Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen

Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các tác nhân gây hại khác đã và đang được thự

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

HÀ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO

VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.)

CHUYỂN GEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

HÀ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO

VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS LÊ THỊ THU HIỀN

2 PGS.TS NÔNG VĂN HẢI

HÀ NỘI - 2015

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Thị Thu Hiền và PGS TS Nông Văn Hải

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả khác Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận án

Hà Hồng Hạnh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu

hệ gen, đặc biệt là tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen đã luôn quan tâm và giúp đỡ, góp ý cho tôi thực hiện và hoàn thành bản luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Chu Hoàng Hà và các cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện một số thí nghiệm tại Phòng Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, Th.S Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi, chăm sóc, động viên giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi thực hiện luận án

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểm

phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến năm 2020 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý Tôi xin trân trọng cảm ơn sự trợ giúp quý báu của các chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Tác giả luận án

MỤC LỤC III DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT IX

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO 4

1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao 5

1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao 8

1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao 9

1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam 11

1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO 12

1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền thống 12

1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học 15

1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE 26

1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên 26

1.3.2 Chitinase ở một số đối tượng sinh vật 27

1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

2.1 VẬT LIỆU 32

2.1.1 Mẫu thực vật 32

2.1.2 Các vector và chủng vi khuẩn 32

2.13 Hóa chất, thiết bị 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP 34

2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao 34

vector chuyển gen thực vật 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 48

3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU 48

3.1.1 Thu thập mẫu 48

3.1.2 Xác định khả năng tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao 49

3.1.3 Xác định khả năng nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao……… 51

3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp 53

3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp 55

3.1.6 Tạo cây ca cao in vitro hoàn chỉnh 57

3.1.7 Khả năng thích ứng cây ca cao in vitro ra vườn ươm 60

3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao 62

3.2 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT 63

3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W 63

3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ vector pCB301 70

3.2.3 Tạo các chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu hiện thực vật đã thiết kế 73

3.2.4 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen chuyển trên cây thuốc lá 75

3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO 77

3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp và thời gian lây nhiễm vi khuẩn cho chuyển gen vào ca cao 78

3.3.2 Chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 80

3.3.3 Phân tích và đánh giá mô, cây chuyển gen 81

3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO 84

3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 84

3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử 87

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 91

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO 105

SUMMARY

PHỤ LỤC

Hình 1.1 Bệnh nấm ở cây ca cao……… 10

Hình 2.1 Một số vector sử dụng trong nghiên cứu……… 32

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm……… 34

Hình 2.3 Hoa ca cao……… 35

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và TDZ đến tỷ lệ tạo phôi từ nhị lép ở một số dòng ca cao nghiên cứu……… 50

Hình 3.2 Ảnh hưởng của kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép……… 51

Hình 3.3 Mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa trên môi trường PCG và SCG……… 52

Hình 3.4 Tỷ lệ tạo phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao……… 54

Hình 3.5 Tái sinh phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao……… 54

Hình 3.6 Tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm……… 56

Hình 3.7 Tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm của phôi soma sơ cấp dòng ca cao TD8……… 57

Hình 3.8 Tỷ lệ phôi soma sơ cấp tạo chồi và ra rễ……… 59

Hình 3.9 Tạo chồi và ra rễ từ phôi soma sơ cấp và thứ cấp……… 59

Hình 3.10 Tỷ lệ cây con sống trên các loại giá thể khác nhau sau 20 ngày…… 60

Hình 3.11 Các cây ca cao in vitro trên môi trường ra cây……… 61

Hình 3.12 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao……… 62

Hình 3.13 Tách chiết DNA tổng số từ lá ca cao dòng TD3……… 63

Hình 3.14 Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W và xử lý pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 bằng BglII trên gel agarose 0,8%……… 65

Hình 3.15 Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao TD3……… 67

Hình 3.16 So sánh trình tự protein TcChi1 ở ca cao dòng TD3 với một số trình tự chitinase lớp I của một số loài thực vật khác……… 69

Hình 3.17 Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 và sản phẩm xử lý BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8% 70

Hình 3.19 Kết quả thiết kế pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%………… 72

Hình 3.20 Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1……… 72

Hình 3.21 Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose 0,8%……… 73

Hình 3.22 Sản phẩm PCR gen TcChi1 từ pCB301+TcChi1……… 74

Hình 3.23 Điện di sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 từ thuốc lá……… 75

Hình 3.24 Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá chuyển gen TcChi1……… 76

Hình 3.25 Cây thuốc lá chuyển gen……… 77

Hình 3.26 Các mảnh mô ca cao dòng TD8……… 78

Hình 3.27 Biến nạp gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8……… 81

Hình 3.28 Biểu hiện gen gus/gusplus trên các mô ca cao chuyển gen………… 82

Hình 3.29 Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các dòng ca cao chuyển gen……… 84

Hình 3.30 Tái sinh cây từ phôi soma của dòng ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 86 Hình 3.31 Các cây ca cao chuyển gen……… 86

Hình 3.32 Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao chuyển gen……… 87

Hình 3.33 Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+ KDEL+tNOS……… 87

Hình 3.34 Vùng T-DNA của vector pCB301+TcChi1……… 89

Hình 3.35 Lai Southern các mẫu ca cao chuyển gen……… 89

Hình 3.36 Quy trình chuyển gen vào cây ca cao……… 90

Bảng 3.1 Nhân mô sẹo sơ cấp trên môi trường SCG……… 52 Bảng 3.2 Nhân mô sẹo thứ cấp trên môi trường SCG……… 56 Bảng 3.3 Tỷ lệ phôi soma thứ cấp tạo chồi và ra rễ……… 58

Bảng 3.4 Lựa chọn chủng vi khuẩn A tumefaciens và vector biểu hiện thích

hợp cho chuyển gen ca cao……… 79

Bảng 3.5 Lựa chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens thích hợp cho

chuyển gen ca cao……… 80 Bảng 3.6 Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu

ca cao biến nạp gen chỉ thị………

82

Bảng 3.7 Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu

ca cao TD8 biến nạp gen mã hóa chitinase……… 85

2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone) BAP 6-benzylaminopurin

Bar Bialaphos resistance gene - Gen chịu thuốc trừ cỏ

Bp Base pair - Cặp base

CaMV Cauliflower mosaic virus - Virus khảm súp lơ

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

DKW Driver and Kuniyuki medium - Môi trường DKW

EDTA Ethylene diaminne tetra acetic acid

EGFP Enhanced green fluorescent protein - Protein tăng cường phát

OD Optical density - Mật độ quang

PCG Primary callus growth medium - Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng dây chuyền polymerase PVPP Poly vinyl poly pyrolidone

RNA Ribonucleotic acid

SD Standard deviation - Độ lệch chuẩn

RD Root development and maintenance medium - Môi trường hình

thành và phát triển rễ TDZ Thidiazuron

YEP Yeast extract peptone - Môi trường YEP chứa cao nấm men và

thịt bò X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Ca cao (Theobroma cacao L.) là một trong những cây kinh tế quan trọng,

đem lại lợi nhuận đáng kể cho một số quốc gia trên thế giới Bột ca cao được

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm tại nhiều nước Có nguồn gốc từ vùng Amazon (Nam Mỹ), cây ca cao phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, trong đó có Việt Nam Hiện nay, cây ca cao đang được quan tâm để phát triển rộng rãi ở nước ta

vì cây có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như triền dốc, đất cát, phù sa, đất nghèo dinh dưỡng Ngoài ra, ca cao còn là cây chịu bóng mát tốt, nên có thể trồng xen canh với cây ăn trái, cây lâm nghiệp, phủ xanh đất tốt, thích hợp với kinh tế hộ gia đình và đặc biệt, thị trường tiêu thụ sản phẩm ca cao là rất lớn

Tuy nhiên, tương tự các loài cây trồng khác, phát triển sản xuất ca cao gặp nhiều khó khăn do giống bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng khác, kỹ thuật canh tác chưa hiệu quả, sâu và bệnh hại Riêng bệnh nấm đã gây sụt giảm khoảng 30% sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới Theo truyền thống, có rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để phòng trừ bệnh hại với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng, cũng như môi trường Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các tác nhân gây hại khác đã và đang được thực hiện với sự tham gia của nhiều tổ chức nghiên cứu và thương mại trên thế giới Bên cạnh công tác chọn tạo giống theo phương pháp truyền thống, phương pháp chọn tạo giống ứng dụng công nghệ sinh học như tạo cây chuyển gen là một trong hướng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo các giống ca cao có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường Tại Việt Nam, nhiều dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao

Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ Chính phủ và nhiều tổ chức quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao Hiện nay chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao ở Việt Nam Bên cạnh những thuận lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không nhỏ

Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện

đề tài “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.)

chuyển gen”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài đặt mục tiêu chung là xây dựng được quy trình tái sinh in vitro và tạo cây

ca cao chuyển gen Mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác

ở Việt Nam;

- Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị

gus/gusplus và gen kháng nấm

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro của 9 dòng ca cao đang được

canh tác ở Việt Nam;

- Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chitinase (TcChi1) từ cây ca cao ở Việt

Nam và thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa chitinase;

- Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam;

- Nghiên cứu chuyển gen TcChi1 vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam và phân tích

các dòng ca cao được chuyển gen

4 Đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên ở Việt Nam, các dòng ca cao thương mại TD1, TD3, TD5, TD7,

TD8, TD9 đã được tái sinh in vitro thành công;

- Gen mã hóa chitinase có hoạt tính kháng nấm đã được phân lập từ dòng ca cao hiện đang được canh tác tại Việt Nam và được chuyển vào vector biểu hiện thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen;

- Gen chỉ thị gusplus và gen mã hóa chitinase đã được chuyển thành công vào dòng ca cao TD8 thông qua vi khuẩn A tumefaciens

