ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ

Hiên nay, rất ít báo cáo công bố về vấn đề này, nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các vi sinh vật hoặc enzyme đã được tim thấy và nguyên cứu không phải lúc nào cũng cần kim loại cho sự sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGÀNH : HĨA DẦU

-


-

ỨNG DỤNG CỦA CƠNG NGHỆ

SINH HỌC TRONG VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS ĐỖ BIÊN CƯƠNG

SINH VIÊN THỰC HIỆN : HUỲNH ĐỨC KỲ

MỤC LỤC

ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRONG VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ

I Kim loại có trong dầu mỏ 2

1 Kim loại trong dầu mỏ 2

2 Ảnh hưởng của kim loại trong các quá trình lọc dầu 2

II Ứng dụng công nghệ sinh học trong khử kim loại trong dầu mỏ 3

1 Porphirin 3

2.Biodemetallization 3

III Phương pháp loại bỏ kim loại ra khỏi nhiên liệu hóa thạch 5

1 Tóm tắt phương pháp 5

2 Mô tả chi tiết phương pháp 6

IV Thảo luận 14

ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG

VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ

I Kim loại có trong dầu mỏ

1 Kim loại trong dầu mỏ

Kim loại trong dầu mỏ không nhiều, thường từ vài phần triệu đến vài phần vạn Chúng có trong dầu mỏ dưới dạng phức với các hợp chất hữu cơ (cơ-kim), thông thường là dạng phức porphirin

Những kim loại nằm trong phức porphirin thường là Vanadium(V) và Nickel (Ni), trong những loại dầu nhiều S chứa nhiều porphirin dưới dạng phức với V, ngược lại trong các loại dầu ít S và đặc biệt là nhiều N thì chứa nhiều porphirin dưới dạng phức với Ni

Các phức nói trên ngoài của V và Ni còn có thể là phức của các kim loại khác như Fe, Cu, Zn, Ti, Ca, Mn

2 Ảnh hưởng của kim loại trong các quá trình lọc dầu

Tuy kim loại tồn tại trong dầu mỏ với hàm lượng rất nhỏ (cỡ ppm) nhưng nó phản ánh mức độ ảnh hưởng của chúng khi sử dụng các phân đoạn làm nguyên liệu hay nhiên liệu cho các quá trình chế biến xúc tác

Ví dụ : Nếu trong nhiên liệu đốt lò (FO) chứa nhiều V, Ni các kim loại này sẽ gây thủng lò do tạo thành các hợp kim với sắt có nhiệt độ nóng chảy thấp; còn trong phản ứng reforming xúc tác, Pb, As sẽ làm xúc tác mất hoạt tính nhanh chóng; Nhiên liệu chứa nhiều kim loại nặng khi cháy sẽ tạo cặn gây ô nhiễm môi trường và làm mài mòn đông cơ

Các loại dầu chứa nhiều kim loại nặng đòi hỏi một công nghệ chế biến phức tạp và chi phí sản xuất cao, hơn nữa năng suất lại không cao Do đó nếu có thể loại bỏ hoặc giảm tới mức có thể (thông thường không được quá 5-10 ppm) lượng kim loại này trước khi đưa vào chế biến thì có thể giảm chi phí sản xuất mà hiệu xuất cũng tăng lên vì giảm khả năng ngộ độc xúc tác do kim loại gây ra

II Ứng dụng công nghệ sinh học trong khử kim loại trong dầu mỏ

1 Porphirin

Porphirin là các phân tử hữu cơ có cấu trúc rất giống với cấu trúc của diệp lục trong thực vật và hemoglobin trong máu động vật Tiền thân của porphyrin là porphine, các porphine biến đổi được gọi là porphyrin Chúng được phân loại như các hợp chất tetrapyrrole và thường chứa các kim loại như Ni và V Porphirin có thể dễ dàng bị phá hủy trong môi trường oxi hóa hoặc môi trường nhiệt Porphirin là một trong những luận điểm chứng minh nguồn gốc sinh học của dầu mỏ

Một số cấu trúc porphyrin thương gặp

Hình 1

Cấu trúc của heme (một trong các loại porphyrin phổ biến nhất) bao gồm 4 tiểu đơn vị pyrrole kết nối với nhau ở nguyên tử carbon α của chúng thong qua các cầu methane (=CH-)

