Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat 1

NGHIÊN c ứ ư BÀO CHÉ TIỂU PHÂN NANO CHỨA ARTESUNATNguyễn Hanh Thủy', Trần Tuấn Hiệp^ HDKH; Nguyễn Ngọc Chiến’, Chui Soon Yong^ ' Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà

NGHIÊN c ứ ư BÀO CHÉ TIỂU PHÂN NANO CHỨA ARTESUNAT

Nguyễn Hanh Thủy', Trần Tuấn Hiệp^ HDKH; Nguyễn Ngọc Chiến’, Chui Soon Yong^

' Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội

^Phòng thỉ nghiệm bào chế, Khoa Dược, Đại học Yeungnam, Hàn Quốc

Từ khóa: artesunat, PLGA, tiểu phân nano, tác dụng chông ung thư

Tóm tẳt

Tiểu phân nano poly-d,l-lactide-co-glycolide (PLGA) chứa artesunat (ART) được bào chế bằng phương pháp bay hơi dung môi từ nhũ tương dần/nước (0/W) với dỉcloromethan là dung môi pha dầu Tỷ lệ giữa 2 pha dầu nước, nồng

độ PLGA trong pha dầu cũng như loại và tỷ lệ chất nhũ hóa có ảnh hưởng khá lớn tới kích thước tiểu phân thu được Lượng thuốc đưa vào hệ được khảo sát từ 2,5-10 mg và cho khả năng nạp thuốc cao nhất khi sử dụng Tween 80 1,5% (kl/tt) Hệ tiểu phân thu được có kích thước nhỏ hơn 170 nm và khả năng giải phóng kẻo dài tới trên 24 giờ, ổn định khi được đông khô với manitol ở tỷ lệ 5% (kl/tt) và ban đầu cho thấy có tác dụng khảng lại các dòng tê bào ung thư trên

mô hình in vitro.

Đặt vấn đề

Tác dụng kháng sốt rét của artesunat (ART) và các dẫn chất của artemisinin đã được các nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh từ lâu [1, 2] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy tác dụng chống ung thư của ART trên nhiều dòng tế bào như tế bào biểu mô, tế bào phổi nhỏ, thận, bạch cầu, [2], Cơ chế tác dụng chống ung thư của ART vẫn đang được nghiên cứu với nhiều giả thuyết được đưa ra như ngăn cản sự tăng sinh của nội mạc mạch máu, giảm sự phá hủy về DNA hay ức chế sự xấm lấn hay di căn khổi u [2, 8], Tuy nhiên thời gian bán thải ngắn của ART cùng với tính kém ổn định nên việc gắn ART vào các chất mang để kéo dài sự giải phóng và độ ổn định của dược chất vẫn là cần thiết [1, 3], Tá dược có khả năng phân hủy sinh học hiện nay

được sử dụng phổ biến như các chất mang cho các hệ đưa thuốc vì có khả năng

tăng sinh khả dụng, ít độc tính, hiệu suất bao gói và kiểm soát giải phóng dược chất tốt PLGA là một polyme có các đặc tính này và được ứng dụng khá phổ biến trên thế giới cho bào chế các dạng tiểu phân nano [4] Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là phát triển hệ đưa thuốc cho ART có các đặc tính hóa lý phù họp và tăng hiệu quả chống ung thư của ART Công thức thu được sẽ được đánh giá ảnh hưỏmg của các yếu tố tới kích thước tiểu phân, phân bố kích thước, khả

năng nạp thuốc, bề mặt tiểu phân, đặc tính hóa lý và sự giải phóng in vitro cũng như nghiên cứu độc tính in vitro trên các dòng tế bào ung thư khác nhau.

Nguyên liệu và phưotig pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

Artesunate (ART) từ Sao Kim Pharma (Hà Nội, Việt Nam) PLGA (Lakeshore 5050 DLG 2A) tò Enovik, Germany Natri lauryl sulfat (SLS), polysorbat 80 (Tween 80) từ Duksan Chemical Co (Ansan, Korea) Polyvinyl alcol (PVA), sucrose, trehalose và manitol của Sigma-Aldrich (St Louis, USA) Poloxamer 188 từ BASF Chemical Co (Ludwigshafen, Germany) Methanol, ethanol, acetonitril (ACN), dicloromethan (DCM) đạt tiêu chuẩn HPLC Các nguyên liệu khác đạt tinh khiết hóa học