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật và công nghệ gen trong việc nhân giống và chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây ca cao nói riêng, cải tiến giống và tăng khả năng chống chịu với các tác nhân gây bệnh

- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro

thông qua phôi soma của một số dòng ca cao hiện đang được canh tác ở Việt Nam Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh các dòng ca cao mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công tác chuyển gen

- Quy trình chuyển gen chỉ thị và gen đích vào cây ca cao thông qua A tumefaciens là cơ sở khoa học để cải tiến giống ca cao thông qua công nghệ

chuyển gen; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng

- Kết quả phân lập gen mã hóa chitinase kháng nấm, thiết kế vector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá và cây ca cao là cơ sở khoa học cho việc

tạo ra các dòng ca cao có khả năng kháng nấm

6 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 141 trang (bao gồm cả tài liệu tham khảo và phụ lục), được chia thành các phần: Mở đầu gồm 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 28 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 16 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 43 trang; Chương 4: Thảo luận, 11 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang Các công trình

đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Summary: 4 trang; Tài liệu tham khảo:

16 trang với 123 tài liệu tham khảo, trong đó 18 tài liệu tiếng Việt và 105 tài liệu tiếng Anh Phần kết quả luận án có 7 bảng số liệu, 36 hình Phụ lục: 8 trang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO

1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao

Cây ca cao có nguồn gốc ở lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ Từ đây, ca cao phát triển rộng sang nhiều quốc gia khác trên thế giới, tập trung ở khu vực Nam Mỹ và Tây Phi Ca cao đặc biệt thích hợp ở những quốc gia có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Theo xếp loại của Hiệp hội Ca cao Thế giới thì hai quốc gia dẫn đầu về sản lượng ca cao hiện nay là Bờ Biển Ngà (Côte d’Ivoire) và Ghana (thuộc Tây Phi) Ở khu vực châu Á, từ năm 1985 trở lại đây, ca cao được phát triển khá mạnh, tiến tới trở thành vùng trồng ca cao lớn không kém Nam Mỹ và châu Phi Các quốc gia sản xuất ca cao hàng đầu ở khu vực này là Indonesia và Malaysia Việt Nam cũng nằm trong cùng vĩ độ “ca cao” với Ghana, Bờ Biển Ngà, Indonesia, Malaysia với khí hậu nhiệt đới mưa nhiều, đất đai màu mỡ, rất thích hợp với cây ca cao Nhìn chung việc trồng, chế biến, tiêu thụ các sản phẩm của cây ca cao trên toàn cầu đang có xu hướng tăng rất cao và nhanh nhờ

sự phát triển kinh tế năng động với mức sống của hàng tỷ người được nâng cao

và các sản phẩm ca cao được tiêu thụ phổ biến hơn Trong khi, sản lượng ca cao sản xuất hàng năm rất bấp bênh, không đủ đáp ứng nhu cầu…Vì vậy, việc phát triển ca cao bền vững, chuyển dịch cơ cấu cây trồng, nâng cao chất lượng giống, hạt ca cao là những vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca cao

Ca cao thuộc chi Theobroma, họ Stercu-liaceae Chi Theobroma bao gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao được trồng rộng rãi, còn

các loài khác hoặc hoang dại, hoặc rất ít được trồng Các tác giả chia

Theobroma cacao ra hai loài phụ là: Theobroma cacao spp ca cao, gồm các quần thể dạng Criollo và Theobroma cacao sphaerocarpum, gồm các quần thể

còn lại, trong đó có Forastero Các loài phụ này đều là các dòng nhị bội, với số nhiễm sắc thể 2n = 20 Criollo có hạt dạng tròn, nội nhũ trắng, có hương vị nhẹ

và tương đối dễ nhiễm bệnh Forastero có dạng cây cao, khỏe, hạt nhỏ hơn Criollo nhưng hương vị đậm hơn Hạt Forastero dạng dẹp, lá mầm bên trong

màu tím, chứa nhiều chất béo hơn Criollo Do vậy, hầu hết các vùng trồng ca cao lớn trên thế giới hiện nay đều trồng dạng Forastero Giống thứ ba được công nhận là Trinitario, một dòng lai giữa Criollo và Forastero, là giống có khảng năng kháng bệnh và mang một số hương vị đặc trưng Tập đoàn gen ca cao phong phú nhất được lưu giữ ở Trinidad với khoảng 2.500 kiểu gen, ở Brazil với khoảng 2.000 kiểu gen và ở Costa Rica với 700 kiểu gen Nghiên cứu gần đây về phân bố ca cao trên toàn thế giới cho thấy một số thay đổi về các nhóm ca cao có thể phân biệt về mặt di truyền và địa lý Theo các nghiên cứu, ca cao phân bố ở Trung và Nam Mỹ đã được chia thành 10 cụm di truyền: Amelonado, Contamana, Curaray, Guiana, Iquitos, Maranon, Nacional, Nanay

và Purus, xuất hiện ở lưu vực sông Amazon và Bahia Nhóm số 10 được mô tả

là nhóm Criollo xuất hiện ở khu vực lưu vực sông Amazon (Motamayor et al., 2008; Utro et al., 2012)

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao

Ca cao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự nhiên Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông qua tỉa cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường kính thân 10 - 18 cm Ca cao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng xen với một số loại cây kinh tế khác Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25 - 40 năm (Phạm Hồng Đức Phước, 2009)

Thân: Đối với thân phát triển từ hạt, sự phát triển của thân có thể chia

thành ba giai đoạn Giai đoạn 1: Hạt nẩy mầm thượng địa (lá mầm nhô lên khỏi mặt đất) Đoạn thân dưới lá mầm không có mầm bất định là nơi để ghép khi nhân giống vô tính mà không sợ bị lẫn giống Giai đoạn 2: lá mầm mở, 4 lá đầu tiên phát triển, đốt rất ngắn Mỗi đợt sinh trưởng kéo dài khoảng 6 tuần, đốt dài

ra trong thời gian này Tùy theo điều kiện môi trường, trong giai đoạn này thân

có thể cao lên từ 0,5 - 2 m Giai đoạn 3: Cây tạm ngừng tăng trưởng về chiều cao Cành ngang trên đỉnh ngọn phát triển tạo tầng cành đầu tiên Đối với thân phát triển từ cành ghép (mầm ghép lấy từ cành ngang): Cành không tăng trưởng thẳng đứng mà thường mọc nghiêng Các chồi nách phát triển sớm, nhiều nên

cây có dạng bụi gồm nhiều cành chính và không có tầng cành Nếu mầm ghép lấy từ thân chính hoặc cành vượt, sự sinh trưởng giống như thân mọc từ hạt

Lá: Lá non phát triển theo từng đợt, sau mỗi đợt ra lá, đỉnh cành vào

trạng thái ngủ Thời gian ngủ tùy theo điều kiện môi trường nhưng thường khoảng 4 - 6 tuần lễ Sự phát triển lá liên quan đến tình trạng nước của cây Ca cao trồng không che bóng, các đợt ra lá nhanh hơn là trồng trong điều kiện có bóng che Điều này là do khi không có bóng che, sự biến động hàm lượng nước trong cây xảy ra thường xuyên và nhiệt độ môi trường bên ngoài cao kích thích chồi lá phát triển

Cây cần dinh dưỡng khi đợt lá mới phát triển Nếu cây thiếu dinh dưỡng

sẽ có sự vận chuyển dinh dưỡng từ lá già sang lá non mới ra và dẫn đến việc lá già bị rụng sớm Do đó, số lá già hiện diện trên thân giúp người trồng có thể hiểu được phần nào hiện trạng dinh dưỡng của cây ca cao Màu sắc lá non thay đổi tùy theo giống từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm Khi trưởng thành, lá có màu xanh thẫm, cứng cáp hơn và nằm ngang Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn ngoài nắng

Rễ: Hạt sau khi nẩy mầm, rễ mọc rất nhanh và có nhiều rễ ngang mọc

thẳng góc quanh rễ trụ Ba tháng đầu rễ phát triển rất nhanh có thể cao hơn 25

cm Để tránh rễ cong khi ươm cây, cần chọn túi đủ dài để rễ phát triển trong 3 -

4 tháng đầu Rễ trụ tiếp tục phát triển khi bị cắt ngang nên khi trồng ta cắt bỏ phần rễ cong trong bầu đất mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của

rễ Khi cây được 3 năm tuổi, rễ trụ dài khoảng 1,5 - 2 m Trên suốt chiều dài của rễ trụ, có rất nhiều rễ ngang mọc ra và phân nhánh với rất nhiều rễ con, tập trung chủ yếu ở vùng rễ phía dưới cổ rễ khoảng 20 cm

Hoa: Hoa xuất hiện trên sẹo lá ở thân, cành Đợt hoa đầu tiên trên cây từ

hạt có thể nở vào khoảng 14 - 20 tháng sau khi trồng Cây ghép hay giâm cành

có thể ra hoa sớm hơn từ 9 - 18 tháng sau khi trồng Hoa ra tập trung vào mùa mưa Những nơi có đủ nước, cây ra hoa quanh năm và vẫn có cao điểm ra hoa

rộ Do hàng năm, hoa xuất hiện cùng một chỗ nên lâu ngày phình to gọi là đệm hoa Thường mỗi đệm mang rất nhiều hoa, nếu đệm hoa bị tổn thương thì

lượng hoa giảm hoặc không ra nữa Hoa có cuống dài từ 1 - 3 cm, có 5 cánh đều đặn Hoa bắt đầu nở từ khoảng 3 giờ chiều hôm trước cho đến 9 giờ sáng hôm sau

