Sử dụng bức xạ gamma và chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn để tạo giống lúa chịu hạn

Ngày nay việc sử dụng đột biến nhân tạo là một trong những phơng pháp có giá trị trong chọn giống cây trồng, thuận lợi chủ yếu của phơng pháp này là kiểu gen của giống ít bị thay đổi hơn

đang thiếu lơng thực trong đó có 25 nớc ở Châu Phi.

Trong các yếu tố khí hậu, đất đai, cỏ dại và dịch bệnh, hạn hán là một trong những yếu tố khốc liệt nhất ảnh hởng lên năng suất cây trồng Đặc biệt

là đối với cây lúa một cây bán thuỷ sinh thì hạn hán là yếu tố chính làm giảm năng suất thậm chí làm mất mùa tuỳ vào cờng độ cũng nh thời gian tác động lên quá trình sinh trởng và phát triển Theo số liệu thống kê năm 2002 diện tích gieo trồng lúa hàng năm ở nớc ta biến thiên từ 7,3-7,5 triệu ha trong đó 1,5-1,8 triệu ha đang bị thiếu nớc và 1,5-2,0 triệu ha cần phải đầu t để chống úng khi gặp ma to và ma tập trung Điển hình cho hạn hán ở nớc ta phải kể

đến hai năm 1993 và 1998 Trong năm 1993 hạn hán kéo dài ở miền Trung và Nam bộ làm năng suất lúa giảm từ 4 tấn xuống 2 tấn/ ha Năm 1998 do hạn nặng ở cả hai vụ (Xuân và Mùa) đã làm các tỉnh ở miền Trung nh Nghệ An,

nông thôn)

Vì vậy việc nghiên cứu tính chịu hạn và chọn tạo những giống lúa có khả năng chịu hạn đã trở thành một trong những nội dung nghiên cứu quan trọng ở cả Việt Nam và trên thế giới Các phơng pháp tạo giống truyền thống trong một thời gian dài đã mang đến những giá trị nhất định trong thực tiễn sản xuất song còn nhiều hạn chế Ngày nay việc sử dụng đột biến nhân tạo là một trong những phơng pháp có giá trị trong chọn giống cây trồng, thuận lợi chủ yếu của phơng pháp này là kiểu gen của giống ít bị thay đổi hơn so với

việc lai tạo hai giống khác biệt mà vẫn có thể cải thiện đợc một số đặc tính và rút ngắn đợc thời gian chọn lọc Trong số các tác nhân vật lý gây đột biến thì tia gamma đợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu chọn giống với mục đích cải thiện các đặc tính nông học của cây trồng (Nguyễn Hữu Đống) [6].

Cùng với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS-Marker Assisted Selecsion) liên kết chặt với các gen đặc hiệu đã cho phép các nhà chọn tạo giống phát hiện ra sự có mặt hay vắng mặt của các gen quan tâm mà không cần đánh giá kiểu hình, vì thế mà chọn tạo giống đã trở nên nhanh hơn và hiệu quả hơn ở lúa chỉ thị STS, SSR liên kết với tính trạng hình thái rễ đang đợc sử dụng để chọn dòng chịu hạn

Xuất phát từ những phân tích trên chúng tôi chọn đề tài: “Sử dụng bức

xạ gamma và chỉ thị phõn tử liờn kết với tớnh chịu hạn để tạo giống lỳa chịu hạn” Với mục đích nghiên cứu ảnh hởng của phóng xạ lên khả năng nảy

mầm, sự sinh trởng và phát triển của cây mạ, đánh giá sự thay đổi trong hệ gen của các dòng chiếu xạ, bớc đầu chọn lọc những dòng có thể mang tính chịu hạn phục vụ cho công tác chọn giống tiếp theo

Chơng 1 Tổng Quan Tài Liệu

1.1 Đại cơng về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại lúa trồng

Cây lúa là cây trồng có từ lâu đời, gắn liền với quá trình phát triển của xã hội loài ngời Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa hoang dại do quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo lâu dài mà nên Qua các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy nguồn gốc của cây lúa là từ vùng

đầm lầy nóng ẩm Đông Nam á, sau đó đợc lan truyền ra nhiều nơi

Theo đặc điểm sinh vật học và quá trình diễn biến thì lúa trồng thuộc họ

Graminae (nay là Poaceae), chi Oryza, loài Oryza-sativa L Chi Oryza có 23

glaberrima phổ biến ở Tây Phi (Oka, 1958) Oryza sativa có 3 loài phụ là

Indica (lúa tiên), Japonica (lúa cánh), và Javanica (lúa bù lu) Indica là loại hình lúa đợc trồng ở các vùng nhiệt đới, Japonica là lúa đợc trồng ở vùng ôn

đới, còn loại hình trung gian Javanica là Japonica nhiệt đới (Glaszman, 1987) [10]

điều kiện ruộng nớc, trong quá trình sống và phát triển chịu sự tác động của chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mà hình thành nên nhiều loài lúa phù hợp với điều kiện sinh thái nh: lúa nớc, lúa nơng, lúa nổi…

thuần hoá từ lúa dại từ 3 trung tâm đầu tiên ở Châu á: Assam (ấn Độ), biên giới Thái Lan-Myanma, và Trung Du Tây Bắc Việt Nam Theo đặc điểm lúa trồng việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica (Bùi Huy Đáp, 2000) [5]

1.1.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam và trên thế giới

Lúa là cây lơng thực quan trọng trong đời sống con ngời Lúa cung cấp lơng thực cho 1/2 dân số thế giới, trên 2/3 lợng calo cho 3 tỷ dân Châu á , 1/3 lợng calo cho 1,5 tỷ dân Châu Phi và Mỹ La Tinh Trong cơ cấu sản xuất lơng thực của thế giới, lúa mỳ chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24% còn lại là các loại ngũ cốc khác

Trên thế giới diện tích trồng lúa ở Châu á chiếm 89,5% tổng diện tích

và sản lợng chiếm 91,1% tổng sản lợng Trong đó ấn Độ là nớc có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới (42 triệu ha với sản lợng 121,3 triệu tấn), Trung Quốc là nớc có sản lợng lúa cao nhất thế giới (187,45 triệu tấn), còn Thái Lan

là nớc xuất khẩu gạo đứng đầu thế giới chiếm hơn 30% thị phần của thị trờng thế giới

ở Việt Nam lúa là cây trồng chính của hơn 70% dân số Diện tích trồng lúa không tăng nhng sản lợng lúa hàng năm đều tăng lên rõ rệt Đặc biệt 10 năm trở lại đây (1993-2003) sản lợng lúa bình quân tăng một triệu tấn một năm (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn) Hiện nay Việt Nam là nớc xuất khẩu gạo đứng thứ hai thế giới, điển hình là năm 1999 kỷ lục xuất khẩu gạo là 4,55 triệu tấn Tuy nhiên ở nớc ta năng suất lúa còn cha ổn định do điều kiện khí hậu và địa hình không bằng phẳng, đồng thời cha chú trọng nhiều đến chất lợng nên còn nhiều vấn đề bất cập Vì thế cần phải đầu t hơn nữa để tạo ra các giống lúa cho năng suất cao, ổn định; phẩm chất tốt; sức chống chịu khá… thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau

1.2 Đại cơng về tính chịu hạn ở cây trồng

1.2.1 Hạn và tác hại của hạn lên thực vật

1.2.1.1 Khái niệm và phân loại hạn

Nớc có vai trò quan trọng đối với thực vật, do vậy thiếu nớc sẽ gây nên những hậu quả lớn cho hoạt động sống của cây Trớc tiên là ảnh hởng đến cân bằng nớc trong cây, sau đó ảnh hởng đến quang hợp, hô hấp, trao đổi chất, sinh trởng và phát triển của cây Nguyên nhân gây nên thiếu nớc ở cây trồng thờng là hạn hán

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nớc ở thực vật do môi trờng gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hởng đến sự phát triển Những cây có khả năng duy trì sự phát triển bình thờng và cho năng suất

ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Và khả năng của thực vật

để ngăn ngừa sự tổn thơng do sự thiếu hụt nớc gây ra gọi là tính chịu hạn Về mặt cân bằng nớc trong cây thì hạn hán đợc chia làm hai giai đoạn chính: Hạn không khí và hạn đất

Hạn không khí thờng xẩy ra khi không khí môi trờng có nhiệt độ cao

tỉnh khu Bốn vào những tháng có gió Tây Nam và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu

và đầu đông Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thờng gây ra hiện tợng héo tạm thời vì làm cho các bộ phận non của cây bị thiếu nớc Mức độ phản ửng của cây với sự thiếu hụt nớc tuỳ thuộc từng giai

đoạn phát triển của cây Đối với cây lúa, hạn không khí ảnh hởng nghiêm trọng trong giai đoạn bắt đầu hình thành cơ quan sinh sản đến lúc kết thúc quá trình thụ phấn Nguy hại nhất là vào giai đoạn lúa phơi màu Vì nhiệt độ cao

và độ ẩm thấp làm cho hạt phấn không có khả năng nảy mầm , quá trình thụ phấn không diễn ra làm hạt bị lép

Hạn không khí kéo dài sẽ làm khô đất và dẫn đến hạn đất Hạn đất sẽ làm mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh đợc với lực giữ nớc của

đất khiến cây không thể lấy nớc vào tế bào qua rễ, và làm toàn bộ cây bị thiếu nớc dẫn đến cây bị héo lâu dài Hạn đất phụ thuộc nhiều vào sự bốc hơi nớc bề mặt và khả năng giữ nớc của đất Đất thịt nặng có khả năng giữ nớc cao nhất (57%), còn đất cát là giữ nớc kém nhất (19%), (McKersie & Cs, 1994)

Nói chung hạn không khí và hạn đất thờng đi song song với nhau và

đ-ợc gọi là hạn kết hợp Đây là loại hạn khốc liệt nhất, nếu kéo dài sẽ làm cây héo vĩnh viễn không có khả năng phục hồi Tuy nhiên, cũng có lúc trong đất

đủ nớc mà cây vẫn bị héo nh: khi gặp nhiệt độ quá thấp, thiếu oxy, hay cây bị

giảm sút Trờng hợp này gọi là hạn sinh lý

1.2.1.2 Tác hại của hạn lên thực vật

Hạn có tác hại rất lớn Trớc tiên nó phá vỡ cân bằng nớc trong cây, từ

đó ảnh hởng đến các hoạt động sinh lý khác của cây nh: Hô hấp, quang hợp,

tổng hợp lên sinh trởng và phát triển của cây, làm giảm năng suất và thu hoạch Hạn kết hợp với gió nóng, khô làm chết phần lớn lá, nhất là những lá ở tầng dới ( ở cây hoà thảo làm khô đầu lá, cây gỗ thì gây chết ở đỉnh cành)

Hạn gây ra sự mất nớc, để bù lại phần nào lợng nớc mất đi lá phải hút nớc từ các nụ, hoa và chồi non gây hại trực tiếp cho các bộ phận này Làm rụng nụ, hoa và quả non, làm giảm năng suất thu hoạch Nếu hạn muộn hơn vào giai đoạn cuối làm ảnh hởng đến sự tạo và vận chuyển dinh dỡng về hạt làm hạt bị lép ( Trần Nguyên Tháp, 2001) [19]

Về ảnh hởng của hạn đến cấu trúc và chức năng sinh lý của tế bào thì

khi cây bị héo thì trạng thái chất nguyên sinh của tế bào bị thay đổi mạnh Độ

phân tán của hệ thống keo bị giảm , làm giảm khả năng trơng nớc và tính đàn hồi của keo sinh chất Các biến đổi trong cây chuyển từ chiều hớng tổng hợp sang phân giải và hoàn toàn bất lợi cho trao đổi chất của tế bào.

Hạn còn ảnh hởng pha sinh trởng giãn của tế bào Nếu tế bào đang ở giai đoạn giãn mà bị thiếu nớc thì tế bào sẽ ngừng sinh trởng và cây còi cọc Vì vậy ngời ta có thể điều khiển sinh trởng của cây thông qua việc điều tiết n-ớc

1.2.2 Cơ chế chống chịu hạn

Trong cùng một điều kiện hạn, một số cây trồng vẫn sinh trởng phát triển và hình thành năng suất, trong khi đó một số cây trồng thì không cho thu hoạch Nguyên nhân là do chúng có những cơ chế chống chịu hạn khác nhau

Có ba kiểu chống chịu hạn chính ở cây trồng là: lẩn tránh hạn (trốn hạn), chịu hạn ở thế nớc trong mô cao và chịu hạn ở thế nớc trong mô thấp

1.2.2.1 Cơ chế lẩn tránh hạn

Lẩn tránh hạn là khả năng cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của chúng trớc khi sự thiếu hụt nớc nghiêm trọng xảy ra Thực vật thuộc nhóm này thờng

là những cây hàng năm, hay những cây đoản sinh trởng sống ở xa mạc Chúng

có thời gian sinh trởng ngắn Hạt giống của chúng nảy mầm khi bắt đầu có ma

đất ẩm, sau đó chúng sinh trởng và phát triển nhanh chóng, hình thành hạt và chết trớc khi mùa khô hạn đến

Nói chung những thực vật này không có những đặc trng thích ứng cho chống chịu hạn Song chúng thờng có thế thẩm thấu thấp nên có thể chống chịu sự thiếu hụt nớc của môi trờng

1.2.2.2 Cơ chế chịu hạn ở thế nớc trong mô cao

Để duy trì trạng thái nớc luôn cao trong mô khi sự bay hơi nớc mạnh và

độ thiếu hụt nớc trong đất lớn thì cây trồng cần có hai đặc trng cơ bản sau: Hạn chế sự thoát hơi nớc và duy trì việc cung cấp nớc

Cây giảm sự thoát hơi nớc bằng ba đờng hớng sau:

