Khảo sát sự hình thành và phát triển của mô sẹo từ lát cắt mô dâu tằm trắng (morus alba l ) trên môi trường MS rắn và lỏng

Khảo sát ảnh hưởng của hormon sinh trưởng lên sự tạo thành mô sẹo từ cắt lát mỏng cây dâu tằm trên môi trường MS rắn .... Dịch huyền phù tế bào được tạo từ 3g mô sẹo và 27 ml môi trường

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC B ẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

TÓM TẮT 1

CHƯƠNG I 2

MỞ ĐẦU 2

I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 2

II MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 3

III KHÁCH THỂ NGHIÊN CỨU 3

IV ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

V NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG II 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

I CÂY DÂU TẰM 4

1.1 Vị trí phân loại 4

1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.3 Thành phần hóa học 5

1.4 Điều kiện tự nhiên và một số đặc điểm nông học 6

1.4.1 Ánh sáng 6

1.4.2 Nhiệt độ 7

1.4.3 Nước 7

1.4.4 Đất 7

1.4.5 Không khí 7

1.4.6 Dịch bệnh và sâu hại 8

1.5 Giá trị kinh tế và y dược 8

II NUÔI CẤY MÔ VÀ MỘT SỐ KẾT QUẢ NHIÊN CỨU TRÊN CÂY DÂU TẰM 8 2.1 Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật 8

2.2 Những phương pháp nuôi cấy mô 9

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL (Thin Cell Layer) 9

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo: 10

2.2.3 Phương pháp nuối cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc 11

2.3 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật 12

2.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy mô trên cây dâu tằm 13

2.4.1 Các nghiên cứu nuôi cấy mô dâu tằm trên thế giới 13

2.4.2 Các nghiên cứu về dâu tằm trong nước 15

CHƯƠNG III 16

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

I VẬT LIỆU 16

1.1 Vật liệu tạo mô sẹo trên môi trường rắn 16

1.2 Vật liệu tạo dịch huyền phù tế bào 16

II THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 16

III MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 16

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

4.1 Khảo sát quy trình khử trùng mẫu 17

4 2 Tạo cây con in vitro bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ 19

4 3 Khảo sát ảnh hưởng của hormon sinh trưởng lên sự tạo thành mô sẹo từ cắt lát mỏng cây dâu tằm trên môi trường MS rắn 20

4.3.1 Ảnh hưởng BA và 2, 4 – D lên sự tạo mô sẹo 20

4 3.2 Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo 22

4.3.3 Khảo sát sự tăng trưởng mô sẹo trên môi trường rắn 23

4.4 Khảo sát môi trường lỏng, lắc thích hợp để nuôi dịch huyền phù tế bào 24

4.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 25

4.4.2 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong dịch huyền phù bằng phương pháp nhuộm TTC 25

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dịch huyền phù ban đầu đến sự tăng trưởng của tế bào 25

4.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tăng trưởng của dịch huyền

phù tế bào 26

4.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của vitamin đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 27 4.4.6 Xác định đường cong tăng sinh trưởng của dịch huyền phù tế bào dâu tằm 27

4.4.6 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào 29

4.5 Xử lý số liệu 30

CHƯƠNG IV 31

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31

I QUI TRÌNH KHỬ MẪU 31

II SỰ TẠO CÂY CON IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH THỨC CHỒI NGỦ 32

III SỰ TẠO THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG MÔ SẸO TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN 34 IV KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG LỎNG THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ……… 40

4.1 Sự hình thành cuả dịch huyền phù tế bào 40

4.2 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong dịch huyền phù tế bào bằng phương pháp nhuộm TTC 42

4.3 Ảnh hưởng của thế tích tế bào ban đầu đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 43

4.3 Ảnh hưởng của saccharose lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 44

4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin tổng lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 46

4.3 Khảo sát sự sinh trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường lỏng lắc 47

3.6 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào 49

CHƯƠNG 4 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

I KẾT LUẬN 51

1.1 Quy trình khử trùng mẫu 51

1.2 Nhân giống dâu tằm in vitro từ chồi bên 51

1.3 Ảnh hưởng của hormon sinh trưởng lên sự tạo mô sẹo từ cắt lát mỏng thân non dâu

tằm 51

1.4 Tạo dịch huyền phù tế bào 51

1.5 Thể tích tế bào lắng ban đầu để thích hợp cho sự tăng trưởng của dịch huyền phù 52 1.6 Nồng độ đường saccharose thích hợp cho dịch huyền phù tế bào tăng trưởng 52

1.7 Thể tích vitamin tổng trong môi trường MS lỏng thích hợp cho dịch huyền phù tế bào tăng trưởng 52

1.8 Xác định đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 52

1.9 Tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát cắt mỏng tế bào 52

II KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

TCL : Thin Cell Layer

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian lắc mẫu lên quá

trình khử trùng 19

Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA và NAA khác nhau lên sự tạo cây con bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ 20

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA và 2, 4 - D khác nhau lên sự tạo sẹo 21

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA và NAA khác nhau lên sự tạo sẹo 23

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và NAA khác nhau lên tăng trưởng mô sẹo 24

Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích ban đầu lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 25

Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 26

Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của vitamin lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 27

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng mẫu 31

Bảng 4.2 Kết quả tạo chồi in vitro bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ ở tuần 04 33

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và 2, 4 – D lên sự tạo mô sẹo và chỉ số tăng trưởng của mô sẹo từ ngày 14- ngày 21 37

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tạo mô sẹo và chỉ số tăng trưởng của mô sẹo từ ngày 14- ngày 21 37

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế tích tế bào lắng ban đầu lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 43

Bảng 4.8: Kết quả ảnh hưởng của saccharose lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 45

Bảng 4.9: Kết quả ảnh hưởng của vitamin lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào 47

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của tế bào mô sẹo 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cành Dâu tằm Morus alba L 4

Hình 2.2: Hình dạng hoa của dâu tằm 5

Hình 2.3: Quả và hạt dâu tằm 5

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu 18

Hình 3.2: Buồng đếm tế bào Neubauer và nguyên tắc đếm trong một ô lớn có thể tích 0.1 mm3 29

Hình 4.1 Kết quả khử trùng trên các nghiệm thức 32

Hình 4.2 Kết quả tạo chồi in vitro bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ 34

Hình 4.3 Lát cắt ngang thân cây dâu tằm 35

Hình 4.4 Hai loại mô sẹo cây dâu tằm sau 2 tuần nuôi cấy 36

Hình 4.6:Sự tăng sinh của mô sẹo trên môi trường T5 39

Hình 4.7 Mô sẹo hóa nâu sau 4 tuần nuôi cấy 40

Hình 4.8 Dịch huyền phù tế bào (ảnh chụp từ đáy của bình thủy tinh 100 ml) 41

Hình 4.9 Màu sắc dịch nuôi cấy thay đổi qua các ngày 41

Hình 4.10: Các tế bào trong dịch huyền phù dưới kính hiển vi 42

Hình 4.11: Tế bào trong dịch huyền phù được nhuộm TTC (mũi tên chỉ tế bào đang phân chia)……… ……… 43

Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thể tích tế bào lắng ban đầu đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù 44

Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù 45

Hình 4.14:Tế bào trong môi trường có nồng độ saccharose 40 g/l đang ở trạng thái co nguyên sinh 46

Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thể tích vitamin đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù 47

Hình 4.16: Đồ thị biểu diễn tăng trưởng số lượng tế bào của dịch huyền phù tế bào 49

Hình 4.17 Tế bào trong dịch huyền phù bắt màu hồng với thuốc nhuộm TTC cấy 50

TÓM TẮT

Dâu tằm chứa nhiều chất có giá trị về mặt y học như acid hữu cơ, flavonoid, tanin, pectin, chlorophyl, coumarin, acid amin, cellulose, anthocyan, đường, vitamin B1, vitamin C, vitamin D…và nhiều hợp chất có giá trị khác vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và cô lập Những nghiên cứu trên cây dâu tằm đang ngày càng được mở rộng trên nhiều lĩnh vực đặc

biệt là Y học Việc tạo nguồn nguyên liệu in vitro khởi đầu để phục vụ cho nghiên cứu là rất

cần thiết Đề tài “KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ

LÁT CẮT MÔ DÂU TẰM TRẮNG (Morus alba L.) TRÊN MÔI TRƯỜNG MS RẮN

VÀ LỎNG” nhằm mục đích tìm ra môi trường thích hợp cho việc hình thành và phát triển mô

sẹo từ lát cắt mỏng dâu tằm trắng Morus alba L cung cấp nguyên liệu khởi đầu in vitro cho

các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo trên dâu tằm

Môi trường MS rắn có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tạo chồi Số lượng chồi trung bình khoảng 1,97 chồi Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo, tăng trưởng của mô sẹo là MS rắn bổ sung 0,5 mg/l BA và nồng độ 1,0 mg/l NAA Tỉ lệ % tạo sẹo trung bình của mẫu là 86%, chỉ số tăng trưởng trung bình của mô sẹo là 1,96 và đường kính và độ dày trung bình của mô sẹo tương ứng khoảng 12,54 mm và 10,79 mm Mô sẹo phải được cấy chuyền sau 04 tuần nuôi cấy chuyền Dịch huyền phù tế bào được tạo từ 3g mô sẹo và 27 ml môi trường MS lỏng tăng trưởng cực đại vào khoảng ngày nuôi cấy thứ 10 Nồng độ thích hợp của saccharose và vitamin trong môi trường MS lỏng cho tăng trưởng của dịch huyền phù tương ứng là 30,0 g và 10 ml Tỉ lệ thể tích tế bào lắng ban đầu và thể tích của môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào là 2:15 Dịch huyền phù cũng có thể tạo trực tiếp bằng cách cấy lát cắt mỏng tế bào trong môi trường MS lỏng có bổ sung 0,5 mg/l

BA và nồng độ 1,0 mg/l NAA

Như vậy, môi trường MS rắn có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tạo chồi dâu tằm trắng Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo, tăng trưởng của mô sẹo là MS rắn, lỏng bổ sung 0,5 mg/l BA, 1mg/l NAA, 30 g /l sucrose và 10 ml/l Mô sẹo phải được cấy chuyền sau 4 tuần nuôi cấy và dịch huyền phù tế bào được cấy chuyền khoảng ngày nuôi cấy thứ 10 với tỉ lệ thể tích tế bào lắng ban đầu và thể tích của môi trường là 2:15

CHƯƠNG I

MỞ ĐẦU

I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Dâu tằm trắng (Morus alba L.) thuộc họ Moraceae Dâu tằm từ lâu đã trở thành loài cây

có giá trị cao về nhiều mặt Nghề trồng dâu và chế biến các sản phẩm từ tơ tằm đã có từ lâu

đời tại Việt Nam Đó là một nghề truyền thống quan trọng nhất là ở các vùng nông thôn Trồng dâu nuôi tằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn nhiều so với các cây trồng khác, vì sản phẩm dâu tằm có giá trị cao, vòng quay lứa tằm ngắn chỉ có 20 ngày Cây dâu tằm có thể trồng được ở những vùng có điều kiện đất đai xấu và khí hậu khắc nghiệt Trồng dâu tằm không chỉ đáp ứng thu nhập quanh năm mà nó còn giải quyết nhiều lao động nhàn rỗi tại nông thôn, là cây xóa đói giảm nghèo Mặt khác, trồng cây dâu tằm còn làm tăng độ che phủ xanh trên các bãi đất hoang tham gia vào điều hòa tiểu khí hậu

Dâu tằm còn có nhiều công dụng quan trọng trong y học Trong Đông y, dâu tằm được gọi là tang ngọc vì toàn thân cây, vỏ, lá, trái dâu và đến cả con sâu đục ruột cây cũng được dùng chế tác thuốc Quả dâu chín (Tang thầm) vị ngọt pha chua, tính mát, ăn tươi hay ngâm rượu dùng bồi bổ gan, thận, dưỡng kinh mạch, trừ cảm mạo, phong hàn, chữa bệnh đái tháo đường, thiếu máu, trị mất ngủ Lá dâu (Tang diệp) chữa ra mồ hôi trộm, đau họng, ho, nhức đầu bốc hỏa, làm sáng mắt Cành dâu (Tang chi) chữa các chứng đau khớp, co quắp tay chân, đau nhức tứ chi, phù ở tứ chi, hạ huyết áp, lợi tiểu…Rượu dâu để lâu năm giúp giảm ho có đờm xanh, hạ cơn suyễn Các loại ký sinh trên cây dâu như tầm gửi (Tang ký sinh), tổ bọ ngựa (Tang phiêu tiêu), sâu dâu, mộc nhĩ cây dâu… không có bộ phận nào không được dùng làm thuốc (Đỗ Tất Lợi, 2004) Mỗi bộ phận khác nhau đều là vị thuốc tuyệt vời cho sức khỏe Ngoài ra, cây dâu tằm còn được sử dụng nhiều trong lĩnh vực làm đẹp

Những nghiên cứu trên dâu tằm cho thấy sở dĩ cây có được những công dụng tuyệt vời trên là do chúng có chứa nhiều chất có giá trị về mặt y học như acid hữu cơ, flavonoid, tanin, pectin, chlorophyl, coumarin, acid amin, cellulose, anthocyan, đường, vitamin B1, vitamin C, vitamin D…và nhiều hợp chất khác vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và cô lập Những nghiên cứu trên cây dâu tằm đang ngày càng được mở rộng trên nhiều lĩnh vực đặc biệt là Y học Để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu xung quanh cây dâu tằm, cần tạo ra nhiều nguồn

nguyên liệu khởi đầu in vitro phục vụ cho nghiên cứu Đề tài “KHẢO SÁT SỰ HÌNH

THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ LÁT CẮT MÔ DÂU TẰM TRẮNG

(Morus alba L.) TRÊN MÔI TRƯỜNG MS RẮN VÀ LỎNG” được thực hiện nhằm tìm ra

môi trường thích hợp cho việc hình thành và phát triển mô sẹo từ lát cắt mỏng dâu tằm trắng

Morus alba L cung cấp nguyên liệu khởi đầu in vitro cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo

trên dâu tằm

II MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Mục đích đề tài là tìm ra môi trường MS lỏng, rắn thích hợp cho việc hình thành và

sinh trưởng của mô sẹo từ lát cắt mỏng cây dâu tằm trắng Morus alba L

III KHÁCH THỂ NGHIÊN CỨU

Cây dâu tằm trắng (Morus alba L.)

