Vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men aspergillus niger

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ THỊ TRANG MSSV: 2071846 VAI TRÒ CỦA KHOÁNG & DINH DƯỠNG ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE SINH RA TỪ SỰ LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER Luận văn tố

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ THỊ TRANG MSSV: 2071846

VAI TRÒ CỦA KHOÁNG & DINH DƯỠNG ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE SINH RA

TỪ SỰ LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER

Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn:

Ths TRẦN THANH TRÚC

Cần Thơ, 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

VAI TRÒ CỦA KHOÁNG & DINH DƯỠNG ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE SINH RA

TỪ SỰ LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Ths Trần Thanh Trúc Lê Thị Trang

MSSV: 2071846

Lớp: CNTP K33

Cần Thơ, 2010

L I CAM OAN

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt

tính pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men Aspergillus niger” do sinh viên Lê

Thị Trang thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

Chủ tịch hội đồng

L I CẢM TẠ



Là sinh viên của trường Đại Học Cần Thơ, chúng tôi luôn được những điều kiện học tập và sự quan tâm sâu sắc của Trường, Khoa nói chung, sự dạy bảo truyền đạt tận tình của quý Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng Nhờ sự tận tình dạy bảo của thầy cô và sự giúp đỡ của các bạn cùng với sự cố gắng của bản thân, đề tài luận văn tốt nghiệp của tôi đã hoàn thành Để có được kết quả này, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

- Cô Trần Thanh Trúc và Thầy Nguyễn Văn Mười, những người đã trực tiếp hướng dẫn, theo dõi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

- Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian gần 4 năm học tập tại trường

- Cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu của mình

- Các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm khoá 33 và các anh chị cao học đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Cuối lời xin kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công Xin chân thành cảm ơn !

Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2010

Sinh viên thực hiện

LÊ THỊ TRANG

TÓM TẮT



Đề tài: “Vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men Aspergillus niger” được thực hiện nhằm tìm ra nguồn dinh dưỡng và khoáng thích hợp cho quá trình lên men từ nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo và vỏ cam

KCl và CaCl 2 , nguồn dinh dưỡng nitrogen được bổ sung từ urea, pepton, (NH 4 ) 2 SO 4 và

NH 4 H 2 PO 4 với nồng độ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME hoạt tính cao Bên cạnh

đó, nguồn carbohydrate thích hợp cho hoạt động của Aspergillus niger sinh enzyme PME cũng được thử nghiệm bằng cách bổ sung một lượng vỏ bưởi sấy khô với tỷ lệ từ 2,5 đến 10% vào cơ chất lên men

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme PME thu nhận cao nhất khi A.niger được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 0,5% MgCl 2 và 1,5% CaCl 2 Thêm vào đó, việc bổ sung nguồn dinh dưỡng từ urea 0,1% cho hiệu quả sinh PME từ A.niger cao hơn hẳn các trường hợp còn lại, hoạt tính PME lên đến 36,93 U/mL Đồng thời, việc bổ sung 5% vỏ bưởi làm gia tăng lượng pectin trong môi trường lên men, điều chỉnh độ DE của cơ chất và tạo điều kiện thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME đạt hiệu quả cao nhất Hoạt tính của PME thu được tăng 1,15 lần so với mẫu không bổ sung vỏ bưởi và tăng gần 2 lần so với mẫu nuôi cấy trong điều kiện không có sự hỗ trợ của khoáng và nitrogen

MỤC LỤC

L I CAM OAN i

L I CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH S CH H NH vi

DANH S CH ẢNG vii

Chương 1 ẶT VẤN Ề 1

1.1 Tổng quan 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Pectin methylesterase 3

2.1.1 Cấu trúc, đặc tính, cơ chế hoạt động thủy phân của PME 3

2.1.2 Nguồn tổng hợp PME 5

2.1.3 Một số ứng dụng của PME trong chế biến thực phẩm 6

2.2 Kỹ thuật trích ly PME từ nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo và vỏ cam 8

2.2.1 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger 8

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 9

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy 10

2.2.4 Thu nhận enzyme 12

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PME 12

2.3.1 Môi trường nuôi cấy 12

2.3.2 Độ ẩm 13

2.3.3 pH 13

2.3.4 Thời gian nuôi cấy 13

2.3.5 Nhiệt độ nuôi cấy 14

2.3.6 Nguồn khoáng và dinh dưỡng bổ sung 14

2.4 Một số nghiên cứu có liên quan 15

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 17

3.1.1 Địa điểm, thời gian 17

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.3 Thiết bị, hóa chất 17

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 18

3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 19

3.3 ố trí thí nghiệm 19

3.3.1 Thông số cố định 19

3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 19

3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 21

3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 23

3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần carbohydrate bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẽ đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 27

