Nguyễn Thùy Dương' ' bộ môn Dược lực, ^Sinh viên K62, K63 ^Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương ''B ộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội Từ khóa: acid p-coumaric, carvci ox
Trang 1NGHBÊN CỨU TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THựC NG H ỆM TRÊN SỎI TIÉT NIỆU
VÀ PHÂN LẬP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CỦA Ý DĨ
{Coix lachryma - jobì L.)
Pham Đức Vinh* Trần Thúy Ngần^, Đỗ Thị Yấn^
Đào Hồng Hạnh^, Nguyễn Thị Đông^ HDKH: TS Nguyễn Quỳnh Chi'*, TS Nguyễn Thùy Dương'
' bộ môn Dược lực, ^Sinh viên K62, K63
^Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương ''B ộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: acid p-coumaric, carvci oxalat, Coix lachryma -jobỉ L„ sỏi tiết niệu, Ỷ dĩ Tóm tắt
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat in vitro và in vivo của dịch chiết nước toàn phần và phân lập hoạt chất có tác dụng của thân Ỷ d ĩ (Coix lachryma-jobi L.) Dịch chiết nước Ỷ d ĩ có tác dụng ức chế phụ thuộc nồng độ đổi với sự hình thành sỏi canxi oxalat, đồng thời làm tăng tỷ lệ COD/COM trên mô hĩnh ỉn vitro sử dụng đĩa 96 giếng Trên chuột cống trắng giống đực được gây sỏi tiết niệu bằng cách bố sung ethylen glycol 0,75% trong nước uổng hàng ngày, dịch chiết nước Ỷ d ĩ 2,52 g/kg thể hiện tác dụng làm giảm sổ lượng sỏi lắng đọng tại thận so với lô chứng bệnh sau 28 ngày điều trị Từ phãn đoạn cỏ tác dụng ức chế sỏi mạnh nhất, phân đoạn ethyl acetat, đã phân lập được acid p-coumaric, thể hiện tác dụng ức chế sỏi in
vitro mạnh hơn so với natri citrat với giá trị ICịo là 2,35 mM Các kêt quả này tạo
cơ sở cho việc phát triển Ỷ d ĩ thành dược liệu tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu
Đặt vấn đề
Sỏi tiết niệu là một bệnh lý khá phổ biến, ảnh hưởng đến khoảng 12% dân
số toàn cầu Cùng với sự phát triển của y học hiện đại, những kỹ thuật ngoại khoa mới đã được áp dụng trong điều trị để loại bỏ sỏi khỏi đường tiết niệu, tuy nhiên những phương pháp này có thể gây tai biến và tỷ lệ tái phát cao [3], Thêm vào
đó, hiện nay vẫn chưa có một thuốc hóa dược nào thực sự hiệu quả để điều trị sỏi tiết niệu, đặc biệt là trong dự phòng tái phát sỏi Vì vậy, xu hướng sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu đang ngày càng được
quan tâm Ý dĩ {Coix ỉachryma-jobi L.) là loài cây bản địa ở Việt Nam được sử
dụng từ lâu trong y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ cơ thể, lợi tiểu, ừị phù thũng, tê thấp, tiểu tiện ra sỏi [1] nhưng chưa được nghiên cứu theo định hướng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với hai mục
Trang 2toàn phần thân Ý dĩ; (2) Phân lập hoạt chất có tác dụng ức chế sỏi tiết niệu từ thân Ý dĩ
Nguyen liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Dược liệu
Thân cây ý dĩ, được thu hái tại Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011 Mau dược liệu đã được Bùi Hồng Quang - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật
định tên khoa học là Coix lachryma-Jobi L., họ lúa (Poaceae) Dịch chiết toàn
phần thu được bằng phương pháp sắc với dung môi là nước, cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 Các phân đoạn dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetat
Hóa chất và động vật
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích
Chuột cống trắng giống đực, chủng Wistar, khối lưọng 180 ± 20 g do Học viện
Quân Y cung cấp, được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn
Phương pháp nghiên cứu
Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của thân Ỷ dĩ
Đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro của dịch
chiết toàn phần Ý dĩ trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ) theo phưoTig pháp được mô tả bởi Gohel và Wong [4], Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm có: các giếng chứng, các giếng natri citrat và các giếng thử được cho tương ứng 160 ỊXÌ
đung dịch nước tiểu nhân tạo, 2 0 ịiì dung môi pha mẫu hoặc natri citrat hoặc
dung dịch thử Tinh thể canxi oxalat được tạo thành khi thêm 20 /xl dung dịch acid oxalic 0,04 N vào tất cả các giếng Đo mật độ quang (OD) trên hệ thống máy ELISA ở bước sóng 620 nm tại thời điểm 30 phút sau phản ứng Tính tỷ lệ
ức chế (%ƯC) và quan sát hình ảnh tinh thể trong các giếng dưới kính hiển vi soi ngược vào thời điểm kết thúc thí nghiệm
Đánh giá tác dụng ức chế sỏi canxi oxaỉat in vivo của thân Ỷ d ĩ
Đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ ở mức liều 2,52 g/kg trên chuột cống trắng với mô hình gây sỏi thực nghiệm được mô tả bởi Karadi VR và cộng sự [6] Tác nhân gây sỏi là ethyl en glycol, bổ sung trong nước uống hàng ngày của chuột ở nồng độ 0,75% trong vòng 28 ngày Quan sát tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực, mồi tiêu bản được quan sát trên 10 vi trường khác nhau (x40), tính số đám sỏi trung bình/vi trưÒTig
Phân lập hoạt chất có tác dụng
Trang 3Đánh giá khả năng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat của các phân đoạn dịch chiết Ý dĩ trên đĩa 96 giếng Phân đoạn có tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat mạnh nhất được lựa chọn để phân lập chất, sử dụng phương pháp sắc ký cột và phương pháp kết tinh lại cấu ừúc hóa học của chất phân lập được xác định bằng phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat của chất đã phân lập được đánh
giá bằng phương pháp in vitro.
