Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, từ đó góp phẩn xây dựng tiêu chuẩn
Trang 1Xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA
AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tạ Văn Bình\ Lê Thị Hải Yến\ Ma Thị Hổng Nga\ Nguyễn Thị Quỳnh^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^
^Trường Cao đẳng YHà Nội, ^Trường Đại học Dược Hà Nội
SUMMARY
The aim of this work is to develop ơn analysis of gentiopicrin in VIEMDA AD cream by high performance lipid chromatography The analysis process was conducted on on Inertsil Cl 8 column (250 mm X 4.6 mm, 5 ụm) The mobile phase of methanol: water (35:65, v/v) was pumped at the flow rate of 1 ml/min Gentiopicrin was identified by UV-DAD detector at wavelength o f270 nm The obtained results showed that linear range, overage recovery and precision were 0.10- 0.30 mg/ml, 100.70% and 2.07% (n = 12), respectively Consequently, this HPLC method was good linear, repeotobility and precision This validated method is appropriate to quantity gentiopicrin in VIEMDA AD creom.
Từkhoá: Kern VIEMDA AD, long đởm, gentiopicrin, HPLC
Đặt vấn đề
Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic
dermatitis - AD) là một dạng viêm da mạn tính, bệnh
thường xuất hiện ở trẻ em nhưng có thể kéo dài đến
tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh còn gặp ở người
lớn [6], Theo nghiên cứu của Christina M Gelbard và
Adelaide A Hebert [4] bệnh viêm da cơ địa là bệnh
mãn tính ảnh hưởng đến 10 - 20% trẻ em và 1 - 3%
người lớn ở Mỹ Các triệu chứng của bệnh thường
dẫn đến mất ngủ, tâm lý căng thẳng, lo lắng gây
ảnh hưởng xấu tới công việc và học tập Tại Việt Nam,
theo báo cáo của Viện Da liễu Trung ương, mỗi ngày
khoa khám bệnh tiếp nhận từ 400 - 600 người mắc
bệnh về da, trong đó bệnh do viêm da cơ địa (sẩn
ngứa, mày đay, chàm, tổ đ ỉa ) chiếm tới 30% số bệnh
nhân Đặc biệt, bệnh viêm da cơ địa có chiều hướng
gia tăng cùng với sự phát triển xã hội, ô nhiễm môi
trường trong những năm gẩn đây [2] Hiện nay, điểu
trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu, chủ yếu sử
dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm và giảm
các phản ứng dị ứng do vậy có thể gây các phản ứng
phụ rất nguy hiểm
Kem VIEMDA AD trong thành phần có chứa dược
liệu Long đởm với dược chất chính là gentiopicrin,
đang được nghiên cứu bào chế để dùng trong điều
trị chàm thể tạng Để có thể đưa thuốc vào sản xuất
và điều trị thì chất lượng thuốc cẩn được tiêu chuẩn
hóa và được kiểm tra, kiểm soát chặt chẽ Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, từ đó góp phẩn xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm sản phẩm
Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Mău thử
Kem VIEMDA AD đóng tuyp 20 g, sản xuất ngày 25/04/2013 là sản phẩm nghiên cứu của Trường Cao Đẳng Y Hà Nội (thuộc đé tài cấp thành phố Hà Nội)
Hóa chất, chất chuẩn
- Chất đối chiếu: gentiopicrin hàm lượng 99,0% tính theo nguyên trạng, đóng lọ 20 mg do Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc) cung cấp
- Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC hoặc PA (Merck - Đức)
Thiết bị
Hệ thổng HPLC - detector u v - DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mềm Aligent Chemstation version B
Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01 mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo, Nhật; Nồi cách thủy WiseCircu',Tây Ban Nha
Các dụng cụ thủy tinh chính xác
Trang 2Phương pháp nghỉên cứu
-Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Inertsil c^g(5 |am, 250 mm x4,6 mm)
+ Pha động: Methanol - nước (35:65)
+ Detector: u v 270 nm
+Thể tích tiêm mẫu: 10 |jl
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút
+ Nồng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu
tiêm: khoảng 0,2 mg/ml
- Chuẩn bị các dung dịch:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một lượng
chất chuẩn tương đương khoảng 10 mg gentiopicrin
cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan trong vừa đủ
thể tích bằng methanol Bảo quản trong lọ thủy tỉnh
kín ở 2 - 8° c dùng trong vòng 1 tháng
+ Dung dịch chuẩn: lấy chính xác 2 ml dung dịch
chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng
vừa đủ thể tích bằng methanol Lọc qua màng lọc 0,45
Mim
+ Dung dịch thử: Lấy thuốc của 5 đơn vị chế phẩm
được chọn ngẫu nhiên Trộn đổng nhất Cân chính
xác khoảng 0,50 g chế phẩm vào ống nghiệm 10 ml,
thêm 7 ml methanot siêu âm trong 20 phút đun cách
thủy ở 60°c trong 15 phút để nguội Chuyển toàn
bộ vào bình định mức 10 ml, rửa ống nghiệm 3 lẩn
mỗi lần với khoảng 1 ml methanol.Tập trung dịch rửa
vào bình định mức trên Thêm methanol đến vừa đủ
thể tích Lắc đểu Ly tâm trong 5 phút với tốc độ 1000
vòng/ phút Lọc lớp dịch trong qua màng lọc 0,45 lim
Định tính:ĩrên sác ký đổ của dung dịch thử phải
có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic
gentiopicrin trên sắc ký đổ của dung dịch chuẩn
Định lượng: Phương pháp so sánh với chuẩn
làm song song trong cùng điểu kiện Hàm lượng
gentiopicrin p (%) trong chế phẩm được tính theo
công thức:
xm^ X 5
Kết quả nghỉên cứu
Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích
Khảo sát và lựơ chọn điểu kiện sắc ký
Dựa vào đặc tính của hoạt chất và các kết quả nghiên cứu định lượng gentiopicrin bằng HPLC đã
công bố [3 ,5 ,8], tiến hành khảo sát và lựa chọn điểu kiện phân tích phù hợp và khả thi
- Sử dụng cột sắc ký Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm,
5 pm) trong nghiên cứu
-Thực hiện sắc ký gentiopicrin (dung dịch chuẩn) với các hệ pha động methanol - nước với tỷ lệ thay đổi, của methanol 25 - 40%, nước 75 - 60% (AC = 5%), tốc độ dòng 1,4 ml/ phút Kết quả cho thấy khi nồng
độ methanol tăng thời gian lưu của pỉc gentiopicrin giảm nhưng áp suất cột táng nhanh (hình 1 và 2) ở
tỷ lệ methanol 35%, nước 65% thời gian lưu khoảng 6 phút và áp suất khoảng 220 bar Để áp suất làm việc của hệ thống không quá cao (< 200 bar), tiến hành giảm tốc độ dòng pha động từ 1,4 ml/ phút tới 1,0 ml/phút (AV = 0,1 ml) thì thấy rằng tại tốc độ dòng pha động là 1 m l/phútvớitỷlệphađộng như trên thì
áp suất cột khoảng 170 bar và thời gian lưu của pic gentiopicrin khoảng 8 phút Đổng thời, thể tích tiêm mẫu nhỏ (10 |jl) được thực hiện nhằm hạn chế doãng pic và giảm thiểu mức độ gây bẩn cột khi sắc ký đối với mẫu thử là dạng cream và có nguồn gốc dược liệu
250
225
X ì
200
150
Nồng độ M eO H (%)
H'inh 1 Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thành phân phũ động tới áp suất cộĩsổc kỷ
Trong đó:
và A^: Diện tích pic của gentiopicrin trong sắc ký
đổ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn
và m : Khối lượng (mg) mẫu thử và mẫu chuẩn,
c và H: Hàm lượng (%) gentỉopicrin và độ ẩm (%)
của chất đối chiếu
- Thơm định phương pháp: theo hướng dẫn của ICH
[7] đối với định tính, định lượng hoạt chất trong chế
phẩm, gồm các chỉ tiêu: tính chọn lọQ khoảng nồng
độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.