Thụ phấn: Hoa ca cao thụ phấn nhờ côn trùng thuộc họ Ceratopogonidae

Loài Forcipomyia là loài phổ biến nhất tham gia thụ phấn Côn trùng này rất

nhỏ thường cư trú trong điều kiện tối, ẩm nơi có các tàn dư thực vật đậu quanh cây ca cao, do đó nếu vườn quá sạch hoặc quá khô sẽ không thuận lợi cho sự thụ phấn Hoa ca cao ra nhiều nhưng chỉ thụ phấn và đậu 1 - 5% Phần lớn hoa

nở mà không được thụ phấn sẽ rụng sau 48 giờ

Quả: Sự phát triển của quả: Sau khi thụ phấn, quả tăng trưởng chậm

trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày Sau 85 ngày, sự tăng trưởng của quả chậm lại, trong khi hạt bên trong quả bắt đầu tăng trưởng nhanh, đây cũng là thời kỳ hạt tích lũy chất béo Lớp cơm nhầy hình thành khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn Khi hạt tăng trưởng tối đa, quả vào giai đoạn chín Quả chín không nở bung ra và ít khi rụng khỏi cây Quả có cuống hóa gỗ nên rất dai Quả non có 5 ngăn trong đó hạt được phân chia đều, khi quả chín vách ngăn này biến mất chỉ còn lại một hốc chứa đầy hạt Từ khi thụ phấn đến khi quả chín kéo dài từ 5 - 6 tháng, tùy theo giống Màu sắc của quả khá đa dạng Quả chưa chín có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm đỏ tím Khi quả chín, màu xanh chuyển sang màu vàng; màu đỏ tím chuyển sang màu da cam Hình dạng quả thay đổi nhiều từ hình cầu đến dài nhọn hay hình trứng Số lượng rãnh và độ sâu của khía trên quả cũng thay đổi từ 5 - 10 rãnh, rãnh có thể sâu nhiều, nông hoặc trơn nhẵn Vỏ quả có thể dày từ 1 - 3 cm Trọng lượng quả dao động từ 0,2 - 1 kg

Hạt: Mỗi quả chứa từ 30 - 40 hạt Mỗi hạt có lớp cơm nhầy bao quanh

có vị chua, ngọt, thơm và xếp thành 5 dãy Hạt có vỏ mỏng màu hồng, nhiều đường gân Hạt rất dễ mất sức nẩy mầm sau khi tách khỏi quả nên thường phải gieo ngay Hạt sau khi tách lớp cơm nhầy và hong ráo, nếu giữ trong mùn cưa hoặc than có thể giữ được sức nẩy mầm trong 3 - 4 tuần (Phạm Hồng Đức Phước, 2009)

1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao

Cây ca cao là cây kinh tế quan trọng đem lại lợi nhuận rất cao nhờ xuất khẩu cho một số quốc gia trên thế giới Hạt ca cao là nguồn cung cấp thực phẩm giàu dinh dưỡng cho con người Ca cao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng cho ngành công nghiệp thực phẩm cụ thể là các sản phẩm cao cấp như chocolate, ca cao Sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới (ca cao là sản phẩm khô thu được bằng cách lên men hạt ca cao) 2/3 được chế biến thành bột

ca cao và bơ ca cao, 1/3 được sử dụng để chế biến các thành phần tạo hương vị

và màu của chocolate Khoảng 5 - 6 triệu hộ nông dân sản xuất nhỏ chiếm 95% sản lượng ca cao toàn thế giới Theo thống kê mới nhất được công bố bởi ICCO 11/6/2015, trong năm 2013/2014, thế giới sản xuất được tổng cộng 4.232.000 tấn hạt ca cao, châu Phi chiếm ưu thế (71,6%) Trong số các nước sản xuất ca cao, Bờ Biển Ngà và Ghana xếp hạng đầu tiên và thứ hai với khoảng 1.000.000 tấn mỗi năm Ở châu Á và châu Đại Dương, Indonesia là quốc gia sản xuất ca cao nhiều nhất Ca cao còn được chứng minh về tác dụng phòng các bệnh tim mạch Các flavanol và procyanidin có trong hạt ca cao đã thể hiện khả năng

chống oxi hóa mạnh trong các thử nghiệm in vitro (Keen et al., 2005) Các ứng

dụng của hạt ca cao đã một lần nữa khẳng định giá trị quan trọng của loài cây công nghiệp này

Ngoài ra, trồng ca cao còn mang lại những lợi ích về môi trường Do ca cao là loại cây ưa bóng với thời gian thu hoạch trên 20 năm, có thể trồng dưới tán những cây lâu năm khác, chúng mang lại các lợi ích như tăng cường đa dạng sinh học trong những vùng đất có chim di cư, bảo vệ hành lang đầu nguồn, đất, nguồn nước và các vùng đệm của những khu rừng nhiệt đới (Rice, Greenberg, 2003) Các tổ chức quốc tế như Tổ chức Bảo tồn Quốc tế (Conservation International), Liên đoàn Động vật hoang dã Thế giới (The World Wildlife Federation) và Hiệp hội Ca cao Thế giới đã nhận thức được vai trò của ca cao trong việc ổn định nền kinh tế địa phương và môi trường và đã

khuyến khích nông dân trồng ca cao trong những khu vực này (Guyton et al.,

2003)

1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao

Bệnh thường gặp ở ca cao do nấm hoặc côn trùng gây ra Một số bệnh hại chính do nấm bao gồm:

- Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (do nấm Phytophthora palmivora):

Bệnh xuất hiện từ khi giai đoạn vườn ươm đến khi thu hoạch và trên tất cả bộ phận của cây (lá, thân, hoa, trái) Trên thân cách mặt đất khoảng 1 m, xuất hiện các vết bệnh sậm màu hơi ướt, sau chuyển sang nâu đỏ, vỏ bị bệnh nứt ra và chảy nhựa vàng Lâu ngày, vết bệnh lan khắp vòng thân và ăn sâu vào phần gỗ,

lá héo và rụng Ở những cây nhiều tuổi, bệnh có thể hại cả trên cành Cây bị bệnh lá héo, rụng, cành bị khô, cây có thể chết Trên lá, vết bệnh màu xanh tái hơi ướt xuất hiện đầu tiên trên mép và chóp lá, sau lan rộng vào phía trong phiến lá, chuyển màu nâu, lá bị cháy khô từng mảng Trong điều kiện ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp tơ nấm màu trắng Trên vỏ trái xuất hiện những chấm màu nâu lan rất nhanh, sau chuyển qua đen và từ từ bao kín mặt trái Trái non đen khô cứng và vẫn dính trên cây Trái gần thu hoạch bị thối một phần hoặc cả trái, trái bị rụng, hạt lép, giảm sản lượng;

- Bệnh khô vỏ thân (do nấm Colletotrichum gloeosporioides): Bệnh

thường xảy ra cả mùa khô lẫn mùa mưa, đặc biệt là đối với những cây ca cao thiếu bóng che hoặc tỉa quá nặng Trên thân, cành nấm xâm nhập vào lớp tế bào dưới biểu bì tạo thành những vết sậm màu, sau đó vùng nhiễm bệnh xuất hiện bào tử màu vàng cam, vỏ thân bị khô từng mảng, nếu bị nặng cây sinh trưởng kém, lá vàng và rụng, một số cành bị khô Trên lá, vết bệnh là những đốm màu nâu, tròn, nhiều đốm liên kết nhau làm cháy lá;

- Bệnh vết sọc đen (do nấm Oncobasidium theobromae): Một hoặc nhiều

lá nằm sau đợt lá cuối cùng có màu vàng với những đốm xanh Thân sần sùi với những mụt nhỏ, cành khô và chết ngược dần từ ngọn vào Nhiều chồi bên phát triển nhưng không hoàn chỉnh Đối với cây con: cây sinh trưởng chậm, lá vàng, lá chân rụng sớm, khoảng cách giữa các lá ngắn; (4) Bệnh nấm hồng (do

nấm Corticium salmonicolor): nấm phá hại ở những cành đã hóa nâu Các vết

bệnh lúc đầu có lớp mốc trắng, sau chuyển màu hồng Nấm mọc sâu vào phần

gỗ cành, lá phần trên của cành nhiễm bệnh bị úa vàng và khô, nhưng vẫn lưu trên cành một thời gian Vỏ cành khô nâu và bong ra từng mảng, bị nặng cành chết khô (Hình 1.1).

Hình 1.1 Bệnh do nấm ở cây ca cao

A Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (P palmivora); B Bệnh vết sọc đen (O

theobromae); C Bệnh khô vỏ thân (C gloeosporioides); D Bệnh nấm hồng (C salmonicolor) Nguồn: http://phdphuoc.com/

Để phòng trị các bệnh trên cây ca cao, bên cạnh các biện pháp canh tác

và xử lý như tỉa cành hợp lý tạo thông thoáng, tiêu hủy cành, lá và trái bị bệnh, nhổ bỏ cây con… thì đều cần phun, tiêm các loại thuốc hóa học - tác nhân gây

ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của người dân (Bowers et al., 2001; Appiah et al., 2004; Aime, Phillips-Mora, 2005) Một số đồn điền ca

cao đã và đang đầu tư nghiên cứu giống kháng bệnh nhằm kiểm soát bệnh hại

1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam

Theo Cục Trồng trọt, tính đến tháng 11.2014, diện tích trồng ca cao cả nước là 16.800 ha, trong đó các tỉnh có diện tích trên 1.000 ha là: Bến Tre (7.342 ha); Bà Rịa-Vũng Tàu (2.787 ha); Tiền Giang (2.578 ha); Đắk Lắk (2.554 ha); Bình Phước (1.310 ha); Vĩnh Long (1.244 ha)… Diện tích ca cao thu hoạch khoảng 11.055 ha, chiếm 50% tổng diện tích, sản lượng hạt ca cao khô lên men năm 2014 là 6.765 tấn, tăng nhẹ so với năm 2013 (65 tấn), trong