Phương pháp bào chế tiểu phân nano chửa artesunat

Tiểu phân nano PLGA chứa ART được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước (0/W) [5] Polyme và ART được hòa tan trong 5ml dicloromethan (DCM), sau đó nhỏ vào pha nước có chứa chất nhũ hóa Nhũ tương OAV được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm (Vibracell VCX130; Sonics, USA) ở 100W trong 5 phút rồi khuấy trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi, ly tâm, rửa với nước để loại chất nhũ hóa rồi đông khô thu sản phẩm

Đánh giá đặc tính hóa lý của hệ tiểu phân nano

Kích thước tiểu phân được xác định bằng phương pháp đo tán xạ ánh sáng (DLS) sử dụng thiết bị Zetasizer Nano 90 (Malvem Instruments Ltd., Worcestershire, UK) Tiểu phân được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, H7600, Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện thế 100 kv

Hiệu suất vi nang hỏa và khả năng nạp thuốc

Định lượng hàm lượng dược chất tự do sử dụng ống ly tâm có màng

10000 Da (MWCO 10000, Millipore, USA) [3, 7], Điều kiện sắc ký gồm cột C18 Inertsil ODS (150x4,6mm, 0,5^m, GL Sciences Inc., Japan), pha động ACN - đệm phosphat pH 3,0 (55-45), bước sóng 216 nm, thể tích tiêm mẫu 50 Ịil, tốc độ dòng Iml/phút sử dụng hệ thống HPLC Hitachi, Nhật Bản Hiệu suất vi nang hóa (EE) và khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức;

Tông ART-ART tưdo „ _

Khôi iưọngtièuphảrnano ART ^ ^

Thử khả năng giải phỏng thuốc từ tiểu phân nano

Thử nghiệm giải phóng dược chất được tiến hành trong túi thẩm tích (kích thước màng lOOOODa - Membrane Cel, Chicago, IL, USA) chứa khoảng 3 mg dược chất, phân tán 3 ml đệm phosphat pH 6,8 [1, 3], Túi thầm tích được đặt trong ống chứa 30 ml dung dịch đệm phosphate pH 6,8 ố n g được giữ trong bể

điều nhiệt (HST-205 sw, Hambaek ST Co., Hàn Quốc) ở 37°c, lắc với tần suất

50 vòng/phút Hút 2 ml dịch và bổ sung môi trường tại từng thời điểm và định lượng hàm lưọng dược chất giải phóng

Thử độc tính in vitro của tiểu phân nano PLGA chứa ART

Thử độc tính tế bào SCC7 (tế bào ung thư biểu mô), A549 (tế bào ung thư phổi người) và MCF-7 (tể bào ung thư vú ở người) (lấy từ ngân hàng tế bào Hàn Quốc và được nuôi trong môi trưòng RPMI-1640 (HyClone, USA) bổ sung huyết thanh bò 10% (FBS) và 1% streptomycin, 5% CO2 ở 37°C) bằng phương pháp MTT: 100 hỗn dịch tế bào ở nồng độ IxlO'* tế bào/ml được nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường 96 giếng và ủ trong 24 giờ Mầu tiểu phân PLGA trống, ART tự do và tiểu phân ART-PLGA (nồng độ từ 10 I^g/ml tới 100 |ig/ml dược chất) được thêm vào các giếng và ủ trong 24 giờ Môi trường cùng với mẫu được loại bỏ và dung dịch MTT (100 i-il dung dịch MTT 1,25 mg/ml trong đệm RPMI) được thêm vào và ủ trong 4 giờ ở 37°c Loại bỏ môi trường MTT và thêm 100 |a,l dimethy sulfoxyd (DMSO), ủ trong 15 phút và đo độ hấp thụ ờ bước sóng 570 sử dụng thiết bị đọc đĩa micro (Multiskan EX, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) [5] Tỷ lệ tế bào hoạt động được tính theo công thức:

Tv lệ TB hoat động = ODs7o(mấu)-ODs7o(trăng;i

ODs7o(chứng)-OD57(j(trắng)xlOO% (3)

Kết quả

Kết quả bào chế tiểu phân nano PLGA

Ảnh hưỏTig của tỷ lệ pha dầu (DCM) và pha nước (dung dịch PVA 0,1%) được khảo sát từ 1 ;5 đến 1 ;20 Kết quả trong hình 1 cho thấy tiểu phần PLGA tạo thành trong khoảng từ 220-270 nm Khi tỷ lệ pha nước tăng lên làm giảm kích