IV ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Môi trường thích hợp cho sự hình thành và phát triển mô sẹo từ lát cắt mỏng của bộ phận

của cây dâu tằm trắng (Morus alba L.)

V NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Định danh dâu tằm thu ngoài môi trường

- Khử trùng nguyên liệu

- Tạo cây dâu tằm con in vitro

- Khảo sát quy trình tạo sẹo từ lát cắt mỏng mô cây dâu tằm trắng trong môi trường rắn và lỏng

- Khảo sát sự sinh trưởng của tế bào mô sẹo trong môi trường rắn và lỏng

- Thu nhận sinh khối mô sẹo

Tên khoa học: Morus alba L

(Nguyễn Văn Long và CS., 2004)

Lá dài 8–15cm, mọc so le, có phiến xoan hình tim Phiến lá nguyên hoặc xẻ thùy, nhọn ở chóp lá và có các khía răng cƣa ở mép lá Có 3 gân rõ rệt tỏa ra từ cuốn lá

Hoa đơn tính, khác gốc Hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, 4 nhị (có khi 3) Hoa cái cũng mọc thành bông hoặc thành hình khối cầu, có 4 lá đài Hoa nở vào mùa xuân và thụ phấn nhờ gió (hình 2.2)

Hình 2.2 Hình dạng hoa của dâu tằm a) Cụm hoa cái – b) Hoa cái dưới kính hiển vi c) Cụm hoa đực – d) Hoa đực dưới kính hiển vi

Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nước thành một quả phức (quả kép) màu đỏ, sau đen sẫm (Đỗ Tất Lợi, 2004) Hạt dâu tằm có màu vàng, vàng sáng hoặc trái xoan dẹt (hình 2.3)

Hình 2.3 Quả và hạt dâu tằm

Rễ ăn sâu, lan rộng 2–3m và phân bố đều ở nhiều tầng đất 10–30 cm Sự sinh trưởng của

rễ ở trong đất tương quan với sự sinh trưởng của thân, lá ở trên mặt đất và tuân theo một tỉ lệ nhất định (tỉ lệ T/R) Cây cao tán rộng thì bộ rễ ăn sâu và rộng hơn cây thấp tán nhỏ Nhìn chung, sự phân bố theo chiều rộng của rễ bằng 1,5 lần chiều rộng của tán lá, còn sự phân bố của rễ theo chiều sâu tuỳ thuộc vào giống dâu, tuổi cây, tính chất đất (Nguyễn Kim Khánh,

2009 và Nguyễn Văn Long, 2004)

1.3 Thành phần hóa học

Thân cây dâu chứa nhiều loại acid amin: phenylalanine; leucin; valin; tyrosin; prolin; alanin; acid glutamic; glycin; serin; arginin; acid aspartic; cystin; threonin; sarcosin; acid 4–

aminobutanoic; acid pipecolic và acid 5–hydroxypipecolic Gỗ chứa morin; dihydromorin; dihydrokaempferol; 2,4,4',6 – tetra – hydroxybenzophenon (Duke, 1983)

Lá dâu chứa nhiều ascorbic acid; α–caroten; vitamin B1; acid folic; acid folinic; vitamin

D và những thành phần dễ bay hơi trong lá gồm n–butanol; valeraldehyd; hexaldehyd;

etylmetylceton; hexylmetylceton; butylamin; acid acetic; acid propionic; acid isobutyric Lá dâu non có chứa calcium malat, acid succinic, acid tartaric, các tannins, adenine (Duke, 1983) Ngoài ra, từ lá Dâu tằm cô lập được rutin, acid gallic, quercetin, kaemferol, quercitrin, catechin (Leena et al, 2003) và mulberrofuran (Hano et al., 1989)

Quả dâu chứa thiamin, riboflavin, acid nicotinic và ascorbic acid (Duke, 1983)

Rễ dâu có chứa morusin, cyclomorusin; kuwanon A, kuwanon B, kuwanon C, albanol A, albanol B (Taro et al, 1978); chalcomoracin (Mitsuo et al, 1980); mulberrofuran I, mulberrofuran S, mulberrofuran P (Yoshio, 1989); các loại flavonoid (Jiang et al, 2003); kuwanon G (Park et al, 2003); artonin E, licoricidin, licochancol A, licorisoflavan A (Taro, 1978); neocyclomorusin, kuwanon E (Mai Đình Trị, 2010); mulberrosid A và steppogenin–

4’–O – β – D – glucosid (Mi Z, 2009)

1.4 Điều kiện tự nhiên và một số đặc điểm nông học

Cây dâu tằm cũng như các cây trồng khác sống trong điều kiện tự nhiên, chịu sự tác động tổng hợp của các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, không khí, đất và nước Tuỳ theo thời kỳ sinh trưởng, phát triển của cây dâu tằm, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới chúng có khác nhau Nghiên cứu tác động của các yếu tố sinh thái tới cây dâu tằm giúp chúng

ta đề ra những giải pháp kỹ thuật trồng và chăm sóc dâu tằm Một số yếu tố sinh thái tác động đến sinh trưởng của cây dâu tằm theo Nguyễn Văn Long và Cộng sự (2004) như sau:

1.4.1 Ánh sáng

Ánh sáng có liên quan chặt chẽ với năng suất và chất lượng lá dâu tằm Trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ, cây dâu tằm sinh trưởng tốt, cành khoẻ và mập, lá dày, có màu xanh đậm, năng suất và chất lượng lá cao Ngược lại, trong điều kiện chiếu sáng không đầy đủ, cành nhánh thường mềm, lá mỏng, màu xanh nhạt, hàm lượng nước trong lá cao, chất khô giảm, dinh dưỡng trong lá thấp Ở 30C, với ngày nắng, cường độ quang hợp của cây dâu tằm là 2mg chất khô/100cm2 lá 1giờ Ngày trời râm, cường độ quang hợp chỉ bằng 50% ngày nắng còn ngày mưa chỉ bằng 30% ngày nắng Ngoài ra, khả năng tiếp nhận ánh sáng của cây dâu tằm còn phụ thuộc vào cấu trúc tán lá Vì vậy, trong kỹ thuật trồng dâu tằm cần có biện pháp

kỹ chăm sóc đốn tỉa hợp lý để giúp cho cây dâu có bộ khung tán phù hợp nhằm tăng khả năng

sử dụng ánh sáng mặt trời

1.4.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố sinh thái tác động tương đối mạnh đến quá trình sinh trưởng của cây dâu tằm bởi lẽ các hoạt động sinh lý của cây dâu như quang hợp, hô hấp, trao đổi chất… đều thay đổi theo nhiệt độ Khoảng nhiệt độ thích hợp cho cây dâu tằm sinh trưởng là 25– 30C Nhiệt độ cao hơn 40C sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của cây và ở nhiệt độ dưới 12C thì cây dâu tằm ngừng sinh trưởng