- Điều chỉnh sự đóng mở của khí khổng: Khí khổng đợc đặt trong một biểu bì không thấm nớc và hoạt động nh van điều chỉnh giữa độ ẩm của lá và

độ khô của không khí, tạo ra cơ chế chính kiểm soát tốc độ mất nớc Đây là cơ chế sinh lý hiệu quả nhất để hạn chế sự mất nớc Những cây mọng nớc thờng

đóng khí khổng để giảm mất nớc Khí khổng của chúng rất nhạy cảm với sự giảm thế nớc tổng số và có khuynh hớng mở khí khổng vào ban đêm khi sự

không mở liên tục, thậm chí đến 40 ngày nh ở cây xơng rồng khi thế nớc của

đất còn thấp hơn thế nớc của cây Giá trị thế nớc gây ra sự đóng khí khổng ở những cây khác nhau là rất khác nhau, phụ thuộc vào tuổi lá và điều kiện môi trờng Ví dụ khí khổng ở lá dâu đóng ở thế nớc -8 bar, còn ở bông là -28 bar… Tuy sự đóng khí khổng là rất quan trọng để duy trì trạng thái nớc của mô Nh-

ng nó gây ra hiệu ứng kèm theo là giảm sự trao đổi khí quang hợp, giảm quang hợp và năng suất Và khi mất nớc quá nhiều thì khí khổng không còn khả năng đóng dẫn đến cây mất nớc ồ ạt và chết (Bohnert & Jensen, 1996) [22]

- Giảm sự hấp thụ bức xạ mặt trời: Cây có thể giảm sự hấp thu bức xạ mặt trời bằng cách lá vận động song song với tia sáng để nhận ánh sáng ít

1981) [27] Ngoài ra sự cuộn tròn lá, sự cụp lá, sự phủ một lớp lông dày hoặc một lớp sáp dày hay lớp tinh thể muối trên lá cũng tránh đợc sự bay hơi nớc.

Trong một số loài cây nghiên cứu thì lớp sáp ở lúa mỳ là có hiệu quả

1/5 so với lúa mỳ) và hầu nh không có liên quan đến sự thoát hơi nớc (O’Toole & Cruz, 1983; Jordan & Cs, 1983) [28] [34]

- Giảm bề mặt bay hơi nớc: Sự thiếu hụt nớc sẽ làm giảm sự sinh trởng của lá, giảm diện tích lá Ngoài ra một số lá bị chết đi hoặc bị rụng khi thiếu nớc cũng làm giảm sự bay hơi nớc ở lúa mỳ, những giống có bộ lá hẹp đã làm giảm sự bốc thoát hơi nớc có hiệu quả (Jone & Cs, 1981)

Sự giảm diện tích lá cùng với sự đóng khí khổng, giảm năng luợng hấp thu đều làm giảm quang hợp, sinh trởng và năng suất

Cây duy trì duy trì sự hấp thu nớc :

Để duy trì trạng thái nớc cao trong mô thì hệ rễ của cây phải đợc tăng mạnh về số lợng và mật độ Bộ rễ phải ăn sâu hơn để lấy nớc ở những tầng đất sâu khi khô hạn Vì thế mà tỷ lệ rễ/ thân tăng lên khi gặp hạn Ngoài ra để tăng dòng vận chuyển nớc từ rễ lên lá thì đờng kính rễ và số lợng mạch dẫn phải tăng Hơn nữa một hệ thống rễ phát triễn ngoài việc giải quyết đợc vấn đề hạn còn cải thiện đợc sự cạnh tranh với cỏ dại và dành đợc dinh dỡng (Mambani & Lal, 1983) [31]

1.2.2.3 Cơ chế chịu hạn ở thế nớc trong mô thấp

Một đặc tính thích nghi quan trọng khi cây bị hạn là khả năng duy trì sức trơng của tế bào khi thế nớc của chúng giảm Các quá trình sinh lý, sinh hoá và phát sinh hình thái của cây đều chịu ảnh hởng của sức trơng tế bào Cơ chế này ở cây có thể đợc thực hiện nhờ sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và tính mềm dẻo của mô tế bào

- Điều chỉnh áp suất thẩm thấu:

Khi thực vật tồn tại trong môi trờng thiếu nớc thì sẽ bị mất cân bằng về thẩm thấu Để chống lại cây đã có những cơ chế đặc biệt liên quan đến những thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự tích luỹ các chất tan bao

điều chỉnh và bảo vệ thẩm thấu loại bỏ gốc tự do khi cây bị thiếu nớc

Bảng1 Các sản phẩm đợc tích luỹ và chức năng của chúng trong việc

chống chịu sự thiếu nớc (Bohnert & Jensen, 1996) [22].

Nhóm chất Tên chất và hợp chất Chức năng

Na + , điều tiết các chất dinh dỡng chính Protein LEA/dehydrin

Osmotin SOD/catalase

Bảo vệ thẩm thấu Các protein hình thành ở điều kiện bất lợi Phân giải gốc tự do

Acid amin Proline

Pinitol

Dự trữ carbon, điều chỉnh thẩm thấu

Điều chỉnh và bảo vệ thẩm thấu, loại bỏ gốc tự do

Polyamin Spermine

Spermidine

Cân bằng ion, bảo vệ chất nhiễm sắc

Amin bậc 4 Glycine betaine

β- Alanine betaine Dimethyl sylfonio – propionate

Bảo vệ thẩm thấu Bảo vệ thẩm thấu Bảo vệ thẩm thấu

Sắc tố và

carotenoid

Carotenoid, anthocyanin betalaine

Bảo vệ quang ức chế

- Sự mềm dẻo của mô: tính mềm dẻo của mô cũng liên quan đến sự điều chỉnh sức trơng của mô tế bào Tế bào càng nhỏ, tính dẻo dai của mô càng cao thì duy trì sức trơng của chúng tốt hơn.

1.2.2.4 Cơ chế phục hồi sau hạn

Cơ chế phục hồi là khả năng huy động các cơ chế sửa chữa khi tái hấp thụ nớc đem lại sự phục hồi các tổn hại trong quá trình khô hạn Tham gia vào cơ chế phục hồi này là các protein và các chất tan khác

Các protein có bản chất là protease phân giải các protein bị phá huỷ không thể sửa chữa do tác động của khô hạn (Guerrero & Cs, 1990) [25]

Các protein sốc nhiệt HPS (Heat Shock Protein) là các protein kèm có chức năng sửa chữa, giúp các protein khác phục hồi lại cấu trúc tự nhiên sau khi bị biến tính hoặc bị tháo xoắn khi có hạn (Kiyosue & Cs, 1994) [30]

Nhiều chất tan trong điều chỉnh thẩm thấu của tế bào trong điều kiện bất lợi cũng có tác dụng trong quá trình phục hồi của cây Sự tích luỹ protein khi thiếu nớc có thể có chức năng khác nh bảo vệ Enzym và giữ ổn định màng sinh học Sự phân giải proline có thể tăng năng luợng của tế bảo phục hồi (Saradhi, 1991) [36]

1.2.3 Các biện pháp khắc phục nâng cao tính chịu hạn

Để khắc phục và nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trồng, hiện nay có những biện pháp sau:

Biện pháp kỹ thuật: Sử dụng phơng pháp tôi hạt giống của Ghenken, xử

cứu gần đây trên các vùng hạn nặng ở Châu Phi cho thấy, có khả năng sử dụng các chế phẩm hoá học đặc hiệu để làm tăng tính chịu hạn cho cây Cơ sở khoa học của biện pháp này là sử dụng các chất chống thoát hơi nớc Các chất th-

cho thấy khi sử dụng axit usnic bón vào đất trớc khi gieo hạt đã làm tăng năng suất đậu đỗ lên đáng kể so với đối chứng cùng trồng trong điều kiện khô hạn Khi bón 12,5 kg axit usnic năng suất hạt tăng 37,7% [12].

