Khảo sát quá trình bảo quản enzyme naringinase bằng các phương pháp khác nhau

DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme naringinase ...11 Bảng 2: Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme naringina

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 2071804 Lớp: CNTP K33

Cần Thơ, 2011

Luận văn đính kèm sau đây với tên đề tài “Khảo sát quá trình bảo quản enzyme

naringinase bằng các phương pháp khác nhau” do sinh viên Trần ngọc Điển

thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện

Nguyễn Công Hà

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2011

Chủ tịch hội đồng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong bài luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân theo sự hướng dẫn của giáo viên Các số liệu và kết quả là trung thực và chưa từng được ai công bố

Người viết

Trần Ngọc Điển

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt bốn năm đại học, bên cạnh sự nổ lực của bản thân em còn nhận được sự chỉ bảo tận tình của quý thầy cô Đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình

Qua đó em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ

đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập và nghiên cứu Xin cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, cũng như hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời tri ân đến cô cố vấn học tập, cô đã cho em thật nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình học vừa qua

Đồng thời, em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến thầy Nguyễn Công

Hà, người đã truyền đạt kiến thức, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi để

em có thể hoàn thành tốt bài luận văn này

Xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khóa 33 cũng như các anh, chị cao học đã động viên tinh thần và trao dồi kiến thức cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô cùng các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công cuộc sống!

Sinh viên thực hiện

Trần Ngọc Điển

TÓM LƯỢC

Với mong muốn giữ ổn định hoạt tính enzyme naringinase thô, sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger theo thời gian bảo quản Và bước đầu khảo sát phương pháp kết tủa protein cho quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme naringinase bằng ethanol Thí nghiệm sẽ được tiến hành như sau:

Sinh tổng hợp enzyme naringinase từ nấm mốc Aspergillus niger

Bổ sung pectin đã được hồ hóa vào các mẫu enzyme thô với tỷ lệ khác nhau 0%; 0,1%; 0,3%; 0,5% (w/v) Rồi tiến hành bảo quản ở 4 0 C và -16 0 C, theo dõi hoạt tính trong 4 ngày

Thực hiện tương tự như trên, maltodextrin đã được hydrat hóa sẽ bổ sung vào dung dịch enzyme thô với tỷ lệ 0%, 10%, 20%, 30% (v/v) Tiến hành bảo quản ở 4 0 C và -

16 0 C, đồng thời theo dõi hoạt tính của các mẫu enzyme trong 4 ngày

Nghiên cứu khả năng kết tủa protein bằng ethanol được tiến hành khảo sát với tỷ lệ dung môi và enzyme là 1:3, thí nghiệm được thực hiện ở -16 0 C

Các kết quả thí nghiệm cho thấy:

Bảo quản enzyme naringinase thô ở điều kiện nhiệt độ -160C là tốt nhất

Việc bổ sung pectin và maltodextrin trong quá trình bảo quản không mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên nồng độ pectin bổ sung 0,1% ở -16 0 C và nồng độ maltodextrin

bổ sung 20% ở -16 0 C sẽ giữ được hoạt tính enzyme ổn định nhất so với mẫu không

bổ sung và các mẫu còn lại

Quá trình kết tủa protein đạt hiệu quả ở nồng độ cồn 70 0 , trong điều kiện -16 0 C, thời gian tủa 4 giờ, với tỉ lệ ethanol : dung dịch là 1:3

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN II LỜI CẢM TẠ III TÓM LƯỢC IV MỤC LỤC V DANH SÁCH BẢNG VIII DANH SÁCH HÌNH IX

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 2

2.1.1 Cấu tạo hóa học của enzyme 2

2.1.2 Tính chất của enzyme 2

2.1.3 Trung tâm hoạt động của enzyme 3

2.1.4 Tính đặc hiệu của enzyme 3

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 3

2.1.6 Hoạt độ enzyme 9

2.1.7 Enzyme naringinase (EC 3.2.1.40): 9

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN 12

2.2.1 Nguồn gốc 12

2.2.2 Cấu tạo của phân tử pectin 13

2.2.3 Tính chất của pectin 13

2.2.4 Phân loại pectin 13

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel 14

2.2.6 Ứng dụng 16

2.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ MALTODEXTRIN 16

2.3.1 Cấu tạo và tính chất 17

2.3.2 Ứng dụng 18

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN 18

2.4.1 Sử dụng muối làm tác nhân gây tủa 19

2.4.2 Tủa protein bằng dung môi hữu cơ 20

2.4.3 Dựa vào điểm đẳng điện để gây tủa protein 21

2.4.4 Tủa protein bằng các non – ionic polymer 22

2.4.5 Tủa bằng ion kim loại 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 24

3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 24

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 25

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu 26

3.3 NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 26

3.3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung pectin, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase .26