1.4.3 Nước

Nước rất cần thiết cho việc hấp thụ, hoà tan, vận chuyển dinh dưỡng, quang hợp, trao đổi chất…Hàm lượng nước trong cây dâu tằm chiếm khoảng 60% Tuy nhiên, đối với các bộ phận khác nhau thì tỷ lệ nước có khác nhau: ở lá tỷ lệ nước là 75–82%, ở cành là 58– 61%, ở

rễ là 54–59% Để tổng hợp được 1 gam chất khô cây dâu tằm cần hút 280–400ml nước

Độ ẩm đất thích hợp cho quá trình sinh trưởng của cây dâu tằm là 70 – 80% Hàm lượng nước trong đất nếu quá cao hoặc quá thấp đều làm cây cằn cỗi, không phát triển được và dễ nhiễm bệnh Nếu trong đất chứa quá nhiều nước, cây dâu tằm có chất lượng lá thấp Nuôi tằm bằng loại lá này, tằm dễ bị bệnh Đất có mực nước ngầm cao hoặc úng ngập, thiếu không khí

sẽ ảnh hưởng đến hô hấp của rễ và tiêu hao dinh dưỡng của cây Nhiều nước trong đất sẽ thiếu oxy, các vi sinh vật háo khí giảm còn vi sinh vật yếm khí tăng lên, sản sinh một số chất khử làm rễ bị ngộ độc, cây sinh trưởng kém

1.4.4 Đất

Cây dâu tằm thích ứng với nhiều loại đất: Đất cát, đất thịt, đất sét, đất chua mặn… và có khả năng sinh trưởng được ở độ pH đất là 4,5 – 9 Loại đất thích hợp nhất cho cây dâu tằm sinh trưởng và phát triển là đất cát pha và đất thịt nhẹ có độ pH khoảng từ 6,5 – 7

1.4.5 Không khí

Oxy và cacbonic trong không khí là những yếu tố không thể thiếu cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây dâu tằm Cacbonic trong không khí là nguyên liệu cần thiết cho quá trình quang hợp, hàm lượng cacbonic tăng trong phạm vi 0,03 – 0,1% thì cường độ quang hợp của lá tăng dẫn đến năng suất lá tăng Qua nghiên cứu cho thấy cứ 100cm2

lá dâu trong 1 giờ sản sinh ra 10 gam chất khô thì cần 15mg CO2 Vườn dâu đảm bảo thông thoáng hoặc tăng

cường bón phân hữu cơ sẽ làm tăng hàm lượng CO2 tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình quang hợp của cây

1.4.6 Dịch bệnh và sâu hại

Dịch bệnh và sâu hại gây ra những tổn thất nặng nề cho năng suất và chất lượng cây dâu tằm Nguyên nhân gây bệnh thường do nấm ký sinh Cây dâu tằm thường gặp phải một số dịch bệnh sau:

1.5 Giá trị kinh tế và y dược

Nghề trồng dâu nuôi tằm nước ta đã có lịch sử vài ngàn năm nay và cho đến hiện giờ, nó vẫn là một nghề truyền thống không hề bị mai một Phát triển nghề trồng dâu, nuôi tằm có nhiều ý nghĩa về kinh tế, văn hoá, xã hội và môi trường

Cây dâu tằm là một cây thuốc quý Trong Đông y, dâu tằm được sử dụng nhiều trong các bài thuốc vì hầu hết tất cả các bộ phận của cây dâu tằm đều mang các công dụng chữa bệnh:

- Cành dâu tằm có tác dụng chữa đau nhức, chân tay co quắp…

- Quả dâu tằm có tác dụng bổ thận, nuôi máu… dùng chữa bệnh tiêu tai ù, huyết hư…ngoài ra còn giúp sáng mắt, giúp cho sự tiêu hóa, chữa kém ngủ, râu tóc sớm bạc

- Lá dâu tằm chữa sốt, giúp ra mồ hôi, cảm mạo, cao huyết áp…

- Vỏ rễ làm thuốc lợi tiểu tiện, chữa ho lâu ngày, hen, ho có đờm, chữa sốt, chữa cao huyết áp…(Đỗ Tất Lợi, 2004)

II NUÔI CẤY MÔ VÀ MỘT SỐ KẾT QUẢ NHIÊN CỨU TRÊN CÂY DÂU TẰM

2.1 Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

1665 Robert Hook quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi thực vật đầu tiên

1924 Hình thành mô sẹo từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic

1934 Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá

1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum

1951 Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan

1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba

1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134 L) bằng nuôi cấy chìm

1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật – môi trường MS

1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis

1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên

quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp

1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở

Hyoscyamus muticus Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên

(Trần Văn Minh, 2007)

2.2 Những phương pháp nuôi cấy mô

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL (Thin Cell Layer)

Phương pháp cấy lát mỏng tế bào (TCL) (Jaime, 2003), có nguồn gốc cách đây gần 30 năm với việc khảo sát sự sinh trưởng phát triển ở hoa, rễ, cành và phôi soma trên cây thuốc lá

Từ đó, TCLs đã được sử dụng thành công trong nhân giống nhiều loài thực vật, cây cảnh Nuôi cấy lát mỏng tế bào là một phương pháp cho nhiều ưu thế hơn các phương pháp nhân

giống in vitro truyền thống khác

Lớp mỏng tế bào là những mẫu cấy có kích thước nhỏ, được cắt ra từ các cơ quan thực vật như thân, lá, rễ, hoa, các bộ phận của hoa…Có hai loại lớp mỏng tế bào:

+ Nếu cắt theo chiều dọc (lTCL: longitudinal thin cell layer) ta được mẫu cấy chỉ bao gồm 1 loại tế bào như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp của tế bào vỏ

+ Nếu cắt theo chiều ngang ( tTCL: transverse thin cell layer) ta được mẫu cấy bao gồm nhiều loại tế bào như biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch cũng như nhu mô…

Sự phát triển và biệt hóa của các tế bào thực vật đều bị chi phối bởi chương trình điều khiển sự biệt hóa và phát sinh hình thái của cơ thể thực vật Nếu cắt mô thành những lớp mỏng chừng vài lớp tế bào và đặt vào môi trường nuôi cấy thích hợp thì chúng có thể thoát khỏi sự ức chế và có khả năng phát sinh hình thái một cách độc lập thông qua sự tái lập trình các thông tin di truyền trong tế bào

Đặc điểm mỏng của lớp tế bào nuôi cấy giúp hạn chế sự tương tác giữa các lớp tế bào lân cận, làm giảm sự phân cực của tế bào, nhanh chóng tạo ra một chương trình biệt hóa và đồng nhất các mô Vị trí lát cắt, loại cơ quan hay kích thước mô khác nhau cũng có thể làm thay đổi chương trình biệt hóa của tế bào khi nuôi cấy trên cùng một loại môi trường

Nuôi cấy lớp mỏng tế bào có nhiều ưu thế và được ứng dụng thành công trên nhiều loài

cây khác nhau như African violet (Saintpaulia ionantha); thu hải đường (Begonia rex), hoa cúc (Dendranthema x grandiflora)… Phương pháp này còn được ứng dụng trong các nghiên

cứu sinh lý học, mô học, cũng như trong nghiên cứu kiểu gen của sự tạo hình hoa, chồi và phôi sinh dưỡng Phương pháp này cũng rất hữu hiệu trong nghiên cứu sự phát sinh cơ quan in

vitro của các loài cây thân gỗ như tre (Bambusa spp.), khoai mì (Manihot esculenta), cây thông (Pinus radiate)…(Đỗ Đăng Giáp và cộng sự, 2009 và Tan Nhat Duong và cộng sự,

2003)