đó phần lớn ca cao được xuất khẩu Tại thị trường Việt Nam, hạt ca cao lên men đang được thu mua với giá khá hấp dẫn và ổn định từ đầu năm tới nay, dao động ở mức 55.000 đến 60.000 đồng/kg (chưa tính giá thưởng), tăng đáng kể

so với mức 45.000 đồng/kg vào cuối năm 2013 Cây ca cao Việt Nam đang đứng trước những cơ hội mới do nhu cầu ca cao của thế giới ngày càng tăng,

dự báo năm 2020 sẽ thiếu hụt khoảng 1 triệu tấn (http://www.khuyennong.vn/) Giống hiện có ở Việt Nam là Forastero và con lai giữa Forastero và Trinitario Giống ca cao trước đây trồng rải rác ở các địa phương là con cháu của sự phối hợp giữa ba nhóm Forastero, Criollo và Trinitario Ca cao là cây dài ngày nên việc chọn giống rất quan trọng Việc chọn giống không đúng sẽ dẫn đến thiệt hại lâu dài hoặc phải mất thời gian từ 3 - 5 năm và nhiều công của cho thời kỳ kiến thiết cơ bản nếu quyết định thay giống khác tốt hơn Hiện nay,

hệ thống giống được sử dụng rộng rãi là hạt lai F1 và các dòng vô tính đã chọn lọc có năng suất cao và kháng sâu bệnh Có hai nguồn giống chính để trồng ca cao là hạt lai và dòng vô tính Các dòng vô tính sau có tiềm năng năng suất từ 2

- 5 tấn/ha trong điều kiện đồng ruộng: TD1, TD2, TD3, TD4, TD5, TD6, TD7, TD8, TD9, TD10, TD11, TD13, TD14, TD20, TD33, TD36, TD38, TD39, TD54, TD55, TD62, TD63, TD64 (Phạm Hồng Đức Phước, 2009) Tuy nhiên,

ca cao cũng bị nhiều loại sâu bệnh tấn công, các loại sâu bệnh hại chính như: rầy hoa, bọ xít, sâu hồng, rầy mềm…

Nhận thức rõ vai trò quan trọng của cây ca cao đối với sự phát triển kinh

tế - xã hội của đất nước, Ban Điều phối Phát triển Ca cao Việt Nam đã được thành lập theo Quyết định số 803/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ký ngày 11 tháng 4 năm 2005 Sau đó, ngày 14 tháng 9 năm 2007,

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã phê duyệt Đề án phát triển ca cao đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 (Kèm theo Quyết định số 2678/QĐ/BNN-KH), trong đó đặt mục tiêu là “Đến năm 2015, dự kiến diện tích cây ca cao đạt 60.000 ha, trong đó có 35.000 ha kinh doanh, năng suất bình quân 15 tạ/ ha, sản lượng hạt khô đạt 52.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 50 -

60 triệu USD ” Đề án tập trung ưu tiên các nội dung: (1) Quy hoạch vùng sản xuất; (2) Xây dựng các quy trình, quy phạm kỹ thuật để phát triển cây ca cao bền vững; (3) Nghiên cứu chọn tạo và nhân giống cây ca cao; (4) Khuyến nông, chuyển giao khoa học công nghệ về sản xuất và sơ chế ca cao; (5) Đầu tư phát triển cơ sở hạ tầng các vùng trồng ca cao trọng điểm (http://www.khuyennong.vn/) Các chính sách, chương trình ưu tiên phát triển chiến lược của Chính phủ cũng như sự hợp tác nhiều mặt của các tổ chức quốc tế, cùng với những thế mạnh rõ rệt về khí hậu, thổ nhưỡng, nguồn nhân lực, là cơ sở đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao quốc tế, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao Hiện Dự án Hợp tác công - tư tăng cường phát triển ca cao bền vững tại Việt Nam (PPP) đã và đang điều phối các nguồn hỗ trợ từ các công ty và tổ chức như công ty Cargill, Grand Place Puratos, Mars, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Chính phủ Hà Lan, Tổ chức IDH The Sustainable Trade Initiative… Công tác hỗ trợ nhằm phát triển ca cao bền vững gồm khâu đầu tư giống, cam kết bao tiêu thu mua sản phẩm, tập huấn chuyển giao kỹ thuật, xây dựng vườn trình diễn kỹ thuật, cung cấp phân bón…

1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO 1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp

truyền thống

Nghiên cứu chọn tạo giống ca cao gặp nhiều khó khăn và hạn chế, do ca cao có chu kỳ sống khá dài (tối thiểu là 2 - 3 năm, từ hạt ra hạt) và phải mất rất nhiều năm thử nghiệm đồng ruộng để đánh giá đầy đủ hiệu suất và các đặc tính kháng bệnh Rất nhiều kiểu gen của ca cao tự bất tương hợp dẫn tới các nghiên cứu chọn tạo giống và phân tích di truyền tốn nhiều công sức hơn Ngoài ra, ca cao cần diện tích canh tác lớn và cần nhiều nhân lực để duy trì và đánh giá các thử nghiệm đồng ruộng Hơn nữa, hạt ca cao cứng và nguồn gen phải được bảo

tồn dưới dạng sống trên đồng ruộng hay nhà kính Hiện nay, hệ thống giống được sử dụng rộng rãi là hạt lai F1 và các dòng vô tính đã chọn lọc có năng suất cao và kháng sâu bệnh Có hai nguồn giống chính để trồng ca cao:

Hạt lai: Là hạt từ những cặp lai đã xác định cha mẹ và đã kiểm nghiệm

năng suất thế hệ F1 Loại hạt giống này chỉ có ở những cơ sở nghiên cứu Nhiều cặp lai (5 - 10 cặp) có thể được phối trộn để tăng khả năng thụ phấn và làm phong phú cơ sở di truyền Từ các quần thể này, những cá thể tốt, đã thích ứng được sinh thái địa phương được tuyển chọn, kiểm nghiệm lại và nhân vô tính để phát triển thành dòng thương mại Sử dụng hạt lai thì khả năng thích ứng của chúng với môi trường địa phương sẽ cao hơn nhờ sự đa dạng về cơ sở

di truyền

Hạt của những quả (kể cả từ cây có năng suất cao; từ quần thể hạt F1) không biết rõ cha mẹ không nên sử dụng để làm giống Ca cao vốn là cây giao phấn nên nếu không được thử nghiệm đánh giá trước, sự phân ly của những hạt không rõ nguồn gốc sẽ cho những cá thể không tốt như dự kiến

Dòng vô tính: Là những cá thể xuất sắc được chọn lọc từ những quần

thể xác định được cha mẹ hoặc những cá thể không rõ nguồn gốc nhưng được phát hiện thông qua điều tra tuyển chọn Các cá thể này được nhân vô tính (ghép, chiết hoặc giâm cành) nên vẫn giữ được hoàn toàn đặc tính của cây mẹ Nguồn giống này cho quần thể có độ đồng đều cao về sinh trưởng, năng suất và chất lượng

Các chương trình chọn tạo giống ca cao được bắt đầu từ những năm

1920 của thế kỷ trước ở nhiều quốc gia trồng ca cao Vào những năm 1930,

1940, các nguồn gen ca cao có giá trị đã được thu thập từ các khu vực Amazon thuộc Brazil, Ecuador và Peru Các dòng vô tính của những nguồn gen có giá trị này hiện vẫn được duy trì trong các bộ sưu tập nguồn gen ca cao Sự đa dạng di truyền lớn của ca cao đã được phát hiện trong các quần thể hoang dại ở khu vực Amazon nhưng những đa dạng di truyền này chưa được lai tạo rộng rãi với các dòng thuần Tính trạng kháng bệnh hiện nay là tính trạng được các nhà tạo giống quan tâm nhất Các tính trạng khác được quan tâm bao gồm tăng

năng suất, hương vị, thành phần bơ (% lipid trong hạt) và chất lượng (acid béo bão hòa), kháng với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi và nhiều các đặc tính nông

học khác (Guiltinan et al., 2008)

Kích thước hệ gen của ca cao được công bố vào khoảng 390 Mb đến 415

Mb (Couch et al., 1993) Kích thước tương đối nhỏ so với hệ gen của thực vật

làm tăng tính khả thi trong nghiên cứu hệ gen và xác định trình tự toàn bộ hệ gen của ca cao (http://www.cacaogenomedb.org/) Kích thước hệ gen của giống

Criollo và Amelonado đã được xác định trình tự 76% và 92% (Arout et al., 2011; Motamayor et al., 2013) Ngoài nguồn nguyên liệu tươi từ cây ca cao,

các nguồn gen ca cao có thể được khai thác từ một số nguồn đã công bố như các thư viện BAC (phục vụ các nghiên cứu về cấu trúc và tiến hóa hệ gen), các EST (phục vụ các nghiên cứu về các hệ thống biểu hiện của gen trong quá trình

phát triển của cây)… (Guiltinan et al., 2008) Trên thế giới, các nghiên cứu về

hệ gen, di truyền và chọn tạo giống ca cao được triển khai bởi nhiều nhóm nghiên cứu với các hợp tác hiệu quả (Bennett, 2003) Nhằm tăng cường sự hợp tác và trao đổi thông tin giữa các nhà chọn tạo giống và di truyền, Nhóm Cải biến Di truyền Ca cao Quốc tế (International Group for Genetic Improvement

of Cocoa - INGENIC) đã được thành lập vào năm 1994 (http://ingenic.cas.psu.edu) Ngoài ra, hầu hết các quốc gia sản xuất ca cao đã được các tổ chức quốc tế cũng như trong nước đầu tư xây dựng các viện/ trung tâm nghiên cứu như Viện Nghiên cứu Ca cao của Ghana (Cocoa Research Institute of Ghana - CRIG), Viện Nghiên cứu Ca cao của Nigeria (Cocoa Research Institute of Nigeria - CRIN), Trung tâm Nghiên cứu Ca cao của MARS (MARS Center for Cocoa Sciences - MCCS) có trụ sở ở Brazil, Viện Nghiên cứu Nông nghiệp (Institute of Agricultural Research - INIA) của Chile… Ở Hoa Kỳ, USDA-ARS đã thành lập hai trung tâm nghiên cứu ca cao ở Beltsville (thuộc Bang Maryland) và Miami (thuộc Bang Florida) Đây là nơi tiến hành các nghiên cứu hợp tác sâu rộng về ca cao với các phòng thí nghiệm trên toàn cầu Ngoài ra, một số trường đại học có các chương trình nghiên cứu

ca cao như Đại học Bang Pennsylvania, Hoa Kỳ (với Viện Nghiên cứu Ca cao Hoa Kỳ, nơi triển khai Chương trình Sinh học phân tử Ca cao) Một số trung

tâm nghiên cứu ca cao chất lượng cao ở châu Âu bao gồm Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp (Agricultural Research for Development - CIRAD) của Pháp, Trường Đại học Reading của Anh… Điểm mạnh của các viện/ trung tâm này là có đội ngũ các nhà khoa học giàu kinh nghiệm trong nghiên cứu ca cao, có các khu vực thử nghiệm đồng ruộng quy mô và các chương trình chọn tạo giống