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin, nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase 27

3.3.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu hiệu quả của việc kết tủa protein bằng

ethanol (cồn) 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29

4.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VIỆC BỔ SUNG PECTIN, KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 29

4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MALTODEXTRIN, NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NARINGINASE THÔ 33

4.3 NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA VIỆC KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ETHANOL ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME 38

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 40

5.1 KẾT LUẬN 40

5.2 ĐỀ NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH XI PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ XIII

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme naringinase 11

Bảng 2: Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger

sinh tổng hợp enzyme naringinase 25

Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase theo nồng độ pectin và nhiệt độ bảo quản 29

Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin và nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính enzyme naringinase 33

Bảng 5: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung

và thời gian bảo quản 35

Bảng 6: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung

và nhiệt độ bảo quản 36

Bảng 7: Đánh giá hiệu quả của việc kết tủa protein bằng cồn 38

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Đồ thị Michaelis - Menten (ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng

enzyme) 4

Hình 2: Ba kiểu phản ứng khi đo enzyme .5

Hình 3: Ảnh hưởng của pH 8

Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme 8

Hình 5: Sơ đồ thuỷ phân naringin thành prunin, rhamnose, naringenin và glucose bởi naringinase gồm hai enzyme là α-L-rhamnosidase và β-D-glucosidase 10

Hình 6: Pectin trong cấu tạo thành tế bào thực vật 12

Hình 7: Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin 13

Hình 8: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa cao 14

Hình 9: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa thấp 14

Hình 10:Công thức cấu tạo của maltodextrin 17

Hình 11: Sơ đồ biến đổi tính chất hóa lý của Maltodextrin theo giá trị DE 17

Hình 12: Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein theo nồng độ muối 19

Hình 13: Tỷ lệ protein tủa theo pH 22

Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 40C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản 30

Hình 15: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở -160C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản 31

Hình 16: Dung dịch mẫu trước khi bảo quản 32

Hình 17: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở 40C sau thời gian 4 ngày 32

Hình 18: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở -160C sau thời gian 4 ngày 32

Hình 19:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở

40C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian 34

Hình 20: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở

-160C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian 34

Hình 21: Mẫu ban đầu 37

Hình 22: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở -160C 37

Hình 23: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Từ nhiều thập kỷ trước, enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường Cùng với sự phát triển của khoa học cũng như enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không chỉ trong lĩnh vực truyền thống mà cả trong nhiều lĩnh vực mới tạo ra các sản phẩm mới

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có trong tất cả các tế bào sống (động vật, thực vật

và vi sinh vật) Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp và chủ yếu nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống do những ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ thu hồi, cùng lúc thu được nhiều loại enzyme Do đó việc gia tăng

sử dụng vi sinh vật đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm enzyme được tạo ra nhiều hơn

Tùy mục đích sử dụng mà người ta sản xuất ra nhiều dạng chế phẩm khác nhau: enzyme thô, enzyme bán tinh khiết và enzyme tinh khiết

Từ những nghiên cứu trước đây đã khẳng định, việc sử dụng enzyme naringinase thô, để thủy phân naringin làm giảm chất đắng trong bưởi có hiệu quả đáng kể Quá

trình khử vị đắng sẽ có hiệu quả cao và kinh tế hơn nếu dùng nấm mốc Aspergillus

để sinh tổng hợp naringinase

Tuy nhiên enzyme rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách khỏi tế bào và cơ thể Vì vậy mục tiêu của đề tài này là tìm ra phương pháp bảo quản enzyme thô sao cho giữ được hoạt tính ổn định nhất

