lưu ở Việt Nam bằng phương pháp đã xây dựng và đánh giá sự đa dạng hàm lượng rotundin trong các loài được nghiên cứu.. Vì vậy, trong nghiên cửu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy ừìn
Trang 1KHẢO SÁT S ự ĐA DẠNG HÀM LƯỢNG ROTUNDIN
TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR ở VIỆT NAM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pham Thi Viêt Hồng' HDKH: TS Nguyễn Quốc Huy^, DS Trần Kiều Duyên^
'lớ p M2K65 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội
^ Lớp CH17, Công ty Mediplantex
Từ khoá: bình vôi, HPTLQ rotundỉn, sắc kỷ ỉớp mỏng hiệu năng cao, Stephania Lour Tóm tắt
Xây dựng quy trĩnh định lượng rotundin trong một số loài Stephania Lour lưu ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Thẩm định một sổ chỉ tiêu trong phương pháp: độ đúng, độ lặp lại, độ đặc hiệu
và độ tuyến tỉnh Khảo sát hàm lượng rotundin trong một sổ loài Stephania Lour lưu ở Việt Nam bằng phương pháp đã xây dựng và đánh giá sự đa dạng hàm lượng rotundin trong các loài được nghiên cứu.
Đặt vấn đề
Rotundin là alcaloid chính có trong một số loài thuộc chi Stephania Lour
Hàm lượng rotundin trong mỗi loài tương đối khác nhau Dựa vào hàm lượng rotundin có thể sơ bộ phân loại các loài với nhau Có nhiều phương pháp định lượng rotvmdin được nghiên cửu như HPLC [2], phương pháp đo quang [7], đo diện tích vết [4] Trên cơ sở sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTI.C có một số
ưu điểm hơn phưong pháp HPLC về thời gian ngắn có thể phân tích song song nhiều mẫu và giá thành thấp Vì vậy, trong nghiên cửu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy ừình định lượng nhanh hàm lượng rotundin bằng phương pháp
HPTLC trong một số loài Stephania Lour lưu ở Việt Nam Qua đó đánh giá sự
đa dạng hàm lượng rotundin ừong các loài
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Mau thử và mẫu chuẩn
Mau chuẩn: Chuẩn rotundin (Viện Kiểm Nghiệm Trung ương)
Mau thừ: Bột thô của củ các loài Stephanỉa brachyandra Diels (Bl); Stephania dielsiana Y.C.Wu (B2); Stephanỉa sinica Diels (B3); Síephania gỉabra (Roxb) Miers (B4); Stephanỉa kwangsỉensis H.S.LO (B5); Síephania venosa (BIO) (TS
Nguyễn Quốc Huy cung cấp)
Thiểt bị và hoá chất
Trang 2Thiết bị: Bộ dụng cụ chiết ngấm kiệt, bộ dụng cụ khai triển HPTLC (gồm máy chấm bản mỏng Linomat 5, máy khai triển sắc ký Camag ADC2, máy soi UV), bình kliai triển sắc ký TLC
Hoá chất: Methanol, Cloroform đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Phương pháp nghiên cứu
Quy trình định lượng
- Lựa chọn điều kiện chiết các mẫu; Lựa chọn phương pháp và dung môi chiết phù hợp với dược liệu và hoạt chất cần tách chiết [3]
Xác định độ pha loãng phù họp cho mẫu thử: Các mẫu thử sau khi chiết được
cô tới cắn và được pha với các thể tích Methanol khác nhau Hiện màu các vết trên máy soi u v Tiến hành khai triển sắc ký với hệ sắc ký phù hợp để kiểm tra khả năng tách các vết và độ đậm màu của vết ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau [4] Lựa chọn điều kiện khai triển HPTLC: Lựa chọn các thông số của máy HPTLC để phù hợp các mẫu phân tích và giảm thiểu sai số của phương pháp [9] Thẩm định phương pháp nghiên cứu: Tiến hành triến khai sắc ký bằng phương pháp HPTLC, định lượng hàm lượng các mẫu bằng phưong pháp so màu dựa vào phần mềm Videoscan Khảo sát, tính toán độ đặc hiệu, tính tuyến tínli,