Biện pháp thứ hai là chọn tạo và sử dụng các giống chịu hạn Đây là biện pháp tích cực, lâu dài và cho hiệu quả cao nhất Đặc trng cơ bản là tính chín sớm, tuy năng suất của chúng thấp nhng lại có khả năng sử dụng nớc rất tiết kiệm Để chọn giống chịu hạn nguời ta thờng dựa vào các đặc điểm hình thái nh: Các đặc trng về bộ rễ, khí khổng, độ rắn và độ dày của lá, hình dạng

vào chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá và quá trình trao đổi chất khi gặp hạn nh: Khả

đời của các chỉ thị phân tử liên kết với các đặc trng chống chịu hạn, đã tạo ra bớc tiến mới trong công tác chọn giống cây trồng

ở lúa những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của hai nhóm: lúa nớc, lúa cạn và lúa chịu hạn cho thấy:

- Bộ rễ của nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn ăn sâu hơn đáng kể so với nhóm lúa nớc Sự phân bố khối lợng rễ của nhóm lúa nớc tập trung chủ yếu ở lớp đất mặt 0-20 cm ( đạt khoảng 85-91%) Còn đối với nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn ở tầng đất 61-80 cm vẫn còn đạt 3,6-7,3%

- Lá của nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn dày hơn, mật độ khí khổng ít hơn, màu sắc lá xanh nhạt hơn do hàm lợng diệp lục a, b ít hơn và hàm lợng sắc tố carotenoid nhiều hơn nhóm lúa nớc

- Các số liệu phân tích về hàm lợng proline cho thấy trong điều kiện đủ nớc thì hàm lợng proline của hai nhóm trên là nh nhau Nhng trong điều kiện thiếu nớc hàm lợng proline trong lá của nhóm lúa cạn và chịu hạn tăng lên, còn nhóm lúa nớc lại giảm đi rõ rệt Điều này cho thấy hàm lợng proline trong

lá là nhân tố quan trọng trong việc giữ nớc và cân bằng nớc trong mô tế bào (Nguyễn Tấn Hinh, Trơng văn Kính, 2002) [3].

1.3 Một số phơng pháp tạo dòng chịu hạn

1.3.1 Chọn dòng chịu hạn thông qua kỹ thuật chọn dòng tế bào

Kỹ thuật chọn dòng tế bào chống chịu với điều kiện bất lợi của môi ờng thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đang là công cụ có hiệu quả cao trong chọn giống cây trồng Sự xuất hiện các biến dị soma xảy ra trong nuôi cấy đặc biệt là dới tác động của tác nhân và điều kiện chọn lọc, đã giúp các nhà khoa học phân lập ra các tế bào có khả năng chịu hạn khá Các

tác nhân gây khô hạn trong môi trờng nuôi cấy Các chất kìm hãm sinh trởng

nh axit abcisic, đợc coi là nhân tố tác động để tăng cờng khả năng giử nớc và chịu mất nớc của mô

1.3.2 Chọn dòng chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen

Có thể nói chịu đợc hạn và hình thành năng suất trong điều kiện hạn là kết quả tổng hợp của sự tác động đa gen trong các thời kỳ sinh trởng và phát triển (bao gồm sinh trởng của bộ rễ, đặc điểm chống chịu hạn của thân lá, khả

Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra các nhóm gen chịu các điều kiện bất lợi về nớc nh: Nhóm gen LEA của cây lúa mạch mã hoá protein trong giai

đoạn muộn của qúa trình hình thành phôi, giúp bảo vệ phôi trong quá trình ngủ nghỉ và chịu hạn của phôi trong hạt khô (Xu & Cs, 1996) Nhóm gen RAB (Responsive to Absicis acid) của cây lúa nớc, phản ứng với ABA nội sinh và ngoại sinh cho ra những protein có chức năng ức chế và bảo vệ thẩm thấu (Claes, 1990; Yamaguchi 1989) Nhóm gen thuộc chu trình sinh tổng hợp

1.3.3 Chọn dòng chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử MAS

MAS (Marker Assisted Selection) và bản đồ di truyền đã cho các nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ giữa tính trạng-gen-môi trờng Nhờ những chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen quan tâm cho phép chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không cần đánh giá kiểu hình cũng nh không phụ thuộc vào điều kiện môi trờng Đối với lúa MAS đã đợc ứng dụng với các gen kháng bệnh bạc lá, đạo ôn và ruồi đục thân Bằng con đờng MAS ngời ta đã qui tụ đợc một số dòng mang 2, 3 và 4 gen kháng bệnh bạc lá (Huang et al, 1997); qui tụ thành công 3 gen kháng nấm đạo ôn và đa gen kháng ruồi đục thân Gm2, Gm4t, Gm7 vào các giống lúa có tiềm năng năng suất cao [17]

Đối với gen tính trạng số lợng (đặc biệt là các gen chống chịu điều kiện bất lợi) việc ứng dụng MAS còn nhiều khó khăn và đến nay mới đạt đợc những kết quả bớc đầu nh việc lập bản đồ và xây dựng QTL (Quantitative Trait Loci) cho một số tính trạng ở lúa nh tính chịu hạn, tính chịu nhôm Về tính chịu hạn thì MAS liên kết với tính trạng hình thái rễ nh: độ dài rễ, số lợng

rễ, tỷ lệ khối lợng khô của rễ trên thân, tỷ lệ khối lợng khô của rễ sâu trên thân đang đợc quan tâm [9]

1.4 Đột biến phóng xạ trong tạo giống

1.4.1 Các thành tựu về chọn tạo giống đột biến

Tạo giống đột biến đã có lịch sử phát triển lâu đời và rộng lớn Tuy nhiên, đến năm 1909 khi Hugo De Vries tiến hành nghiên cứu và đa ra học thuyết đột biến thì nó mới đợc chấp nhận Đến năm 1953 ngời ta đã tìm ra các hoá chất siêu đột biến nh: Ethylenimine (EI), Ethylmethane sulphonate

có thể gây đột biến ở cây trồng, động vật, thậm chí ở cả vi sinh vật Cùng với những khám phá về cấu trúc vật liệu di truyền của Watson và Crick đã mang

lại nhiều tiến bộ mới trong nghiên cứu cơ chế đột biến ở mức độ phân tử, quá trình tự sửa chữa và tạo đột biến.

