của đề tài là: “Bướcđầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật đất để ly trích lipase và thực hiện chuyển hóa lipid”.Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Chọn lọc và gia tăng mật số vi sinh vật phân hủy dầu từ những nguồn đất nhiễmdầu - dầu mỡ đã qua sử dụng và chưa sử dụng

- Xác định thời gian nuôi cấy đạt mật số vi sinh vật cao nhất

- Xác định lipase do vi sinh vật tổng họp để thủy phân chất béo là lipase nội bào hayngoại bào

- Khảo sát phản ứng thủy phân từ nguồn lipase thu được

- Ly trích lipase thô từ nguồn vi sinh vật đã nuôi cấy

- Thực hiện sự chuyển hóa lipid từ chế phẩm lipase thô thu được

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Giói thiệu iỉpase

1.1 Lỉpase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase) là nhỏm enzyme xúc tác phản ứng thủy phântriacylglycerols thành diacylglycerols, monoacylglycerols, các acid béo và glycerol ở bềmặt phân cách pha giữa nước và lipid Lipase xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từngliên kết ester trong phân tử mà không cắt đứt cả ba liên kết ester cùng một lúc Một vàilipase không có tính đặc hiệu, chúng xúc tác phản ứng ở tất cả các vị trí trongtriacylglycerols Phần lớn lipases có tính đặc hiệu và tính chọn lọc, các enzyme này xúctác phản ứng bằng cách bám vào các vị trí đặc biệt trên phân tử [7]

Phản ứng thủy phân với xúc tác lipase có thể làm dịch chuyển phản ứng thủy phâncủa liên kết glycerol ester và tổng họp những glycerol ester Phản ứng được minh họa nhưsau: [8]

Lipase Esteriíicatỉon

R J COOII + R,OH ^ ^ R1COOR2 + H 2 O

hydrolysỉs

Tùy theo mục đích tổng họp và tùy vào tính đặc hiệu của lipase Phản ứng thủyphân có thể xảy ra theo cơ chế sau [14]

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Lipase có thể xúc tác phản ứng thuận nghịch để hình thành các sản phẩm khác nhau.Hiểu được cơ chế hoạt động của lipase giúp chúng ta có thể kiểm soát được sản phẩm tạo

ra để đạt hiệu suất cao nhất

1.2 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lỉpase [6]

- Khi thủy phân bằng enzyme còn cho phép điều chỉnh được thành phần hóa họccủa sản phẩm

- Lipase có thể thủy phân trong điều kiện nồng độ cơ chất rất cao do đó giảm đượcchi phí hơi

b Nhược điểm

- Thời gian thủy phân của lipase dài hơn so với acid

- Dung dịch do lipase thủy phân thường khó lọc hơn khi thủy phân bằng acid, do

có chu kỳ sản xuất kéo dài

- Muốn có hiệu suất cao và chất lượng sản phẩm tốt phải có chế phẩm enzyme tinhkhiết

1.3 Phương pháp tách và làm sạch lỉpase trong nghiên cứu [19]

Enzyme là một loại protein tổng họp trong tế bào Phần lớn chúng tồn tại trong tếbào do các enzyme thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào Ly tríchenzyme ra khỏi tế bảo rất khó bởi vì: Hàm lượng enzyme trong tế bào sinh vật khônglớn so với các thành phần khác Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điềurất khó Hơn nữa enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tácđộng của các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, pH Do bản chất là protein, enzymethường liên kết với những loại protein khác không có thuộc tính của một enzyme nhưngcác protein này lại có đặc tính lý hóa tương tự enzyme

Như vậy việc ly trích enzyme là làm sao loại được các protein không phải enzyme,nước, và các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme Một trong những phương pháptinh sạch enzyme hiện nay được sử dụng:

a Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, làm biến tính chọn lọc cácloại protein tạp Phương pháp này chỉ thích họp với enzyme chịu acid và bền nhiệt Ởđiều kiện nhiệt độ cao và pH thấp, enzyme sẽ bị biến tính Sau đó bằng phương pháp lytâm hoặc phương pháp lọc ta có thể loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà tamong muốn

b Phương pháp kết tủa phân đoạn

Trong các phương pháp tinh sạch enzyme, phương pháp kết tủa là hữu dụng nhất

và phù họp với các qui mô sản xuất lớn và nhỏ Phương pháp kết tủa gồm có 4 loại: kếttủa bằng các dung dịch muối, kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa với sự thay đổi pH,

và kết tủa bằng dung môi nước polymer

Kết tủa bằng dung dịch muối

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối

Ở nồng độ muối thích họp, tính tan trong nước của các phân tử kích thước lớn tương

tự các protein tăng Hơn nữa, khi tăng nồng độ muối sẽ làm kết tủa protein

Dung dịch muối phụ thuộc vào pH và nhiệt độ Các enzyme hòa tan ít nhất quanhđiểm đẳng điện của chúng và một ít hòa tan thấp hơn trong dung dịch đệm, nói cách khác

là trong sự có mặt của muối, về nhiệt độ, các protein nhìn chung kết tủa ở nhiệt độ caotrong dung dịch đệm

Các muối được dùng để kết tủa enzyme như: (NH4)2SC>4; Na2SC>4; K2SƠ4;MgS04 sự hòa tan của các loại muối này phụ thuộc vào nhiệt độ và các loại muối khôngảnh hưởng đến thuộc tính tự nhiên của enzyme

Dựa vào khả năng kết tủa của các enzyme ở các nồng độ muối khác nhau, người tathường sử dụng (NH4)2S04 để kết tủa phân đoạn enzyme Ngoài ra một số dung môi hữu

cơ được sử dụng để kết tủa enzyme Phương pháp kết tủa này thường làm enzyme biếntính rất nhanh Vì thế trước khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm sạch các chất kết tủa

và cả dung dịch enzyme (NH4)2S04 có hiệu quả nhất cho quá trình kết tủa do chúng có