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định nồng độ maltodextrin và pectin bổ sung vào dịch chiết enzyme thô Kết hợp khảo sát hoạt tính enzyme theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 40C và -160C Bước đầu nghiên cứu khả năng kết tủa protein từ dịch chiết thô bằng ethanol ở nhiệt

độ -160C với các nồng độ cồn khác nhau

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME

2.1.1 Cấu tạo hóa học của enzyme

Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20 L-α amino acid Các acid amin kết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-)

Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme một thành phần, hoặc là protein phức tạp, gọi là enzyme hai thành phần hay haloenzyme

Phân tử haloenzyme bao gồm hai thành phần:

+ Phần không phải protein gọi là coenzyme , có vai trò thực hiện chức năng xúc tác

Enzyme có những đặc tính ưu việt hơn các chất xúc tác khác như:

- Hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 105 – 1012 lần so với khi không có chất xúc tác

- Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường (nhiệt độ 20 - 400C,

pH từ 5 - 8)

- Có tính đặc hiệu cao, tính đặc hiệu lập thể…

- Có thể tham gia phản ứng đến cùng để đạt hiệu quả 100% và không tạo ra phụ phẩm thừa

- Chúng có thể tham gia các phản ứng theo dây chuyền Khi đó, sản phẩm của phản ứng đầu là nguyên liệu cho phản ứng sau

- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu tốn năng lượng là ít nhất

- Trong tế bào sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp Số lượng chúng là rất lớn và ứng với số lượng các phản ứng cơ thể cần thiết phải thực hiện

- Không tham gia vào thành phần của sản phẩm cuối và được giải phóng ra ở dạng ban đầu (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

2.1.3 Trung tâm hoạt động của enzyme

Trong phân tử enzyme có một phần nhỏ kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành, hoặc cắt đứt các liên kết của phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa tạo thành sản phẩm phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

- Trung tâm hoạt động chỉ chiếm một phần nhỏ trong phân tử, nằm trong túi (pocket) hoặc trong khe (cleft) gần trên bề mặt phân tử

- Trung tâm hoạt động bao gồm: Các nhóm chức khác nhau của mạch bên (gốc R) của các acid amin trong phân tử, phân tử H2O liên kết, các nhóm chức của coenzyme

- Trung tâm hoạt động có cấu hình không gian xác định, sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất

2.1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hay tính chuyên hóa của enzyme Mức độ đặc hiệu của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta thường phân thành các mức sau:

- Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một chất nhất định

- Đặc hiệu nhóm: Các enzyme thuộc nhóm này chỉ tác dụng với những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết

- Đặc hiệu liên kết: mức độ đặc hiệu tương đối thấp, chỉ có tính đặc hiệu đối với liên kết bị cắt đứt

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Nồng độ enzyme, đặc tính, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất

vô cơ và hữu cơ khác Các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh hưởng đến độ bền cấu trúc không gian, độ tích điện của phân tử enzyme, mà còn làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó

2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ([E])

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào [E]

V = k[E]

V: vận tốc phản ứng; [E]: nồng độ enzyme

Nhưng nếu nồng độ enzyme quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian rất ngắn, vận tốc phản ứng đã không thay đổi theo thời gian (Phạm Thị Trân Châu, 2006)

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ([S])

Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn bằng phương trình Mischaelis – Menten (1)

] [

] [

max

S K

S V V

Km: hằng số Michaelis-Menten, đặc trưng cho từng loại enzyme

Hình 1: Đồ thị Michaelis - Menten (ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng

enzyme)

(Nguồn: Nguyễn Công Hà, 2008)

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

[S] tăng → tăng tốc độ và tăng cơ hội cơ chất gặp được enzyme

- Giữ số lượng enzyme là hằng số

- Để nồng độ cơ chất gia tăng dần dần → tốc độ phản ứng sẽ gia tăng và đạt đến cực đại Sau điểm này, nếu gia tăng nồng độ cơ chất sẽ không còn gia tăng tốc độ phản ứng nữa

- Nồng độ cơ chất hiện diện với số lượng rất lớn → phản ứng phải độc lập với nồng