1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học

1.2.2.1 Tái sinh in vitro cây ca cao

Giống như nhiều loài cây trồng khác, ca cao được nghiên cứu tái sinh nhằm mục đích nhân nhanh và nhiều các giống mới, bảo tồn nguồn gen, ứng dụng trong công tác chọn tạo giống biến đổi gen, tạo vật liệu nguồn để lai ghép

giống Tuy nhiên, đối với cây ca cao, việc xây dựng quy trình nuôi cấy mô in vitro và tái sinh phục vụ công tác chuyển gen là hết sức khó khăn, một phần do

ca cao là cây gỗ có chu kỳ sống dài Việc nghiên cứu và hoàn thiện các phương pháp nhân giống vô tính ca cao có những bước tiến triển chậm Hiện nay, cây

ca cao chủ yếu được tái sinh từ hạt và ghép cành Các hạt ca cao thường được tạo ra thông qua giao phấn nên không được thử nghiệm đánh giá trước, sự phân

ly của những hạt không rõ nguồn gốc sẽ cho những cá thể không tốt như dự kiến Các cây ca cao có nguồn gốc từ hạt thường không ổn định về các tính trạng nông học Ngoài ra, cũng có một số điểm không thuận lợi khi nhân giống

ca cao vô tính từ ghép, chiết hoặc giâm cành như tốn nhân công và chi phí cao,

tỷ lệ tái sinh thấp (Figueira, Janick, 1993; Li et al., 1998)

Những nghiên cứu ban đầu về nuôi cấy tái sinh in vitro cây ca cao thông

qua phôi soma tập trung vào việc phát sinh phôi trực tiếp từ các phôi hợp tử

chưa trưởng thành (Pence et al., 1980; Esan, 1992) Mặc dù các phôi soma

được phát triển từ các mô có nguồn gốc từ phôi hợp tử nhưng việc chuyển dạng hoặc làm nảy mầm các phôi soma này gặp không ít khó khăn Một số nhóm đã nghiên cứu tạo phôi soma từ các mô hoa và mô phôi tâm nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến di truyền phát sinh khi sử dụng các mô hợp tử (Figueira,

Janick, 1993; Sondahl et al., 1993; Alemanno et al., 1996; Li et al., 1998) Mặc

dù đã có những thành công nhất định trong hướng nghiên cứu này, nhưng hiệu quả phát sinh phôi soma và tạo cây ca cao được công bố vẫn còn rất thấp

Nhiều nhóm nghiên cứu đã gặp khó khăn trong tạo rễ và vi nhân giống in vitro (Flynn et al., 1990; Figueira, Janick, 1993) Ngoài ra, khả năng ứng dụng của các

công nghệ này trong nhân giống vô tính ca cao chưa cao khi phần lớn các dòng ca

cao không thể phát sinh phôi soma (Pence, 1989) Việc tái sinh in vitro cây ca cao

thông qua phôi soma là một hướng thay thế có triển vọng Để tăng hiệu quả của

phương pháp tái sinh in vitro ca cao qua phôi soma, Li và đồng tác giả (1998),

Maximova và đồng tác giả (2002) đã xây dựng quy trình phát sinh phôi soma từ lá mầm của phôi soma sơ cấp và thứ cấp Ở cây ca cao, nguồn mẫu cấy chính được sử

dụng là nụ hoa (bao gồm nhị lép (staminode) và cánh hoa (petal)) (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002) Quainoo và đồng tác giả (2008) đã khai thác quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma này như là công cụ để loại bỏ virus gây bệnh trên cây ca cao (Quainoo et al., 2008) Tuy nhiên, ở ca cao, sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây được công bố là phụ thuộc nhiều vào từng dòng (Maximova et al., 2002; Maximova et al., 2003) Trong khi, nhiều dòng còn gặp khó khăn khi thực hiện tái

sinh trong phòng thí nghiệm Dưới đây là một số nghiên cứu về phát sinh phôi soma

ở ca cao

Giai đoạn cảm ứng: Phương pháp tạo phôi ca cao từ phôi hợp tử chưa

trưởng thành đã được sử dụng với một vài cải biến ở nhiều phòng thí nghiệm

(Pence et al., 1980) Phôi hợp tử chưa trưởng thành của ca cao được tách khỏi

noãn của các quả ca cao đã khử trùng bề mặt và đặt trên môi trường cảm ứng

MS (Murashige, Skoog, 1962) thường chứa casein hydrolysate Sự phát sinh được thúc đẩy nhờ sự có mặt của auxin, nước dừa hoặc các peptone Nghiên cứu phôi hợp tử dựa trên môi trường lỏng thay vì môi trường bán lỏng cũng có

thể tăng cường phát sinh phôi trực tiếp (Pence et al., 1980) Cơ sở di truyền của

mô đóng vai trò quan trọng bởi vì các phôi hợp tử từ các loài khác nhau có phản ứng phát sinh phôi rất khác nhau Giai đoạn phát triển của phôi chưa trưởng thành được sử dụng cũng là yếu tố ảnh hưởng Các phôi có kích thước

từ 4 - 10 mm cho hiệu quả tạo phôi soma cao nhất trên môi trường có auxin và

nước dừa so với các giai đoạn sớm và muộn hơn (Pence et al., 1980)

Phôi soma có thể được phát sinh từ lá mầm của các phôi hợp tử trưởng

thành sử dụng phương pháp hai bước (Aguilar et al., 1992) Các mảnh lá mầm

trưởng thành được đặt trên môi trường có chứa cytokinin và auxin trong tối trong 3 tháng Trong giai đoạn này các phôi ở giai đoạn hình cầu và hình thủy lôi được hình thành Các phôi này sau đó được chuyển sang môi trường không

có các chất tăng trưởng, nuôi ngoài sáng một tháng nữa để tiếp tục phát triển Ngoài phát sinh phôi trực tiếp, các phôi hợp tử chưa trưởng thành cũng được sử dụng để phát sinh mô sẹo có khả năng tạo phôi Ngoài 2,4-D kích thích sự hình thành phôi, nước dừa hoặc thay thế sucrose bằng glucose hoặc fructose cũng cho kết quả khả quan Ở một dòng phát sinh qua mô sẹo, gibberellic acid (GA3) cũng thúc đẩy sự hình thành phôi Mặc dù phôi soma được tạo thành công, các phương pháp này sử dụng các phôi hợp tử làm vật liệu nuôi cấy khởi đầu và không hữu ích cho việc nhân giống vô tính Các mô khác của ca cao không có phản ứng trong phát sinh phôi soma Một số quy trình đã được nghiên cứu thành công Phát sinh phôi soma đã được công bố từ mô lá ca cao, kích thích bởi auxin và cytokinin ở nồng độ rất cao (Litz, 1986) Các phôi được hình thành nhưng không phát triển tiếp mà chỉ dừng ở giai đoạn tạo phôi hình tim

Quy trình phát sinh phôi soma từ mô phôi tâm và hoa với nhiều bước đã được Sondahl và đồng tác giả (1993) xây dựng Quy trình sử dụng môi trường bán lỏng để tái sinh, phát triển phôi, tạo phôi trưởng thành và chuyển dạng Phôi tâm được nuôi cấy trong tối trên môi trường khoáng có giảm nồng độ các muối MS và bổ sung auxin, cytokinin, polyvinylpyrrolidone (PVP) cùng rất nhiều các hợp chất hữu cơ khác như casein hydrolysate, cystein, cao mạch nha, nước dừa Các phôi nhỏ sau khi hình thành được chuyển sang nuôi cấy ngoài sáng trên môi trường phức tạp khác có chứa auxin và cytokinin, GA, abscisic acid (ABA) Sau khi lá mầm xuất hiện, các phôi được chuyển sang môi trường trưởng thành chứa cytokinin, auxin, GA và ABA cùng sucrose và charcoal với nồng độ tăng Môi trường cho phép rễ hình thành và chồi phát triển chuẩn bị cho chuyển dạng Các phôi soma cũng được tạo từ cánh hoa chưa trưởng thành nuôi cấy trên môi trường có auxin và cytokinin Phôi hình thành được chuyển sang môi trường phát triển… giống như các phôi phát sinh từ phôi tâm

(Sondahl et al., 1993) Figueira và Janick (1993) cũng tiến hành nuôi cấy phôi

tâm sử dụng môi trường cảm ứng dạng lỏng Sau hai tháng nuôi trong tối, mô sẹo được chuyển sang môi trường bán lỏng bổ sung cytokinin, cao mạch nha, nước dừa và PVP, nuôi tiếp trong hai tháng Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được chuyển sang môi trường duy trì với muối MS và casein hydrolysate nhưng không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và các phức hợp khác Bước này có sự tạo phôi hình cầu và hình thủy lôi Những phôi này sẽ tiếp tục trưởng thành và sẵn sàng cho chuyển dạng thành cây khi được chuyển sang môi trường lỏng có chứa sucrose nồng độ thấp 1% và 4,4% sorbitol Tiền phôi được tạo thành công từ mô phôi tâm và mô trong vỏ sử dụng môi trường đơn giản hơn chứa auxin và cytokinin, nuôi trong tối Tuy nhiên, các phôi này không phát triển tiếp, có thể do sự có mặt của các hợp chất phenolic tích tụ trong phôi Vấn đề này không được giải quyết khi bổ sung nitrate bạc vào môi trường Bước quyết định trong quá trình này là loại auxin và cytokinine sau 2 -