2.Biodemetallization

Biodemetallization trong nghành công nghiệp lọc dầu về cơ bản là việc loại bỏ Nickel (Ni) và Vanadium (V) ra khỏi các loại dầu Hiên nay, rất ít báo cáo công bố về vấn đề này, nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các vi sinh vật hoặc enzyme đã được tim thấy và nguyên cứu không phải lúc nào cũng cần kim loại cho sự sinh trưởng và phát triển của mình, trong nhiều trường hợp chúng có thể dễ dàng sử dụng các nguồn sinh học khác để thay thế

Mặt dù vậy, một số enzyme chủ yếu từ lớp haloperoxidase như enzyme chloroperoxidase đã được chứng minh là có khả năng phản ứng oxi hóa dẫn đến sự oxi hóa từng phần của phần tử porphyrin giữ kim loại do đó có thể giải phóng được kim loại ra khỏi phức hợp này, phương pháp này có thể loại bỏ được 93% Ni và 53%

V

Hình 2 : Cấu trúc của chloroperoxidase

Tuy nhiên, bất lợi của loại enzyme này là có độ ổn định không cao, hơn nữa các phản ứng chỉ được chứng minh trong hỗn hợp dung môi hữu cơ chứ không phải là trên các loại dâu mỏ,thêm vào đó phương pháp này đòi hỏi một lượng clorua và sản phẩm được khử trùng bằng clo lớn nên gây ra những tác động không mong muốn tới môi trường từ việc đốt cháy nhiên liệu do quá trình demetallization tạo ra

Do vậy, việc nghiên cứu giải quyết các vấn đề liên quan đến khả năng hoạt động của hệ thống enzyme để thực hiện phản ứng demetallization trong dầu thô hoặc một thành phần có nguồn gốc dầu thô là cân thiết

Một số báo cáo cho thấy rằng peroxidase không đòi hỏi phải có ion halogen, chẳng hạn như việc sử dụng cytochrome C Cytochrome C là một heme protein , là một protein hòa tan cao, không giống như các cytochrome khác với độ tan vào khoảng 100g/L và là một thành phần quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử Nó có khả

năng tham gia phản ứng oxi hóa và phản ứng khử, nhưng không liên kết với oxi, nó chuyển đổi các electron giữa phức III và phức IV.

Hình 2 : Cấu trúc ba chiều của cytochrome c với mọt phân tử heme

phối hợp với một trung tâm nguyên tử sắt

III Phương pháp loại bỏ kim loại ra khỏi nhiên liệu hóa thạch

Mặt dù vi sinh vật đã được chứng minh là có thể làm phân hủy các metaltoporphyrin, nhưng có rất ít bằng chứng chứng minh rằng công nghệ sinh học có thể tiếp cận được vấn đề tách kim loại ra khỏi dầu thô Gần đây, Fedorak et al (Fedorak, PM et al, Enzyme microb Technol 15:429-437 (1993)) đã chứng minh rằng một enzyme ngoại bào, chloroperoxidase có thể biến đổi các petroporphyrin và asphaltenes.Phương pháp đã loại bỏ được 93% Nickel octaethylporphyrin và 53% vanadyl octaethyporphyrin từ phần asphalten Tuy nhiên hệ thống yêu cầu clorua và các sản phẩm khử trùng bằng clorua Sản phẩm khử trùng bằng clo tạo ra những vấn

đề không mong muốn về môi trường

1 Tóm tắt phương pháp

Là một phương pháp loại bỏ kim loại trong nhiên liệu hóa thạch với một xúc tác sinh học chứa oxygenase, chính nó sẽ làm giảm các phân tử porphyrin khi có những điều kiện thích hợp cho việc loại bỏ kim loại và sẽ tách kim loại từ nhiên liệu hóa thạch Các phản ứng được thực hiện tốt nhất khi không có mặt clo hoặc clorua Ngược lại với peoxidase, chẳng hạn như chloroperoxidase, oxygenase có thể làm giảm

các phân tử porphyrin mà không phụ thuộc vào mạch hydrocarbon bằng clo và peroxidase Những điển hình của các xúc tác sinh học này gồm có các heme oxygenase và cytochrome c reductase, chẳng hạn như cytochrome C reductase từ Bacillus megaterium, Catharanthus roseuse, Escherichia coli, các tế bào động vật, tế bào thực vật nấm men