độ cơ chất

→ Bất cứ sự thay đổi nào của sản phẩm hình thành trong một khoảng thời gian nào

đó sẽ phụ thuộc vào mức độ enzyme hiện diện

Hình 2: Ba kiểu phản ứng khi đo enzyme

Giữa A và B, đồ thị biểu diễn phản ứng bậc không, tốc độ là hằng số với thời gian Khi cơ chất sử dụng hết, trung tâm hoạt động của enzyme không còn bão hòa, nồng

độ cơ chất trở thành giới hạn của tốc độ, và phản ứng trở thành bậc 1 giữa B và C

Để đo độ hoạt động lý tưởng, phương pháp đo phải thực hiện trong phần của đồ thị nơi có phản ứng bậc không B thể hiện phản ứng bậc không, ở đó cho phép xác định chính xác độ hoạt động enzyme cho một phần hoặc tất cả thời gian phản ứng Phản ứng này bắt đầu là bậc không và sau đó chậm dần

Độ hoạt động đúng thể hiện bởi đường chấm Đường C thể hiện một phản ứng với giai đoạn chậm (lag phase)

Xác định nồng độ sản phẩm nhiều lần sẽ đảm bảo mỗi đường được vẽ ra và độ hoạt động thực sự được xác định chính xác điểm kết thúc tại E sẽ dẫn đến kết luận sai rằng tất cả 3 mẫu có nồng độ enzyme giống nhau

2.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Chất kìm hãm là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Các chất này có thể là các ion, các chất vô cơ hay hữu cơ, có thể là cơ chất hay là sản phẩm của phản ứng enzyme Các chất này có thể tác dụng theo nhiều cách khác nhau như:

đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch

Chất ức chế thuận nghịch tương tác với enzyme thông qua các liên kết không đồng hóa trị hay các phản ứng phân li Ngược lại, chất ức chế không thuận nghịch gây ra

sự thay đổi liên kết đồng hóa trị trong enzyme Vì thế, sự ức chế không thuận nghịch thường làm giảm nồng độ của enzyme hoạt động Ức chế thuận nghịch gồm

có ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

Các chất kìm hãm cạnh tranh

Các chất kĩm hãm cạnh tranh (I) thường có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơ chất (S) Do đó, chúng có khả năng cạnh tranh với cơ chất để kết hợp với enzyme (E) ở trung tâm hoạt động, nhưng khác với S ở chỗ nó không bị chuyển hóa bởi E (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau:

Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành phức hợp EIS như phản ứng sau:

E + S = ES E + P

E + I EI

ES + I = ESI

EI + S = EIS

Kiềm hãm do thừa cơ chất

Trong một số trường hợp thừa cơ chất sẽ kìm hãm phản ứng Giải thích hiện tượng này có nhiều giả thuyết khác nhau Ví dụ có thể do nồng độ cơ chất quá cao tạo rào cản không gian gây khó khăn cho tương tác đúng giữa enzyme và cơ chất (caseine đối với protease của Bacillus pumilus) Hoặc có thể do cơ chất kết hợp không đúng

cách tạo phức ESS không hoạt động (phản ứng do succinate dehydrogenase xúc tác) (Lê Ngọc Tú, 2004)

Kiềm hãm bởi sản phẩm của chúng

Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó

Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu: S1 + S2 P1 + P2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2 Trong trường hợp này P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2

2.1.5.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại

Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme Các ion kim loại nặng, ở nồng độ gây biến tính protein có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này, lại có tác dụng kìm hãm enzyme (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

2.1.5.5 Các chất hoạt hóa khác

Một số chất có thể làm tăng hoạt độ enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp Gọi

là gián tiếp khi tác dụng hoạt hóa là loại trừ chất kìm hãm khỏi hỗn hợp phản ứng, hoặc không tác dụng trực tiếp với enzyme Các chất hoạt hóa trực tiếp thì thường tác dụng vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006)

2.1.5.6 Ảnh hưởng của pH

Hoạt độ enzyme phụ thuộc và môi trường, vì pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc acid amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một khoảng pH nhất định, pH thích hợp của phần lớn enzyme vào khoảng 7 (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006), tuy nhiên pH tối thích của enzyme còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác như tính chất dung dịch đệm, đặc tính và nồng độ

cơ chất, nhiệt độ phản ứng…(Lê Ngọc Tú, 2004)