X ử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0 Tiến hành kiểm chuẩn trước khi xử lý số liệu theo các phương pháp thống kê y học Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Kết quả
Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần Ý dĩ
Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ (YD) được đánh giá tác dụng ức chế tinh
thể canxi oxalat in vitro ở các mức độ pha loãng khác nhau: 1/1, 1/4, 1/16, 1/64
Bảng 3.1 Tác dụng ức chế hình thành túứi thể canxi oxalat của dịch chiết nước Ý dĩ
Chú-ng
(n=8)
Citrat lOmM (n=8)
Y D l/6 4 (n=8)
Y D l/1 6 (n=8)
Y D l/4 (n=8)
Y D l/1 (n=8)
* p < 0,05 so với chứng; ** p < 0,01 so với chứng Dịch chiết toàn phần Ý dĩ bắt đầu thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat ở độ pha loãng >1/64, tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ Tác dụng ức chế của dịch chiết Ý dĩ tương tự chứng dương natri ciừat nhưng yếu hon so với natri citrat ở tất cả các nồng độ thử Khi có mặt dịch chiết
Ý dĩ, các tinh thể canxi oxalat có xu hướng chuyển tìr dạng COM sang dạng COD So vói các giếng có mặt naừi citrat, mật độ sỏi tại các giếng có mặt dịch chiết Ý dĩ dày hơn nhưng tỷ lệ COD/COM cao hơn và kích thước tinh thể COD cũng nhỏ hơn
' •• ù'/- ^
Hình 1 Hình ảnh tinh thể canxi oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất
Trang 4Tác dụng ức chế sỏi canxi oxalat in vỉvo của dịch ch iấ toàn phần Ỷ dĩ
Sau 4 tuần sử dụng hóa chất gây sỏi, sự hình thành sỏi tại thận được nhận thấy rõ ở hầu hết các chuột thuộc lô chứng bệnh so với lô chứng thưòng Dịch chiết nước Ý dĩ ở mửc liều 2,52 g/kg thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi thận, làm giảm rõ rệt sổ lượng các đám sỏi lắng đọng tại thận so với lô chứng bệnh Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa số lượng sỏi của lô Ý dĩ và
lô chứng dương natri citrat
C liứ ng
tb ư ờ n ạ
C h ứ n g bệnh
N n tn c iu a t 2.52g.1vg
Ýílĩ
2.52 g/k g
Hình 2 Số lượng các đám sỏi trên tiêu bản mô bệnh học thận của các lô (n=8)
* p < 0 ,0 1 so với lô chứng thường, **p < 0 ,0 1 so với lô chứng bệnh Trên hình ảnh tiêu bản mô thận, không quan sát thấy sự lắng đọng sỏi tại thận của lô chứng thường Lô chứng bệnh có nhiều đáni sỏi kết tập cả ở vùng nhu
mô (bao gồm vùng vỏ và vùng tủy) và vùng nhú ứiận Lô chứng dương natri citrat và lô ý dĩ chỉ có một vài đám sỏi nhỏ nằm rải rác ở các vùng này
;
ị ■ ' - - ' ¿ s
k " - ’
1
Hình 3, Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưód kính hiển vi phân cực (H&E, X40)
a: chứng thưòng, b: chứng bệnh, c: chứng dưomg, d: Ý dĩ;
1: vùng nhu mô, 2: vùng nhú Kết quả phân lập hoạt chất
Trang 5Lựa chọn phân đoạn ức chế tinh thể canxi oxalat mạnh nhất
Ba phân đoạn (PĐ) của dịch chiết Ý dĩ là n-hexan, chloroform, ethyl acetat được đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat ở nồng
độ 0 ,1 mg/ml trong cồn tuyệt đối để tìm phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh nhất
Bảng 2 Tác dụng ức chế tinh ứiể canxi oxalat của các phân đoạn dịch chiết Ý dĩ
Chứng (n=8)
PĐ n-hexan (n=8)
PĐ chloroform (n=8)
PĐ ethyl acetat
(n=8)
%ưc 12,8% 10,3% 25,6%
* p < 0,05 so với chứng Trong ba phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, chỉ có phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat rõ rệt, với tỷ lệ ức chế tại thời điểm 30 phút là 25,6% Do đó, phân đoạn ethyl acetat được lựa chọn để phân lập chất
Phân lập chất từ phân đoạn ethyl acetat