Từ năm 1965 trở đi những nghiên cứu về đột biến tiếp tục phát triển Tạo đột biến không chỉ là một phơng pháp hữu hiệu để tạo giống cây trồng mà

nó còn làm tăng tính đa dạng sinh học Nhiều nớc đã chú trọng áp dụng tác nhân gây đột biến nhân tạo trong chọn tạo giống mới nh: Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, ấn Độ, Trung Quốc, Bagladesh, Mianma, Thái Lan và Việt Nam Một số giống lúa đột biến nổi tiếng đã đợc biết đến nh: Reimei (Nhật Bản, 1966), Jagannath (ấn Độ, 1969), Calrose (Mỹ, 1976), RD-6 (Thái Lan, 1977), Basmati 615 (ấn Độ), Sheshu-802 (Trung Quốc)…

Theo tài liệu của FAO/IAEA đến 7/2000 trên thế giới có hơn 2225 giống cây trồng trong sản xuất đợc chọn tạo bằng đột biến gen Trung Quốc là nớc dẫn đầu về số lợng đột biến nhân tạo đợc công nhận, chiếm 27,2% tổng số giống đột biến trên thế giới

ở Việt Nam đột biến thực nghiệm đã đợc khởi xớng vào năm 1960 bởi Lơng Đình Của Tuy nhiên nó chỉ phát triển từ năm 1980 bởi Phan Phải và đội nghiên cứu của ông Sau đó nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu đột biến ở nhiều loại cây trồng khác nhau nh: Lúa, ngô, đậu, táo, cà chua, da hấu, lạc… Nhiều dòng cây đột biến có giá trị cao đã đợc tạo ra và chọn lọc để sử dụng trực tiếp trong sản xuất, hoặc gián tiếp cho việc lai tạo ra giống mới Đến nay

có nhiều giống đột biến đã đợc công nhận là giống quốc gia nh: Giống lúa

®iÓm lµ cho s¶n lîng cao, chÊt lîng tèt, cøng c©y, chèng chÞu s©u bÖnh vµ ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i trêng kh¸.

1.4.2 Đột biến và các nhân tố gây đột biến

Đột biến (Mutation), bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mutatio, là những biến

đổi trong vật chất di truyền, nghĩa là những biến đổi trong cấu trúc gen, hoặc các biến đổi trong cấu trúc và số lợng nhiễm sắc thể Đột biến tạo nên vô số các biến dị, làm tăng tính đa dạng trong sinh giới, là cơ sở của quá trình chọn lọc

Trên cơ sở nguyên nhân phát sinh đột biến, nguồn gốc và đặc điểm của

đột biến mà đột biến đợc chia làm nhiều loại khác nhau Dựa vào thành phần cấu trúc bị đột biến có thể chia đột biến thành bốn nhóm là đột biến gen, đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến số lợng nhiễm sắc thể và đột biến tế bào chất Dựa vào nguyên nhân phát sinh đột biến các đột biến đợc chia thành hai nhóm: đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo Dựa vào hậu quả đột biến chia thành: đột biến gây chết, đột biến giảm sống, đột biến làm xuất hiện làm xuất

tính

cho mỗi gen hoặc locus Trong khi đó đột biến nhân tạo gây ra bởi các tác nhân gây đột biến vật lý và hoá học đã làm tăng tần số đột biến lên 10-100 lần Về tác nhân gây ra đột biến có thể chia làm hai loại là: tác nhân vật lý và tác nhân hoá học

Tất cả nhân tố vật lý gây biến tính ADN, gây đứt đoạn hoặc làm hỏng cấu trúc của ADN đều gây đột biến bao gồm: nhiệt độ; các loại tia UV, tia X,

không đủ gây ion hoá, khả năng xuyên sâu kém nên chỉ đợc sử dụng để gây

đột biến ở hạt phấn, tế bào trần, vi sinh vật

Các nhân tố học gây đột biến chủ yếu do làm thay đổi cấu trúc gen và cấu trúc nhiễm sắc thể Các hoá chất gây đột biến có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, màng nhân và đồng thời gây thay đổi trạng thái của ADN và nhiễm sắc thể Tác nhân hoá học gây đột biến có thể chia thành các nhóm sau

các chất acridin nh proflavin; các chất đồng đẳng của base nitơ nh bromuracin, aminopurin

5-1.4.3 Bức xạ ion hoá và cơ chế gây đột biến

1.4.3.1 Bức xạ ion hoá

tr-ờng và từ trtr-ờng, có khả năng xuyên sâu kém, dùng trong y học là chủ yếu

thấu hơn tia X Tia gamma thờng xuất hiện trong quá trình phân rã hạt nhân các đồng vị phóng xạ hoặc các phản ứng hạt nhân Có hai nguồn phát tia

tr-ờng, có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện để xử lý cây trồng

Tia alpha: Là tia có bản chất hạt đợc hình thành từ hạt nhân của nguyên

tử He (helium) Hạt alpha có khả năng xuyên sâu 0,07 mm trong mô sinh vật

Tia beta: Là chùm điện tử giải phóng ra từ nguyên tử của các đồng vị

Liều lợng phóng xạ đợc xác định bằng cách đo khả năng ion hoá của phóng xạ trong không khí, đơn vị là r (Roentgen) Năng lợng hấp thụ đợc đo bằng rad (1rad = 100 erg/g) Hai đơn vị r và rad đợc coi là tơng đơng nhau

1 GY (gray) = 100 rad

Tia phóng xạ ion hoá gây tổn thơng cấu trúc ADN, do bức xạ ion hoá

có thể gây đứt mạch đơn, đứt mạch kép hoặc thay thế các bazơ nitơ Đối với sinh vật nhân chuẩn bức xạ ion hoá làm đứt gãy nhiễm sắc thể, thờng gây chết Nhiều loại sinh vật trong tế bào có hệ thống tự sửa chữa đột biến, tuy nhiên có thể dẫn đến đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn và mất đoạn

Thuyết cơ chế tác dụng gián tiếp: Bức xạ ion hóa tác dụng gián tiếp lên phân tử nớc trong tế bào tạo nên các gốc tự do Các gốc tự do có thể tác động với các chất trong tế bào tạo thành peroxyt Các peroxyt tác dụng lên phân tử

hoặc làm đứt liên kết giữa đờng pentoza và gốc dị vòng chứa nitơ, hoặc làm

đứt vòng pirimidin gây đứt mạch ADN, gây ra các đột biến gen

Thuyết hiện đại: Thuyết hiện đại giải thích cơ chế tác dụng của tia phóng xạ nên vật chất di truyền bằng nồng độ và trạng thái của các chất hữu cơ trong tế bào Khi tế bào có nồng độ các chất hữu cơ cao, sự va chạm của l-ợng tử vào các phân tử nhiều hơn dẫn đến hiệu quả trực tiếp lớn hơn Nếu nồng độ thấp, các lợng tử phóng xạ phân huỷ nớc tạo thành các gốc tự do, hình thành các peroxyt vô cơ và hữu cơ làm biến đổi cấu trúc ADN gây ra đột biến.