4.2 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 29

4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 31

4.4 Ảnh hưởng thành phần carbohydrate bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ Ề NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 ề Nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PH P PHÂN TÍCH viii

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xi

DANH S CH H NH

Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME 3

Hình 2: Phản ứng thuỷ phân pectin dưới sự xúc tác của PME 4

Hình 3: Nấm mốc Aspergillus niger 8

Hình 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 20

Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 22

Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 24

Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 25

Hình 8: Đồ thị so sánh ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung tối ưu đối với hiệu quả gia tăng hoạt tính PME từ A.niger 29

Hình 9: Đồ thị so sánh ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung kết hợp đối với hiệu quả gia tăng hoạt tính PME từ A.niger 30

DANH S CH ẢNG

Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase 7 Bảng 2: Thành phần pectin của táo, cam và một số loại trái cây 10 ảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các ch tiêu trong nghiên cứu 19 Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung đến sự thay đổi hoạt tính của PME

CHƯƠNG 1 ẶT VẤN Ề

Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, điều khiển hoạt động PME đóng vai trò hết sức

quan trọng, cụ thể là trong sản xuất nước quả citrus đục (Nath and Ranganna, 1977),

giúp tăng độ nhớt trong sản xuất nước quả và puree cà (Nath et al., 1983), hoặc góp

phần cải thiện cấu trúc và độ cứng chắc trong quá trình chế biến một số loại rau quả

(Pilnik and Voragen, 1991; Stanley et al., 1995)

Hoạt động của enzyme PME trong thực phẩm có thể được thúc đẩy bằng cách kích

hoạt nội enzyme hay bổ sung thêm chế phẩm enzyme (Duvetter, 2007; Tran et al.,

2008) Tuy nhiên, một số loại rau quả PME nội bào rất thấp đồng thời việc kích hoạt

PME bằng phương pháp xử lý nhiệt làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, vì vậy

việc nghiên cứu bổ sung chế phẩm enzyme PME là biện pháp khả thi nhất

So với pectinase từ thực vật, sản xuất pectinase từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn

như: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, tiết ra enzyme dễ dàng trên cơ chất rẽ tiền

và có hiệu suất thu hồi cao (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Tuy vậy, việc sử dụng rộng

rãi nhóm emzyme này và sản xuất PME thương mại vẫn chưa được quan tâm nhiều ở

nước ta, việc nhập khẩu PME từ nước ngoài thường có giá rất cao Chính vì thế,

nghiên cứu trích ly PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là cần thiết

PME có thể được sản xuất từ rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc như: Aspergillus sp,

Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp…

(Polizeli et al.,1991), nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Torres et al.,2005) Trong

nhóm này, việc ly trích PME từ Aspergillus niger cũng được ưu tiên chọn lựa

(Schmitz, WO 03/000876)

Mặc dù vậy, hiệu quả trích ly PME từ nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều các thông số

như điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ pha loãng của cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian ủ cũng như

tác động của các thành phần khoáng vi lượng, nguồn dinh dưỡng bổ sung… (Berovic

et al., 1993; Schmitz, 2002; Hamdy, 2005; Joshi et al., 2006) Hiệu quả trích ly cũng

như hoạt tính của PME sẽ được cải thiện khi các thông số trên được thực hiện ở giá trị

tối ưu Do đó, việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của PME cần được

quan tâm

Chính vì vậy, đề tài “vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính enzyme PME

sinh ra từ sự lên men Aspergillus niger” đã được nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát vai trò của khoáng và nguồn dinh dƣỡng bổ

sung đến hoạt tính của enzyme pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men nấm mốc