Hình 3: Ảnh hưởng của pH

2.1.5.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất enzyme là protein Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng Tốc độ của phản ứng do enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc

Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hệ số Q10,

là tỷ lệ của vận tốc phản ứng ở một nhiệt độ nào đó so với vận tốc phản ứng ở nhiệt

Hệ số này càng lớn phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường

Nhiệt độ hoạt động thích hợp của đa số enzyme vào khoảng 40 - 500C (hình 4), trên

500C hoạt độ thường giảm mạnh do cấu trúc enzyme bị phá hủy

Ở nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ enzyme bị giảm nhiều, nhưng lại có thể được phục hồi khi đưa về nhiệt độ bình thường

Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme

2.1.6 Hoạt độ enzyme

Trong enzyme học người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme Để xác định hoạt độ của enzyme về nguyên tắc có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

+ Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme nhất định

+ Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phảm ứng với một nồng độ enzyme nhất định

+ Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Để tiêu chuẩn hóa việc biểu diễn mức độ hoạt động xúc tác của enzyme theo quy ước quốc tế, sử dụng các đơn vị sau:

+ Đơn vị UI (International unit): Một đơn vị UI là hoạt độ của một enzyme ở các điều kiện tiêu chuẩn thích hợp, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một µmol cơ chất trong một phút

1 UI = 1µmol cơ chất/phút = (10-6 mol/60 giây)

+ Đơn vị Katal: Một đơn vị katal là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa

một mol cơ chất trong một giây ở các điều kiện phân tích

1 katal = 1mol/giây Như vậy: 1 katal = 60 x 106 UI

Hoạt độ riêng

Là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ sạch của chế phẩm enzyme Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein

2.1.7 Enzyme naringinase (EC 3.2.1.40):

2.1.7.1 Đặc tính của enzyme naringinase

Naringinase từ những nguồn khác nhau sẽ có những đặc tính khác nhau

Naringinase từ sp Penicillium bao gồm cả α -L-rhamnosidase và β-D-glucosidase

pH tối ưu cho hai enzyme này lần lượt là 4,5 và 3,0 (Gabor và Pittner, 1984)

Naringinase từ Aspergillus niger chứa cả α-L-rhamnosidase (EC 3.2.1.40) và βglucosidase (EC 3.2.1.21) Hoạt động của hai enzyme này phụ thuộc vào pH và nồng độ protein, α-L-rhamnosidase hoạt động độc lập trong dãy pH từ 3-7 Trong

Naringin có thể được thủy phân bởi α -L-rhamnosidase tạo ra rhamnose và prunin (4,5,7-trihydroxyflavonone-7-glucopy-ranoside) Cũng có thể thu được prunin từ

β-D-glucosidase (Park and Chang, 1979)

Naringinase phân cắt naringin thành naringenin qua hai công đoạn sau:

+ Naringin Prunin + rhamnose

Hình 5: Sơ đồ thuỷ phân naringin thành prunin, rhamnose, naringenin và glucose

Theo nghiên cứu của Ladaniya (2008) cho thấy các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme và thời gian thuỷ phân cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân naringin Khả năng thủy phân của naringinase tăng khi tăng nhiệt độ Tuy nhiên, mối quan hệ này không tuyến tính Ở nồng độ enzyme thấp, khả năng thủy phân tỷ lệ với thời gian thuỷ phân Tuy nhiên, ở nồng độ enzyme cao hơn thì khả năng thủy phân ít phụ thuộc vào thời gian

Ngoài ra, áp suất cũng có tác động đến hoạt tính thủy phân naringin của enzyme naringinase Kết quả cho thấy, ở cùng một nhiệt độ (303 K), hoạt động của enzyme cao hơn ở áp suất 160 MPa (Vmax = 2,7 mM/phút) so với áp suất khí quyển (Vmax = 0,06 mM/phút) (Helder và ctv, 2006)

2.1.7.2 Sản xuất enzyme naringinase

Trong lịch sử, enzyme naringinase được trích ly từ thực vật như hạt cần tây hay lá bưởi (Hall, 1938) Tuy nhiên, nguồn naringinase thực vật chưa mang lại lợi ích cao Những nghiên cứu về sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật có tính khả thi hơn so với nguồn thực vật Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng để sinh tổng hợp enzyme naringinase

Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii Kishi, 1955

2.1.7.3 Những ứng dụng khác của enzyme naringinase

Bên cạnh khả năng thủy phân naringin, α-L-rhamnosidase còn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp Nó được sử dụng để loại tinh thể hesperidin Đặc biệt naringinase được sử dụng để sản xuất những glycosides tự nhiên và làm tăng hương

vị cho rượu và nước quả (Pandey, 1984) Theo Sankyo (1988) naringinase còn được dùng để sản xuất chloropolysporin C, được xem là một chất chống các vi khuẩn

gram (+) hiệu quả (đặc biệt là Staphylococcus aureus và Enterobacteria) Sapogenis

và diosgenis (những tiền chất để tổng hợp multivitamin và hormone sinh học) có thể

được sản xuất bằng cách sử dụng naringinase để thủy phân hạt cari (Elujoba and Hardman, 1987) Những sản phẩm thủy phân này có tiềm năng ứng dụng cao Prunin có thể sử dụng để chống lại DNA/RNA của virus Prunin còn là một hợp chất ngọt dành cho người tiểu đường và là chất chống ung thư, chống oxi hóa Rhamnose là tiền chất trong quá trình tổng hợp nhiều chất hữu cơ và nó là nguồn nguyên liệu cho dược phẩm, đồng thời nó còn là tác nhân bảo vệ thực vật và tổng hợp các chất ngọt và chất mùi thương mại (Kaul và Middleton, 1985)

Bên cạnh đó naringinase còn được dùng để tổng hợp dihydrochalcone Độ ngọt của dihydrochalcone glucosides của naringin, neohespiridin và hespiridin gấp lần lượt là

300, 1100 và 300 lần so với đường saccharose (Horowitz và Gentili, 1963)

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN

2.2.1 Nguồn gốc

Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin

Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ, hoặc thân của một số loài thực vật: trong táo 10 – 15%; quả citrus 20 – 50%; củ cải đường 10 – 20%; đài hoa hướng dương 15 – 25% Trong cùng một quả nhưng ở những phần khác nhau thì hàm lượng pectin cũng khác nhau

Hình 6: Pectin trong cấu tạo thành tế bào thực vật

(Nguồn: http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cong-nghe-san-xuat-pectin.170186.html)

2.2.2 Cấu tạo của phân tử pectin

Hình 7: Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin

Pectin là một polysaccharide mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử acid D-galacturonic (C6H10O71), liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- glucoside Trong đó một số gốc acid có chứa nhóm methoxyl (-OCH3)

Phân tử lượng của các loại pectin phụ thuộc vào số phân tử acid galacturonic và thường thay đổi trong phạm vi 10000 – 100000

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là:

+ Chỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl (–OCH3) có trong phân tử pectin

+ Chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân tử acid galactoronic trong phân tử pectin

2.2.4 Phân loại pectin

2.2.4.1 Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa

Pectin chia thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp

+ Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE > 50 % hay MI > 7% Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm Muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %

Hình 8: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa cao

+ Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 % hay MI < 7% Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm

Hình 9: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa thấp

2.2.4.2 Theo khả năng hòa tan trong nước

+ Pectin hòa tan (methoxyl polygalacturonic): là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galacturonic trong đó có một số gốc acid chứa nhóm thế methoxyl

+ Pectin không hòa tan (protopectin): là dạng kết hợp của pectin với araban (polysaccharide ở thành tế bào)

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel

không đơn thuần ở hàm lượng pectin được sử dụng Hai yếu tố quan trọng hàng đầu

là chiều dài mạch phân tử pectin và mức độ methoxyl hóa trong phân tử của chúng

Chiều dài của phân tử quyết định độ cứng của gel:

Nếu phân tử pectin quá ngắn thì nó sẽ không tạo được gel mặc dù sử dụng với liều lượng cao Nếu phân tử pectin quá dài thì gel tạo thành rất cứng

Mức độ methoxyl hoá quy định cơ chế tạo gel:

Khả năng keo hóa của pectin phụ thuộc tương đối vào mức độ hiện diện của các nhóm methoxyl Tùy thuộc vào chỉ số methoxyl cao (>7%) hoặc thấp (3 – 5%) ở phân tử pectin mà các kiểu kết hợp giữa chúng sẽ khác nhau trong việc tạo gel