1.4.4 Phơng pháp đột biến nhân tạo ở cây trồng

Nguyên tắc cơ bản để gây tạo đột biến thành công là dựa vào đặc điểm sinh trởng, phát triển của cây trồng để chọn phơng pháp và tác nhân gây đột biến thích hợp Đột biến có thể xuất hiện ở bất cứ tế bào nào của cơ thể Tuy nhiên, những cây sinh sản bằng hạt thì chỉ có những đột biến nào xuất hiện trong tế bào của phôi hay từ những tế bào xôma thông qua hàng loạt lần phân chia để hình thành các tế bào sinh dục thì mới đợc di truyền cho đời sau (Trần Duy Quý) [15]

Đa số các đột biến là đột biến lặn Do đó ở đời M1 không biểu hiện ra bên ngoài trừ trờng hợp đột biến trội và trội không hoàn toàn Tuy vậy không phải bao giờ cũng phát hiện đợc đột biến trội và nửa trội vì có một số tính trạng đợc qui định bởi sự tác động của đa gen, các gen riêng rẽ thì không đủ

đó lại là những đột biến nhỏ rất có giá trị về phơng diện chọn giống

Mặt khác đột biến thực nghiệm còn giúp ta khắc phục đợc hiện tợng không lai đợc ở một số loài không có hoa hoặc có hoa, quả nhỏ nh lúa, cao l-

ơng Với đột biến phóng xạ, để thu nhận nhiều đột biến ta cần phải chiếu xạ ở liều lợng đủ lớn để gây ra biến dị di truyền có lợi mà không gây chết nhiều cũng nh tăng độ bất thụ Do đó với mỗi loại cây trồng cần tìm ra ngỡng tới hạn, là ngỡng làm giảm mạnh khả năng sống (chỉ còn 30-40% số cây sống sót

sau chiếu xạ), giảm độ hữu thụ và gây chết Các cây khác nhau thì có liều tới hạn rất khác nhau, xê dịch rất lớn từ 5-20 krad khi chiếu xạ ở hạt khô Từ liều tới hạn ta sẽ tìm ra liều lợng thích hợp nhất cho công tác chọn giống Thờng thì liều chiếu xạ thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần là đợc, tốt nhất là sử dụng liều chiếu xạ chỉ làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trởng Sau đây là liều lợng chiếu xạ và liều lợng tới hạn ở một số cây trồng chính (bộ phận chiếu xạ

là hạt khô)

Bảng 2 Liều tới hạn và liều chiếu xạ ở một số cây trồng chính

1.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase), đợc Kary Mullis & Cs phát minh vào năm 1985 Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN với sự tham gia của các thành phần chính bao gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi

hiện trong máy chu trình nhiệt hay còn gọi là máy PCR

Đoạn khuôn có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nhân gen qua PCR

Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn hoặc ARN đợc tách chiết từ

đối tợng cần nghiên cứu PCR chỉ cần một lợng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ

20-100 ng, phản ứng lại rất nhạy nên đòi hỏi ADN khuôn có độ nguyên vẹn cao và không bị lẫn tạp.

Mồi PCR là những đoạn oligonucleotid mạch đơn kích thớc từ 6-70 bazơ, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự ở hai đầu mạch khuôn Để đảm bảo hiệu quả PCR, cần thiết kế các mồi xuôi và ngợc có trình tự không bổ sung cho nhau, với hàm lợng G, C từ 40-75%, và phải đảm bảo Tm (nhiệt độ nóng chảy) không chênh lệch nhau quá lớn Hơn nữa khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngợc không nên quá 1kb

Enzym DNA polymerase thờng sử dụng là Taq polymerase, một loại enzym chịu nhiệt đợc chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus có khả năng

độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra chính xác và đặc hiệu Nồng độ Taq tối

u cho phản ứng khoảng 0,5 UI/25μl

Nồng độ các loại nucleotid khoảng 20-200 μM mỗi loại Sự mất cân bằng trong hỗn hợp dNTPs sẽ làm giảm độ chính xác của Taq polymerase

trọng trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hởng đến hoạt độ của Taq polymerase, nồng độ thích hợp là khoảng 0,5-5 mM

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn biến tính, phân tử ADN đợc biến tính ở

trong 30 giây đến 1 phút, nếu ADN khuôn có tỉ lệ G C cao, chuỗi GC liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp Giai đoạn gắn mồi, mồi bắt cặp

động, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 5 phút

Kết thúc mỗi chu kỳ lợng ADN tăng lên gấp đôi và ADN đợc nhân lên

sẽ trở thành ADN khuôn cho những chu kỳ sau Thông thờng đặt khoảng

30-60 chu kỳ Tuy nhiên số chu kỳ quá lớn sẽ làm tăng sự sai lệch trong quá trình tổng hợp Vì theo lý thuyết enzym Taq có thể tổng hợp nhầm nucleotid với tỷ

nh-ng sản phẩm lại khônh-ng tănh-ng, do sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứnh-ng, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, số các bản sao tạo ra quá nhiều nên các bản sao không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Hồ Huỳnh Thuỳ Dơng, 1998)

Nhờ tính đặc hiệu và nhanh chóng mà kỹ thuật PCR từ khi ra đời đã có những ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong sinh học phân tử và công nghệ gen Nó đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các chỉ thị phân tử khác dựa trên phản ứng PCR nh: RAPD, AFLP, SSR, STS…

1.5.2 Kỹ thuật RAPD và ứng dụng

Phơng pháp RAPD (RADNom Amplified Polymorphic DNAs) đợc William & Cs đề xuất năm 1990, thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi đợc thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này sẽ bắt cặp với ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào có trình tự bổ sung với nó Mồi ngẫu nhiên là các đoạn nucleotid từ 9-12 bases Phơng pháp này tạo ra từ 1-10 đoạn từ một mồi đơn qua phản ứng PCR (Reiter et al, 1992) [38] Cho sự

đa hình cao và có thể đợc xác định dễ dàng bằng nhuộm EtBr các băng trên gel agarose

Các đoạn nhân lên bởi RAPD có kích thớc từ nhỏ hơn 100 bp đến lớn hơn 2 kb Và chỉ thị RAPD đợc xem nh là yếu tố trội trong di truyền Mendel ở một cơ thể lỡng bội vì nó không phân biệt đợc cây dị hợp tử với cây đồng hợp

tử trội

u điểm của RAPD là chỉ cần một lợng ADN nhỏ từ 25-100 ng cho một phản ứng Các mồi ngẫu nhiên không đòi hỏi trình tự ADN trong cơ thể nghiên cứu và bộ mồi có thể đợc sử dụng cho nhiều loài khác nhau Mỗi mẫu cung cấp số liệu của nhiều locus trong hệ gen Vì vậy những đa hình hiếm trong các cá thể có quan hệ gần gũi có thể đợc phát hiện nhanh chóng