16
.a
Dí) C '
It
•I
Nồng độ M eO H (%)
Hình 2 Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thònỉì phân phũ động tới thời giQíì lưu CỦQ gentiopiơin
Trang 3Bước sóng phát hiện được lựa chọn là bước
sóng cực đại hấp thụ khi quét phổ hấp thụ của pic
gentiopicrin trong sắc ký đổ dung dịch chuẩn
Từ kết quả khảo sát bằng thực nghiệm, chúng tôi
lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng gentiopicrin
như trình bày ở phán phương pháp nghiên cứu
Xử lý mâu
Gentiopicrin có khả năng hòa tan tốt trong
methanol mặt khác methanol là dung môi trong
thành phần pha động do đó methanol được lựa chọn
là dung môi dùng trong xử lý mẫu Tiến hành khảo
sát bằng thực nghiệm với thể tích dung môi 10 -2 0
ml (AV = 2 ml), thời gian siêu âm và thời gian thủy
phân 1 0 -3 0 phút (At = 5 phút), nhiệt độ thủy phân
cố định là 60°c nhỏ hơn nhiệt độ sôi của methanol để
lựa chọn quy trình xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao
nhất loại được tạp với thời gian xử lý ngắn.Từ kết quả
thu được quy trình xử lý mẫu lựa chọn được trình bày
ở phần phương pháp nghiên cứu (Dung dịch thử)
Thẩm định phương pháp
Tiến hành thẩm định các tiêu chí theo hướng dẫn
của ICH [7]
Tính chọn lọc
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu placebo, dung dịch chuẩn gentiopicrin, dung dịch thử (Kem VIEMDA AD) Kết quả được trình bày trong hình 3
Kết quả ở hình 3 cho thấy thời gian lưu của pic trên sắc đồ dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu pic gentiopicrin của dung dịch chuẩn (8,16 phút) và trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic trong khoảng 7 - 1 0 phút Như vậy phương pháp có tính chọn lọc cao
Tính thích hợp của hệ thống
Được xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu của gentiopicrin khi sắc ký 6 lẩn liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin
nồng độ 0,2 mg/ml Kết quả cho thấy RSD của diện
tích pic và thời gian lưu của pic gentiopỉcrin lẩn lượt
là 0,18% và 0,23% (n = 6) đểu thấp hơn 2,0% do đó
hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng gentiopicrin
Khoảng nổng độ tuyến tính
Của phương pháp được xác định dựa trên mối tương quan hồi quy giữa nồng độ và diện tích pic của gentỉopicrin trong khoảng nồng độ khảo sát 0,10 - 0,30 mg/ml Kết quả được trình bày ở bảng 1
• bÁÒVo-S;;;ã>Ò4Ri«^(AHffeSÚWAtk'.YÂÌN
mAU
120 100
mAU
ĩ
80
lỊ
1
60
40
20
ỉ
Kinh 3 Sâc ký đổ các mẫu: a Plũcebo; b genĩiopicrin chuổn; c Kem VIEMDA AD
Trang 4Bỏng I Kết quỏ khỏo sát khoỏng nống độ tuyến tính
Phương trình hổi quy: y = 10567 X -189,9
Hệ sỗ tương quan: r = 0,9930
Độ chính xác
Của phương pháp được xác định dựa vào sự phân tán số liệu (RSD) khi tiến hành phân tích 6 lần riêng biệt trong 1 ngày (độ lặp lại) và thực hiện tương tự như vậy ở ngày phân tích khác (độ chính xác khác ngày) trên một mẫu chế phẩm Kem VIEMDA AD theo quỵ trình trên Kết quả được trình bày ở bảng 2
Báng 2 Kết quở độ chính xác CỦQ phương pháp
(g)
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng gentiopicrin (%)
(mAU.s)
Hàm lượng gentiopicrin (%)
Hàm lượng trung bình gentiopicrin với n = 12 là: 0,383%
RSDvớin = 12là:2,07%
Độ đúng
Được xác định theo phương pháp thêm chuẩn bằng cách thêm một lượng chính xác chuẩn gentiopicrin
vào mẫu thử (khối lượng 0,50 g) ở 3 mức lần lượt là 0,2 mg; 0,4 mg và 0,6 mg (thêm 1,00 ml; 2,00 ml và 3,00 ml dung dịch gentiopicrin chuẩn có nồng độ 0,2 mg/nnl) tương ứng lượng gentiopicrin thêm vào là khoảng 10%; 20% và 30% lượng hoạt chất có trong mẫu thử Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký Kết quả được trình bày ở bảng 3
Bỏng 3 Két quở khâo sớt độ đúng (n=3)
(mg)
Lượng gentiopicrin tìm lại được
(mg)
Bàn luận
Kem VIEMDA AD là một chế phẩm thuốc mới được bào chế từ dược liệu, đã chứng minh có tác dụng tốt trong điểu trị viêm da cơ địa Thành phần chính của chế phẩm này là dược liệu Long đởm với dược chất chính
Trang 5là gentiopicrin [3] Để có thể đưa thuốc vào sản xuất
và đăng ký lưu hành thì cẩn tiêu chuẩn hóa chất lượng
sản phẩm Dược điển Việt Nam IV [1], trong chuyên