độ lặp lại và độ đúng của phương pháp dựa vào các thông số Idiai triển sắc ký thu được [1],
Khảo sát hàm lượng roíundỉn trong một số loài Síephania Lour, ở Việt Nam
Các mẫu bình vôi B l, B2, B3, B4, B5, BIO được tiến hành chiết xuất, định lượng bằng phưcmg pháp HPTLC với các điều kiện đã đưa ra trong nghiên cứu
Kết quả
Xây dựng quy trình định lượng
Lựa chọn điều kiện chiết các mẫu
Lựa chọn phương pháp chiết ngấm kiệt vì phương pháp này đơn giản, thiết bị sẵn
có, Idiả năng chiết kiệt tốt Dung môi chiết là Methanol, Methanol là dung môi có khả năng chiết tốt tất cả các chất, khả năng chiết kiệt tốt, giá rẻ
Xác định độ pha loãng phù hợp cho mẫu thử
Cấc mẫu thử sau Idìi chiết được cô tới cắn và được phalại bằng Methanol với các
thể tíchkhác nhau lần lượt là: 100 ml; 125 ml; 150 ml So sánh khả năng tách, độ đậm màu giữa các độ pha loãng khác nhau nhận thấy pha loãng với 125 ml cho kết quả tốt nhất
Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
Hệ dung môi khai ữiển được chọn là MeOH - Cloroform (9:1), lựa chọn các điều kiện sắc ký ở bảng 1
Trang 3Bảng 1, Các điều kiện khai ừiển HPTLC của máy Camag
Thông số HPTLC
Lượng mẫu chấm
Chỉ tiêu
2\ủ
Pha tĩnh
Thời gian bão hoà dung môi
Thời gian bão hoà bản mỏng
Thời gian sây khô bàn mỏng khai triên
Kử Iv kêt auả; Đinh lươne băng 1
Silicagel GF254
20’
10 ’
Xử lý kêt quả; Định lượng băng phương pháp xây dựng đưòfng chuấn, sử dụng phần mềm VideoScan
Thẩm định phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu
Mầu chuẩn; Từ chuẩn rotundin, pha thành dung dịch chuẩn gốc 6 mg/ml.Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lưọt là 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 1,0 mg/ml; 1,5 mg/ml; 3 mg/ml; 4 mg/ml Các chuẩn được ký hiệu lần lượt là C l; C l’; C2; C3; C4; C5
Mau thử: Thêm các chuẩn có nồng độ lần lượt 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 1,0 mg/ml vào dịch chiết mẫu thử B4 đã được pha loãng, dịch chiết mẫu thử B4
Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp
Tiến hành khai triển sắc ký với các mẫu trắng (dung dịch Methanol), mẫu thử (dịch chiết B4), mẫu chuẩn (C4)
Kết quả; Mau thử B 4 và mẫu chuẩn C4 có giá ứị R f đo được lần lượt là 0,653 và
0,654 Giá trị Rf có độ lệch chuẩn RSD là 0,1082% s ắ c ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pick trong khoảng thời gian lưu tưcmg ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
Khảo sát độ tuyển tỉnh
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Hình 1 Đô thị khảo sát độ tuyến tính các phương pháp nhân
Khảo sát với các mẫu chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0,6 mg/ml; 1,0 mg/ml; 1,5 mg/ml; 3,0 mg/ml; 4,0 mg/ml
Hệ số tương quan r tính toán được là; 0,998957
Nhận xét: Phương pháp
có hệ số tương quan trong khoảng giá trị chấp
Trang 4Khảo sát độ lặp lại của phưomg pháp
Mẩu khảo sát B4 được chấm 6 vết khác nhau trên bản mỏng sắc ký Kết quả Rf, diện tích pick sắc ký