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

thể hòa tan ở bất kỳ nhiệt độ nào và giá thành lại thấp (NH4)2S04 cũng hữu ích cho tínhbền các enzyme

♦♦♦ Quá trình kết tủa bằng dung môi

Nước có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, isopropanol và acetone

Sự hòa tan của các enzyme kết tủa là do sự kết tủa của các dung môi nước chứa chấtkhông dẫn điện và nói cách khác nước hình thành quanh các protein Các dung môi hữu

cơ có thể làm dịch chuyển các lipid lân cận đến một protein Quá trình kết tủa bằng dungmôi hữu cơ bị ảnh bởi nhiệt độ, liên kết ion và pH của dung dịch đệm

Các protein phổ biến được kết tủa khoảng 40% trong rượu, nhưng protein với bề mặt

kỵ nước như lipase thì tan với ở những điều kiện sau: Nồng độ rượu từ 80 - 90% là cầnthiết cho quá trình kết tủa lipase Nồng độ protein cao hơn 1 mg/ml và dung dịch đệmthấp hơn 50 mM Dung dịch và dung môi hữu cơ được giữ ấm và hỗn họp được giữ dưới

0°c trong quá trình thêm dung môi hữu cơ

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Quá trình kết tủa bằng cách thay đỗi pH

Có hai cách kết tủa bởi sự thay đổi pH, kết tủa ở điểm đẳng điện và kết tủa thuộctính acid Tuy nhiên, kết tủa thuộc tính acid chỉ thích họp cho những protein bền, cácprotein thô thì không bền trong giới hạn acid

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Quá trình kết tủa bằng dung dịch nước polymer

Quá trình kết tủa bằng dung dịch nước polymer là một phương pháp đơn giản cho sựkết tủa và sự kết dính của protein Nhiều protein dễ kết tủa khi có sự hiện diện của cácdung dịch nước polymer không ion như polyethylene glycerol (PEG 2000, 4000, 6000),methyl celluso, polyvinyl alcohol (PVA) và dextrans (DEX)

Các dung môi nước polymer có khả năng lấy nước từ xung quanh các protein Cácprotein liên kết với các polymer bằng liên kết hydro, và sau đó hỗn họp kết tủa như mộtchất rắn hoặc đôi khi là một chất sền sệt

c Phương pháp hấp thụ chọn lọc

Chất hấp thụ có thể được cho trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịchenzyme chạy qua một cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ thường sử dụng làhydroxyapatie Bằng phương pháp này, có thể hoặc hấp thụ enzyme hoặc hấp thụ protein

tạp Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện các quá trình hấp thụ ởnhiệt độ 0°c Sau khi hấp thụ các enzyme được ly trích bằng các dung môi thích họp.

d Phương pháp sắc ký

Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhântrao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme Cáctác nhân trao đổi ion sau:

Nhựa trao đổi ion Dẩn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,dietylamino-etyl-cellulose (DEAE - cellulose) Hoặc Sephadex, dẫn xuất củapolysaccaride dextran

Hiện nay chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làmsạch enzyme Do đó việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọncác phương pháp riêng, kết họp với nhau, tạo ra một hệ thống gồm các phương pháp nốitiếp nhau hài hòa nhất

1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ củachúng Enzyme không thể được định lượng trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thôngqua hoạt độ của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gianphản ứng Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương phápsau để xác định khả năng xúc tác của enzyme:

-Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau mộtthời gian nhất định và lượng enzyme được xác định trước Phương pháp này được ápdụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác

-Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhấtđịnh của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định.-Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thuđược sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

II Lipid

11.1 Khái niệm

Lipid hay chất béo là nhỏm họp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào độngvật và thực vật Các lipid có thảnh phần hóa học và cấu tạo khác nhau nhưng chứng cónhững đặc tính chung là không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ (ete,cloroíorm, bezen, toluen ) Lipid là một trong những thành phần cấu tạo quan trọng củamàng tế bào cũng như các bào quan trong tế bào Ngoài ra, lipid còn là nguồn cung cấpnăng lượng, nguồn cung cấp vitamin A, D, E, K và F cho cơ thể [6]

11.2 Phân loại

Dựa vào thành phần cấu tạo, có thể chia lipid thành hai nhóm [6]

II.2.1 Lipid đơn giản: là ester của rượu với acid béo.

n.2.1.1 Glycerìd: Là ester của rượu glycerol và acid béo, là mỡ dự trữ phổ biến ở

động vật và thực vật

Glycerol: là triol không màu, vị ngọt, và nhờn Khi đốt glycerol hay lipid có chứa

glycerol với chất hút nước sẽ tạo acrolein có mùi khét

Acid béo: acid béo thường gặp là những acid béo có số carbon chẵn, mạch thẳng, có

thể no hay không no và chuỗi c xếp theo hình chữ chi

Tuy nhiên cũng có những acid béo ngoài nhóm chức acid còn chứa những nhóm chứckhác như rượu, cetone, mạch carbon có vòng hay nhánh

II.2.1.2 Cerid: là ester của rượu và acid béo, nhiệt độ thường ở thể rắn, có ở

động thực vật, ở thực vật nó thường tạo thảnh một lớp mỏng phủ lên lá, thân, quả củacây

Cerid có công thức tổng quát l à : R - 0 - C - 0 - R

Rượu trong cerid là rượu cao phân tử, chỉ chứa một nhóm OH , mạnh c không phânnhánh, rất ít khi mạch c có vòng (Rượu cetol)

Sáp ong, sáp cá voi (spermaceti) là ester của rượu cetol và palmitic acid

Ngoài ra trong sáp ong và sáp cá voi còn có rượu tự do, acid béo tự do và

hydrocarbon

II.2.1.3 Sterid: là ester của rượu sterol và acid béo Rưọu sterol có vòng và trọng

lượng phân tử rất lớn, sterol tiêu biểu là cholesterol, acid mật Acid béo thường làpalmitic, oleic, ricinoleic

