Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bào chế Bàng l Công thức bào ché hệ F-HLC Pha dấu Chất diện hoạt thân dáu 3g Pha nước Chất diên hoat thân nước Nước cất đã lọc qua màng 0,2 Itn 1 0 0
Trang 1Nghiên cứu bào chế hệ nano lipìd chứa fluconazol
Đào Minh Huy, Nguyễn Thị Mai Anh, Ngô Thị Phương Liên
Trường Đại học Dược Hà Hội
SUM M ARY
F lu co n a z o le -lo a d e d n a n o s tru c tu re d lip id ca rriers (F-NLC) w ere p r e p a re d b y em u lsific a tio n -u ltra so n ic a tio n m e th o d a n d a s se s se d fo r
d iffe re n t ch a ra cte ristics The resu lts s h o w e d th a t th e F-N LC re p re se n t th e p a rtic le siz e o f a p p ro x im a te ly Ỉ9 0 nm , p o ly d isp e rsity in d e x (PDI) o f o 150, z e ta p o te n tia l o f - 3 0 m V D S C th e rm o g ra m su g g e sts th a t flu co n a z o le is so lu b iliz e d o r fin ely d isp e rse d in lip id m a trix In
v itro re le a se stu d y s h o w s th a t, F-N LC w ith 2 % liq u id lip id h a s lo w e st relea se rate.
Từ k hó a; h ệ n a n o lip id , fiu co n a z o l, b à o c h ế
Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, sự chú ý được dành
cho hệ nano lipid (NLC) do những ưu điểm như khả
năng kéo dài giải phóng, tăng thấm qua da và bảo
vệ dược chất Tuy nhiên hệ nano này có nhược điểm
là độ ổn định về kích thước tiểu phân không cao, có
hiện tượng trục xuất dược chất ra khỏi cốt lipid và
hiện tượng gel hóa trong quá trình bảo quản [2],-[4]
Fluconazol (FLZ) là dược chất chống nấm thuộc
nhóm azol Fluconazol có độ tan khoảng 8 - 1 0 mg/
ml, thường được bào chế dưới dạng gel thân nước
điểu trị nhiễm nấm ngoài da Nhằm mục đích kéo dài
giải phóng fluconazol, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu với mục tiêu: xây dựng công thức và đánh giá
một số đặc tính của hệ nano lipid rán chứa fluconazol
(F-NLC)
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên
cứu
Nguyên liệu và thiết bị
Nguyên vật liệu
Fluconazol, alcol cetylic xuất xứ Trung Quốc
(USP ,32); Tween 40 (Hàn Quốc); Tween 80, Tween
20, Cremophor EL, poloxamer, benzalkonium clorid,
natri lauryl Sulfat, natri deoxycholat, Span 80: theo
tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc hoặc tiêu chuẩn
nhà sản xuất Dinatri phosphat, acid phosphoric, methanol; đạt tiêu chuẩn cho HPLC
Thiết bị
Máy khuấy từ IKA-WERKE (Đức), máy siêu âm Labsonic (Đức), máy đo kích thước tiểu phân và thế zeta Zetasizer ZS90 (Malvern Instrument), màng thẩm tích MWCO 12-14kDa (Spectrumlab), máy phân tích nhiệt vi sai Mettler Toledo, nhớt kế quay Brookfield LVDV-E
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bào chế Bàng l Công thức bào ché hệ F-HLC
Pha dấu
Chất diện hoạt thân dáu
3g Pha nước Chất diên hoat thân nước
Nước cất đã lọc qua màng 0,2 (Itn 1 0 0 ml
Bào chế hệ nano lipid chứa fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa siêu âm theo công thức trong bảng 1
- Hòa tan fluconazol và chất diện hoạt (CDH) thân dẩu trong hỗn hợp alcol cetylic và acid oleic nóng