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo (Dương Công Kiên, 2002) là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô

và cơ quan phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lí các chất điều hoà sinh trưởng thực vật…) Các tế bào hoặc các mô thuộc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hoá trước lần phân chia đầu tiên Nếu được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hoá mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…

Đối với những thực vật khó trồng bằng các phương pháp bình thường và không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì người ta thường sử dụng phương pháp

nuôi cấy mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo ban đầu có thể tái sinh một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên, mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn

2.2.3 Phương pháp nuối cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào)

Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy Ta cũng có thể nuôi cấy mảnh mô đã biệt hóa, khi đó thời gian nuôi cấy sẽ kéo dài hơn và những tế bào nuôi cấy sẽ ở trạng thái tự do (tế bào đơn) Tuy nhiên, không có dịch huyền phù nào chỉ có những

tế bào đơn Các cụm tế bào gồm các tế bào có kích thước khác nhau, ngoài ra còn có các tế bào đang phân chia và những tế bào chết

Danh từ xốp (friability) dùng để chỉ những tế bào tách rời nhau sau khi phân chia Mức

độ tách rời tế bào phụ thuộc khả năng tạo nhiều tế bào xốp và được điều khiển bởi môi trường Tăng tỉ lệ cytokinin/ auxin sẽ sản xuất nhiều tế bào xốp

Những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy và sinh trưởng trong dịch huyền phù gọi là dòng

tế bào Dòng tế bào có những đặc điểm sau:

- Khả năng tách tế bào cao

- Phát sinh hình thái đồng nhất

- Nhân to và tế bào chất đậm đặc

- Nhiều hạt tinh bột

- Có những dẫn liệu tạo cơ quan

- Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72 giờ

- Mất tính toàn năng

- Tăng mức đa bội thể

Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có một số

ưu điểm sau:

- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô và sự đồng nhất giữa các lô sản xuất

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

Chúng ta có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, vì tế bào thực vật và vi sinh vật vẫn có các đặc điểm khác nhau, nên cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy để tìm được các yêu cầu đặc thù cho nuôi cấy tế bào thực vật (Lê Văn Hoàng, 2008)

2.3 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật

Thực vật cần các chất hữu cơ như protein, gluxid, lipid,…để cấu tạo nên tế bào, mô, và cung cấp năng lượng cho hoạt động sống Bên cạnh đó, chúng còn cần các chất có hoạt tính sinh lý như vitamin, enzyme và các hormone Trong đó, hormone có một vai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý khác của thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất hữu cơ (bao gồm các hợp chất tự nhiên và nhân tạo) khi sử dụng ở nồng độ thấp có tác dụng điều tiết (kích thích hay ức chế) quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Chính vì vậy, chúng có vai trò hết sức quan trọng trong nuôi cấy mô Ngày nay, sáu nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật đã được công nhận (Dương Công Kiên, 2002) Trong nuôi cấy mô thực vật, các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là:

- Auxin có tác dụng nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của cây: hoạt động của tầng phát sinh, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sự tạo thành rễ hoặc phối hợp với cytokinin để kích thích tạo mô sẹo Auxin thường sử dụng trong nuôi cấy mô là NAA, IBA, IAA

- Cytokinin có hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng rõ rệt lên sự phân hóa cơ quan thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều Ngoài ra, cytokinin còn có khả năng kìm hãm sự hóa già của các cơ quan và trong một số trường hợp còn ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và củ Cytokinin thường sử dụng trong nuôi cấy mô là BA, kinetin hoặc nước dừa

- Giberellin có tác dụng kích thích sự kéo dài lóng do sự phân chia của tế bào thân và kích thích sự tăng trưởng lá ở nồng độ cao Ngoài ra, chúng còn kích thích sự nảy mầm của hạt, củ, kích thích sự ra hoa

- Acid abscisic là một chất ức chế sinh trưởng rất mạnh Acid abscisic có vai trò điều chỉnh sự rụng (do kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời ở cuống, sự ngủ nghỉ, sự đóng mở khí khổng và sự hóa già của cây Axit absxisic còn được xem như là homone của stress vì nó được hình thành mạnh khi cây gặp điều kiện bất lợi của môi trường (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy mô trên cây dâu tằm

2.4.1 Các nghiên cứu nuôi cấy mô dâu tằm trên thế giới

Nhân giống in vitro từ đốt và đỉnh ngọn Morus alba L trên môi trường MS có bổ sung

Kn và BAP Tần số nảy chồi là 80% và 70% tương ứng cho chồi bên và chồi ngọn Trên môi tường MS có bổ sung BAP (2,0 mg) và NAA (0,2 mg) Khoảng 80% chồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg NAA mọc rễ Những cây có rễ tốt chuyển sang đất có tỉ lệ sống sót là 70% (Anis et al, 2003)

Nhân giống in vitro Morus alba L từ chồi đỉnh và đốt trên môi trường MS có bổ sung

cytokinin Nghiên cứu này cho thấy rằng tác dụng của cytokinin BA là tốt hơn Kn đối với sự hình thành chồi bên Môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l là tốt nhất cho mẫu cấy phát triển với chồi bên có chiều dài trung bình là 5,46+/-0,2 cm Sự tạo rễ và số lượng rễ chịu ảnh hưởng mạnh bởi auxin và loại auxin 100% chồi tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA (Habib, 2003)

Nuôi cấy mô Morus alba L tạo rễ tơ trong môi trường cơ bản cho cây gỗ bổ sung hormone sinh trưởng nhờ chủng Agrobacterium tumefaciens C58Cl Môi trường lý tưởng cho

tạo chồi là môi trường nuôi cấy môi cho cây gỗ có bổ sung IBA 1,0 mg/l, NAA 0,1mg/l Rễ tơ xuất hiện sau khi nhiễm 10 ngày và tần số xuất hiện rễ tơ của mẫu cấy từ thân khoảng 92 % sau 30 ngày Xác định trong rễ tơ sau khi nuôi cấy 50 ngày trong môi trường ½ MS lỏng có bổ sung 0,05 mg/l IBA Kết quả cho thấy rằng hàm lượng quercetin tăng 8,5 lần (Xiangyun et al, 2010)

Nghiên cứu những ảnh hưởng của auxins, cytokinins và nitrogen lên sự tạo rutin từ mô

sẹo và rễ bên của Morus alba L (Lee, 2010) Trong các loài của Morus, Morus alba L có

hàm lượng rutin cao nhất khoảng 242 μg/g mô tươi Auxin như 2,4D, IAA và NAA làm tăng cường khả năng phát triển của mô sẹo và rễ bất định, tăng hàm lượng protein và rutin Cytokinin như BA thì ngược lại là giảm sự tạo rễ bất định và hàm lượng rutin Mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng có IAA sẽ tạo nhiều rutin hơn là không có IAA Tuy nhiên, sự tiết

lớn đến sự tạo rutin và tiết rutin Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng rutin cao nhất được tạo ra khi rễ bất định sinh trưởng trong môi trường MS có tỉ lệ Auxin/Nitỏ là 34/66 bổ sung IAA 0,5 mg/l