2 Mô tả chi tiết phương pháp

Phương pháp dựa trên việc khám phá ra rằng các enzyme có thể phân hủy các phân tử porphyrin, đặc biệt là metalloporphyrin và có thể loại bỏ các kim loại ra khỏi nhiên liệu hóa thạch Các kim loại có thể được loại trừ bằng sáng chế thường nằm trong các hợp chất organometallic như etioporphyrin Các kim loại có thể được loại bỏ

là nikel (Ni), Vanadium (Va), Coban (Co), Đồng (Cu), Sắt (Fe), Magie (Mg), và kẽm (Zn)

Nhiên liệu hóa thạch có chứa kim loại bao gồm dầu mỏ và một số sản phẩm từ các phân đoạn chưng cất dầu khí, chất lỏng từ đá phiến có nguồn gốc từ than, dầu, bitum, gilsonite, hắc ín và các sản phẩm tổng hợp từ chúng Ở đây đặc biệt chú trọng đến dầu thô và một số sản phẩm từ các phân đoạn chưng cất dầu khí

Các chất xúc tác được sử dụng bao gồm một số loại enzyme có khả năng phản ứng demetallization hoặc các mảnh vỡ bất kỳ có khả năng đó của enzyme Các xúc tác sinh học được sử dụng trong phương pháp có thể giải phóng một cách tốt nhất kim loại ra khỏi các phân tử porphyrin

Ví dụ : Xúc tác sinh học heme oxygenase (EC 1.14.99.3) và cytochrome C reductase

chẳng hạn như cytochrome C reductase (EC 1.6.99.3) từ Bacillus megaterium, Catharanthus roseuse, Escherichia coli, tế bào động vật (chẳng hạn các tế bào trong gan, thận), tế bào thực vật (chẳng hạn như tế bào trong đậu xanh hoặc cây Araibidopsis thaliana), hoặc tế bào nấm men (chẳng hạn như Candida tropoculis)

Nói chung enzyme là chất xúc tác protein của tế bào sống Enzyme thúc đẩy, định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện một phản ứng cụ thể nào đó hoặc một loạt các phản ứng (chuỗi phản ứng) mà không tham gia vào thành phần sản phẩm Các xúc tác sinh học hữu ích trong phát minh bao gồm các loại vi sinh vật phân giãn, trích xuất, phân hủy

Các chất dinh dưỡng và các chất phụ gia có thể được bổ sung thêm vào bao gồm coenzyme, cofactor, hoặc các coreactant của các tế bào hoặc các enzyme

Ví dụ : NADPH là giúp ích thêm cho quá trình sử dụng cytochrome c reductase từ

Bacillus megaterium hoặc Catharanthus roseuse

Một trong những khả năng của chất xúc tác sinh học cố định là tạo thuận lợi cho việc phục hồi các xúc tác sinh học Ví dụ, một vi sinh vật không hữu hiệu có thể đóng vai trò như một người vận chuyển (carrier) cho các xúc tác sinh học Một số loại carrier có thể được sử dụng gồm loại màng, bộ lọc, nhựa cao phân tử vật liệu diatomaceous, hạt thủy tinh, các hạt gốm hoặc các chất hỗ trợ khác

Các xúc tác sinh tốt nhất là tồn tại ở pha lỏng trước khi được cho tiếp xúc với hỗn hợp nhiên liệu hóa thạch Pha lỏng có thể chỉ là nước hoặc có thể kết hợp với một

số dung môi phụ hợp khác bao gồm cả hỗn hợp của nước với một hợp chất hữu cơ nào khác Nói chung việc lựa chọn dung môi thích hợp là việc đòi hỏi phải có kĩ năng cao trong công việc