RAPD thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) và phân tích dòng gần đồng gen (near isogenic line) là các dòng chỉ khác nhau ở một tính trạng

Trong phản ứng RAPD đoạn mồi gắn với ADN khuôn ở nhiệt độ không

phân tử ADN là tơng đối dễ dàng Nhng do mồi ngắn nên dễ bị ảnh hởng bởi các điều kiện gắn mồi, vì thế kết quả nhiều khi không đồng nhất Và đôi khi hai đoạn ADN có kích thớc nh nhau từ hai cá thể cùng loài có thể không đợc tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen (Brown, 1996) [23]

1.5.3 Kỹ thuật SSR và ứng dụng

SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại

đơn giản, còn gọi là phơng pháp vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (Microsetllite) Bộ gen của Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích th-

ớc dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài từng giống Ví dụ ở lúa có khoảng gần

1000 lần lặp lại trình tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trình tự GATA/CTAT Nhiều loài cây một lá mầm nh ngô, lúa lặp lại đoạn CGG/GGC Các đoạn ADN thờng nằm gần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể, có vai trò giữ tính ổn định của bộ nhiễm sắc thể qua quá trình phân bào [16]

Do sự sai khác về kích thớc các đoạn lặp lại, nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen SSR là chỉ thị đồng

SSR thờng dài khoảng 18-20 bases Mỗi mồi có từ 1-12 locus đợc tổ hợp trong một phản ứng PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locus nên tiết kiệm đợc đáng kể thời gian và hoá chất.

Hạn chế của SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Bao gồm việc tách dòng và

đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR Tuy nhiên nhiều thành công đạt đợc đã khiến giá thành của nó giảm đi (Brown, 1996) Sản phẩm PCR sau đó đợc xác định chính xác bằng điện di trên gel acrylamide và nhuộm bạc

ở lúa các chỉ thị SSR đợc xác định là liên kết chặt với một số tính trạng hình thái đã đợc sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn nh: RM104 liên kết với tính trạng chiều cao cây; RM250, RM270 liên kết với độ dài rễ; RM156 liên kết với tính trạng số lợng rễ; RM263 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của

rễ trên thân; RM221, RM242, RM228 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ sâu trên thân (Nguyễn Đức Thành, 2001) [18] Đặc biệt là các locus RM221 trên NST số 2, RM242, RM288 trên NST số 9 có ảnh hởng lớn đến khả năng chịu hạn của các dòng lúa chọn lọc và có thể sử dụng nh một chỉ tiêu trong chọn dòng chịu hạn (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [9] Các locus kiểm soát rễ dài, rễ dày nh RM29 trên NST số 1;RM234, RM248 trên NST số 7 cũng đợc xem là những chỉ thị chuẩn trong chọn lọc các cá thể chịu hạn (Shen & Cs, 1999) [37]

1.5.4 Kỹ thuật STS và ứng dụng

Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) tức điểm trình tự đợc đánh dấu,

do Olson & Cs đề xuất năm 1989 STS có thể xem nh là một kỹ thuật thay thế RFLP và RAPD Nguyên lý của STS là: Xác định trình tự các nucleotid ở hai

đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong RFLP hay sản phẩm RAPD Sau đó dựa vào trình tự đã biết thiết kế mồi PCR có chiều dài 18-20

nucleotid Với những mồi nh vậy có thể tổng hợp những đoạn ADN nằm trong vùng sản phẩm RFLP và RAPD Cuối cùng điện di sản phẩm PCR và phân tích tính đa hình.

Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật dựa vào so sánh kích thớc các băng ADN Mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN có thể không khác nhau

về kích thớc nhng lại khác nhau về trình tự nucleotid Từ đó các nhà khoa học

này đợc gọi là CAPs (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)

Một chỉ thị khác dựa trên STS là SCARP (Sequence Charracterised Amplified Regions) là chỉ thị bậc hai phát triển từ chỉ thị RAPD đã đợc xác

định trên bản đồ di truyền và liên kết với một tính trạng nào đó Chỉ thị này dựa trên sự tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD đợc quan tâm Từ đó thiết kế mồi dài khoảng 25 mer bổ sung với trình tự đầu và cuối của đoạn RAPD ban đầu Do đó mỗi mồi SCARP sẽ xác định đợc một locus đơn tơng ứng với đoạn ADN ban đầu STS là chỉ thị đồng trội, đợc ứng dụng trong đánh giá và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS, ngoài ra còn đợc ứng dụng trong

đánh dấu gen, nhận dạng giống…

Hiện nay có một số chỉ thị STS đợc sử dụng trong chọn dòng lúa chịu hạn nh: RZ19, RG690, RZ730 và RZ801 trên NST số 1; RG171, RG157, RZ318 trên NST số 2; RZ978, RZ288, RZ12 trên NST số 9 đợc xác định là liên kết chặt với các locus kiểm soát hình thái rễ dài, rễ dày (Shen & Cs, 1999) Các locus RG140 liên quan đến điều hoà áp suất thẩm thấu trên NST

Cs, 1999) [40]

Chơng 2 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

- 4 giống lúa: Chí chùa 1, Chí chùa 2 là hai giống lúa nơng địa phơng xin từ Lào Cai, Yên Bái; R2021, RDB09 là hai giống lúa cạn do Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

- Các hoá chất đặt mua từ các hãng USB, Sigma, Amersham; các mồi RAPD, đặt mua tại hãng Operon (Mỹ); Các mồi SSR mua từ hãng New England Biolabs

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Phơng pháp xử lý phóng xạ

Chiếu xạ các giống lúa Chí chùa 1, Chí chùa 2, với 6 liều 10, 15, 20, 25,

30, và 40 Krad, tại Trung tâm chiếu xạ - Viện Khoa học và Kỹ thuật hạt nhân,

Các dòng chiếu xạ và đối chứng của 3 giống đợc ngâm trong nớc ấm (3 sôi, 2 lạnh) trong hai ngày để hạt hút nớc đạt độ ẩm 25-30%, sau đó chắt hết

Khi cây mạ đợc 10 ngày tuổi, loại bỏ những cây có đột biến có hại quan

cây còn lại cho xử lý PEG, đồng thời chọn ngẫu nhiễn 50 cây từ mỗi dòng chiếu xạ và đối chứng của từng giống, đo chiều cao cây và độ dài rễ để xác

định ảnh hởng của phóng xạ lên khả năng sinh trởng và phát triển của cây mạ

2.2.2 Phơng pháp xử lý hạn PEG với các cây M 0

Polyethyleneglycol (PEG) là một chất có ái lực lớn với nớc Cùng với

gây khô hạn trong môi trờng nuôi cấy Adkin và Cs (1995) đã sử dụng PEG

8000 làm tác nhân gây mất nớc trong môi trờng nuôi cấy mô sẹo, kết quả là chọn đợc dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 Trong