Cây con được tạo ra từ nuôi cấy mô sẹo của Morus alba L (Bhau, 2001) Để tạo mô sẹo, các mẫu cấy từ lá, lóng và cuống lá của Morus alba L được nuôi trong môi trường MS có bổ

sung 2,4 D và BA Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào phần nào của cây được sử dụng và các chất điều hòa sinh trưởng Theo nghiên cứu này, lá là nguyên liệu tốt nhất cho sự hình thành mô sẹo trong môi trường MS kết hợp 1 mg/l 1 2,4-D and 0,5 mg/l BA (95-100%) Mô sẹo hình thành chồi trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA Nếu bổ sung thêm 0,1 mg l−1 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA) làm tăng cường biệt hóa chồi của mô sẹo Chồi sau đó được kích thích tạo rễ trên môi trường MS chứa 0,5 mg/l indole-3-butyric acid (IBA) or α-naphthaleneacetic acid (NAA)

Nuôi cấy Morus alba L in vitro trong điều kiện chiếu tia UV-B có cường độ và thời lượng thích hợp làm tăng cường sự tổng hợp các chất trao đổi chất thứ cấp ở Morus alba L Lá của cây in vitro sau đó được chiết rút bằng MeOH Cao MeOH được phân tích bằng sắc ký

HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng chalcomoracin và moracin N trong lá tăng Hàm lượng chalcomoracin và moracin N trong 10 g lá khô là 8,18 mg và 3,52 mg (Gu et al., 2010)

Nuôi cấy mô Morus alba L nhằm tăng cường sản xuất phytoestrogen Trong nghiên cứu

này tác giả đã thiết lập môi trường MS có bổ sung đường, phytagel, auxin và cytiokinine để

tạo mô sẹo và phát triển mô sẹo từ thân, lá và cuốn lá của Morus alba L Kết quả cho thấy, sự

tạo mô sẹo và phát triển mô sẹo tốt nhất trong môi trường MS bổ sung 2% sucrose và 0,3% phytagel, NAA 1g/l và BAP 0,5 g/l ủ trong tối ở 25± 2 oC Mô sẹo sau đó được dùng để xác định hoạt tính phytoestrogen trong sự so sánh với mô từ cây trưởng thành Kết quả cho thấy hàm lượng của phytoestrogen trong mô nuôi cây cao hơn trong mô lấy từ cây trưởng thành ngoài thiên nhiên (Bakshi, 2009)

Một nghiên cứu khác cho thấy tế bào cố định của Morus bombycis K tăng cường tạo

rutin và γ - amino butyric acid (GABA) Đặc biệt là tế bào cố định sẽ sản xuất rutin và GABA cao trong môi trường MS có bổ sung 2,4 D 1 mg/l và KN 0,1 mg/l, rutin (8,2 µg/g mô sẹo) và GABA (305 µg/g mô sẹo) và đồng thời tiết một lượng lớn ra môi trường (Han, 2011)

Như vậy, nuôi cây mô Morus tạo mô sẹo làm nguyên liệu nghiên cứu cho các mục đích

khác nhau đã được thực hiện nhiều trên thế giới Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa đề cập đến

việc sử dụng phương pháp lát mỏng trong nuôi cấy mô Morus Đây là một phương pháp có

nhiều ưu thế cho sự hình thành và phát triển mô sẹo (Jame, 2003)

2.4.2 Các nghiên cứu về dâu tằm trong nước

Cây dâu tằm được nhân dân ta biết đến và sử dụng từ lâu Dâu tằm sử dụng để chữa bệnh trong các bài thuốc dân gian Các nghiên cứu về kỹ thuật trồng, chăm sóc và chọn giống cây dâu tằm đã được thực hiện nhằm nâng cao năng suất cây dâu tằm trong ngành công nghiệp trồng dâu nuôi tằm Bên cạnh đó, nghiên cứu về đánh giá khả năng sử dụng cây dâu tằm làm thức ăn cho gia súc nhai lại ở miền Trung, Việt Nam mang lại nhiều lợi ích trong việc sử dụng cây dâu vào nông nghiệp

Gần đây Việt Nam cũng đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây dâu tằm nhằm

tìm ra các chất có ích như: “Khảo sát thành phần hoá học của rễ cây dâu tằm Morus alba L của Nguyễn Kim Khánh, “Nghiên cứu một số hoạt chất từ lá cây dâu tằm Morus alba để ứng

dụng tạo chế phẩm kháng oxy hóa của Mai Đình Trị, “Nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột

uống liền từ dịch trích ly lá dâu tằm (morus alba L.) Việt Nam” của Hoàng Thị Lệ Hằng … Hiện tại vẫn chưa có công trình trong nước về nuôi cấy mô dâu tằm được công bố

CHƯƠNG III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

I VẬT LIỆU

Cây dâu tằm trắng (Morus alba L.) được thu nhận ngoài tự nhiên ở nhiều địa điểm khác

nhau ở quận 7 thành phố Hồ Chí Minh: chùa Kiều Đàm, đường Trần Xuân Soạn và đường Lê Đức Thọ phường 6 quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu cây được định danh là

cùng một loài Morus alba L bởi Tiến sĩ Phạm Văn Ngọt , trường Đại học Sư phạm, TPHCM

(phụ lục 10)

1.1 Vật liệu tạo mô sẹo trên môi trường rắn

Thân non cây dâu tằm trắng (Morus alba L.) được cắt thành từng lát mỏng dày khoảng

3-4 mm

1.2 Vật liệu tạo dịch huyền phù tế bào

Mô sẹo cây dâu tằm (Morus alba L.) từ môi trường MS rắn sau tuần thứ 3 chuyển vào

môi trường lỏng để nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào

Ngoài ra, dịch huyền phù tế bào cũng được thử nghiệm tạo trực tiếp từ lát mỏng tế bào cành non cây dâu tằm trên môi trường MS lỏng

III MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) (phụ lục 2), bổ sung 30 g/l saccharose, 10 g/l agar (khi sử dụng môi trường rắn), pH = 5,9 (được điều chỉnh bằng NaOH 2% hay HCl 2%) Môi trường được hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng (autoclave) ở 1210C, 1atm, trong 20 phút Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng là

BA, 2,4-D và NAA

Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 22 ± 2oC, ẩm độ 70% ± 2oC, cường độ và thời gian chiếu sáng 2800 ± 200 lux, 16 giờ/ngày

Khi khảo sát yếu tố môi trường nuôi cấy tác động lên sự tăng trưởng của tế bào, chỉ yếu

tố được khảo sát thay đổi còn các yếu tố khác được giữ nguyên

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Khảo sát quy trình khử trùng mẫu

Khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng Mẫu được khử trùng tốt sẽ cho tỉ lệ tái sinh cao, mức độ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thấp Đây là các yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy mô

 Mục đích thí nghiệm

Tìm ra quy trình khử trùng tốt nhất để tạo ra nguồn mẫu vô trùng nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

 Hóa chất được dùng trong khử trùng mẫu

Xà phòng lifebouy, cồn 70o, dung dịch Ca(OCl)2 nồng độ 2%, 5%, 10% và nước cất vô trùng

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo 09 nghiệm thức kí hiệu từ K1 đến K9 Mỗi nghiệm thức được thực hiện trong 03 đĩa petri, mỗi đĩa chứa 10 mẫu Mỗi nghiệm thức được lập lại 03 lần Trong các nghiệm thức, thời gian khử trùng với xà phòng lifebouy và cồn 70o là không thay đổi; nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian lắc mẫu khác nhau (bảng 3.1) Quy trình khử trùng chung được thực hiện theo sơ đồ sau (hình 3.1):