Hỗn hợp nhiên liệu hóa thạch và xúc tác sinh học này có thể được pha trộn để tạo thành một nhũ tương (ổn định hoặc không ổn định) hay microemulsion -

microemulsion đơn giản là sự pha trộn các thành phần mà không đòi hỏi những điều kiện cao thường được dung để hình thành các nhũ tương bình thường, chúng có độ ổn định về nhiệt động lực học, là một hỗn hợp đẳng hướng của nước, dầu và chất hoạt động bề mặt,ba loại cơ bản của microemulsion là loại trực tiếp (dầu phân tán trong nước o/w), đảo ngược (nước phân tán trong dầu w/o), và bicontinuous - có hoặc

không có phụ gia (chẳng hạn như chất hoạt động bề mặt hoặc chất phân tán)

Nhũ tương hoặc microemulsion được tạo ra theo các phương pháp kĩ thuật đã được biết tới, trong đó pha liên tục có thể là nước hoặc hợp chất hữu cơ, nhưng tốt nhất là hợp chất hữu cơ vì có thể giảm thiểu lượng nước đưa vào phản ứng

Môi trường phản ứng, có thể nhũ tương hoặc microemulsion, được duy trì theo những điều kiện đủ để quá trình loại bỏ các kim loại ra khỏi các hợp chất organometallic xảy ra

Ví dụ : Môi trường phản ứng có thể được ủ trong những điều kiện thuận lợi trong một

thời gian đủ để tạo ra một sản phẩm hữu cơ, kim loại tự do và trả lại nguyên ven xúc tác sinh học đã dùng, tốt nhất ở nhiệt độ từ 5 - 40oC, pH tốt nhất từ 5 – 9

Phản ứng này được thực hiện cho đến khi một phần lớn organometallic được chuyển đổi Các kim loại có thể được thu hồi từ dung dịch nước đi ra bằng các phương pháp như trích ly, chưng cất, hoặc sắc kí trao đổi ion

Quá trình này có thể được tiến hành trong một mẻ theo chế độ liên tục, bán liên tục hoặc gián đoạn kết hợp với một hoặc nhiều quá trình biorefining bổ sung (chẳng hạn như quá trình biodesulfurization) Hơn nữa, phản ứng có thể xảy ra trong một hệ thống khép kín hoặc mở trong sự có mặt hoặc không có mặt ánh sáng

Giải thích về hóa chất trong phương pháp :

+ Hóa chất : Flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), 3-(3-cholamidopropyl) dimethyammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS), cytochrome c, pyridine, và các porpyhyrin kim loại bao gồm octaethyl porphyrin coban (II), octaethyl porphyrin đồng (II), octaethyl porphyrin sắt (III), octaethyl porphyrin magie (II), octaethyl porphyrin nickel (II), octaethyl porphyrin vanadium (IV), octaethyl porphyrin kẽm (II) và chlorophyll Dithiothrietol (DTT), Hemin, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), cytochrome C và phenylmethyl sulfonyl fluoride DE52 nhựa trao đổi anion, 2', 5'-adenosine diphosphate-Sepharose 4B, (2'5'ADP) and Sepharose 4B

Cấu trúc phân tử của octaethyl

porphyrin vanadium (IV)

+ Nguồn gốc cytochrome C reductase : Bacillus megaterium, ATCC 14581 được sử dụng như cytochrome c reductase (Miura, Y and Fulco, A J J Biol Chem 249:1880-1888 (1974)) Plasmid pSK-R9 có chứa một đoạn mã hóa 2.3 kb cDNA cho một phần NADPH- cytochrome c reductase phu thuộc từ Catharanthus roseus (Meijer,

A H et al., Pl J 4:47-60 (1993)) Plasmid được electroporated và mantained trong E coli DR 10β theo Sambrook et al (Sambrook, J et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (1989))

Sáng chế sẽ được mô tả cụ thể hơn qua các bước sau :

+ Bước 1 : Chuẩn bị thô cytochrome C reductase

Các Bacillus megaterium được phát triển trong môi trường tối thiểu có chứa 0,4% axit casamino ở 30oC và liên tục được khuấy trộn E coli chứa PSK-R9 được nuôi cấy trong LB nước (Sambrook, J et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)) đến một OD 0,2 IPTG sau đó thêm vào môi trường nuôi cấy (trung tâm cuối cùng 2 mM) và được ủ ở 37oC lắc thêm 4 giờ như mô tả của Meijer et al, PI J 4:47-60 (1993) Tế bào vi khuẩn (vi khuẩn Bacillus hoặc E coli) được thu bằng phương pháp

ly tâm tại 4000 xg trong 5 phút và ở dạng viên resuspened chiếm 1/10 thể tích ban đầu

là 50 mM dung dịch đệm (pH = 7,8) có chứa 1mM EDTA, 5 mM DTT vad 20% (v/v) glycerol Các tế bào vi khuẩn bị hư hại được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm ở 38.000 xg trong 40 phút và được lưu trữ ở 800C