c h ả y ở 6 0 -7 0 “C
- Hòa tan CDH thân nước trong 100 ml nước, khuấy từ kết hợp đun nóng tới bằng nhiệt độ pha dầu
Trang 2- Phối hợp pha dầu vào pha nước, duy trì nhiệt độ
60 - 70“C, siêu âm với tẩn số 30 kHz, biên độ 100 |am,
15 phút, kết hợp khuấy từ liên tục
- Khuấy duy trì trong khi làm nguội nhũ tương vể
nhiệt độ phòng thu được hỗn dịch nano lipid chứa
fluconazol (F-NLC)
Phương pháp đánh giá đặc tính của hệ nano lipid
chứa fluconazol
- Kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số đa phân tán
(PDI) và thế zeta của hệ F-NLC được xác định sử dụng
thiết bị Zetasizer ZS90 Điểu kiện: nhiệt độ 25°C; hệ
số khúc xạ 1,5; mẫu được pha loãng 100 lẩn bằng
nước đã lọc qua màng 0,2 um
- Hàm lượng fluconazol trong hệ được định
lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) theo phương pháp của Gupta [3]
- Khả năng giải phóng in vitro của hệ F-NLC được
đánh giá qua màng thẩm tích (phân tử lượng cut
off 12-14 kDa) trên thiết bị thử giải phóng qua màng
Hanson Research Môi trường thử giải phóng: 7 ml
đệm phosphat pH 7,4 có chứa 2% Tween 80 1 ml
hỗn dịch được thêm vào ngăn cho, đậy kín Sau mỗi
khoảng thời gian nhất định, 1 ml mẫu được rút ra từ
ngăn nhận [2], Hàm lượng fluconazol được đánh giá
bằng phương pháp HPLC như đã nêu [3],
- Trước khi phân tích nhiệt vi sai (DSC), hỗn dịch
F-NLC được đông khô (Triad freeze-drier Labconco)
với các thông số: đông lạnh -60“C (6 giờ), làm khô sơ
cấp -15°c (20 giờ), làm khô thứ cấp 20°c (8 giờ) Điểu
kiện phân tích nhiệt: nhiệt độ quét 10 - 250“C, tốc độ
10“C/phút, môi trường khí Nitơ, khối lượng mẫu từ
5 - 20 mg
- Độ nhớt của mẫu được xác định bằng nhớt kế quay Tốc độ 100 v/p, lượng mẫu 100 ml Sử dụng kim đoS64và S61
Kết quả và bàn luận
Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới KTTP, thế zeta và độ ổn định của hệ F-NLC
Bào chế hệ F-NLC với khối lượng và thể tích trong bảng 1 và quy trình trong phương pháp bào chế với các CDH và hỗn hợp CDH khác nhau (Tween 20,40, 80; Tween 80-Span 80 1:1; Cremophor; Poloxamer; benzalkonium clorid; natri deoxy cholat; natri lauryl sulfat; Tween 20-Tween 80 1:1; Tween 20-Span 80 14:1; Poloxamer-Span 80 1:1; natri lauryl sulfat-Span
80 2:1) Tổng lượng CDH sửdụng là 3 g Kết quả được trình bày trong hình 1
Kết quả cho thấy hệ F-NLC bào chế với các chất diện hoạt không ion hóa đểu có thế zeta khoảng -30 mV Với các chất diện hoạt anion như natri deoxỵcholat và natri lauryl sulfat, thế zeta giảm sâu hơn (< -50 mV) do sự hấp phụ của các anion này lên
bề mặt Đối với CDH cationic benzalkonium clorid thế zeta mang giá trị +46,9 Tuy nhiên phân bố KTTP
có thêm một pic tại 1500 nm do những tiểu phân trong quá trình chuyển thế zeta từ âm sang dương (khi cation benzalkonium hấp phụ lên bề mặt) đâ kết tụ Tuy nhiên, không có mối tương quan giữa thế zeta và KTTP cũng như PDI Trong các CDH đã
sử dụng Tween 40, NaLs, POL-Span 1:1 vàNaLs:Span 1:1 cho hệ F-NLC có KTTP và PDI nằm trong giới hạn mong muốn (< 250; < 0,250 tương ứng) Chỉ có hệ
1
h 0.8 0.6
0.4Õ
Q.