Aspergillus niger để thu đƣợc nguồn enzyme có hoạt tính cao

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Pectin methylesterase (PME, Pectinesterase (PE), EC 3.1.1.11) thuộc nhóm enzyme

pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân pectin PME thường tấn công vào các

nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân

cắt nhóm methoxyl (-OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectic

PME có 2 dạng cấu trúc là bậc I và bậc II Ở cấu trúc bậc I, PME là một chuỗi acid

amin cao Trung tâm hoạt động cố định gồm các acid amin: 2 acid aspartic, arginine, 2

glutamine và các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp phản ứng Cấu trúc bậc II

của PME là dạng cấu trúc β-helix Đây là cấu trúc dạng vòng xoắn có gấp nếp β-helix

theo hướng phải, bao gồm 3 chuỗi β-sheet song song và có những đoạn dạng vòng

được kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu giống như khe nứt Khe nứt

thường tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và 2 gốc aspartate, tương ứng với trung

tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; D’Avino et al.,

2003)

PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trưng không giống nhau Nhiều loại

PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa được tìm thấy ở các thực vật

2 lá mầm ( ordenave et al., 1996) PME là những enzyme có kích thước trung bình và

phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003) Điểm đẳng điện của PME

thay đổi từ 3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến 11 đối với PME cà chua Hầu hết

PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, ch một vài trường hợp có PME

có tính acid (Bordenave, 1996)

Việc đo lường hoạt tính đã ch ra có sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các bộ phận

khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau ( ordenave and Goldberg, 1993)

Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trường chứa ion và chịu tác động lớn bởi

pH Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ưu của PME

vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996) Giá trị pH tối thích cho hoạt

động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là phù hợp cho

PME từ Aspergillus (Duvetter, 2006) PME thường được hoạt hóa bởi các ion Ca2+ và

Mg2+

Hai nguồn được dùng sản xuất PME là từ thực vật (cà chua, cam, táo, cà rốt…) và vi

sinh vật (nấm mốc Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger…)

iii Cơ chế hoạt động thủy phân của PME

Phản ứng thủy phân pectin được thực hiện ở đơn vị galacturonic chứa ester bên cạnh

nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova-Benkova et al., 2004) Kết

quả là hình thành methanol và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn (pectinic acid hoặc

pectic acid)

Hình 2: Phản ứng thuỷ phân pectin dưới sự xúc tác của PME

(Nguồn: Sila et al, 2003)

Khi enzyme hoạt động, không phải toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt động xúc

tác mà ch có trung tâm hoạt động của enzyme tham gia phản ứng Trung tâm hoạt

động của enzyme do cấu trúc của enzyme tạo ra

Dựa trên cấu trúc của PME carrot, Johansson et al (2002) đề nghị cơ chế hoạt động

như sau: trung tâm hoạt động của PME carrot bao gồm Asp157, Arg225, Gln113,

Gln115 và Asp136 Trong đó, Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy và Arg225

Arg225 được xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhóm carbon từ

carboxymethyl và carbonyl của pectin Asp136 liên kết với Phe160, có tính acid trong

giai đoạn đầu phản ứng và methanol được tách ra Tiếp theo, Asp136 có khả năng

phản ứng như một base tách hydrocuar một phân tử nước để cắt liên kết hóa trị giữa

cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho enzyme (Johansson et al.,

2002)

2.1.2 Nguồn tổng hợp PME

i Thực vật

PME có nhiều trong hầu hết các loại trái cây Đặc biệt có nhiều trong cà chua, chuối,

cam, táo,… PME ở thực vật thường tồn tại dạng đồng phân Thông thường, các dạng

đồng phân của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và khối lượng phân tử

(Bordenave, 1996) Mối quan hệ t lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy

theo mức độ tăng trưởng của trái và các nguồn PME khác nhau (Bordenave and

Goldberg, 1993) Ví dụ như cà chua có hai loại đồng phân là PME1 và PME2 Trong

giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở giữa giai đoạn chín thì

PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín (Nguyễn Đức Lượng,

2004) Hoặc như hai dạng đồng phân của PME trong cam, PME1 có pI là 10,05 và

PME2 có pI > 11 Các đồng phân PME trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử,

cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bền nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

PME thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim

loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của enzyme

Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ lần lượt là

0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996)