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu

Sau khi khử trùng, mẫu được cắt ngang thành những lát mỏng có kích thước khoảng

0.5-1 ml cấy vào môi trường

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu chết, tỉ lệ mẫu sạch khỏe

Ngâm lắc mẫu trong

xà phòng Liefboy trong

15 phút

Rửa mẫu bằng nước cất

vô trùng

3 lần cho sạch

xà phòng trong tủ cấy vô trùng

Ngâm lắc mẫu trong cồn 70°

trong 1 phút trong tủ cấy vô trùng

Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần cho sạch

xà phòng trong tủ cấy vô trùng

Ngâm lắc mẫu trong dụng dịch Ca(Ocl)2với các nồng độ

và thời gian khác nhau

Rửa sạch mẫu với nước cất

vô trùng

4, 5 lần trong tủ cấy vô trùng

Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl) 2 và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng

4.2 Tạo cây con in vitro bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS được bổ sung thêm các chất sau: đường saccharose (30g/l); agar (10g/l); chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA và NAA với các nồng độ khác nhau Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,9 bằng NaOH 2% hoặc HCl 2%

Nghiệm

thức

Nồng độ Ca(OCl) 2 Ca(OCl) 2 2% Ca(OCl) 2 5% Ca(OCl) 2 10%

Quan sát và ghi nhận kết quả trong 04 tuần nuôi cấy và đánh giá sự sinh trưởng của cây con.chỉ tiêu theo dõi là % số mẫu tạo chồi, số chồi trên mẫu và chiều dài chồi

Bảng 3.2: Ảnh hưởng BA và NAA khác nhau lên sự tạo cây con bằng phương pháp đánh thức chồi ngủ

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của hormone sinh trưởng lên sự tạo thành mô sẹo từ cắt lát mỏng cây dâu tằm trên môi trường MS rắn

4.3.1 Ảnh hưởng BA và 2, 4 – D lên sự tạo mô sẹo

NAA (mg/l)

Môi trường MS được bổ sung thêm các chất sau: đường saccharose (30g/l); agar (10g/l); chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA và 2, 4-D với các nồng độ khác nhau Môi trường được

điều chỉnh về pH = 5,9 bằng NaOH 2% hoặc HCl 2%

- Quan sát và ghi nhận kết quả sau 2 tuần nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo, chỉ số tăng trưởng của mô sẹo

Chỉ số tăng trưởng của mô sẹo được tính bằng công thức sau (Chen et al., 2003)

M ngày 21: khối lượng tươi mô sẹo ở ngày thứ 21

M ngày 14: Khối lượng tươi mô sẹo ở ngày thứ 14

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và 2, 4 - D khác nhau lên sự tạo sẹo

Nồng độ BA và 2, 4 - D Nghiệm thức

BA (mg/l)

2, 4 - D (mg/l)

4 3.2 Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo

 Mục đích thí nghiệm

Tìm ra nồng độ BA và NAA thích hợp nhất bổ sung vào môi trường nuôi cấy để tạo ra

số lượng lớn mô sẹo

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS được bổ sung thêm các chất sau: đường saccharose (30g/l); agar (10g/l); chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA và NAA với các nồng độ khác nhau Môi trường được

điều chỉnh về pH 5,9 bằng NaOH 2% hoặc HCl 2%

- Quan sát và ghi nhận kết quả sau 2 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo, chỉ số tăng trưởng của mô sẹo Chỉ số tăng trưởng của mô sẹo được tính theo công thức:

M ngày 21: khối lượng tươi mô sẹo ở ngày thứ 21

M ngày 14: Khối lượng tươi mô sẹo ở ngày thứ 14

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA và NAA khác nhau lên sự tạo sẹo

4.3.3 Khảo sát sự tăng trưởng mô sẹo trên môi trường rắn

 Mục đích thí nghiệm

Theo dõi sự tăng trưởng của mô sẹo trên môi trường rắn

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS được bổ sung thêm các chất sau: đường saccharose (30g/l); agar (10g/l); chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA và NAA với các nồng độ khác nhau Môi trường được

điều chỉnh về pH = 5,9 bằng NaOH 2% hoặc HCl 2%

Nồng độ BA và NAA Nghiệm thức

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

- Quan sát và ghi nhận kết quả sau 4 tuần cấy chuyền Chỉ tiêu theo dõi: đường kính và

độ dày mô sẹo

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và NAA khác nhau lên tăng trưởng mô sẹo

4.4 Khảo sát môi trường lỏng, lắc thích hợp để nuôi dịch huyền phù tế bào

Thành phần môi trường lỏng là môi trường MS không bổ sung agar Trong nội dung này,

đề tài sẽ khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích tế bào lắng (SCV) của dịch huyền phù tế bào ban đầu, nồng độ saccharose và vitamin tổng đến sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào

Nồng độ BA và NAA Nghiệm thức

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

4.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào

Dịch huyền phù tế bào được tạo ra bằng cách đặt 3g mô sẹo sau lần cấy chuyền thứ 3 vào các bình thủy tinh 100 ml có chứa sẵn 30 ml môi trường MS lỏng và đậy bằng nút cao su Các bình nuôi cấy được đặt trên máy lắc vòng với vận tốc 150 vòng/phút, điều kiện chiếu sáng

2800 ± 200 lux, 16 giờ/ngày, nhiệt độ 22oC ± 2oC, ẩm độ 70% ± 2oC Dịch huyền phù tế bào sau 07 ngày nuôi cấy được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

4.4.2 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong dịch huyền phù bằng phương pháp nhuộm TTC

Dung dịch TTC được chuẩn bị từ 0,2 g TTC trong 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7.5; giữ trong tối Hút 0,5 ml dịch huyền phù tế bào bằng pipette trộn chung với 0,5 ml phẩm nhuộm 2,3,4-triphenyltetrazolium chloride (TTC), để yên 30 phút và quan sát dưới kính hiển

vi Tế bào chết không có màu trong khi tế bào sống có màu hồng do hoạt động hô hấp tạo ra những hợp chất có khả năng kết hợp với TTC tạo phức chất formanzan màu hồng

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dịch huyền phù ban đầu đến sự tăng trưởng của

Bảng 3.7: Khảo sát ảnh hưởng của thể tích tế bào lắng ban đầu lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào

SCV ban đầu (ml) SCV sau 14 ngày nuôi cấy (ml) Chỉ số tăng trưởng

2

4

6

8

– Các bình nuôi cấy được lắc trong điều kiện như phần 4.4.1 Quan sát sự tăng trưởng

của dịch huyền phù tế bào sau 14 ngày nuôi cấy qua sự gia tăng thể tích tế bào lắng

- Tính chỉ số tăng trưởng của dịch huyền phù theo công thức của Chen và cộng sự năm

– Để yên dịch huyền phù tế bào ở 4.4.1 khoảng 15 phút, dùng pipette để rút một thể tích

tế bào lắng (được xác định ở 4.4.3) của dịch huyền phù tế bào cho vào các bình nuôi cấy bình thủy tinh 100 ml có chứa sẵn 30 ml MS bổ sung nồng độ sacchcrose 20, 30 và 40 g/l (bảng 3.8)

Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào

20

30

40

– Các bình nuôi cấy được lắc trong điều kiện như phần 4.4.1 Quan sát sự tăng trưởng

của dịch huyền phù tế bào sau 14 ngày nuôi cấy qua sự gia tăng thể tích tế bào lắng