3 tuần trên môi trường cảm ứng sử dụng amino acid và nước dừa Sau 6 - 8 tuần tiếp theo, các phôi hình cầu được chuyển sang môi trường thứ ba có bổ sung muối với nồng độ giảm một nửa, auxin, GA3, adenine sulfate và maltose

để trưởng thành (Figueira, Janick, 1993)

Giai đoạn phát triển phôi soma: Sự phát triển trực tiếp phôi soma từ

mô phôi hợp tử xảy ra qua 2 giai đoạn hoàn toàn khác biệt Giai đoạn 1 là giai đoạn nảy chồi (budding) Trong giai đoạn này, các cấu trúc tương tự tuyến lông trên bề mặt của phôi hợp tử hình thành các phôi soma (các phôi trải qua các giai đoạn phát triển thông thường của sự hình thành phôi) Sự phát triển này được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét, trong đó bề mặt nhăn nheo của phôi ở giai đoạn phôi hình cầu chuyển sang nhẵn nhụi ở giai đoạn hình tim Trong khi đó, ở giai đoạn không nảy chồi (nonbudding), phôi soma phát triển

từ mô lá mầm bên trong (Pence et al., 1980) Trong một số trường hợp, dường

như phôi dạng không tạo chồi ngừng phát triển trước khi lá mầm xuất hiện và hình thành phôi dạng chồi từ bề mặt của chúng

Tương tự về mặt hình thái như phôi hợp tử, các phôi soma của ca cao cũng có khả năng tổng hợp sinh học bình thường Anthocyanins, acid béo,

triglycerides và alkaloids cũng có thể được tích tụ trong phôi soma trong quá

trình trưởng thành in vitro theo cách tương tự như đối với phôi hợp tử in vitro

mặc dù ở các mức thấp hơn so với những quan sát ở phôi hợp tử trưởng thành

in vivo (Pence, 1989)

Giai đoạn chuyển dạng từ phôi sang cây: Các phôi ca cao chưa trưởng

thành, từ phôi hợp tử hay soma không sẵn sàng trải qua giai đoạn chuyển dạng sớm thành cây bình thường Một số phương pháp đã được xây dựng để chuyển phôi soma thành cây con Rễ ở các phôi soma ca cao được phát triển nhờ nuôi cấy trên môi trường với nồng độ muối MS giảm 50% và nhờ chuyển phôi sang môi trường mới chuẩn bị (Wang, Janick, 1984) Các phôi soma ca cao nuôi cấy trên môi trường có chứa zeatin và naphthalene acetic acid (NAA) có thể nảy

mầm khi lá mầm được loại (Noval et al., 1986) Điều này cho thấy khả năng có

sự tồn tại của chất ức chế nảy mầm ở trong lá mầm Sondahl và đồng tác giả (1993) sử dụng môi trường chứa nước dừa, BAP, IAA, GA3, ABA và charcoal cho quá trình nảy mầm phôi soma được tạo ra từ quá trình phát sinh phôi soma nhiều bước: phát sinh, phát triển và trưởng thành Figueira và Janick (1993) đã chuyển phôi soma trưởng thành sang môi trường bán rắn của cây gỗ với fructose Phôi sau đó được chuyển sang tủ nuôi cấy với 20.000 ppm - CO2 kích thích sự nảy mầm

Chuyển dạng phôi sang cây là một bước không đơn giản Nhiều quy trình đã được công bố, trong đó có quy trình loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn

lá mầm Nếu phôi soma từ vật liệu nuôi cấy vô tính có thể chuyển dạng sang cây với hiệu suất cao, ứng dụng của công nghệ phát sinh phôi soma có thể giải quyết được vấn đề rất lớn trong cải tiến giống và bảo tồn nguồn gen ca cao

Tiếp tục các nghiên cứu tái sinh in vitro cây ca cao, khắc phục các nhược điểm

của các nghiên cứu trước đó, năm 1998, Li và đồng tác giả đã công bố quy

trình tái sinh in vitro cây ca cao thành công từ phôi soma sử dụng các mô hoa

của một số dòng ca cao Quy trình này sau đó đã được sử dụng trong nhiều

nghiên cứu khác (Maximova et al., 2002; Maximova et al., 2003; Traore et al., 2003; Maximova et al., 2005; Maximova et al., 2006; Maximova et al., 2008; Silva et al., 2009) Các cây ca cao tạo ra từ phôi soma được trồng trong nhà

kính và biểu hiện những tính trạng nông học tương tự với các cây trồng có

nguồn gốc từ hạt (Li et al., 1998) Niemenak và đồng tác giả (2008) đã nghiên

cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System - TIS) trong sản xuất lượng lớn phôi soma và tăng hiệu suất chuyển

dạng phôi (Niemenak et al., 2008)

Bên cạnh các nghiên cứu về hoàn thiện các quy trình để tái sinh in vitro

cây ca cao với hiệu suất cao nhất, một số tác giả cũng tiến hành nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cường phát sinh phôi soma Các gen liên quan đến yếu tố

phiên mã như BBM và LEC2 có trong cây Arabidopsis thaliana (AtBBM, AtLEC2) cũng đã được phân lập từ T cacao (TcBBM, TcLEC2) Sự biểu hiện của TcBBM, TcLEC2 đã được quan sát thấy trong suốt quá trình phát triển phôi soma Mức độ

biểu hiện của các gen ở phôi soma và phôi hợp tử cũng được so sánh Nghiên cứu của Zang và đồng tác giả (2014), Florez và đồng tác giả (2015) đã xác nhận rằng

TcBBM, TcLEC2 là các gen tương đồng với AtBBM và AtLEC2 và có một vai trò đặc biệt trong phát sinh phôi soma và phôi hợp tử Mức độ phiên mã của TcBBM, TcLEC2 có thể sử dụng như là một chỉ thị sinh học để đánh giá khả năng phát sinh phôi trong mô ca cao (Zhang et al., 2014; Florez et al., 2015)

1.2.2.2 Nghiên cứu tạo cây ca cao chuyển gen

Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị vào cây ca cao: Trên đối tượng cây ca

cao, những công bố đầu tiên cho thấy sự mẫn cảm của tế bào ca cao với A tumefaciens và sự biến đổi của các tế bào ca cao (Purdy, Dickstein, 1989; Sain

et al., 1994) Việc sử dụng phương pháp bắn gen (bắn các hạt vàng vận tốc cao

để gắn DNA vào tế bào thực vật nuôi cấy) đã được báo cáo trên đối tượng ca

cao (Perry et al., 2000; Santos et al., 2002) Hai nghiên cứu đã cho thấy gen

ngoại lai có thể được đưa vào các tế bào ca cao, tuy nhiên, không có nghiên cứu nào thành công trong việc tái sinh cây ca cao chuyển gen

Hiện nay, với mục đích thiết lập và tối ưu hóa quy trình chuyển gen kết

hợp hệ thống tái sinh in vitro từ phôi soma của ca cao, đã có một số nghiên cứu

sử dụng các gen chỉ thị như gen mã hóa protein phát huỳnh quang (Enhanced Green Fluorescent Protein - EGFP) và gen chỉ thị nhuộm màu mô tế bào ß-

glucuronidase (gus) chuyển vào cây ca cao thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Khởi đầu của những nỗ lực chuyển gen vào ca cao, nhóm nghiên cứu của Furtek tại Trường Đại học Bang Pennsylvania, Hoa Kỳ đã thăm dò phương pháp chuyển gen vào ca cao sử dụng các tế bào lá (Furtek, 1994) Mặc dù nhóm nghiên cứu đã có thể chuyển được gen ngoại lai vào các tế bào cây ca cao sử

dụng A tumefaciens, tuy nhiên hiệu quả chuyển gen thấp và không có khả năng

phát sinh phôi Năm 2003, Maximova và đồng tác giả đã mô tả quy trình

chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang vào ca cao thông qua vi khuẩn A tumefaciens chủng AGL1 Kết quả đã tạo được các cây chuyển gen có khả năng

tạo ra các protein có phát huỳnh quang khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang Các nghiên cứu về hình thái và sinh lý học của nhiều cây ca cao chuyển gen cho thấy không có sự thay đổi về kiểu hình so với các cây ca cao không chuyển

gen Việc đưa các vùng MARs (Matrix attachment regions) của thuốc lá (Allen

et al., 1996; Spiker, Thompson, 1996) vào T-DNA đã làm tăng sự biểu hiện, ổn

định và đồng nhất của gen mã hóa protein phát huỳnh quang ở các cây ca cao chuyển gen Sự phân ly và biểu hiện của các cây ca cao chuyển gen ở thế hệ T1 cho thấy sự tiếp hợp và biểu hiện ổn định của gen chuyển ở một trong các dòng

ca cao được đánh giá Một yếu tố quan trọng khác quyết định sự thành công của phương pháp này chính là nghiên cứu gần đây cho thấy kháng sinh

moxalactam rất hiệu quả trong chọn lọc ngược (counter-selection) A tumefaciens và tăng hiệu quả tái sinh phôi soma thứ cấp (Antúnez de Mayolo

et al., 2003)

Năm 2009, nhóm nghiên cứu tại Brazil thông qua gen chỉ thị gus đã nhận

thấy ảnh hưởng tích cực của các polyamine và kháng sinh diệt khuẩn ß-lactam đến quá trình phát sinh phôi soma trong quá trình chọn lọc và tái sinh cây ca cao chuyển gen Các kháng sinh ß-lactam timentin và meropenem sử dụng chọn

lọc A.tumefaciens có thể sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen vào ca cao