Các PME ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự

do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid

không bị ester hóa rất mẫn cảm với calcium (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hoạt tính của PME thực vật có thể được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt được

cường độ hoạt động tối ưu ở áp suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa và nhiệt độ

từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al., 2004)

ii Vi sinh vật

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus, Aspergillus

saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam,

Penicillium Cilimim, Fusarium monniliforme,…

Nấm men: Saccharomyces fragilis,…

Vi khuẩn: bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes,

Erwinia,…

Các PME có nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiêt hơn so với các PME có nguồn gốc

thực vật Các PME của nấm mốc khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa dạng, các

nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly Nguyen, 2004)

Nấm mốc là nguồn cung cấp enzyme, đặc biệt là hệ enzyme pectinase PME từ nấm

mốc là các loại enzyme ngoại bào Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu từ

30  45oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55oC pH tối ưu của nấm mốc trong

khoảng 3  5,5 PME từ các loài Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm đẳng

điện và pH tối ưu trong vùng acid Hoạt động của PME từ A.niger đạt tối đa ở pH 4,5

và nhiệt độ 400C Trong khi pH tối ưu của PME từ A.species là 3,7  4,2 và PME từ

A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.3 Một số ứng dụng của PME trong chế biến thực phẩm

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học

lớn Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước

trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất

này nằm ở thành tế bào được phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão Các chế phẩm

enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là

đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình

cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật

Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép Nếu pectin

còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao và

rất khó lọc trong

ảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase

Loại nước quả

Hiệu suất nước quả (%)

Hàm lượng chất khô (%)

Độ acid chuẩn (%)

Đường (%)

Pectin (%)

Điểm đánh giá cảm quan

Nước quả từ táo

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

71,2 78,8

10,2 11,5

0,53 0,62

6,7 8,0

0,33 0,15

4,5 4,8

Nước quả vải

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

49,2 72,4

8,5 10,2

0,91 1,16

5,62 7,4

0,26 0,12

3,8 4,3

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ứng dụng quan trọng nhất của PME trong công nghiệp chế biến thực phẩm là khả

năng cải thiện cấu trúc của rau quả đóng hộp ( aker và Wicker, 1996) Khi được kích

hoạt, PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion

Ca2+, tạo độ giòn và độ cứng chắc cho sản phẩm

Ảnh hưởng của sự tách loại nhóm methoxyl trong phân tử pectin đối với độ cứng mô

thực vật bao gồm hai hiện tượng: ở mô chưa xử lý, sự hiện diện các nhóm carboxyl tự

do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calcium giữa hai mạch pectin, và

ở mô đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với Ca2+

và làm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi là β – elimination (Sajjaanatukal và Pitifer, 1991)

Tuy nhiên, một vài loại trái cây ch chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào Do đó nhiều

phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật nguyên vẹn

và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm – thấm thụ động Tuy nhiên đây là một

quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô ch giới hạn ở bề mặt Vì thế cần có

sự hiện diện của các chất phụ gia Nếu trong mô có khoảng không chứa khí đáng kể

thì phải tiến hành dưới áp lực trực tiếp hoặc là chân không Kỹ thuật trong trong chân

không (vacuum infusion – VI) được sử dụng trong nhiều quá trình chế biến khác nhau

để cải thiện chất lượng về cấu trúc của sản phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành

phần chức năng trong sản phẩm

Ngâm bằng kỹ thuật chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bưởi và

CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp Theo aker và Wicker

(1996), có mối tương quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năng cải thiện độ

cứng Kỹ thuật trong trong chân không của PME nấm mốc với CaCl2 được khảo sát

thấy có hiệu quả cải thiện độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông

và vỏ cam

2.2.1 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger

Hình 3: Nấm mốc Aspergillus niger

(nguồn: http://genome.jgi-psf.org/Aspni1/Aspni1.home.html )

Aspergillus thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), cuống

đính bào tử có đầu phình ra Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng

bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính

bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Sợi nấm

có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn Các chuỗi bào tử bụi từ đầu

phồng mọc tỏa khắp mọi hướng ào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu

đen (Aspergillus niger) (Abarca et al., 2004)

Aspergillus niger được sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm trong nhiều thập

kỷ qua và không có tác động xấu đến sức khỏe con người (Dijck et al., 2003) Thêm

vào đó, sản phẩm từ Aspergillus niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và

thuốc của Mỹ (FDA) chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS)