+ Lượng đường trong hỗn hợp pectin – đường – acid thường phải lớn hơn 50% thì mới có khả năng tạo gel Thông thường người ta tạo hỗn hợp có 65% đường để tiến hành keo đông Nếu hàm lượng đường dùng cao hơn, sự kết tinh đường có thể xảy

ra trên bề mặt hạt keo, hoặc ngay trong hệ keo Để khắc phục hiện tượng này, có thể thay thế một phần đường saccharose bằng đường glucose nhằm tránh hiện tượng kết tinh đường

Với pectin chất lượng càng tốt thì lượng pectin dùng để gel hóa cùng một lượng đường càng ít

2.2.5.4 Acid

Pectin chỉ có thể tạo gel trong môi trường acid có pH < 4

+ Trong môi trường có H+ , các phân tử pectin tích điện âm sẽ bị trung hòa và trở thành dạng trung hòa điện dễ tạo đông tụ Hơn nữa, ion H+ sẽ thay thế các ion kim

loại (nếu có) trong nhóm cacboxyl của phân tử pectin và chuyển dạng muối pectat (không tạo đông) thành dạng pectin (có tạo đông)

+ Acid sử dụng để tạo đông cần có mức độ phân ly cao hơn acid pectic để acid này

có thể ngăn cản sự phân ly của acid pectic, và giữ cho chúng ở dạng trung hòa điện tích

+ Nồng độ ion H+ càng lớn thì khả năng tạo gel của dung dịch pectin sẽ càng cao Cần duy trì độ pH thấp để khi đun nấu sẽ gây ra quá trình nghịch đảo đường saccharose (30 – 50% đường thêm vào pectin) để ngăn cản sự kết tinh của đường Cũng không nên dùng quá nhiều acid, vì pH quá thấp sẽ gây ra sự nghịch đảo một lượng lớn saccharose từ đó gây kết tinh glucose và hóa gel nhanh tạo nên các vón cục Thường dùng độ pH từ 3 đến 3,5

+ Mức độ tạo gel chỉ tăng đến một giới hạn nào đó của nồng độ acid rồi sẽ ngừng lại bởi vì ở ngưỡng nồng độ đó toàn bộ gốc COO- của phân tử pectin đã được trung hòa điện tích Nên dù có tăng thêm ion H+ cũng không thể tăng thêm mức độ tạo gel Nồng độ acid để tạo gel dung dịch pectin phụ thuộc mức độ methoxyl của pectin và hàm lượng pectin trong dung dịch Khi hàm lượng pectin sử dụng tăng khoảng 0,05–0,1% thì pH của dung dịch có thể tăng lên 1 đơn vị

+ Nếu phải sử dụng pectin có khả năng đông tụ yếu thì nên tăng nồng độ acid lên Nhưng việc tăng nồng độ này lại dễ làm tăng lượng đường chuyển hóa và làm tăng tính háo nước của sản phẩm

2.2.6 Ứng dụng

Pectin là chất tạo gel quan trọng nhất được sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm Khả năng tạo gel của nó được sử dụng trong những thực phẩm cần có sự ổn định của nhiều pha Tác dụng tạo gel của pectin được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm mứt trái cây và mứt đông

Tác dụng của pectin là tạo ra cấu trúc mứt đông và mứt trái cây không bị thay đổi trong quá trình vận chuyển, tạo ra mùi vị thơm ngon cho sản phẩm và giảm sự phá

vỡ cấu trúc Trong một số trường hợp, pectin còn được sử dụng với carageenan để tăng hiệu quả tạo gel

2.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ MALTODEXTRIN

Maltodextrin được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến thực phẩm và dược phẩm Theo dược điển Mỹ USP 24 [3], maltodextrin là một chất không ngọt,

là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn bằng acid hoặc enzym hoặc bằng

hỗ hợp acid và enzym

Đương lượng Dextroza Equivalent viết tắt là DE là đại lượng chỉ khả năng khử đối với chuẩn là 100% ở đường glucoza (dextrose), hay là số gam tương đương D-glucoza trong 100 gam chất khô của sản phẩm [3], [9]