0.4 300 Ị

0.3 I Ị -250

0.2 gi I I200J

-4)

ị •§ 150

100

1

57-ĩ-r: 0 4

0.3

0 2 Q

0,0

1 1.5

N ồ n g đ ộ P L G A (k l/tt)

Hình 1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/nước Hình 2 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA tới

tới kích thước tiểu phân kích thước tiểu phân

Tỷ lệ polyme trong pha nội cũng ảnh hưởng khá lớn tới sự hình thành của các tiểu phân nano Hình 2 cho thấy kích thước tiểu phân tăng lên khi tăng nồng

độ polyme từ 0,5 đển 2% (Id/tt) ở tỷ lệ PLGA cao (>1%) (MW 17000-18000 Da), kích thước tiểu phân cũng như chỉ số PDI thu được tăng lên Tuy nhiên, khi

tỷ lệ nước quá cao hay nồng độ polyme quá thấp, mật độ tiểu phân thấp, Idió để thu lấy sản phẩm cho các nghiên cứu tiếp theo Do vậy, tỷ lệ dầu - nước và nồng

độ PLGA được lựa chọn lần lượt là 1; 10 và 1% cho các nghiên cứu tiếp theo

Ảnh hưởng của chất diện hoạt: tiểu phân nhỏ nhất là 208,0 ± 2,1 Inm; 72,69 ± 0,74nm và 166,4 ± 3,44 nm khi sử dụng dung dịch pha nước lần lượt là PVA 0,25% (Hình 3A), SLS 0,75% (Hình 3B) va Tween 80 1,5% (Hình 3C)

íĩi^KTTP

r 0.1

0.25 0.5 0 75 1

N ồ n g đ ộ PV A (k l/tt) 0 25 N ồ n g đ ộ S L S (k i/tt)0 ,5 0 75 1

■ 4

0.5 1 1.5

N ồ n g đ ộ T w e e n 80 (k»/tt) í,

Hình 3 Ảnh hưởng của chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân,

trong đó (A) PVA; (B) SLS; (C) Tween 80 Bảng 1 Ảnh hưởng của tỷ lệ thuốc đưa vào hệ nano tới đặc tính tiểu phân Chất

diện hoạt

Lượng ART (mg)

Kích thước

Hiệu suất

vi nang hóa

EE (%)

Khả năng nạp thuốc

LC (%)

-Tween 80 2,5 162,4±1,2 0,191±0,015 83,40±0,50 8,12±0,34 (1,5%) 5 167,2±2,8 0,183±0,040 78,57±0,46 13,58±0,41

10 177,7±1,7 0,143±0,025 77,52±1,03 23,67±0,61

-SLS 2,5 11,1±Q,\ 0,118±0,012 77,76±1,57 8,06±0,92 (0,25%) 5 78,5±0,5 0,177±0,035 60,5 5± 1,24 12,32±0,53

10 82,7±0,5 0J84±0,009 59,55±5,28 19,43±1,72

o 208,0±3,4 0,201±0,010

PVA 2,5 289,6±4,6 0,214±0,015 42,36±0,76 4,34±0,23 (0,25%) 5 295,9±1,2 0,237±0,008 40,32±1,96 7,46±0,66

10 305,5±4,3 0,209±0,037 41,34±1,66 14,19±0,56

Ó ty le cúa tímg chát dién hoat có kích thirác tiéu phán nhó nhát, tién hánh phoi hgp dirgc chát tír 2,5-10 mg (PLGA la 25mg/2,5ml DCM) dé dánh giá hieu suát vi nang hóa va khá náng nap thuóc cúa he (báng 1) Khi táng lirgng ART, kích thiróc tiéu phán déu táng song táng nhiéu nhát khi düng PVA la chát nhü hóa Các cóng thúc sú dung PVA cüng cho két quá vi nang hóa tháp hcm dáng ké

so vói khi sú dung Tween hay SLS He có khá náng bao gói tót han Ichi lugng ART dua váo tháp, tot nhát vói cóng thúc düng Tween 80 khi phói hop 2,5 mg ART (lén tói > 80%) Tuy nhién, dé có tác dung chong ung thu, ART dirgc cho la cán düng vói liéu khá lón [1, 9] Vi vay, lugng ART dua váo he dugc chgn la 10 / 1 1 ^ W A 1 A 1 ^ 1 ^ ' 1 r v ^ O/ A > O T o \