- Tính chỉ số tăng trưởng của dịch huyền phù theo công thức của Chen và cộng sự năm

– Để yên dịch huyền phù tế bào ở 4.4.1 khoảng 15 phút, dùng pipette để rút một thể tích

tế bào lắng (được xác định ở 4.4.3) của dịch huyền phù tế bào cho vào các bình nuôi cấy bình thủy tinh 100 ml có chứa sẵn 30 ml MS bổ sung nồng độ saccharose được xác định ở phần

– Các bình nuôi cấy được lắc trong điều kiện như phần 4.4.1 Quan sát sự tăng trưởng

của dịch huyền phù tế bào sau 14 ngày nuôi cấy qua sự gia tăng thể tích tế bào lắng

- Tính chỉ số tăng trưởng của dịch huyền phù theo công thức của Chen và cộng sự năm

 Bố trí thí nghiệm

- Chuyển 3g mô sẹo cây dâu tằm vào bình thủy tinh có chứa sẵn 30 ml môi trường nuôi

MS có bổ sung BA, NAA, saccharose và vitamin với nồng độ được xác định ở trên

- Các bình nuôi cấy được lắc trong điều kiện như phần 4.4.1

- Đếm mật độ tế bào của dịch huyền phù tế bào ở ngày nuôi cấy thứ 0, 2, 4, 6, 8, 10 và

12 ngày nuôi cấy và ghi nhận kết quả (bảng 3.9)

Bảng 3.9: Mật độ tế bào qua các ngày nuôi cấy

Ngày nuôi cấy

có trong mỗi ô theo nguyên tắc đếm nhất định (hình 3.2) Số tế bào trung bình trong mỗi ô là

số tế bào trung bình có trong 10-4 ml dung dịch huyền phù đã nhỏ vào

Hình 3.2: Buồng đếm tế bào Neubauer và nguyên tắc đếm trong một ô lớn có thể tích 0.1 mm 3

- Dựa vào bảng 3.9 vẽ đường cong tăng tưởng của dịch huyền phù tế bào

4.4.7 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào

 Mục đích thí nghiệm

Thời gian nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thông qua mô sẹo quá dài: bao gồm thời gian để mẫu cảm ứng, thời gian để mô sẹo tăng trưởng, thời gian cấy chuyền để tạo ra một lượng lớn mô sẹo…trên môi trường MS rắn Vì thế, đề tài tiến hành thử nghiệm nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lát mỏng tế bào

- Chuyển 10–15 lát mỏng (0.5– 1 mm) mẫu thân non đã khử trùng vào mỗi bình

-Các bình nuôi cấy được lắc trong điều kiện như phần 4.4.1

- Quan sát sự tăng trưởng của lát mỏng tế bào trong 12 ngày nuôi cấy và ghi nhận kết quả.

4.5 Xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp 3 lần Số liệu được thống kê và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0, phân tích phương sai ANOVA một chiều, test Duncan với P = 0,05

Hiệu quả khử trùng kém đối với nghiệm thức 1, 4, 6 và 9 với tỉ lệ mẫu sống dưới 25% (bảng 4.1) Chỉ sau vài ngày nuôi cấy, hầu như toàn bộ mẫu khử trùng theo nghiệm thức 1

và 4 đều nhiễm nấm mốc và vi khuẩn (hình 4.1) Nồng độ Ca(OCl)2 thấp (2%) và thời gian khử trùng (10 hoặc 20 phút) chưa thể vô trùng mẫu

Nhìn chung, khi tăng nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian khử trùng, hiệu quả khử trùng tăng

rõ rệt Các nghiệm thức khử trùng đạt hiệu quả cao là 2, 3, 5, 7 và 8 với tỉ lệ mẫu sống trên 58% Trong đó, nghiệm thức 5 với nồng độ Ca(OCl)2 là 5% và thời gian lắc mẫu là 20 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất với mẫu sống và sạch là 90% ± 0,866 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác (bảng 4.1 và hình 4.1)

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl) 2 và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng mẫu (phụ lục2)

Tuy nhiên, nồng độ Ca(OCl)2 quá cao (10%) và thời gian lắc kéo dài (20, 30 phút) làm mẫu hóa nâu và chết (nghiệm thức 9) (hình 4.1)

Hình 4.1: Kết quả khử trùng trên các nghiệm thức

Như vậy, kết quả khảo sát trên cho thấy quy trình khử mẫu sử dụng nồng độ Ca(OCl)25% trong 20 phút (nghiệm thức 5) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất

Ngoài Ca(OCl)2, một số hóa chất khác có thể kể đến là HgCl2, Br2…cũng có thể dùng

để khử trùng mẫu Tuy nhiên, đây là các chất độc hại, có tác động khử trùng mạnh, tác động tiêu cực đến sức khỏe và môi trường Do đó, để tạo nguồn vật liệu ban đầu tốt nhất nhằm phục vụ cho quá trình làm đề tài và cũng để đảm bảo an toàn hơn, chúng tôi tiến hành xử lý

mẫu thân non cây dâu tằm (Morus alba L.) với Ca(OCl)2

II SỰ TẠO CÂY CON IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH THỨC CHỒI

tất cả môi trường đều có khả năng kích thích sự phát triển của chồi nách Tỉ lệ mẫu tạo chồi

là trên 73% (bảng 4.2) Tuy nhiên, chỉ số nhân chồi không cao

BA có khả năng kích thích sự nảy mầm của chồi ngủ và chiều dài chồi Tăng nồng độ

BA, số lượng chồi trung bình sẽ tăng Số lượng chồi trung bình cao nhất là 1,33 chồi khi nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA (nghiệm thức 3) (bảng 4.2) Trong đó,

đa số mẫu chỉ phát triển thành một chồi, một số mẫu phát triển thành 2 chồi (hình 4.2a) Chiều dài trung bình của chồi ở ba nghiệm thức 1, 2 và 3 lần lược là 0,91 ± 1,079, 0,93 ± 1,086và 0,94 ± 1,093 Nhìn chung tốc độ sinh trưởng của chồi khá chậm

Sự phối hợp tác động của BA và NAA làm tăng số lượng chồi ở các mẫu cấy và sự sinh trưởng của chồi non Các mẫu cấy ở nghiệm thức 8 MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA cho số lượng chồi trung bình cao nhất khoảng 2,05 chồi khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với các nghiệm thức còn lại (bảng 4.2 ) Trong đó, có nhiều mẫu phát triển thành 3, 4 chồi (hình 4.2b) Mặc dù có sự phối hợp với NAA, khi nồng độ của BA tăng cao đến 2,5, số lượng chồi trung bình /mẫu giảm

Chiều dài của chồi tăng lên khi có sự kết hợp của BA và NAA như ở nghiệm thức 4, 5,

6, 7 và mạnh nhất cũng ở nghiệm thức 8 Sau 03 tuần nuôi cấy, chiều dài trung bình của chồi ở nghiệm thức 8 là cao nhất khoảng 2,45 ± 0,33 cm có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

NAA (mg/l)

Tỉ lệ chồi có đáp ứng (%)

Số lượng chồi mới trung bình tạo ra trên mỗi mẫu (chồi)

Chiều dài chồi trung bình (cm)