Nồng độ protein được xác định theo phương pháp của Lowry et al, J Biol Chem 193:265-275 (1951) bằng cách sử dụng albumin huyết thanh bò như một tiêu chuẩn Nồng độ cytochrome C reductase được ước lượng dựa trên hàm lượng flavin

+ Bược 2 : Thanh lọc cytochrome C reductase

Bacillus megaterium ATCC 14581 được cấy vào một lít môi trường cấy tối thiểu (3 bình 1 lít, và sử dung 2% chất cấy) và được ủ ở 300C và khuấy trộn trong 12 giờ Các tế bào được thu hồi bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 5.000 rpm trong mười phút ở 40C và được rửa qua một lần bằng sucrose 0,25M Cytochrome C reductase tinh khiết nhờ sử dụng phương pháp thanh lọc ba bước, cụ thể là các bước như sắc kí

gel sepharose 4B, sắc kí trao đổi ion DE52 và sắc kí 2’5’ADP sepharose như đã mô tả

ở (Sambrook, J et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)) Nông độ protein được theo dõi tại bước sóng 280 nm với một detector Bio Rad Econo UV Mỗi phần nhỏ được thu thập và đem đi khảo nghiệm khả năng hoạt động

+ Bước 3 : Khảo nghiệm cytochrome C reductase

Khảo nghiệm hỗn hợp có chứa 100 ml enzyme thô sonicate trích xuất và 40

mM cytochrome C, 100 mM NADPH trong một thể tích nhất định có chứa 1 ml dung dịch đệm Na3PO4 0,3M (pH = 7,4) Hỗn hợp này được ủ ở 37oC trong 30 phút khuấy trộn trong bóng tối Sự thoái phân bởi cytochrome C được theo dõi ở bước sóng 550

nm và tính bằng cách sử dụng hệ số extinction của 21 cm mM-1-1

+Bước 4 : Heme bi thoái phân bởi cytochrome C reductase

Hoạt động thoái phân các heme của cytochrome C reductase được mô tả cụ thể như trong mô tả của Yoshinaga et al (Yoshinaga, T et al., J Biol Chem 257:7794-7802 (1982)) Hỗn hợp phản ứng có chứa 40 nM hemin, 800 nm của NADPH và cytochrome C reductase trong dung dịch đệm K3PO4 0,1M ở pH= 7,5 ủ ở

370C trong 60 phút, khuấy trộn trong bóng tối Phản ứng được dừng lại bằng việc thêm vào 200 µl pyridine và 50 µl KOH 8M để tạo thành một pyridine hemochromogen (Paul, K G et al ActaChem Scand 7:1284-1287 (1953)).Số lượng heme bị xuống cấp được xác định bằng sự khác biệt của độ hấp thụ được đo ở các bước sóng 540 và 557 nm của pyridine hemochromogen và được tính toán thông qua

hệ số extinction của 20,7 mM-1 cm-1

Cytochrome C reductase có nguồn gốc từ các chất trích xuất từ dầu thô, các chất trích xuất này được thử nghiệm cho heme suy thoái Cytochrome C reductase có khả năng làm giảm ít nhất 15 nm của hemin trong một giờ theo các điều kiện được mô tả ở trên

+ Bước 5 : Đặc điểm các chế phẩm enzyme của cytochrome C reductase

Để đảm bảo hoạt tính của cytochrome C reductase và đánh giá được độ tinh khiết của nước giải hấp có chứa cytochrome C reductase, một phần cytochrome C reductase tinh khiết từ phương pháp lọc gel sepharose 4B hoặc sắc kí trao đổi ion sepharose 4B và DE52 đã được sử dụng để khảo nghiệm tính khử của cytochrome C