Nấm mốc Aspergillus niger thường được tìm thấy trong quá trình thu hoạch và bảo

quản các loại thực phẩm như đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua và dưa

(Pitt và Hocking, 1997)

A.niger thường được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (như -

galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và acid hữu

cơ Pectinases thường được sử dụng trong quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc

thực vật Trong khi đó, các acid hữu cơ như acid citric được sử dụng rộng rãi trong

công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc như một phụ gia tạo vị, điều ch nh

acid, chất ổn định hay bảo quản (Magnuson và Lasure, 2004)

Ngay từ năm 1917, A.niger đã được sử dụng để sản xuất acid citric (Raper và

Femmel, 1965) Ngày nay, acid citric được sản xuất từ A.niger với sản lượng khoảng

700.000 ÷ 1.000.000 tấn/năm (Ikasari et al., 1996; Magnuson và Lasure, 2004; Prado

et al, 2005) Khoảng 70% acid citric sản xuất được sử dụng trong các loại thực phẩm

và sản phẩm bia, phần còn lại thường được ứng dụng trong ngành dược (Magnuson và

Lasure, 2003; Prado et al., 2005)

Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A.niger, thường được sử dụng phổ biến

trong công nghệ chế biến nước quả, kế đến là cellulases và hemicellilases, hàng năm

doanh số thu được từ ba dạng enzyme này xấp x 20% một triệu đô la Mỹ (Kashyap et

al., 2001)

A.niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử

pectin Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase

(EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC

3.2.1.67),… Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ

methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và pectate lyase

Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất có độ methyl ester bất kỳ

(Christensen et al., 2001)

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

i Khái quát về nguyên liệu táo và cam

Táo ta và cam sành là hai loại quả chủ lực ở Việt Nam, đặc biệt là ở đồng bằng sông

Cửu Long (Lê Thanh Phong, 2004; Hà Văn Thuyết và Trần Quang ình, 2002) Táo

ta có tên khoa học là Ziziphus nummularia thuộc họ Rhamnaceae Đây là loài cây ăn

quả của vùng nhiệt đới, là loại cây được trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Cửu

Long Cây có thể lớn rất nhanh thậm chí trong các khu vực khô và cao tới 12 mét và

đạt tuổi thọ 25 năm

Táo là một trong những loại quả chứa rất nhiều chất dinh dưỡng quý giá và giúp chữa

rất nhiều bệnh nguy hiểm: giảm các bệnh đường ruột, hạ lượng cholesterol trong máu,

ngăn ngừa bệnh ung thư…

Cam sành có tên khoa học là Citrus grandis, là một giống cây ăn quả thuộc chi Cam

chanh, có nguồn gốc từ Việt Nam Quả cam sành rất dễ nhận ra nhờ lớp vỏ dầy, sần

sùi giống bề mặt mảnh sành, và thường có màu lục nhạt (khi chín có sắc cam), các

múi thịt có màu cam Đây là loại quả có giá trị dinh dưỡng cao, thành phần múi chứa

từ 6÷12% đường, hàm lượng vitamin C từ 40 ÷ 90mg/100 gam cam sành tươi, các axit

hữu cơ từ 0,4 ÷ 12% trong đó nhiều loại khoáng chất, dầu thơm có lợi cho sức khỏe

Táo và cam cũng giống như nhiều loại quả khác có rất nhiều pectin đặc biệt là phía

trong lõi (Joshi, 2006), nên được chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp

PME

ảng 2: Thành phần pectin của táo, cam và một số loại trái cây

ii Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm thích

hợp Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trường cám là

60% Độ ẩm vượt quá 60% thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó

dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ Nếu độ ẩm nhỏ hơn 60% (thường 45 ÷ 50%) thường

gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, và như vậy enzyme thu sẽ giảm hoạt tính

rất mạnh

Sau khi chuẩn bị xong môi trường, tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu diệt các

vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật

mà ta sẽ nuôi cấy Thông thường, môi trường sẽ được thanh trùng bằng hơi nước nóng