Kháng sinh hygromycin sử dụng cho chọn lọc ở thực vật gây ức chế mạnh đến

sự phát triển phôi soma thứ cấp Nồng độ kháng sinh hygromycin sử dụng phù hợp nhất là ở 20 mg/l Nghiên cứu cũng hoàn thiện quy trình chuyển gen với

thời gian siêu âm mảnh mô là 100 giây, thời gian lây nhiễm A tumefaciens là

20 phút ở nồng độ 1,0 (OD600nm) ở 22°C, đồng nuôi cấy 48 giờ ở 25°C (Silva et al., 2009) Souki (2009) đã tối ưu các điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian đồng nuôi cấy, tuổi của mô sẹo để chuyển gen gus trong vector pGPTV-Kan/gus vào hai dòng ca cao KKM19 và P22 sử dụng A tumefaciens chủng AGL1 Kết quả

cho thấy, đối với dòng ca cao P22, hiệu quả chuyển gen đạt cao nhất khi sử dụng mô sẹo hai tuần tuổi, đồng nuôi cấy ở pH 5,8, 25o

C, 1 ngày Trong khi, các thông số tối ưu cho dòng KKM19 là sử dụng mô sẹo ba tuần tuổi, nuôi cấy

Đối với gen đích, Maximova và đồng tác giả (2006) đã biểu hiện thành

công gen mã hóa chitinase lớp I (TcChi1) trong cây ca cao dòng PSU-Scavina 6

(S6) nhằm mục đích nghiên cứu các gen chức năng có giá trị Gen này đã được chọn lựa để nghiên cứu vì chúng đã được mô tả biểu hiện trong vỏ quả khi bị thương và tế bào nấm bị loại bỏ (Snyder, 1994) Ngoài ra, việc sử dụng gen của cây ca cao để chuyển lại vào cây ca cao có thể dễ được chấp nhận hơn so với việc sử dụng gen phân lập từ các nguồn tài nguyên sinh vật khác Cây ca cao

chuyển gen TcChi1 được tăng cường khả năng kháng lại nấm C gloeosporioides gây bệnh trên ca cao Gen mã hóa TcChi1 được chuyển vào ca cao nhờ phương pháp chuyển gen qua A tumefaciens vào các lá mầm của phôi soma Gen TcChi1 được biểu hiện trong ca cao chuyển gen dưới sự điều khiển

của CAMV35S promoter đã được cải biến tại một số điểm Mặc dù các nghiên cứu tương tự đã được thực hiện ở các loài thực vật khác, đây là công bố đầu tiên trên đối tượng cây ca cao Các kết quả nghiên cứu cho thấy gen chuyển đã tiếp hợp vào hệ gen của ca cao với số lượng bản sao khác nhau và biểu hiện ở các mức độ khác nhau đối với từng dòng ca cao nghiên cứu Nhóm nghiên cứu

đã quan sát thấy sự liên kết chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và tính kháng bệnh nấm Khi đánh giá tính kháng nấm, hai dòng ca cao với hoạt tính protein

thấp hơn cũng xuất hiện những vùng bị tổn thương với kích thước lớn so với hai dòng ca cao có hoạt tính chitinase cao hơn Điều này chứng tỏ rằng sản

phẩm của gen TcChi1 đóng vai trò như là một protein kháng nấm trong cây ca cao Tương tự, hai dòng đối chứng là S6 và S6 mang gen gfp có chứa mRNA TcChi1 ở lá với mức độ không thể phát hiện được có hoạt tính chitinase thấp

hơn so với tất cả các dòng ca cao chuyển gen Ở hai dòng này lá xuất hiện với vùng bị tổn thương rộng nhất so với tất cả các dòng nghiên cứu Điều này hoàn

toàn phù hợp với giả thuyết rằng sản phẩm của gen TcChi1 có chức năng kháng

nấm Những kết quả này phù hợp với những công bố trước đó về sự biểu hiện

của TcChi1 được phát hiện ở vỏ quả khi bị tổn thương và có mặt ethylene,

chứng tỏ vai trò của gen này đối với tính kháng bệnh Như vậy, sản phẩm của

gen TcChi1 giúp kháng lại mầm bệnh C gloeosporioides Các kết quả thu được

từ nghiên cứu này đã một lần nữa khẳng định nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng hệ thống chuyển gen vào cây ca cao, mở ra tiềm năng tạo các cây ca cao chuyển gen có khả năng kháng được các bệnh do nấm gây ra

(Maximova et al., 2006)

Gần đây, các nhà khoa học cũng quan tâm đến protein liên kết Phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) có khả năng kháng được các bệnh do nấm gây ra trên cây ca cao PI3P là một thụ thể cho phép sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh ở thực vật như nấm hay nấm noãn Sự liên kết của thụ thể PI3P với protein tương ứng sẽ làm giảm hay chặn đứng sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh Do đó, các protein liên kết với thụ thể PI3P có vai trò quan

trọng trong việc kiểm soát bệnh ở thực vật (Kale et al., 2010; Plett et al.,

2011) Helliwell và đồng tác giả (2015) đã nghiên cứu sự biểu hiện và tiết ra môi trường của 4 protein PI3P trong lá cây ca cao nhiễm bệnh nấm Kết quả cho thấy, các protein này đã làm giảm 85% kích thước vùng tổn thương và sự tăng trưởng của nấm Cây ca cao chuyển gen biểu hiện 2 protein liên kết PI3P

khác nhau được tăng đáng kể khả năng kháng nấm P tropicalis, P palmivora

và các tác nhân gây bệnh do nấm C theobromicola Những kết quả này chứng

minh việc sản sinh protein liên kết PI3P là phương thức hiệu quả làm tăng khả

năng kháng bệnh ở ca cao và các loài thực vật khác (Helliwell et al., 2015)

Santoso và đồng tác giả (2004) đã tiến hành nghiên cứu xác định khả năng diệt ấu trùng sâu đục quả ca cao (ca cao pod borer larvae) của các loại protein Cry (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ba, Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Ea, Cry1Fa, Cry1Ia và hai protein lai 1Ab/1Ab/1Ca và 1Ba/1Ia/1Ba) có

nguồn gốc từ vi khuẩn Bt Kết quả cho thấy các protein Cry đều thể hiện độc

tính gây chết khá cao với ấu trùng sâu (tỷ lệ gây chết thấp nhất là 40% (Cry1Cb), cao nhất đạt 80% (protein lai 1Ba/1Ia/1Ba)) Các protein Cry1Ab và

Cry1Ac đều gây chết sâu với tỷ lệ 60% Như vậy, nguồn gen cry của Bt đóng

vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra một thế hệ cây chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên (không cần phun thuốc trừ sâu trong quá trình trồng) và an toàn cho người sử dụng

Bên cạnh các gen kháng sâu bệnh, một nhóm gen khác cũng rất được quan tâm nghiên cứu nhằm tạo nguồn gen chuyển giúp nâng cao khả năng chịu hạn của cây ca cao Do sinh trưởng trong vùng nhiệt đới với lượng mưa hàng năm khá lớn, cây ca cao rất mẫn cảm với hiện tượng khô hạn Bae và đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các polyamine đến sự đáp ứng của cây

ca cao đối với các tác nhân gây hạn hán cũng như các tác nhân bất lợi khác Nhóm tác giả này đã nhận thấy sự biểu hiện của một số enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các polyamine trong cây ca cao như decarboxylase (TcODC), decarboxylase (TcADC) và S-adenosylmethionine decarboxylase (TcSAMDC) trong điều kiện hạn hán Các protein này được cảm ứng biểu hiện trong điều kiện bất lợi của môi trường bởi các tác nhân hữu cơ và vô cơ Trong điều kiện hạn, mức độ biểu hiện của các protein này có tương quan với sự thay đổi ở khí khổng, quá trình quang hợp, sự giữ nước và sự phát huỳnh quang xanh lục ở lá Hơn nữa, TcODC vàTcADC cũng được cảm ứng trong điều kiện

mô tế bào bị tổn thương do cơ học hay do nấm P megakarya (tác nhân gây bệnh bệnh thối thân, cháy lá, thối trái ở ca cao), Fusarium oxysporum gây chết

và rụng hoa Trong số các enzyme kể trên, ADC được xác định là enzyme đóng

vai trò chính (Galloway et al., 1998) Enzyme ADC có khối lượng phân tử

khoảng 66 - 72 kDa, được mã hóa bởi một gen đơn bản hoặc có rất ít bản sao nằm trong nhân với vùng mã hóa xấp xỉ 2100 nucleotide Gen mã hóa ADC có

mặt trong nhiều loài cây, bao gồm cả ca cao Trong nghiên cứu của Bae và đồng tác giả (2008), kết quả kiểm tra định lượng bằng real-time PCR từ RNA tổng số được tách chiết từ nhiều cơ quan khác nhau (lá, hoa, thân, rễ, hạt, quả xanh) trong nhiều giai đoạn phát triển của cây ca cao đã cho thấy mức độ phiên

mã của gen TcADC trong các cây bị hạn cao hơn nhiều so với trong cây đối chứng (không bị hạn) Trong mô lá, mức độ phiên mã của gen TcADC trong

các cây không được tưới nước 10 ngày đã tăng 4 lần so với đối chứng Trong

mô rễ, gen TcADC cũng nhanh chóng được cảm ứng trong điều kiện khô hạn và biểu hiện đạt gần cực đại sau 7 ngày cây không được tưới nước (Bae et al.,

2008)