Bảng 2 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
v ế t số
4
Trung bình
RSD (%)
Rf 0,637 0,640 0,640 0,643 0,646 0,649 0,6425
0,687
Diện tích pick
53968,9 53603,9 53636,8 55009,4 56426,0 57413,7 55009,78
2,90
Nhận xét: Giá trị RSD tính
theo chỉ số Rf của mẫu rất nhỏ cho độ tin cậy cao, Giá trị RSD tính theo chỉ số diện tích pick sắc ký mẫu tương đối lón do diện tích pick được tính toán dựa trên quá ừình chọn độ rộng chân pick gây sai số lớn hơn
Khảo sát độ đúng
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn Khảo sát 3 mẫu thử có hàm lượng rotundin ở các mức khoảng 80%, 100% và 120 % so với mức hàm lượng lý thuyết Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất
Bảng 3 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
v ế t số Nồng độ chuẩn thêm vào
(mg/ml)
Nồng độ tìm lại (mg/ml)
Tỷ lệ thu hôi
(%)
Trung bình 87,05
RSD (%) 7,91
Trang 5Nhận xét: Giá trị RSD của phưong pháp cao, sai số lớn có thể do quá trình pha
mẫu thử để khảo sát, mẫu sau Ichi pha không được bảo quản trong điều kiện ứiích họp gây biến đổi rotvmdin
Khảo sát hàm lượng rotundin trong một số loài Stephanỉa Loiir ở Việt Nam
Các mẫu bình vôi được tiến hành
địnli lượng theo quy trìnli đã được
trình bày ở trên
Kết quả khảo sát hàm lượng
rotundin trong các loài theo phương
pháp trên ở hình 2; 3; 4 và bảng 4
* C1 a C3 C4 C5 B I B2 B3 B4 BS BÍQ
Hình 3 Sắc ký đồ các mẫu ở bước
sóng 366 nm
I t â ả ậ ỉam pte â
ị
I
- c A Ì l
' Ì * 1 ' ỉ '
Hình2 Pick sắc ký của mẫu thừ B 1
area
ỉí»«
ỉcóỉií 1
tí5 ĩíỉ iCKỄỈ Í5ÍCỈ
sdv=3,12%
ỉ ỉ !
Hình 4 Đường chuẩn thể hiện mối quan
hệ giữa diện tích pick và hàm lượng
rotundin
Trang 6Khối lưọng cân(g) Hàm ẳm(%) Nồng độ(%g/ml) Hàm Iưọ-ng(yo) Mẩu
Nhận xét: Hàm lượng rotundin trong các mâu khác nhau tương đôi rõ rệt B 1 là
loài có hàm lượng rotundin cao nhất (6,25%), các loài B3, B4, B5 có hàm lượng khá tương đồng nhau (3,02% đến 4,53 %) Hai loài B2 và BIO có hàm lượng rotundin tương đổi thấp so với các loài còn lại
Bàn luận
Phương pháp HPLC có độ nhạy và khả năng phân tích mẫu tốt hơn so với phương pháp HPTLC, tuy nhiên phương pháp HPTLC có khả năng bán định lượng nhanh nhiều mẫu trong một lần triển khai, tiết kiệm thời gian, giá thành thấp và có thể ứng dụng trong khảo sát nhanh sự thay đổi hàm lượng giữa các mẫu
Bên cạnh phương pháp HPLC, rotundin đã được nghiên cứu định lượng bằng phương pháp đo quang [7] và phương pháp đo diện tích vết trên bản mỏng TLC [4], So với 2 phương pháp trên, phương pháp HPTLC đã có sự cải tiến hơn việc định lượng vẫn dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của các vết ở bước sóng
366 nm, đo cường độ màu trên toàn bộ diện tích vết và đưa ra đường chuẩn về chiều cao và diện tích pic các mẫu chuẩn để tính toán hàm lượng mẫu thử, phương pháp HPTLC sử dụng bản mỏng kính và việc đưa mẫu lên bản mỏng và triển khai sắc ký được thực hiện trên máy Linomat 5 và ADC 2 có độ chính xác cao hơn so với phương pháp đo diện tích vết
Hàm lượng Rotundin của các loài khảo sát bằng phương pháp HPTLC so với phương pháp HPLC có sự khác nhau trên một loài, tuy nhiên sự khác nhau về hàm lượng rotundin tưang đối giữa các loài không thay đổi