0.2
0
-0.2
Chất diện hoạt
Hình l:KnPjhézetũ,vòPDIcủũhệF-NLCvớicácá&diệnhoạtÈácnhouJ20,40,80:ĩween20,40JO:S:Spũn80:CRE:ữemophor:POL:Poloxom:Blữ:benmlbnm
ừ> r ~ r
-òo
Trang 3F-NLC sử dụng Tween 40 cho thấy độ ổn định vật lý sau 1 tháng bảo quản tại điểu kiện phòng thí nghiệm, hệ F-NLC bào chế với các CDH còn lại đểu tách lớp hoặc kết tụ rõ rệt sau 1 tuần bảo quản
Ảnh hưởng của lượng lipid tới KTTP, độ nhớt và độ ổn định của hệ F-NLC
Tiến hành bào chế hệ F-NLC theo khối lượng và thể tích trong bảng 1, với tổng lượng alcol cetylic và acid oleic thay đổi từ 1 ,2 ,5 ,7 và 10 g Kết quả được trình bày trong bảng 2
Unq 1 lữTP vờ PDI cùa hệ F-NLC trong quá trình bâo quần
Lượng lipid (g)
1
10
Kết quả cho thấy với lượng CDH cố định là 3% (để đảm bảo các yêu cẩu vể giới hạn CDH), ICTTP tăng dẩn khi tăng lượng lipid trong hệ (bảng 2) Với lượng lipid 7 và 10 g, sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng hệ NLC
có thể chất đặc như gel (5200 cps) Sau 1 tháng bảo quản hệ F-NLC 5 g lipid chuyển sang thể chất gel (3000 cps) do hiện tượng chuyển dạng thù hình của alcol cetylic [4], Sự chuyển dạng thù hình của lipid từ dạng kém bền (a, ß') sang dạng bển hơn (ß) thường đi kèm với sự thay đổi hình dạng (từ tròn sang thuôn dài) Do đó, diện tích bể mặt các tiểu phân và lực liên kết sơ nước (Van der Waals) tăng lên, độ linh động của toàn hệ giảm xuống (gel hóa) [4]
Ảnh hường cùa tốc độ làm lạnh tới HTTP của hệ F-NLC
Bào chế các mẫu F-NLC theo khối lượng và thể tích trong bảng 1 với 2 loại CDH thân nước là Tween 40 và natrilautyl Sulfat với quỵ trình trong phương pháp bào chế Trước khi làm nguội nhũ tương D/N vể nhiệt độ phòng để thu được các tiểu phân F-NLC rắn, nhũ tương này được xác định KTTP trong điểu kiện duy trì nhiệt
độ 70°c Sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng nhanh (5 phút) và chậm (30 phút), mẫu NLC được xác định KTTP
và PDI Kết quả được trình bày trong bảng 3
IVICiU
Quá trình làm lạnh nhanh hay chậm sẽ ảnh hưởng tới trạng thái kết tinh của lipid trong hệ (tròn hoặc thuôn dài [4]) Kết quả cho thấy, với công thức sử dụng Tween 40 nếu quá trình làm lạnh thực hiện nhanh (5 phút) KTTP và PDI tảng không nhiều so với trước khi làm lạnh (TI cao hơn TO không nhiều); nhưng nếu quá trình thực hiện chậm (30 phút) thì KTTP và PDI tăng lên nhiều (T2 cao hơn TO nhiều) Với công thức sử dụng
natri lauryl Sulfat, KTTP và PDI tăng không đáng kể (NO, N I, N2 xấp xỉ nhau) Sự khác nhau này có thể giải thích do natri lauryl Sulfat có giá trị nồng độ tạo micel tới hạn (8,67x10'^IVI) cao hơn nhiều so với Tween 40 (0,0067x10'^M) [7] Nath lauryl Sulfat sẽ tổn tại nhiểu trong dung dịch dưới dạng tự do và khả năng bao phủ các bể mặt của hệ nano tốt hơn (khi alcol cetylic kết tinh do làm lạnh [4]) Do vậy, quá trình làm lạnh nhanh sẽ được áp dụng để bào chế hệ F-NLC
Trang 4Phán tích nhiệt vi sai
Đánh giá đặc tính nhiệt của fluconazol, alcol cetỵlic, hệ F-NLC 0 ,2 ,2 0 % lipid lỏng (acid oleic) Khối lượng mẫu phân tích nhiệt vi sai được đảm bảo sao cho lượng FLZ trong mỗi mẫu là gán tương đương nhau nhằm tránh hiện tượng pha loãng làm giảm cường độ pic của FLZ Kết quả được trình bày trong hình 2
Kinh ĩ Phổ phân tích nhiệt vi Sũi của các màu fiuconazol, olcol cetỵlic, F-NLC 0; 2; 20%.