ở 121oC trong thời gian 15 ÷ 30 phút

Môi trường nuôi cấy sẽ được trải đều vào các khay và tiến hành trộn giống vi sinh vật

vào khối môi trường sao cho thật đều Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme

vào khoảng 36 ÷ 60 giờ

(Schmitz, 2002; Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy

Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sản xuất enzyme PME có thể được

thực hiện theo cả hai phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và lên men

chìm Trong đó, phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi

sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm Thông

thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp

nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác

(amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosphate) Phương pháp này phát

triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay Những ưu điểm cơ bản của phương pháp

nuôi cấy bề mặt:

- Dễ thực hiện, quy tr ình công nghệ đơn giản

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với

nuôi cấy chìm

- Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường rắn khi nuôi cấy bằng phương

pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1:

Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt

đầu trương nở và hô hấp Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi:

- Nhiệt độ tăng rất chậm

- Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

- Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

- Khối môi trường còn rời rạc

- Enzyme mới bắt đầu được hình thành

- Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi

- Các enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được

tạo ra nhiều hơn

- Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này

cần phải được thông khí mạnh là tốt nhất

Giai đoạn 3:

Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 12 giờ Lúc này nhiệt độ khối môi trường sẽ giảm

dần, cường độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi

và thể hiện màu đặc trưng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.4 Thu nhận enzyme

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được

gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh

vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường

Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá

trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành tinh sạch

enzyme Để thu nhận được chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme

thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối trung

tính

Muối trung tính như amonium sulfate, natri chloride thường được sử dụng để kết tủa

enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ,

không làm biến tính enzyme, enzyme thu được có hoạt tính cao hơn so với các

enzyme thu được bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ Tuy nhiên, khi sử

dụng muối trung tính cũng có nhược điểm là lượng dung dịch dùng gấp 5 ÷ 6 lần dịch

chiết enzyme và không thể tái thu hồi được dung môi

Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu được không mất hoạt tính nhanh, người ta thường

sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá

trình sấy thường nhỏ hơn 10% Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta

thường sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40oC Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến

đổi Trong trường hợp sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng như

các enzyme khác từ vi sinh vật, trong đó thành phần pectin giữ vai trò rất quan trọng

(Patil, 2006) Các phụ phẩm nông nghiệp như cám mì (Taragano et al., 1997), bã mía,

bã củ cải đường (Solis-Pereira et al., 1993), xác đậu cô ve (Boccas et al., 1994), vỏ

chanh (Larios et al., 1989) và bã táo (Hours et al., 1988; Joshi et al., 2006) có hàm

lượng pectin cao (15  25%) được biết đến như nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản

xuất pectinase cũng như PME nguồn gốc vi sinh vật

2.3.2 Độ ẩm

Độ ẩm cao của môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí trong khi độ ẩm thấp quá sẽ

kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme

ên cạnh việc ảnh hưởng đến độ thoáng khí, độ ẩm của môi trường còn liên quan đến

sự kết dính, từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như

khả năng tạo enzyme

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 ÷ 60% và phải

giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi Độ ẩm vượt quá 70% làm

giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì kiềm hãm sự sinh trưởng và

phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme (Ashok et al., 2000)

Khi nuôi cấy trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trường sau

khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn (Joshi et

al., 2006)

2.3.3 pH

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm

ẩm thấp nên pH môi trường thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy Tuy

nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển

của nấm mốc và sự tạo thành enzyme Khi pH môi trường dịch về phía acid hoặc phía

kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme

pectinase bị kiềm hãm pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong

khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007) Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng

enzyme, loại cơ chất và chủng nấm mốc, giá trị pH tối thích cho hoạt động của

A.niger sinh tổng hợp PME là khác nhau Chính vì thế, cần thiết phải xác định điều

kiện pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận enzyme mong muốn

2.3.4 Thời gian nuôi cấy

Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng như hoạt

tính của enzyme Vi sinh vật cần thời gian đủ dài để phát triển và sản sinh enzyme

Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng, vi sinh vật

phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm

Thời gian nuôi cấy để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thực

nghiệm Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính

enzyme Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc

khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nấm mốc Aspergillus

niger thường được nuôi cấy trong thời gian 48 đến 96 giờ cho quá trình sinh tổng hợp

PME (Smith, 2002; Joshi et al., 2006)

2.3.5 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của

nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme

Nhiệt độ nuôi cấy cũng là yếu tố quan trọng đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật và

tổng hợp enzyme Nếu không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt lực

của các enzyme Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30oC

Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của nấm mốc, đến một mức tới

hạn nào đó sẽ ức chế hoàn toàn sự phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;