Sau khi chiết xuất phân đoạn từ 1 kg dược liệu khô ban đầu thu được 2,7 g cắn ethyl acetat, đem phân lập trên sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 40 - 60 Ịj,m, Merck) với hệ dung môi là n-hexan: ethyl acetat (1:1) thu được 3 phân đoạn kí hiệu là EA l, EA2, EA3, trong đó, phân đoạn EAl cho thấy có một vết chất chính trên sắc ký đồ Tinh chế EAl bằng phương pháp kết tinh lại thu được 24 mg tinh thể hình kim màu trắng, ký hiệu YOl
Phổ khối (MS) của chất YOl có pic ion phân tử ở m/z 163 [M-H]' Khối lưọfng phân tử của YOl là 164 tưoTig ứng với công thức phân tử CgHgOa- Dựa trên
dữ liệu phổ IH-NMR, phổ 13C-NMR, phổ HMBC cho phép kết luận YOl là acid (£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic hay acid p-coumaric
IH - NMR (500 MHz, MeOD) ô (ppm): 6,30 (IH, d, / = 16 Hz, H3); 6,82 (2H,
dd, 8,5 Hz; 2Hz, H3’, H5’); 7,45 (2H, dd, / = 8,5 Hz; 2Hz, m \ H6’), 7,61
(IH, d, J = 16 Hz, H2) 13C - NMR (125 MHz, MeOD) ỗ (ppm): 115,6 (C2);
116,8 (C3’, C5’); 127,2 (cr), 131,1 (C2’, C6’); 146,7 (C3); 161,1 (C4’), 171,0 (Cl)
Hình 4 Công thức cấu tạo của acid (£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic
Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro của acidp-coumaric
Trang 6Acid p-coumaric pha trong cồn tuyệt đối ở các nồng độ từ 0 , 2 - 1 0 mM
được đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vỉtro trên đĩa
96 giếng Kết quả được thể hiện ở hình 3.5
- > I C 5 o = 9 , 6 1 (8 ,2 9 -1 1 ,1 6 ) mM
►-acid p-coiixiimic
Hình 5, Tác dụng ức chế hình tinh thể canxi oxalat của acid p-coumaric và naừi citrat
ở nồng độ thấp (<0,5 mM), acid p-coumaric không thể hiện tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat tạo thành, ở nồng độ cao hơn (> ImM), acid p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0% ở nồng độ
10 mM Tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat của acid p-coumaric mạnh hơn chứng dương natri citrat, với giá trị IC50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy 95%: 1,47 - 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29 - 11,16) của natri citrat
Bàn luận
Canxi oxalat là thành phần phổ biến nhất của sỏi tiết niệu, chiếm khoảng 80% các trưòng họp sỏi tiết niệu nói chung Quá trình hình thành sỏi canxi oxalat trong cơ thể trải qua 5 giai đoạn chính, bao gồm: quá bão hòa nước tiểu, tạo nhân tinh thể, sự lớn lên của các tinh thể, kết tập các tinh thể và gắn tinh thể vào tế bào
biểu mô ống thận [2], Trên cơ sở đó, chúng tôi đã áp dụng các mô hình in vitro
và ỉn vivo phù họfp để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat của Ý
dĩ Trên mô hình in vỉtro sử dụng đĩa 96 giếng, Ý dĩ đã thể hiện tác dụng ức chế
sự hình thành tinh thể canxi oxalat tăng dần theo nồng độ, đồng thời làm tăng số lượng tinh thể COD, giảm số lưọng tinh thể COM Điều này có thể giảm nguy cơ lắng đọng sỏi tại thận do COM là dạng tinh thể dễ kết tập, dễ gắn với tế bào biểu
mô ống thận, do đó khó đào thải hơn tinh thể COD [1], Khi so sánh với một số
nghiên cứu khác trên thế giới [4, 7], phương pháp in vitro được áp dụng trong
nghiên cứu này có hạn chế là chưa đánh giá được tác dụng của Ý dĩ lên từng giai đoạn của quá trình hình thành tinh thể canxi oxalat trong nước tiểu Tuy nhiên,
kết quả in vitro trong nghiên cứu này chỉ mang tính sàng lọc, tạo cơ sở để tiếp tục nghiên cứu tác dụng của thuốc trên động vật thực nghiệm Gây sỏi trên chuột
Trang 7cống trắng bằng ethylen glycol là mô hình đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới
để đánh giá tác dụng của các thuốc điều trị sỏi tiết niệu [6] ở Việt Nam, đây là lần đầu tiên mô hình này được triển khai và áp dụng Dịch chiết Ý dĩ ở mức liều 2,52 g/kg đã thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành sỏi tại thận sau 28 ngày điều trị tưcmg tự chứng dương natri citrat Tuy nhiên, trong khi natri citrat làm tăng đáng kể thể tích và pH nước tiểu, Ý dĩ ở mức liều nghiên cứu không làm thay đổi các thông số này khi so sánh với lô chứng bệnh (số liệu không thể hiện trong phần kết quả) Điều này cho thấy tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của Ý
dĩ ở liều nghiên cứu không liên quan đến tác dụng lợi tiểu đã được đề cập trong y văn [2], Như vậy, tác dụng của Ý dĩ có thể theo một số cơ chế sau; ức chế các giai đoạn tạo nhân, lớn lên và kết tập tinh thể; thay đổi dạng tinh thể hoặc ức chế
sự gắn của tinh thể vào tế bào biểu mô ống thận Từ phân đoạn ethyl acetat là phân đoạn có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat mạnh nhất, đã phân lập được acid p-coumaric, một acid hữu cơ có mặt khá phổ biến trong thực vật và cũng đã được phân lập từ hạt Ý dĩ [2] Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của acid p-coumaric cho thấy chất này có tác dụng chống dị ứng, chống oxy hóa, chống ung thư [5, 8] nhưng chưa được đánh giá tác dụng trên sỏi tiết niệu trong các nghiên cứu đã công bố Theo kết quả nghiên cứu này, acid p-coumaric
có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể canxi oxalat và tác dụng này phụ thuộc nồng độ Như vậy có thể sơ bộ kết luận acid p-coumaric là một thành phần
có tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể canxi oxalat của thân Ý dĩ Tuy nhiên, đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, để phát triển Ý dĩ trở thành dược liệu tiềm năng trong điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu, cần cỏ phương pháp chuẩn hóa dược liệu và đánh giá hiệu quả thông qua thử lâm sàng
Kết luận
Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết
niệu cả in vitro và in vivo In vitro, tác dụng của Ý dĩ tăng dần theo nồng độ với tác dụng ức chế tối đa đạt 33,1% ở dịch chiết 1/1; in vivo, Ý dĩ đường uống mức
liều 2,52 g/kg làm giảm sự lắng đọng sỏi tại thận gây ra bởi ethylen glycol tương
tự chứng dưomg natri citrat Đã phân lập được acid p-coumaric có tác dụng ức
chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 là 2,35 mM
Trang 8Tài liệu tham khảo
1 Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,
tr.844-846
2 Chen H.J., et al.(2010), Mast cell dependent allergic responses are inhibited by
ethanolic extract of adlay testa, Journal o f Agricultural and Food Chemistry,
58(4), pp 2596-2601
3 Coe Fredric L., et al Pathology and treatment of kidney stone, Medical progress, vol 327, pp 1141-1150.
4 Gohel Wong s.p (2006), Chinese herbal medicines and their efficacy
in treating renal stones, Urology Research, 34, pp 365-372.
5 Jaganathan KS, et al (2013), Events associated with apoptotic effect of p-
Coumaric acid in HCT-15 colon cancer cells, World Journal Gastroenterol
21, pp.7726-7734
6 Karadi VR, et al (2006), Effect of Moringa oleífera Lam root-wood on ethylene glycol induced urolithiasis in rats, Journal o f Ethnopharmacology,
105, pp 306-311
7 M Beghalia, et al (2008), Inhibition of canxium oxalate monohydrate crystal
growth using Algerian medicinal plants, Journal o f medicinal plants research, pp 66-70.
8 Takahashi H., et al.(1999), Coumaroyl triterpenes from Casuarina equisetifolia, Phytochemmistry, 51, pp 543-550.