Bảng 5 Ket quả định lượng hàm lượng rotundin bằng phưong pháp HPLC
Trang 7Căn cứ vào kết quả khảo sát hàm lưọng rotundin bằng phương pháp HPTLC, có thể phân loại các loài nghiên cứu thành hai nhóm Nhóm 1 - gồm các loài B l, B3, B4, B5 có hàm lượng rotudin tương đối cao Nhóm 2 - gồm các loài B2, BIO có hàm lượng rotundin thấp hơn khá nhiều Ket quả này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trước đây về các loài này
Dựa vào phương pháp HPTLC, có thể phân loại nhanh các loài đồng thời bằng sắc ký đồ cũng như hàm lượng rotundin của các loài
Kết luận
Nghiên cứu đã đưa ra được quy trình định lượng hàm lượng rotundin bằng phương pháp HPTLC; Chọn dung môi chiết; methanol, hệ dung môi khai triển sắc ký: Chloroform - Methanol (9:1), điều kiện sắc ký với các thông số về lượng mẫu chấm (2 thời gian bão hoà dung môi (20 phút), thời gian bão hoà bản mỏng (10 phút), thời gian sấy khô bản mỏng (5 phút); đã thẩm định độ đúng với RSD là 7,91%; độ lặp lại với RSD là 2,9 %; độ tuyến tính với r là 0,998957
Đã tiến hành khảo sát bằng phương phápHPTLC sự đa dạng hàm lượng rotundin trong một số loài Bình Vôi cho thấy hàm lượng chia 2 nhóm: (i) Nhóml
(có hàm lượng rotundin cao); Stephania brachyandra Diels (Bl); Stephania sinica Diels (B3); Stephania glabra (Roxb) Miers (B4); Stephania kwangsiensis
H.S.LO (B5) với hàm lượng lần lượt là 6,25%; 3,05%; 4,03%; 3,61%; (ii) Nhóm
2 (có hàm lượng rotundin thấp); Stephania dieỉsiana Y.C.Wu (B2); Stephania venosa (BIO) với hàm lượng lần lượt là 0,2%; 0,43%.
Tài liệu tham khảo
I Bộ Y Tế (2012), Khoả đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLMvà HPLC trong thuốc Đông dược.
2 Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV.
3 Phạm Thị Duyên (2004), Nghiên cứu định lượng L-tetrahydropalmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên nang cứng Heatos 4 bằng phương
pháp sắc ký lóp mỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận văn Thạc s ĩ dược học.
4 Mai Thị Hằng (2008J, Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Rotundin trong bán thành phẩm Sen vông - R, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ.
5 Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học, một
số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour, ở Việt Nam, Luận án tiến s ĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
6 Lã Đình MỠI, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc
Bản (2005), Chi Bình vôi - Stephania Lour 1790, Tài nguyền thực vật Việt Nam (Những cây chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học), tập I, tr 58-82.
Trang 87 Nguyễn Tiến Vững (2000), Nghiên cứu về thực vật, hoá học và tác dụng sinh
học của một số loài thuộc chi Stephania Lour, ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Dược học, Trường Đại Học Dược Hà Nội.
8 Biodiversity Conservation and Managerment Thematic Group (2010), Analysis o f Berberin Content using HPTLC fingerprinting o f root and Mark
o f the Himalayan Berberis Species.
9 ManMohan Srivastasva (2011), High - Performance Thin - Layer Chromatography (HPTLC).