♦

%•

120 ^

_ 100 -i

I “ i

¿ 60 ■

o

-É

40 I

<a>-20

O

-f-tú tiéu phán nano PLGA PLGA chúa ART sú dung Tween 80

(A ) A 5 4 9 - 2 4 h

1

- J i - l

10

■ P LG A ttóng

a ART t i j do OART-PLGA

25 50 N&ng do (pg/mL)

.,

120

100

e ‘

I SO IV

f 60 j

I I

" 20 J

O

4-( B ) S C C - 7 - 2 4 h

Ití]

« P L G A tró n

a ART t y de

O AR T -P LG /

25 50 N6ng d 9 (pg/mL)

20

O

■ P L G A t r ô n g

B A R T tụ- d o

O A R T - P L G A

N ồ n g d ô ( p g /m L )

Hình 6 Tỷ lệ tế bào hoạt động ở các dòng tế bào,

trong đó (A) A549; (B) SCC-7; (C) MCF-7

Khả năng giải phóng dirợc chất in vitro

Đánh giá khả năng giải phóng in vitro của 2 công thức sử dụng pha nước

Tween 80 1,5% và SLS 0,25% được thể hiện trong hình 4 cho thấy tiểu phân ART-PLGA có sự bùng nổ giải phóng trong 10 giờ đầu và đạt tới 80% trong trường hợp, sử dụng SLS và 60% với Tween 80 Điều này có thể do sự liên kết lỏng lẻo giữa phân tử dược chất và polyme ở bề mặt tiểu phân cũng như do tỷ lệ dược chất khá cao so với polyme Ngoài ra, kích thước tiểu phân nhỏ hơn cũng

có thể khiến ART giải phóng từ hệ SLS nhanh hơn so với hệ Tween 80 Với mục tiêu duy trì được nồng độ thuốc trong máu lâu hom cũng như giảm độc tính do chất diện hoạt có thể gây ra, Tween 80 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo Hình ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua TEM có thấy tiểu phân có cấu trúc khá đồng nhất, cầu, với kích thước khoảng 170 nm (hình 5)

Kết quả thử độc tính tế bào in vitro

Tỷ lệ tế bào hoạt động ở dòng tế bào SCC7, A549 và MCF-7 sau 24 giờ ở các nồng độ ART từ 10-100 )ag/ml được thể hiện trong hình 6 cho thấy ở tất cả các dòng tế bào, ART tự do và tiểu phân ART-PLGA đều có hoạt tính mạnh đặc biệt với dòng A549 và MCF-7 (hình 6A và 6B) trong khi tiểu phân trống duy trì

tỷ lệ tế bào hoạt động tới trên 80% sau 24 giờ cho thấy tiểu phân PLGA trống là

ít độc tính ở các nồng độ khảo sát Tiểu phân ART-PLGA có khả năng ức chế tế bào tốt hcm dạng ART tự do ở tất cả các dòng tế bào ung thư

Độ ổn định của tiểu phân ART-PLGA

Tiểu phân PLGA chứa ART được

làm khô bằng đông khô sử dụng

các chất bảo vệ là manitol, sucrose

hoặc trehalose Kết quả trong hình

7 cho thấy sự thay đổi về kích

thước của tiểu phân sau khi đông

kliô tăng nhẹ khi sử dụng manitol

hay sucrose ừong khi với ứehalose

kích thước tàng đáng kể

Banđẳu Man.5% Man.10% Suo,5% Suc.10% Tre,5% Trs.10%

Hình 7 Ảnh hưỏfng của chất mang tới kích

thước tiểu phân sau Iđii đông khô

Bảng 2 Độ ổn định của tiểu phân nano ART-PLGA trong 1 tháng bảo quản

Nhiệt độ phòug

-KTTP(nm) Hàm luựng (%) KTTP (nm) Hàm lượng (%)

Hỗn dịch 162,77 ±3,83 95,81 ± 2,65 164,89 ± 1,99 82,60 ± 3,62 Bột đông khô 165,90 ±3,28 99,34 ± 1,65 163,61 ± 3,66 97,12 ±1,36