Joshi et al., 2006)

2.3.6 Nguồn khoáng và dinh dưỡng bổ sung

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong các quá trình sống để

xây dựng tế bào Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều có chứa nitơ

(protein, acid nucleic, enzyme, …)

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà vi

sinh vật có thể đồng hóa được Việc chọn nguồn nitơ là rất cần để đảm bảo được hiệu

suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật Các nguồn nitơ dùng trong

công nghiệp lên men thường là các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ (Lương Đức Phẩm,

1998)

Các nguyên tố đa, vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp enzyme của

vi sinh vật Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và nhiều

coenzyme, đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy hóa sinh học

Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác

Cation Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu

đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi Lưu huỳnh kích thích tạo enzyme (Lưu huỳnh

có trong thành phần các acid amin quan trọng như methionine, cystein) Ngoài ra,

calcium, mangan, corban, … cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức

Lượng, 2004)

Những hợp chất khoáng của môi trường có nhiều ý nghĩa sinh lý khác nhau Một trong

những tính chất của chúng là làm thay đổi trạng thái hóa keo của tế bào chất Dưới tác

dụng của những muối vô cơ, lớp bề mặt tế bào không ngừng thay đổi và dẫn đến làm

thay đổi tốc độ các phản ứng enzyme trong quá trình trao đổi chất (Lương Đức Phẩm,

1998)

Theo nhiều tác giả, các ion K+

, Na+, Ca2+ có ảnh hưởng tới hiệu quả tác dụng của PME, Kretovits và Iarovenko (1982) thừa nhận rằng muối Ca2+ và Mg2+ nâng cao hoạt

độ của enzyme Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl2, H2O2 không có tác dụng tới hoạt độ

PME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO3 với nồng độ thấp có khả năng nâng

cao hoạt độ của enzyme này Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đưa ra kết luận

EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của Aspergillus

repens, làm giảm hoạt tính PME

PME đã được phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991;

Solís-Pereira, 1993), đặc biệt là A.niger đã được khảo sát khá chi tiết với cả hai phương thức

lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau

(Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006) Nhìn chung, đặc điểm thành phần cơ chất giàu

pectin và điều kiện môi trường là những yếu tố chi phối mạnh đến hiệu quả lên men

sinh PME từ vi sinh vật

Theo nghiên cứu của Joshi et al., (2006) về việc sinh pectin methylesterase (PME) từ

Aspergillus niger trên cơ chất bã táo đã cho thấy, nhiệt độ ủ 25oC, điều kiện pH phản

ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ưu cho việc lên men sinh PME ở cả

môi trường rắn (SSF) và môi trường lỏng (SmF) Ngoài ra, vai trò của các nguồn nitơ

bổ sung như (NH4)2SO4, thành phần khoáng cũng như tỷ lệ pha loãng của cơ chất :

nước nhằm tạo độ ẩm cho quá trình lên men sinh PME thích hợp cũng được xác định

Theo đó, t lệ pha loãng 1: 3 (độ ẩm ban đầu của cơ chất khoảng 4%) là thông số tối

ưu cho quá trình lên men rắn (SSF) (Joshi et al., 2006)

Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong

khoảng từ 30 ÷ 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và được hoạt hóa bởi Ca2+

và Mg2+ Phương pháp trích ly PME cũng được nghiên cứu (Contreras – Esquivel, 1999), kết

quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% được sử dụng trích ly PME từ vỏ quả

chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly cao nhất

Sarvamangala và cộng sự (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất

là hạt của hoa hướng dương và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong

quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3%

amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của

pectinase thu được trên môi trường rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu

được trên môi trường lỏng (45,9U/g và 18,9U/g)

Vỏ cam cũng được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất pectin lyase từ

Rhizopus oryzea với những điều kiện thích hợp (bổ sung NH4NO3, NH4Cl, nhiệt độ

đạt 50oC và pH 7,5 với sự có mặt của các chất khoáng như Ca2+, Mg2+, Na+ và K+)