Kết quả cho thấy đường nhiệt của maufluconazol
có một pic tỏa nhiệt mạnh tại 140°c tương ứng với
pic nóng chảy của FLZ, 1 pic tỏa nhiệt nhẹ tại 100°c
tương ứng với quá trình mất nước của dạng FLZ
monohydrat [6] Các pic này không xuất hiện trên
đường nhiệt của các mẫu F-NLC chứng tỏ sự hòa
tan/ phân tán của FLZ vào cốt lipid hoặc sự chuyển
dạng FLZ từ kết tinh sang vô định hình Trong các
mẫu F-NLC có thể do sự hiện diện của Tween 40,
acid o leic (có điểm ch ả y th ấp - th ể hiện ở cá c pic thu
nhiệt tại khoảng 10 - 20“C) và FLZ đã ngăn cản sự
hình thành các tinh thể hoàn chỉnh của alcol cetylic
do vậy pic thu nhiệt tương ứng với điểm chảy của
alcol cetylic (60°C) bị dịch chuyển (từ 60 xuống 50°C)
Khả nàng giải phóng invitro
Bào chế các mẫu F-NLC với tỷ lệ lipid lỏng (acid
oleic) 0 ,2 ,2 0 và 100% Các mẫu F-NLC có cùng hàm
lượng fluconazol KTTP của các mẫu khác nhau
không nhiều (nằm trong khoảng 150 - 200 nm) Tiến
hành thử giải phóng theo phương pháp ghi trong
phương pháp đánh giá đặc tính của hệ nano lipid
chứa fluconazol Kết quả được trình bày trong hình 3
Kết quả cho thấy lượng FLZ trong mẫu dung dịch
thấm qua màng thẩm tích là lớn nhất (xấp xỉ 80%
Thời gian (giờ)
Hình 3 Phán trăm fluconozol giỏi phóng qua mòng thổĩĩì tích DD: dung dịch fliiconazol, HLC 0; 2; 20 vờ 100 hệ mong lipid có cấu trúc nom V Ở ÌO ; ì ; 20 vờ ĩ00% lipid lỏng
sau 24 giờ) Các mẫu F-NLC đểu cho thấy khả năng kiểm soát giải phóng FLZ ở các mức độ khác nhau Khi lượng lipid lỏng giảm dần từ 100; 20 và 2% khả năng kiểm soát giải phóng FLZ của F-NLC tăng dẩn (lượng FLZ giải phóng sau 24 giờ giảm dẩn: 45; 30
và 25% tương ứng) Tuy nhiên với hệ F-NLC 0% lipid lỏng, có thể do hiện tượng trục xuất thuốc [2], FLZ không phân bố nhiều vào lõi lipid mà nằm ngoài pha nước Do vậy, tốc độ giải phóng FLZ từ hệ F-NLC 0%
và 100% là tương đương
Trang 54
Kết luận alcol cetylic tốt hơn các chất diện hoạt khác Hệ có thể
được hấp tiệt khuẩn mà không ảnh hưởng tới KTTP Trong nghiên cứu này, hệ NLC chứa fluconazol đã và PDI Tỷ lệ nồng độ lipid rắn trong hệ và lượng CDH được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa - siêu âm thêm vào cẩn nhỏ hơn 5:3 để đảm bảo hiện tượng gel kết hợp khuấy từ và có độ ổn định vể đặc tính hóa hóa không xuất hiện NLC bào chế với 2% lipid lỏng
lý trong 1 tháng Những kết quả thu được gợi ý rằng có khả năng kiểm soát giải phóng tốt hơn dung dịch Tween 40 có khả năng ổn định hệ NLC bào chế với fluconazol cũng như NLC với 0; 20 và 100% lipid lỏng
TÀI LIỆU TH AM KH ẢO
1 Bộ Y tế (2009), D ược th ư Q uốc gia, NXB Y học, Hà Nội, pp 464 - 467.
2 Das Surajit (2012), "Are nanostructured lipid carriers (NLCs) b e tterth a n solid lipid n anop articles (SLNs): D evelopm en t, ch aracterizations
and co m p arative evaluations o f clotrim azole-loaded SLN s and NLCs?", European Jo u rn a l o f Pharm aceutical Sciences, 47(1), pp 130 -1 5 1
3 G upta M (2012), "D evelopm en t, ch aracterization and in vivo assessm ent o f effective lipidic nanop articles fo r derm al d elivery of flu con azo le ag ainst cu taneo us candidiasis", Chem istry a n d Physics o f lipids, 165 (4), pp 454 - 461.
4 Helgason T (2009), "Effect o f su rfactan t surface co verag e on form ation o f solid lipid n anop articles (S L N )", Jo u rn a l o f Colloid an d Interface Sciences, 334(1), pp 75 - 81.
5 M ehn ert w (2012), "Solid lipid n anop article: Prod uction, characterization and ap plications", A d va n ce Drug Delivery Review s, 64, pp
83-101.
6 M ino R Caira (2004), "Preparation and crystal characterization o f a p o lym orp h, a m onohyd rate, and an ethyl acetate solvate o f the
an tifu ng al f\uconazo\e", Jo u rn a l o f Pharm aceutical Science, 93(3), pp 601 - 511
7 Pasupati M., M ysels K J (1971), "Critical m icelle con centration o f aqueous su rfactan t system s", United Stated D ep artm ent o f