II.2.2 Lipid phức tạp:

Trong phân tử lipid phức tạp ngoài acid béo và rượu còn có các thành phần khácnhư acid phosphoric, bazơ, nitơ, đường Một số lipid phức tạp gồm: glycerophospholipid(phosphatid), sphingophospholipid, glycolipid

II.3 Tính chất vật lý và hóa học của lỉpỉd [6]

Nếu acid béo ở dạng muối thì dễ hòa tan hơn

Trong các dung môi hữu không phân cực như benzen, ether, ether dầu hoả acid béo

dễ tan Tuy nhiên trong dung môi hữu cơ phân cực như aceton, acid béo khó hoà tan hayhoà tan rất ít

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CÓ thể dùng phản ứng này để xác định số nối đôi trong phân tử acid béo Phản ứng

dễ dàng hay khó xảy ra tuỳ thuộc vào vị trí nối đôi đối với nhóm carboxyl, nối đôi cànggần nhóm carboxyl phản ứng càng khó xảy ra

Để xác định số nối đôi người ta căn cứ vào chỉ số Iod

Chỉ sổ Iod: là số gam Iod cần thiết để tác dụng lên 100 gam chất béo Do đó chỉ số

Iod càng lớn thì số nối đôi càng nhiều

c Sự thuỷ phân:

Ester khi thuỷ phân sẽ tạo thành rượu glycerol và acid béo Tác nhân thủy phân làacid, kiềm, nước hay enzyme

* Thủy phân bằng nước cần nhiệt độ và áp suất cao

* Thủy phân bằng kiềm: NaOH hay KOH

Chỉ sổ xà phòng hoá: là sổ mg KOH cần để trung hoà 1 g chất béo Chỉ sổ xà phòng

Ngoài ra để xác định tính chất của chất béo người ta còn căn cứ vào một số chỉ sốkhác như chỉ số acid

Chỉ số acid: là số mg KOH dùng để trung hoà tất cả acỉd béo tự do có trong 1 g chất béo.

d Sự ôi hóa:

Dầu mỡ để lâu có mùi và vị khó chịu gọi là sự ôi hóa, một trong những nguyên nhângây ra là do oxy không khí kết họp vào nối đôi tạo thành peroxide Nếu oxy kết họp vàonguyên tử carbon đứng cạnh liên kết đôi thì sẽ tạo thành hydrogen peroxide Sau đóperoxide và hydrogen peroxide sẽ bị phân giải để tạo thành aldehyde và cetone Cácaldehyde và cetone này đều là những chất có mùi và vị khó chịu

II.3.3 Sự chuyển hóa của lipid dưới xúc

tác lipase

II.3.3.1 Phản ứng thủy phân

1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân

Phản ứng thủy phân là phản ứng rất phổ biến và rất quan trọng trong bảo quản vàsản xuất thực phẩm Do phản ứng thủy phân mà chất lượng các sản phẩm thực phẩm bịgiảm đi, tuy nhiên phản ứng thủy phân cũng làm tăng phẩm chất cho thành phẩm Quaphản ứng thủy phân, không những chỉ các tính chất cảm quan mà các tính chất hóa họccủa sản phẩm cũng có thể bị biến đổi

- Phản ứng thủy phân thường mở đầu cho một loạt các phản ứng khác tiếp diễn Cácphản ứng khác có thể xảy ra khi phản ứng thủy phân đã kết thúc

- về mặt sinh học, phản ứng thủy phân thường đặc trưng cho giai đoạn phân giải, làgiai đoạn kết cùng của một quá trình sinh học

- Trong sản xuất thực phẩm, phản ứng thủy phân có vai trò rất quan trọng Để giảmbớt sự tổn thất phẩm chất thực phẩm, người ta phải tìm những biện pháp kỹ thuật tươngứng để ngăn ngừa và hạn chế các phản ứng thủy phân Trái lại, qua phản ứng thủy phân

mà chất lượng thành phẩm tăng lên thì người ta phải tạo điều kiện cho các phản ứng xảy

ra đến tận cùng [6]

2 Đặc điểm của các Cff chất bị enzyme thủy phân

- Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là chất đạm (protein), tinh bột(glucid), chất béo (lipid), v.v

- Theo Bemard Pullman và Alberte Pullman, đặc điểm chung của những cơ chất này

là có “ liên kết bị thủy phân” do các nguyên tử tích điện dương tạo nên Người ta gọi liênkết này là “ liên kết nhị dương”

- Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bịthủy phân càng lớn [6]

3 Đặc điểm chung của tâm hoạt động của enzyme thủy phân.

- Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại Như vậy bắt buộc tâmhoạt động của chúng phải có các gốc acid amine đặc hiệu

- Tâm hoạt động của enzyme hydrolase thường chứa nhóm imidazol của histidin vànhóm hydroxyl của một trong số các gốc serin

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

- Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein - enzym mà nhóm hydroxyl của serin vàvòng imidazol của histidin gần gũi nhau Khi đó giữa nhóm hydroxyl của serin và nguyên

tử nitơ bậc ba của imidazol tạo thành liên kết hidro Nhờ thế oxy của nhóm hydroxyl thuđược tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất

[6].