(Hossam, 2005) Kết quả thu được pectin lyase với hoạt tính là 297 U/mL Đồng thời,

nghiên cứu này cũng cho thấy ion Zn2+, Co2+, Mn2+, Hg2+ là nhân tố ức chế khả năng

sinh pectin lyase của Rhizopus oryzea

Tóm lại, quá trình lên men sinh enzyme PME phụ thuộc rất nhiều yếu tố khác nhau, vì

vậy cần phải được khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng, từng

loại cơ chất cũng như các điều kiện của môi trường lên men

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Địa điểm: Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm ộ môn Công nghệ Thực

phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ 9/8/2010 đến 06/12/2010

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus niger So2 từ cam soàn đã được phân lập và tuyển chọn từ phù

hợp cho quá trình nuôi cấy sinh pectin methylesterase (Tran et al., 2010 a)

Môi trường lên men sinh PME: lên men bề mặt trên cơ chất bã táo ta và vỏ cam với tỷ

lệ bã táo : vỏ cam là 7 : 3 và độ ẩm điều ch nh đến 60% (Tran et al., 2010 b)

 Pectin táo DE = 75% (Sigma)

 Acid citric, Na2HPO4 (Merck)

 Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 )

 Ammonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4 )

 Urea (P.A)

 Peptone

Và một số hóa chất khác sử dụng trong phân tích

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

i Cơ chất

ã táo: bã táo ta (Ziziphus nummularia) được tách loại nước bằng cơ học và được sấy

ở nhiệt độ (60  1)0C đến khi độ ẩm còn (4  1)% ã táo khô được nghiền thành bột

và đóng trong các bao PE nhỏ (Joshi et al., 2006) hay để trong keo thủy tinh cách ẩm

Vỏ cam: (Citrus grandis): lấy phần vỏ trắng bên trong, rửa sạch, cắt nhỏ khoảng 1mm

(chú ý luôn duy trì độ ẩm vỏ cam 75%)

Vỏ bưởi: giống Năm roi (tên khoa học Citrus maxima) cũng được xử lý loại phần vỏ

xanh, sau khi cắt nhỏ sẽ mang đi sấy ở nhiệt độ khoảng 600

C đến độ ẩm bằng với độ

ẩm bã táo

ii Chủng vi sinh vật

Nấm mốc A.niger So2 được chọn lựa ra từ nhiều chủng khác nhau, đã phân lập và

được nuôi cấy trên môi trường rắn, chọn chủng sinh PME có hoạt tính cao nhất Cho 5

mL dung dịch NaCl 0,025M vào ống nghiệm A.niger đã được nuôi cấy sau 4 ngày để

thu nhận dung dịch có chứa bào tử nấm A.niger Đo độ truyền quang %T của

Aspergillus niger ở bước sóng 530 nm để xác định mật số trước khi pha loãng với

nước cất đến mật số mong muốn (105

bào tử/mL) Lấy 2 mL huyền phù nấm mốc cho vào các bình tam giác có sẵn cơ chất

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các ch tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo phương pháp tổng hợp ở bảng 3

ảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các ch tiêu trong nghiên cứu

Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ điện thế acid – baz ở pH 4,5 và

nhiệt độ 30 0 C ±1 (Crelier et al., 1995, trích dẫn bởi Duvetter, 2007)

Số liệu được xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0 Sử dụng

phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để đưa ra kết luận về sự sai biệt giữa

các giá trị trung bình các nghiệm thức Các số trung bình được so sánh bằng phương

pháp LSD

3.3.1 Thông số cố định

Một số thông số cơ bản của quá trình lên men được sử dụng dựa trên các nghiên cứu

trước đây như: khối lượng cơ chất sử dụng (5 g/bình lên men 250 mL, với t lệ 3,5 g

táo - 1,5 g vỏ cam), mật số nấm mốc được cho vào môi trường lên men (2 mL huyền

phù A.niger, 105 bào tử/mL), được nuôi cấy 96 giờ ở nhiệt độ 370C trong môi trường

60% ẩm (pH của môi trường là 3,5) và t lệ dung dịch đệm sử dụng để trích ly PME

(20 mL dung dịch đệm citrate - phosphate pH 4,5 trên 5 g cơ chất)

3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung đến khả

năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger

i Mục đích

Tìm ra loại khoáng và tỷ lệ bổ sung thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME từ

nấm mốc A.niger đạt hoạt tính cao nhất