Kích thước tiêu phân gân như không thay đôi trong quá trình bảo quản ở

cả 2 điều kiện sau 1 tháng theo dõi (bảng 2) Tuy nhiên hàm lượng dược chất ở mẫu hỗn dịch giảm đáng kể ở điều kiện phòng Tuy nhiên, bột đông Ichô vẫn cho kết quả khá ổn định với hàm lượng đạt trên 97%

Bàn luận

Độ nhớt và sức căng bề mặt phân cách pha ảnh hưởng lớn kích thước tiểu phân và phụ thuộc vào loại và tỷ lệ chất diện hoạt sử dụng [4], Do đó, khi tăng độ nhót của 2 pha (tăng nồng độ polyme, ữiay đổi loại chất diện hoạt) hoặc thay đổi

tỷ lệ giữa 2 pha dầu - nước sẽ ảnh hưởng khá lớn tới kích thước và phân bố của tiểu phân Với SLS và Tween 80 khi sử dụng là chất nhũ hóa cho tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 200nm đem lại nhiều im điểm khi đi qua hàng rào mạch máu

- mô ung thư Tuy nhiên, tiểu phân của hệ sử dụng SLS có khả năng nạp thuốc cũng như khả năng kiểm soát giải phóng dược chất kém hơn so với hệ sử dụng Tween 80 Tiểu phân sau khi đông khô có thể ổn định hcm cả về vật lý lẫn hóa học so với dạng hỗn dịch ban đầu

Đánh giá độc tính tế bào in vitro cho thấy tiểu phân PLGA trống Iđiá an toàn, trong Iđii ART tự do và tiểu phân ART-PLGA đều có tác dụng khá mạnh ứên các dòng tế bào sử dụng Tác dụng trên dòng ung thư của dạng tiểu phân ART-PLGA mạnh hơn ở dạng thuốc tự do nhưng cần liều khá cao để cho tác dụng Điều này phù họp với một số nghiên cứu về liều dùng cùa ART trên các

mô hình ung thư có thể lên tới 100-240 mg/kg thể trọng [1, 7, 8],

Kết luận

Tiểu phân nano PLGA chứa ART được bào chế theo phưong pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tưong dầu/nước Tiểu phân có hình cầu đều, phân bố kích thước hẹp, khả năng nạp thuốc cao, kéo dài giải phóng ART tới 24 giờ, ổn định sau khi đông khô và có hoạt tính tốt trên tất cả các dòng tế bào Như vậy, tiểu phân nano PLGA có thể là hệ phân phối thuốc ART các nghiên cứu xa hơn trên các mô hình

chống ung thư in vivo.

Tài liệu tham khảo

1. Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N Artesunate-loaded chitosan/lecithin

nanoparticles; Preparation, characterization, and in vivo studies Drug Development and Industrial Pharmacy, 38, 1538-1546 (2012).

2 Efferth, T Willmar Schwabe Award 2006; antiplasmodial and antitumor activity of artemisinin-from bench to bedside Planta medica, 73, 299-309 (2007)

3 Gabriels, M., and Plaizier-Vercammen, J Physical and chemical evaluation of

liposomes, containing artesunate Journal o f pharmaceutical and biomedical analysis, 31, 655-667 (2003).

4 Kumari, A., Yadav, s K., and Yadav, s c Biodegradable polymeric

nanoparticles based drug delivery systems Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75, 1-18 (2010).

5 Pradhan, R., Poudel, B K., Ramasamy, T., Choi, H.-G., Yong, c s., and Kim, J o Docetaxel-Loaded Polylactic Acid-Co-Glycolic Acid Nanoparticles;

Formulation, Physicochemical Characterization and Cytotoxicity Studies

Journal o f Nanoscience and Nanotechnology, 13, 5948-5956 (2013).

6 Woerdenbag, H J., Moskal, T A., Pras, N., Malingré, T M., El-Feraly, F s.,

Kampinga, H H., and Konings, A w Cytotoxicity of artemisinin-related

endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells Journal o f natural products, 56,

849-856 (1993)

7 Xiao, X.-C., and Hong, Z.-G Firstborn microcrystallization method to prepare nanocapsules containing artesunate International journal o f nanomedicine, 5, 483 (2010).

8 Xu, Q., Li, z.-x., Peng, H.-Q., Sun, Z.-W., Cheng, R.-L., Ye, Z.-M., and Li, W.-X Artesunate inhibits growth and induces apoptosis in human osteosarcoma

HOS cell line in vitro and in vivo Journal o f Zhejiang University SCIENCE B,

12, 247-255 (2011)