4 Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase

- Tâm ái nhân của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tíchđiện dương của liên kết bị thủy phân

- Enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thànhliên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần với liên kết bị thủy phân

- Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein-enzyme mà nhỏm hydroxyl của serin vàvòng imidazol của histidin gần nhau Khi đó giữa nhóm hydroxyl của serin và nguyên tửnitơ bậc ba của nhân imidazol tạo thành liên kết hydro và oxy của nhóm hydroxyl thuđược tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất [6]

5 Một số đặc điểm của phản ứng do enzyme xúc tác

Cô chaâ + nõôà -► saâ phaẩh

Sơ đồ phản ứng cho thấy phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân.Nhưng vì nồng độ của nước rất lớn coi như không thay đổi trong suốt thời gian phản ứng,

do đó vận tốc của phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất Như vậy, phản ứng thủy phânbởi enzyme là phản ứng đơn phân và bậc nhất

- Nhiệt độ và pH cũng có thể điều chỉnh các phản ứng thủy phân bởi enzyme Mỗienzyme thủy phân có một nhiệt độ và pH tối ưu riêng do đó chiều của phản ứng thủy phân

có thể kiểm soát được bởi nhiệt độ và pH [6]

II.3.3.2 Phản ứng biến đổi dầu và mỡ động,

thực vật

1 Esterhóa

- Enzyme xúc tác phản ứng ester hóa đã được ứng dụng phổ biến trong công nghiệpnhư cải biến chất lượng dầu mỡ động, thực vật đáp ứng nhu cầu sản phẩm tinh sạch, íthóa chất phục vụ cho con người Tương tự những chất xúc tác khác, enzym cũng ảnhhưởng đến chiều phản ứng, và được xác định bằng nhiệt động học của phản ứng Ví dụcân bằng của phản ứng dưới xúc tác nhóm hydrolase khi thay đổi nồng độ tác nhân vàlượng nước thì cân bằng cũng thay đổi theo

- Vài ester quan trọng là glycerides có mặt trong dầu mỡ động, thực vật được sửdụng trong công nghiệp thực phẩm và những ngành công nghiệp khác Enzymes, đặc biệt

là lipase, có nhiều mục đích sử dụng trong việc xử lí và chế biến dầu mỡ động, thực vật.Những thuận lợi gần đây trong nghiên cứu thực phẩm, quan trọng nhất là các acid béokhông bão hòa và nguy cơ bị isomer hóa dạng cis thành trans trong quá trình hydro hóadầu thực vật thúc đẩy các quá trình sinh học phát triển cắt đứt mạch dầu thực vật Sự thayđổi một số acid béo của triglycerides từ những loại dầu khác nhau, nhằm biến tính chất lý-hóa và dinh dưỡng, vị ngon của nguyên liệu Ví dụ việc chọn những lipase cho vị trí 1 và

3 trên mạch glycerol thì rất thuận lợi, vì hầu hết những triglycerides quan trọng có trong

bơ cocoa chứa các acid palmitic hoặc strearic ở vị trí 1 và 3, và acid oleic ở vị trí 2, vàphản ứng ester hóa giữa các phân tử bằng xúc tác hóa học không thể thực hiện được Nóchỉ thực hiện xúc tác tồn tại dưới dạng mono- và diglycerides, có thể sử dụng nhữngenzyme đặc biệt này để di chuyển nhóm acyl và có thể sản xuất triglycerides từ glycerol

và các acid béo tự do sử dụng lipase đặc hiệu cho vị trí 1, 3

- Phản ứng ester hóa bằng xúc tác lipase được ứng dụng để tổng họp một số ester từdầu và acid béo tương ứng, như tổng họp ester sáp được sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm[13]

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

- Trong điều chế tổng họp nhiên liệu sinh học, biodiezel Lipase được sử dụng nhưchất xúc tác cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động, thực vật Lipase xúc tác tổng họpnhững ester đơn giản từ những nguồn lipid khác nhau dưới điều kiện có hoặc không códung môi hữu cơ Trước đây việc sản xuất những ankyl ester này là sử dụng chất xúc táchóa học như acid, base Nhưng các phương pháp này tồn tại nhiều hạn chế như sự phụchồi glycerin và loại bỏ xúc tác rất khó khăn, và phá hủy một số sản phẩm phụ có giá trịnhư tocopherol, tocotrienol và những lipid nhạy cảm khác như DHA (Docosahexaenoicacid), EPA, acid linoleic Cho nên chất xúc tác sinh học, lipase, đã được ứng dụng vàocông nghiệp với qui mô lớn để sản xuất những ankyl ester này bằng phương pháptransester hóa [15]

* Các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình transester hóa bằng xúc tác lipase

- Nguồn alkyl có vai trò quan trọng trong động học phản ứng khi sử dụng enzymelàm xúc tác

- Tỉ lệ nồng độ cơ chất trên sự tạo thành ester sẽ không ức chế xúc tác enzyme, màquá trình phản ứng xảy ra nhanh và hoàn toàn.

- Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme Phản ứngxảy ra nhanh khi tăng nhiệt độ, tuy nhiên nhiệt độ tăng lên làm biến tính nhanh xúc tácenzyme, và tương tác kị nước giảm mạnh Chẳng hạn như khảo sát nhiệt độ của quá trình

transester hóa của dầu cọ với dialkyl carbonates làm nguồn alkyl ở khoảng nhiệt độ 40 đến 80°c Thì thấy ở nhiệt độ 60°c có sự tạo thành ester là cao nhất Nếu nhiệt độ lớn hơn 70°c thì sản phẩm ester tạo thành giảm mạnh.