đề tài này chúng tôi đã sử dụng PEG 8000 để gây hạn nhân tạo ở giai đoạn mạ [31]

Chúng tôi sử dụng môi trờng Hoangland 1/2 có bổ sung 1% đờng, 30%

môi trờng Hoangland đợc trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Môi trờng Hoangland

(g/100 ml)

Hàm lợng (ml/l)

Tiến hành xử lý hạn trong 10 ngày sau đó ngâm nớc 1ngày rồi rửa sạch

rễ và cho môi trờng phục hồi là môi trờng Hoangland 1/2 không chứa PEG Một tuần sau khi cho môi trờng phục hồi, tính tỷ lệ cây hồi (cây xanh trở lại)

để xác định khả năng phục hồi sau hạn của các dòng chiếu xạ so với dòng đối chứng

2.2.3 Phơng pháp tách chiết ADN hệ gen

Các cây phục hồi đợc trồng ở nhà lới, sau 3-4 tuần có thể thu lá để tách chiết ADN Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phơng pháp tách chiết ADN hệ gen của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Các hoá chất để tách chiết ADN hệ gen nh sau:

5 M; 4,5 ml EDTA; 250 μl β- Mercapto ethanol; 2,25 g CTAB

ớc 1: Nghiền 1 gam lá lúa trong nitơ lỏng bằng chày cố sứ Bột đã nghiền

ớc 9: Hút lớp trên sang ống mới, tủa bằng cồn tuyệt đối lạnh (1-1,2 ml)

cộng thêm 15 μl NaCl 5 M, xoay ống nhẹ nhàng trong vài phút Nếu

ADN tủa nhiều thì có thể câu ra ống mới Nếu tủa ít thì để tủ -200C trong 30 phút.

ớc 12: Hoà tan ADN bằng TE 8,0 lợng TE tuỳ vào lợng tủa Sau đó thêm

ADN sau khi tinh sạch theo phơng pháp trên đợc đo nồng độ trên máy quang phổ 8452 Hewllet và dựa vào đó để pha loãng ra nồng độ 25 ng/μl bằng nớc cất 3 lần để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.4 Phơng pháp phân tích RAPD

2.2.4.1 Phản ứng PCR với các mồi RAPD

Kỹ thuật chạy PCR của hệ gen với các mồi RAPD đợc thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ)

Bảng 2.2 Các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Thành phần của mỗi phản ứng nh sau:

Xylene cyanol FF; 0,4 g Sucrose; thêm nớc cất đến 1ml

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0,4 g thạch cho vào 40 ml dung dịch

đệm 1xTBE Đun trong lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch (lợng agarose và dung dịch TBE tuỳ thuộc vào thể tích của

Đợi khoảng 45-60 phút cho gel đông lại Đặt khay vào bể điện di sau đó đổ dung dịch 1xTBE ngập gel khoảng 0,5 cm, rút lợc khỏi gel

và tra thêm ADN marker 1kb để xác định độ dài của các băng ADN Điện

di ở 76 V trong vòng 1 tiếng (thời gian và hiệu điện thế điện di tuỳ thuộc vào khoảng cách giữa hai điện cực và mục đích của ngời nghiên cứu) ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cựcdơng của điện trờng Dựa vào vị trí của vạch màu để dừng quá trình điện di

bromide nồng độ 30 μl/l Để trên máy lắc trong 25-30 phút, sau đó rửa bản gel và ngâm nớc cất 15 phút

254-260 nm của máy soi ADN Sau đó đợc chụp ảnh bằng máy chuyên dụng Polaroid

2.2.4.2 Phơng pháp phân tích số liệu RAPD

Dựa vào vị trí của các băng ADN so với ADN chuẩn ta xác định đợc sự

có mặt hay vắng mặt của chúng ở các dòng nghiên cứu Nếu có ký hiệu là 1, không có ký hiệu là 0 Các số liệu này sau đó đợc đa vào xử lý theo chơng trình NTSYS pc để tính ma trận tơng đồng giữa các đôi mẫu Việc tính toán

ma trận tơng đồng dựa trên công thức:

J ij = a/(n-d) Trong đó:

a: số băng ADN có ở hai dòng i và j

d: số băng ADN không có ở cả hai dòng i và jn: Tổng số băng thu đợc

Sau đó xử lý tiếp trong NTSYT-SIMQUAL để biểu hiện trên biểu đồ

2.2.5 Phơng pháp phân tích SSR

2.2.5.1 Phản ứng PCR với các mồi SSR

Ngoài các mồi RAPD, chúng tôi còn sử dụng các mồi SSR đợc xác định

là có liên kết với một số tính trạng hình thái rễ để xác định khả năng chịu hạn của các dòng nghiên cứu Các mồi SSR đợc sử dụng nh sau:

Bảng 2.3 Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

STT Mồi Trình tự mồi xuôi Trình tự mồi ngợc

1 μl ADN (25 ng/ μl)Chơng trình chạy nh sau:

3 550C trong 1 phút 6 720C trong 5 phút

Sản phẩm PCR với cá mồi SSR đợc chạy điện di trên gel

polyacrylamide có độ phân giải cao và sử dụng phơng pháp nhuộm bạc để phát hiện băng

Chuẩn bị các bản kính: Kính chạy gel có hai tấm, tấm kính dẫn điện không bám gel và tấm kính dài để gắn gel Hai tấm kính đợc rửa sạch bằng n-

ớc cất 2-3 lần sau đó đợc lau khô bằng giấy lụa mềm, lau lại bằng giấy Kimwipe cho sạch

- Tấm ngắn: Bôi trơn bằng dung dịch Rain X thấm trên giấy Kimwipe, chờ 15-20 phút cho khô

- Tấm dài: Đợc bôi một lớp dính gồm 1 ml hỗn hợp 95% cồn tuyệt đối; 0,5 % acetic acid và 3 μl Bind silance Chờ 15-20 phút cho khô rồi dùng giấy Kimwipe lau lại để loại bỏ dịch thừa

Ghép hai tấm kính lại với nhau để tạo khuôn đúc gel có độ dày bằng độ dày của hai thanh spacer nằm giữa hai tấm kính

Chuẩn bị gel chạy điện di: Lấy 55 ml polyacrylamide, bổ sung thêm 55

μl TEMED, và 165 μl APS 10%, trộn đều Dùng xi-lanh 140 cc hút và bơm từ

từ vào khoảng trống giữa hai tấm kính qua một lỗ ở đáy hệ thống của bản gel 19x50 cm, bản gel của máy đọc trình tự Sequen Gen (Biorad Laboratories Inc; Hercules, Calif, USA)

Lắp lợc vào gel, chờ 2-3 giờ cho gel đông lại Trong trờng hợp giữ gel qua đêm ở nhiệt độ phòng cần bịt đầu có lợc bằng màng plastic

Tra mẫu: Sản phẩm SSR đợc thêm 8 μl dung dịch tra mẫu 3xSSR (0,2

ml 5 M Na0H; 95 ml Formamide 95%; 50 μg Bromophenol blue; 50 μg