Ngoài ra, nhóm gen có khả năng tăng độ ngọt cho ca cao cũng được các nhà khoa học quan tâm Trong thực vật bậc cao, sucrose synthase (Sus, EC 2.4.1.13) được xem là enzyme chính tham gia vào quá trình chuyển hóa đường

sucrose Mặc dù, một số gen mã hóa paralogous isozyme khác nhau của Sus đã

được xác định và đặc trưng trong nhiều hệ gen thực vật, tuy nhiên chưa có

nhiều thông tin chi tiết về các gen Sus ở cây ca cao Nghiên cứu của Li và đồng tác giả (2015) đã xác định được 6 gen Sus từ cây ca cao Phân tích cấu trúc gen

và phát sinh loài của các gen Sus đã cho thấy sự bảo toàn họ Sus ở ca cao và các loài thực vật khác Sự biểu hiện của gen Sus trong ca cao đã được kiểm tra

bằng real-time PCR với các mô và các giai đoạn phát triển khác nhau của lá, chồi, hoa và quả Protein TcSus1, TcSus5 và TcSus6 chủ yếu biểu hiện trong

vỏ cây, TcSus2 biểu hiện trong hạt giống, TcSus3 và TcSus4 đã được tìm thấy

nhiều trong vỏ quả và vỏ hạt (Li et al., 2015) Năm 2014, Li và đồng tác giả

cũng đã thực hiện phân lập và phân tích biểu hiện của 6 gen vận chuyển

sucrose (sucose transfactor – Sut) giả định: TcSut1, TcSut2, TcSut3, TcSut4, TcSut5 và TcSut6 từ kiểu gen ca cao TAS-R8 Các phân tích gen cho thấy các Sut trong ca cao chứa số exon khác nhau, từ 1 - 14 Khối lượng phân tử trung

bình của 6 protein khoảng 56 kDa (52 - 66 kDa) Sáu protein đều được dự đoán

có những đặc điểm đặc trưng của các chất vận chuyển đường sucrose với 12 vùng xuyên màng Phân tích phát sinh loài cho thấy protein TcSut2 và TcSut4 tương ứng thuộc về nhóm 2 Sut và nhóm 4 Sut Các protein TcSut khác thuộc

về nhóm 2 Sut Kết quả kiểm tra biểu hiện của gen Sut bằng real-time PCR cho thấy, TcSut1 đã được biểu hiện trong vỏ quả và TcSut3, TcSut4 được biểu hiện cao trong vỏ quả và vỏ cây TcSut5 chỉ biểu hiện trong vỏ hạt ở giai đoạn hạt chín (Li et al., 2014) Những kết quả này cung cấp những thông tin cơ bản hỗ trợ giải thích các chức năng của họ gen Sus, Sut trong cây ca cao.

Chuyển gen là một công cụ bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và

có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi sang các giống khác Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau được áp dụng thành công trên nhiều loại cây trồng và từng bước được tối ưu trong các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới Trên đối tượng cây ca cao, mặc dù đã có những thành công nhất định, nhưng hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào từng loài

1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE

1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên

Họ chitinase là các enzyme tham gia quá trình thủy phân acetylglucosamine (GlcNAC) polymer chitin Chitinase có một phổ phân bố rộng trong tự nhiên, được tìm thấy ở tất cả các giới loài, từ vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật cho đến động vật Chúng có rất nhiều chức năng khác nhau thường liên quan đến tiêu hóa, sự lột xác của động vật chân khớp và chức năng bảo vệ Gen mã hóa chitinase là đối tượng được quan tâm nghiên cứu trong vài năm trở lại đây và ngày nay, giá trị của gen mã hóa chitinase được nâng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật để giảm thiểu bệnh hại

N-Căn cứ vào trình tự amino acid bảo toàn, cách gấp cuộn protein, chitinase được chia làm 2 họ là họ chitinase 18 và 19 (Coutinho, 1999) Họ chitinase 18 có một phổ phân bố rộng ở tất các các giới loài bao gồm cả vi khuẩn, thực vật và động vật Trong khi đó, họ chitinase 19 lại tìm thấy chủ yếu

ở thực vật Tuy nhiên, cũng có một vài báo cáo về họ chitinase 19 từ những

nguồn được phân loại như từ vi khuẩn (Kawase et al., 2004), ve bét (You et al., 2003) và một số virus (Mediavilla et al., 2000)

Có nhiều cách phân loại chitinase dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau Các lớp chitinase thực vật khác nhau được phân biệt bởi các tiêu chuẩn sinh hóa, sinh học phân tử và các tiêu chuẩn hóa lý Do đó, các chitinase có thể khác nhau về cơ chất, vị trí trong tế bào và các hoạt động cụ thể Các nhà nghiên cứu

đã đưa ra 3 lớp chitinase thực vật Chitinase lớp I là enzyme có tính bảo thủ cao với 1 miền đầu N giàu cysteine được tạo bởi khoảng 40 amino acid Chitinase lớp II thiếu miền đầu N giàu cysteine nhưng có trình tự amino acid

có tính tương đồng cao với chitinase lớp I Chitinase lớp III không có trình tự tương đồng nào với chitinase lớp I hay II Chitinase lớp III có một sự tương đồng nhỏ với chitinase vi khuẩn và vùng hoạt động được cho là chứa 4 amino

acid aspartic hoặc glutamic suy ra từ tính kị nước của vùng này Có ý kiến cho

rằng tồn tại một lớp chitinase khác là chitinase lớp IV bao gồm chitinase ở củ cải đường, cây cải dầu và đậu Chitinase lớp IV cũng chứa vùng giàu cystein để duy trì cấu trúc cơ bản giống như chitinase lớp I nhưng mức độ giảm đi 4 lần Chitinase lớp IV chỉ chứa 241 - 255 amino acid ở protein trưởng thành trong khi chitinase lớp I là 300 amino acid So sánh trình tự amino acid đặc trưng giữa lớp IV và lớp I giống nhau 41 - 47%, trong lớp IV thông thường là 59 - 63% và trên 69% đối với lớp I Hơn nữa, chitinase lớp IV và lớp I có thể phân biệt bằng huyết thanh học Miền đầu N giàu cystein được cho là vùng kết hợp với chitin và được tìm thấy ở rất nhiều loại protein Những protein chứa vùng giàu cystein có khả năng liên quan tới 1 gen dung hợp vùng gắn chitin và vùng không liên quan Chitinase lớp V: dựa vào những dữ liệu về trình tự, nghiên cứu nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể giảm đi nhiều lần

trong quá trình tiến hóa thực vật bậc cao (Collinge et al., 1993; Punja, Zhang, 1993; Rifat et al., 2013).

1.3.2 Chitinase ở một số đối tƣợng sinh vật

Chitinase thực vật chủ yếu được tìm thấy ở thân cây, hạt, củ và hoa Chúng được sản sinh khi có sự tấn công của bệnh hại hay các chất điều hòa sinh trưởng như ethylene (Gooday, 1996) Dạng chitinase được nghiên cứu rộng rãi nhất ở thực vật là endochitinase, một loại enzyme phân cắt bên trong phân tử chitin, giải phóng N-acetylglucosamine, có khối lượng phân tử nhỏ hơn

chitinase côn trùng Endochitinase thực vật là loại enzyme có bản chất protein, khối lượng đơn phân tử từ 25 - 35 kDa, có điểm đẳng điện cao hoặc thấp Chitinase có một khoảng pH tối ưu rất rộng xung quanh pH 6 và có khoảng nhiệt cố định không quá 50ºC (Boller, 1987) Chitinase có thể biểu hiện ở mức

độ thấp nhưng cũng được tăng cường đáng kể bởi các yếu tố như ethylene, salicylic acid, dung dịch muối, ozone, tia UV, nấm, vi khuẩn, virus Chitinase

ức chế sự phát triển của nấm thường kết hợp với các enzyme khác như glucanases, được tìm thấy ở khoai tây, thuốc lá, cam quýt, đậu, cà chua, ngô,

β-1,3-khoai lang và đậu Hà Lan (Koga et al., 1996) Chitinase có thể được phát hiện ở giai đoạn đầu của sự phát triển thực vật (Kasprzewska, 2003; Rifat et al., 2013)

Chitinase còn được tìm thấy trong tất cả các loài côn trùng thuộc các bộ Hai cánh, Cảnh vảy, Cánh nửa, Cánh cứng và Cánh màng Chúng dễ dàng được tinh sạch với nồng độ cao từ dịch lột xác của côn trùng (lớp dịch nằm giữa lớp

vỏ cutin cũ và mới) (Arakane, Muthukrishnan, 2010) Chức năng chính của chitinase côn trùng là quay vòng chitin trong quá trình lột xác Đầu tiên endochitinase sẽ bẻ gẫy ngẫu nhiên cutin tạo thành chitooligosaccharides, sau

đó, chúng sẽ được hydrolised hóa bởi các enzyme exo thành GlcNAC Những phân tử đơn phân này lại được tiếp tục tái sử dụng để tổng hợp một lớp cutin mới Ngoài ra, chitinase côn trùng còn có vai trò phòng thủ chống lại các ký sinh trùng hoặc thực hiện chức năng tiêu hóa nếu chế độ ăn của chúng có chứa chitin Việc sản xuất enzyme này được quy định bởi hormone trong quá trình chuyển đổi của ấu trùng Chitinase côn trùng có thể bị ức chế bởi allosaminidin Mặc dù chitinase côn trùng đã được nhận diện ở mức độ protein vào những năm 1970, nhưng việc tách dòng một cDNA mã hóa cho chitinase côn trùng chỉ đạt được vào 2 thập kỷ sau đó Kramer là người đầu tiên báo cáo

đã phân lập được một dòng cDNA có độ dài đầy đủ từ sâu sừng thuốc lá

(tobacco hornworm), Manduca sexta (Kramer et al., 1993) Kể từ đó, hơn 100

cDNA chitinase từ nhiều loài côn trùng khác nhau đã được tách dòng (Arakane, Muthukrishnan, 2010)

Chitinase từ nấm cũng là một nguồn chitinase được quan tâm nghiên cứu Thành tế bào nấm là một cấu trúc phức tạp gồm chitin, glucan và một số