- Nước có vai trò rất khác nhau trong môi trường phản ứng cũng như đóng vai trò rấtquan trọng trong cấu trúc không gian của protein, và hòa tan tốt chất rắn Sự hiện diện củanước rất quan trọng cho cả độ bền nhiệt và hoạt tính của enzyme, làm tăng tính dẻo vàhoạt tính của enzyme Lượng nước có mặt trong môi trường phản ứng phải có một giớihạn tiêu chuẩn

- Khi tái sử dụng xúc tác enzyme, sản phẩm ester tạo thành giảm đến 2-3 lần khienzyme tái sử dụng đến lần thứ 2, cứ thế tiếp tục giảm khi enzyme được tái sử dụng tiếp

- Dung môi cũng đóng vai trò quan trong trong môi trường phản ứng, có thể có hoặckhông có sử dụng dung môi Sự thay đổi độ bền của enzyme có liên quan đến việc lựachọn dung môi cho chất điện môi, là dung môi phân cực hay tương tác ion với protein Độbền chuyển hóa điện tích đã biến đổi vị trí hoạt động phân cực Ví dụ như sự biến đổi vềtổng năng lượng tự do kết họp với quá trình sovat hóa của những dung môi khác nhau[15]

III Nguyên liệu sản xuất một số ỉỉpase quan trọng

Enzyme có bản chất là protein và chúng chỉ được tổng họp bằng con đường sinhhọc Do đó, muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận chúng từ cơthể sinh vật Tất cả các tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật có enzyme nhưng mức

độ enzyme ở từng loại thì khác nhau cho từng loại tế bào

stt Enzyme Mã số

enzyme

Nguồn enzyme

Nội bào, ngoại bào

Mức đ ô

•

sản xuất

ứng dụng trong công nghiệp

Nguồn động vật

1 Catalase 1.11.1.6 Gan động

2 Chymotrypsi

3 Lipase 3.1.1.3 Tụy tạng Ngoại bào - Thực phẩm

4 Rennet 3.4.23.4 Da múi khế Ngoại bào + Phô mai

độngvật

5 Trypsin 3.4.21.4 Tụy tạng Ngoại bào + Thuộc da

Nguôn thực vật

6 Actinidin 3.4.22.1

4 Trái Kiwi Ngoại bào - Thực phẩm

7 a-Amylase 3.2.1.1 Malt Ngoại bào +++ Bia

8 P-Amylase 3.2.1.2 Malt Ngoại bào +++ Bia

9 Bromelin 3.4.22.4 Dịch dứa Ngoại bào

-Bia

10 P-Glucanase 3.2.1.6 Malt Ngoại bào ++ Bia

1

17 Glucose 5.3.1.1 Bacillus sp. Nội bào ++ Sừoíruco

somerase

18 Penecillin 3.5.1.11 Bacillus sp. Nội bào - Dược

amidase

19 Protontin 3.4.21.1

20 Pollulanase 3.2.1.41 Klobaỉolla Ngoại bào - Tinh bột

Hiện nay người ta ly trích và tinh sạch lipase từ ba nguồn cơ bản:

III.l Nguồn lỉpase từ động vật

Ở động vật, không phải tế bào nào cũng có khả năng tạo ra những enzyme mà tamong muốn

Hiện nay, người ta chỉ mới ly trích enzyme từ các tuyến dịch hoặc những cơ quantrực tiếp, hoặc gián tiếp vào quá trình tiêu hóa của động vật Enzyme được khai thác chủyếu là nhóm protease, có hoạt tính khá cao và ổn định Mặc dù có hoạt tính cao nhưngviệc ly trích rất khó khăn

- Do mục tiêu của chăn nuôi là lấy thịt, sữa, da và do việc lấy enzyme chỉ là phụnên không thể có trường họp chăn nuôi chỉ lấy enzyme Enzyme chỉ chiếm một lượng nhỏtrong sản phẩm của ngành chăn nuôi

- Hiện nay, chưa có một nghiên cứu tạo giống động vật nào nhằm vào mục tiêu tạoenzyme protease mạnh dùng trong công nghiệp thực phẩm Người ta coi enzyme như làmột phần đương nhiên trong thu nhận sinh khối từ chăn nuôi

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

III.2 Nguồn lỉpase từ thực vật

Ta có thể khai thác và thu nhận enzyme amilaza từ mầm lúa, papain từ nhựa quả đu

đủ hoặc bromelin từ khóm

III.3 Nguồn lỉpase từ vi sinh yật (VSV)

Trong ba nguồn sinh vật có thể li trích enzyme thì vsv được sử dụng nhiều nhất.Hiện nay, các enzyme được trích từ vsv đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong đờisống và sản xuất

vsv có nhiều đặc điểm khác cơ thể động vật và thực vật Điểm khác lớn nhất ở cơthể vsv là chúng thuộc cơ thể đơn bào Chính vì chúng được cấu tạo từ một tế bào nênchứng có những tính chất chuyên biệt Ví dụ, sự trao đổi chất giữa tế bào vsv và môitrường xung quanh là trao đổi trực tiếp Do đó vsv thường có khả năng thích ứng nhanhvới sự thay đổi của môi trường sống

III.3.1 Điều kiện sinh trưởng và phát triển vsv

3.1.1 Điều kiện sinh trưởng

Môi trường dinh dưỡng của vsv bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiếtkhác nhau Thành phần các chất dinh dưỡng này tùy thuộc vào nhu cầu cần thiết của từngloại vsv, từng yêu cầu nghiên cứu Nhìn chung các nguyên tố không thể thiếu trong quátrình sinh trưởng và phát triển của vsv là c, H, N và các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu,

Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I

- Nguồn nitơ: vsv cần nitơ ở nhiều dạng khác nhau Một số vsv cố định đạm có khảnăng nhận nitơ từ không khí nên chúng không cần cung cấp nitơ trong quá trình nuôi cấy.Phần lớn vsv trong tự nhiên không có khả năng này do đó khi nuôi cấy các vsv này,chúng ta cần cung cấp nitơ vào môi trường nuôi cấy

Nguồn carbon:

vsv rất cần carbon để tổng họp các chất khác nhau cho tế bào

Nguồn khoáng và các chất sinh trưởng:

Các chất khoáng vi lượng cần thiết với số lượng rất nhỏ Tuy số lượng ít nhưng các chấtkhoáng rất quan trọng vì chúng đóng vai trò giữ pH môi trường ổn định

♦♦♦ Độ ẩm

Ngoài các nguồn trên, vsv cũng có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh

lý, sinh hóa của tế bào, bao gồm: hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm tươngđối của không khí