2.3.1 Cấu tạo và tính chất

Maltodextrin được tạo thành từ sự liên kết của các phân tử D-glucose theo liên kết α-1,4 glycoside Maltodextrin bao gồm một hỗn hợp của các chuỗi khác nhau với độ dài khoảng 3-9 đơn vị glucose

Hình 10: Công thức cấu tạo của maltodextrin

Tính chất của Maltodextrin có DE 9 – 12 : ít hút ẩm, ít ngọt, ít tham gia phản ứng hóa nâu, hòa tan tới 30% chất khô, hàm lượng glucose 0,8%, maltose 2,9% chất khô

Ức chế tăng trưởng tinh thể

Khả năng hòa tan

Độ ngọt

Độ nhớt / yếu tố tạo hình

Hình 11: Sơ đồ biến đổi tính chất hóa lý của Maltodextrin theo giá trị DE

(Nguồn: Hoàng Kim Anh, 2005)

2.3.2 Ứng dụng

Maltodextrin được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến thực phẩm và dược phẩm Sản phẩm có DE 4 – 7 dùng để tạo màng mỏng dễ tan và tự hủy được làm vỏ bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, đưa vào kem, làm phụ gia cho các loại nước xốt, làm chất độn tạo viên trong công nghiệp dược Sản phẩm có DE 9 – 12 dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, đồ uống

và thức ăn riêng cho vận động viên thể thao, làm kẹo gum mềm, chất trợ sấy, chất giữ hương, yếu tố tạo hình Sản phẩm có DE 15 – 18 được sử dụng làm chất kết dính, chất tăng vị cho đồ uống, đưa vào thành phần bơ, sữa bột, cà phê hòa tan và làm vật mang các thành phần không phải đường

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN

Kết tủa protein được phân tách nhờ sự biến đổi từ protein hòa tan thành không hòa tan, loại bỏ những thành phần không mong muốn, làm giảm thể tích và tăng nồng

độ protein Việc sử dụng các phương pháp kết tủa cho từng loại enzyme riêng biệt phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính sinh lý, sinh hóa của enzyme Tuy nhiên, sau quá trình kết tủa enzyme, cần sử dụng các kỹ thuật hiện đại như điện di, lọc gel, sắc ký, để có enzyme tinh khiết hơn Tùy mục đích sử dụng ta có thể tạo ra chế phẩm thích hợp

Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau Trong

đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với các nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme

Thuận lợi chính của phương pháp kết tủa là dễ sử dụng Thêm vào đó, protein ở dạng kết tủa sẽ ổn định hơn là ở dạng dung dịch Protein bị kết tủa khi thay đổi bề mặt ngoài của nó, thay đổi đặc điểm tích điện hoặc thay đổi khả năng hòa tan của nó trong dung môi Quá trình thay đổi khả năng hòa tan trong dung môi thường được

sử dụng hơn Protein kém hòa tan ở điểm đẳng điện của nó (pI), vì vậy việc lựa chọn loại dung môi gần điểm đẳng điện của protein được tiến hành nghiên cứu Tuy nhiên, một vài loại protein có thể bị biến tính ở điểm đẳng điện của nó Có nhiều phương pháp được tiến hành để làm giảm khả năng hòa tan của protein như: dựa trên điện tích (Ammonium sulfate, sodium chloride), nhiệt độ, pH, ion kim loại (Cu2+, Zn2+, ), non-ionic polymer PEG), dung môi hữu cơ (acetone, ethanol), acid tannic, herparin, dextran sulfate, (Scopes, 1994)

2.4.1 Sử dụng muối làm tác nhân gây tủa

Đây là cách phổ biến để tủa protein Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…Phương pháp kết tủa bằng muối dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định để loại bỏ một phần protein tạp của dung dịch enzyme (Scopes, 1994)

Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, ở nồng

độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out) (Rosenberg, 2005)

Debye – Huckel giải thích giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp như sau: Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch

Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:

log S = B - KI

Với S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)

K: hằng số salting out (phụ thuộc pH, hỗn hợp và lượng muối trong sử dụng) I: cường độ ion của muối

Hình 12: Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein theo nồng độ muối

(Nguồn: http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html)