luận "Long đởm" mới chỉ để cập tới phương pháp
định tính Long đởm dựa vào chuẩn là dược liệu chuẩn
bằng sắc ký lớp mỏng và hóa học Các nghiên cứu xác
định (định tính, định lượng) gentiopicrin trong dược
liệu thường được thực hiện bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao [3 ,5 ,8]
Định tính, định lượng gentiopicrỉn trong Kem
VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long
đởm - được thực hiện bằng phương pháp HPLC cho
phép tách hoạt chất ra khỏi nển mẫu phức tạp (tá
dược thuốc cream, thành phần khác trong dược liệu
Long đởm), định tính dựa vào thời gian lưu của pic
gentiopicrin trong sắc ký đổ của dung dịch chuẩn bị
từ mẫu chế phẩm và dung dịch chuẩn gentiopicrin;
định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại chuẩn
hóa một điểm dựa trên so sánh diện tích pic của
gentỉopicrỉn trong dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn,
nổng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu chuẩn và
lượng mẫu thử đem định lượng Quá trình tách, định
tính, định lượng hoạt chất được thực hiện đổng thời
trong cùng một phép phân tích nên phương pháp
được thực hiện nhanh, có tính kinh tế với độ chính
xác cao
Phương pháp định tính, định lượng gentỉopicrin
trong chế phẩm xây dựng được đơn giản chỉ cán sử
dụng thiết bị HPLC detector uv là loại detector phổ
biến trong các phòng phân tích Phương pháp có tính
chọn lọc cao (pic gentiopicrin tách khỏi các pic cản
trở, cân đối với thời gian lưu khoảng 8,10 phút), chính
xác (độ lặp lại trong ngày đều có RSD < 2,0% với n =
6 và độ chính xác khác ngày RSD < 3,0% với n = 12), khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp (khoảng nồng
độ 0,10 - 0,30 mg/ml với r > 0,99), độ đúng nằm trong khoảng cho phép 98,0 -102% theo qui định vể thẩm định phương pháp phân tích [7]
Xu hướng hiện nay là ứng dụng các phương pháp phân tích hiện đại - đặc biệt là phương pháp HPLC -
để tiêu chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu với chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm đánh giá đúng và góp phần kiểm soát chất lượng dược liệu Khi thực hiện nghiên cứu, trước tiên phải xác định được chất đánh dấu có hoạt tính sinh học để tiêu chuẩn hóa, mặt khác phải có chất chuẩn Nhưng khó khăn là chất chuẩn dược liệu rất hiếm và đắt tiền (đắt hơn 3 - 10 lẩn so với chất chuẩn có nguổn gốc tổng hợp) Do đó, để có thể nâng cao chất lượng kiểm nghiệm dược liệu và các chế phẩm có nguổn gốc từ dược liệu một trong những việc cắn chú trọng là thiết lập chất chuẩn có nguồn gốc dược liệu tạo điểu kiện cho các nhà sản xuất nhà phân tích có cơ hội sử dụng chuẩn với giá thành hạ và dễ dàng
Kết luận
Phương pháp HPLC định tính, định lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long đởm - đã xây dựng đơn giản, có tính chọn lọc cao, độ chính xác, độ đúng đảm bảo phù hợp với điểu kiện thiết bị của các phòng phân tích do
đó phương pháp có tính ứng dụng cao Kết quả này
là cơ sở để hoàn thiện Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm trong hổ sơ xin đăng ký sản phẩm nhằm sớm đưa thuốc ra thị trường phục vụ cộng đổng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2009), DƯỢC điển Việt Nam IV, tr 812-813
2 Lê Hữu Doanh (2009), Tinh hình viêm da cơ địa tại viện Da liễu Quốc gia từ 1995 đến 2005, Tạp chíYhọc thực hành, (12).
3 Chinese Pharmacopoeia Commission (2010), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, pp 204-205.
4 Christina M Gelbard, Adelaide A Hebert (2008) Patient Preference and Adherence, Vol.2, p 387-392.
5 Huang z, Lin s (2005), Determination gentiopicrin in biyanqingdugmnuloe by SPE-HPLC, Zhong Yoo Col, 28(6), pp 507-8.
6 Donald Y.M Leung, Mark Boguniewicz, Michael D Howell, Ichiro Nomura, and Qutayba A Hamid (2004), The Journal of Clinical
Investigation, Vol 113(5), pp 651-657.
7 ICH Q2(R2) Validation of analytical procedures (2005): Text and Methodolody Analytical Method Validation.
8 Yin H,ZhaoQ,Sun FM, AnT (2009),Gentiopicrin-producingendophyticfungusisolatedfromGenf/ữnơmứcrop/7y//a,P/73^omed/c/ne.,l 6(8),
pp 793 7