Nước trong sản phẩm bao gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết(nước tự do), vsv chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm và cũngchỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí

Độ ẩm không khí là tỉ lệ phần trăm hơi nước của không khí ở nhiệt độ nhấtđịnh với lượng hơi nước bảo hòa của không khí ở nhiệt độ đó

Nhiệt độ

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối

Khả năng hấp thụ hay thoát hơi nước của sản phẩm đều có liên quan đến nhiệt

độ của môi trường, phần lớn vsv có khoảng nhiệt độ thích họp là 15 - 30°c [4]

III.3.2 Quá trình trao đỗi chất của vsv

Trong quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài, vsv biểu hiện quá trìnhđồng hóa và dị hóa rõ hơn ở động vật và thực vật Đe thực hiện quá trình đồng hóa và dịhóa đó, vsv sẽ tổng họp ra những enzyme tương ứng:

- Các enzyme đồng hóa được tổng họp trong tế bào và chỉ thực hiện các hoạt độngđồng hóa xảy ra trong tế bào

- Các enzyme dị hóa được tổng họp trong tế bào nhưng có thể hoạt động trong tếbào và ngoài tế bào gọi là enzyme nội bào (endoenzyme) hay ngoại bào (exoenzyme)

Enzyme nội bào còn bao hàm cả các loại enzyme tham gia tổng hợp, enzymetham gia quá trình oxy hóa và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất trong tếbào

Phần lớn những enzyme ngoại bào thuộc enzyme cảm ứng Do đó việc điềukhiển sinh tổng họp enzyme này ta áp dụng quy luật cảm ứng sẽ thu được kết quảnhư mong muốn

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

III.3.3 ưu điểm của vsv so với động yật

So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vsv cónhiều ưu điểm quan trọng sau

• vsv có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn Do đó, cường độ các phản ứngsinh hóa xảy ra rất mạnh, nghĩa là độ sinh tổng họp enzyme và hoạt tính của các enzymerất manh Cưởng độ phản ứng của các enzyme từ vsv vượt xa rất nhiều so với cường độphản ứng của các enzyme từ các nguồn sinh vật khác Ví dụ, trong 24 giờ, vsv có thểchuyển hóa một thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng tế bào của chúng Trong khi

đó hệ enzyme tiêu hóa của con lợn trong một ngày chỉ chuyển hóa được 3 - 4 kg thức ăn

• Hệ enzyme của vsv vô cùng phong phú Cùng một lúc ta có thể khai thác nhiềuloại enzyme khác nhau và cũng có thể thu được một số enzyme chuyên biệt

• Việc cải tạo giống vsv, để tạo ra được những chủng có khả năng sinh tổng họp cácloại enzyme theo ý muốn có thể được thực hiện trong một thời gian ngắn Trong khi việccải tạo giống động vật và thực vật đòi hỏi một thời gian dài

• Khi sinh vật có cường độ sinh sản mạnh, trong một thời gian ngắn ta có thể thunhận được một lượng sinh khối lớn Do đó, với một quy mô nhất định và trong một thờigian ngắn ta có thể thu nhận được một lượng enzyme rất lớn Trong một số trường họp ta

có thể dùng sinh khối như là một nguồn enzyme dùng cho sản xuất mà không cần qua tinhchế

• vsv không đòi hỏi nghiêm ngặt do đó ta có thể dễ dàng tìm kiếm nguyên liệu dùng

để sản xuất chế phẩm enzyme từ vsv Trong rất nhiều trường họp, nguồn nguyên liệudùng để nuôi cấy vsv thu nhận enzyme hòan toàn không phải là nguyên liệu thực phẩmcho người, thậm chí dùng cả phế liệu trong nông nghiệp, công nghiệp để sản xuất enzyme

từ vsv Điều này giúp ta thu nhận được nguồn lợi lớn trong sản xuất

Sản xuất enzyme từ vsv hoàn toàn có thể thực hiện theo qui mô công nghiệp Khienzyme tham gia vào phản ứng phân giải một cơ chất nào đó thì khi có sự hiện diện của

cơ chất trong môi trường nuôi cấy, lượng enzyme này được tổng họp cao rất nhiều lần sovới độ trung bình khi không có cơ chất, được gọi là enzyme cảm ứng Chúng thuộc loạinhóm enzyme thủy phân và enzyme dị hóa Những chất được đưa vào môi trường để

kích thích quá trình tổng họp ra enzyme cảm ứng gọi là cơ chất cảm ứng Muốn điềukhiển quá trình sinh tổng họp enzyme bằng cơ chất cảm ứng phải chú ý đến hai điểm sau:+ Muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thỉ phải cho cơ chất cảm ứng của enzyme

đó vào môi trường Ví dụ như muốn nhận lipase thì cho lipid (chất béo), muốn nhậnprotease thì phải cho protein,

+ Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao khi ở một liều lượng nhất định nào đó

• Công nghệ sản xuất enzyme từ vsv có thể tiến hành tự động hóa và cơ giới hóa [1].

III.3.4 Cơ chế hoạt động của enzyme vsv

Sơ đồl: Quá trình điều khiển sinh tổng hợp enzyme cảm ứng.

Khi không có cơ chất, chất ức chế có trong tế bào sẽ tương tác với gen điều khiển,toàn bộ quá trình tổng họp enzyme sẽ không hoạt động

Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất ức chế, genđiều khiển thoát khỏi sự ức chế của chất ức chế và do đó gen tổng họp enzyme tương ứngvới cơ chất sẽ hoạt động, enzyme được tổng họp sẽ phân hủy cơ chất Đến khi cơ chất bịenzyme phân hủy hết, chất ức chế sẽ không bị bất hoạt và trở lại tương tác, kết quả là gentổng họp enzyme không hoạt động, quá trình tổng họp bị ngưng trệ Như vậy, muốnenzyme được tổng họp ta phải luôn cho vào môi trường lên men cơ chất cảm ứng với liềulượng phù họp Đồng thời pH môi trường, nhiệt độ, hoạt tính của nước và nhu cầu oxygencũng phải được điều chỉnh và bổ xung họp lý

Ở động vật và thực vật, việc thu enzyme phụ thuộc vào các cơ quan có chứaenzyme Ngược lại, ở vsv người ta có thể thu enzyme ở dạng thô lỏng (từ quá trình nuôicấy chìm) Dịch nuôi cấy chủ yếu chứa enzyme ngoại bào và có thể thu chế phẩm enzyme

Gen điều khiểnẠ

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

thô dạng rắn (từ nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn) Chế phẩm này không chỉ chứaenzyme ngoại bào mà còn chứa cả enzyme nội bào Sau khi thu được chế phẩm enzymedạng thô (dạng lỏng hay dạng rắn), người ta tiến hành tinh chế chúng và thu được enzyme

ở dạng tinh khiết hom Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sử dụng enzyme ở dạngthô hay tinh khiết

ị

Thu nhận kết quả -►

enzymeỶ

Sản xuất _> ứng dụngvsv cố định lên men

Nguồn enzyme

từ động vật

> ứng dụng chếphẩm enzymeứng dụngenzyme thô

IV ứng dụng của ỉipase [17]

Lipase được sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến dầu mỡ, chất tẩy rửa và chấtkhử dầu mỡ, chế biến thực phẩm, tổng họp các chất hóa học và dược phẩm, sản xuấtgiấy, và sản xuất mỹ phẩm (Rubin & Dennis, 1997a, b; Kazkauskas & Bomscheuer,1998)

IV 1 Lỉpase trong công nghiệp chất tẩy rửa

Do khả năng của chúng là thủy phân các chất béo, lipase được ứng dụng như là chấtphụ gia trong công nghiệp bột giặt và các bột giặt ở hộ gia đình Các lipase được chọnlọc đặc biệt theo yêu cầu: (1) một cơ chất đặc biệt thấp, có khả năng thủy phân chất béocủa các họp chất khác nhau; (2) có khả năng chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệttương đối quá trình giặt (pH 10- 11, 30 - 60°C); (3) khả năng chống lại các chất hoạtđộng bề mặt có hại và các enzyme, là các chất có thành phần quan trọng của công thứcbột giặt

IV 2 Lỉpase trong công nghiệp thực phẩm

Dầu mỡ là thành phần quan trọng của thực phẩm Giá trị dinh dưỡng, cảm quan vàcác thuộc tính vật lý của triglycerides bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố như: vị trí củaacid béo trong mạch chính của glycerol, chiều dài chuỗi của acid béo, và độ chưa bão.Tính chất của lipid có thể được thay đổi bằng cách thay đổi vị trí của các chuỗi acid béotrong glycerol

IV 3 Lỉpase trong công nghiệp giấy

“Hắc ín” hoặc những thành phần kỵ nước của gỗ (chủ yếu là các triglycerides vàsáp); là nguyên nhân của các vấn đề bột giấy và sản xuất giấy Lipase được dùng để loại

bỏ hắc ín trong bột giấy để sản xuất giấy Công ty Nippan, Nhật Bản đã phát triển một

phương pháp điều khiển hắc ín là việc sử dụng lipase từ nấm Candida rugosa đã thủy

phân đến 90% các triglycerides trong gỗ

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

IV.4 Lỉpase trong tồng họp hữu Ctf

Việc sử dụng các lipase trong tổng họp các chất hữu cơ trở nên ngày một quantrọng Lĩnh vực chính của lipase được dùng để xúc tác trong hóa hữu cơ có nguồn gốc từ

vsv Những enzyme này hoạt động ở bề mặt ưa nước - kỵ nước và các dung môi hữu

cơ không bị phản ứng trong phản ứng hóa học Việc sử dụng lipase trong tổng họp cáchọp chất đã được khảo sát bởi Berglund & Hutt (2000)

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU

I Phương tiện nghiên cứu

1.1 Địa điểm - thòi gian

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, bộ môn Sinh Học, khoa KhoaHọc, trường Đại Học cần Thơ

- Thời gian thực hiện: 15/08/08 - 31/10/08

1.2 Nguyên liệu

1 Lipid (dầu)

Thí nghiệm trên 3 loại dầu

- Dầu olive mua ở các siêu thị, kí hiệu: (2)

- Dầu dừa có nguồn gốc ở Bến Tre

Dầu dừa được lấy ở 2 cơ sở khác nhau:

> Cơ sở ở phường 7- khu phố 2, kí hiệu: (la)

> Cơ sở ở phường 7- khu phố 3, kí hiệu: (lb)

- Dầu đã qua sử dụng được mua ở cần Thơ

Có 3 loại dầu đã qua sử dụng:

> Dầu chiên cá ở nhà ăn sinh viên Đại Học cần Thơ, kí hiệu:(l)

> Dầu chiên chuối ở cổng c Đại Học cần Thơ, và đường 3/2, kí hiệu: (2), (3)

> Dầu chiên vịt ở đường Trần Văn Hoài, kí hiệu: (4)

2 Đất đã nhiễm dầu

Thu mẫu đất đã nhiễm dầu và dầu tương ứng ở các địa điểm trên

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Dụng cụ lấy đất:

Spatula, túi nylon kiếng, mâm

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Cách lấy mẫu đất thí nghiệm

T Địa điểm thu mẫu

Dầu

Ký hiệu mẫu Nhiễm Không

nhiễm

4: dầu chiên vịt đường Trần Văn Hoài

la: dầu dừa ở khu phố 2, Bến Tre

lb: dầu dừa ở khu phố 3, Bến Tre

2: dầu olive

1.3 Dụng cụ và trang thiết bị

■ Tủ cấy vô trùng (Laminar flow, Việt Nam)

■ Nồi khử trùng nhiệt ướt (t = 120°C; p = 1 bar) HVE - 50.

■ Máy ly tâm (Centriíuge model, Trung Quốc).

■ Máy ly tâm lạnh (Hettich zentaifuge D 78532 Tuttlingen, Đức)

■ Tủ sấy (Memmer, Đức).

■ Tủ ủ (Memmer, Đức).

■ Micropipette 20,100,200, 1000, 5000 pl

■ Tim hút

■ Máy đo pH (Thermo election Corporation, Mỹ)

■ Máy nghiền tế bào bằng sóng siêu âm (Branson Soniíier 150, Đức)

■ Máy đo quang phổ (Pharmacia LKB- Ultrospec Plus Spectrophotometer, Mỹ)

■ Cân phân tích (Mettler Toler, Switzerland).

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

I 4 Hóa chất

- (NH4)2S04, K2HP04, MgS04.7H20, nấm men, CaC03, agar (Prolabo, EC),chất chống nấm Cycloheximide, Sigma

- Tween 80, NaOH 0.05 N, KOH 0.05 N, dung dịch I 2 0.1 N trong alcol 95°,

Na 2 s 2 0 3 0.1 N, HC10.1 N, acid oxalic, ethanol, diethyl ete, ete dầu hỏa, H 2 S0 4 đậm đặc,

acid acetic, CaCl2

- Chất chỉ thị màu: Heliantin, phenolphtalein

- Nước cất, giấy lọc, giấy sắc ký bản mỏng (Merck)

II Phương pháp nghiên cứu

II 1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Muc đích:

Đánh giá sơ bộ chất lượng nguyên liệu: dầu chưa sử dụng và chưa tinh chế, dầuchưa sử dụng và đã tinh chế, dầu đã qua sử dụng

1 Xác đinh chỉ số acid

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Định nghĩa

Chỉ số acid là số miligam KOH cần thiết để trung hòa hết lượng acid tự do có trong

1 g chất béo

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Nguyền tắc:

Dùng KOH để trung hòa những acid béo tự do có trong chất béo để phân tích vớiphenolphtalein làm chất chỉ thị

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Thí nghiệm

Dùng một bình tam giác 100 ml cho vào 5 ml alcol tuyệt đối và 5 ml eter (theo tỉ lệ1:1) cho thêm vào bình này 2-3 giọt phenolphthalein và dùng dung dịch KOH 0.05 Ntrong alcol để trung hòa hỗn họp đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sau đó thêm vào hỗnhọp vừa trung hòa 0.3 g dầu tương ứng Trung hòa hỗn họp này bằng dung dịch KOH0.05 N trong alcol cho tới khi có màu hồng bền vững sau 30 phút

Kết quả

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối

1 ml dd KOH 0.05 N tương ứng với 2.805 mg KOH

Ca Chỉ số acid (mg KOH/g)

a: Thể tích (ml) dd KOH đã sử dụng

b: Khối lượng dầu tương ứng

2 Xác đinh chỉ số iod:

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Nguyên tắc:

Trong những điều kiện thí nghiệm xác định những nối đôi - CH = CH- xảy ra phảnứng cộng với halogen chứ không phải phản ứng thế

Chỉ số iod được xác định dựa trên khả năng iod kết họp được với acid béo ở nhữngnối đôi Cho chất béo cần phân tích tác dụng với một lượng iod thừa trong tối để phảnứng cộng xảy ra hoàn toàn Phần iod thừa được định phân bằng dd Na2s203 0.1 N chuẩnvới hồ tinh bột làm chỉ thị Như vậy, chỉ số iod xác định tổng quát các acid béo không no

có trong chất béo

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Thí nghiệm

Bình tam giác 1: 0.2 g dầu tương ứng + 10 ml alcol tuyệt đối + 10 ml dd iod 0.1 Ntrong alcol

Bình tam giác 2: 0.2 ml nước + 10 ml alcol tuyệt đối + 10 ml dd iod 0.1 N trongalcol

Lắc đều và để yên trong tối 30 phút, sau đó chuẩn độ bằng Na 2 s 2 0 3 0.01 N đến khi

có màu hồng vàng sậm, thêm 1-2 giọt tinh bột 1% Nếu có màu xanh xuất hiện thì tiếptục chuẩn độ cho tới khi xuất hiện màu vàng rơm rất nhạt

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Kết quả:

0.01269: lượng Iot (g) tương đương với lml dung dịch Na2s203 0.1 N

0.01269 Xl00(fl-ft)

LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Nguyên tắc:

Cho chất cần thử kết họp với một lượng KOH thừa để xà phòng hóa tất cả các chấtbéo Phần KOH thừa được định lượng bằng một dung dịch acid chuẩn, vớiphenolphthalein làm chất chỉ thị

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Tiến hành

Bình tam giác 1: 0.3 g dầu tưong ứng + 8 ml dd KOH 0.1 N trong alcol

Bình tam giác 2: 0.3 g nước + 8 ml dd KOH 0.1 N trong alcol

Tiến hành đun cách thủy 2 bình trong 30 phút Khi dung dịch trong suốt, để nguội,

thêm vào mỗi bình 2 ml nước và 2 giọt phenolphthalein, dung dịch sẽ có màu hồng, sau

đó chuẩn độ dung dịch với HC1 0.1 N đến khi dung dịch mất màu, ta xác địng được thểtích HC1 đã sử dụng

♦> Kết quả được tính theo công thức:

1 ml KOH 0.1N tương ứng 5.6 mg KOH

m: khối lượng chất béo (g)

II.2 Nuôi cấy vsv

1 Môi trường nuôi cấy lỏng

❖ Kết tủa bằng dung dịch muối Nguyên liệu