Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp pectin methylesterase từ aspergillus niger sử dụng phụ phẩm n

LỜI CAM ĐOAN Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp Pectin Methylesterase từ Aspergillus Niger sử dụng phụ phẩm nông nghiệp”

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGÔ THỊ THẢO OANH MSSV: 2071829

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN HIỆU QUẢ SINH TỔNG HỢP

PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu

quả sinh tổng hợp Pectin Methylesterase từ Aspergillus Niger sử dụng phụ phẩm

nông nghiệp” do sinh viên Ngô Thị Thảo Oanh thực hiện và báo cáo đã được hội

đồng chấm luận văn thông qua

Người viết

Ngô Thị Thảo Oanh

LỜI CẢM TẠ

Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, mà đề tài tốt nghiệp đã hoàn thành sau

ba tháng làm việc tại phòng thí nghiêm Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

Cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng dẫn và luôn quan tâm giúp đỡ

em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Văn Mười đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn Mặc

dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy cô vẫn thường xuyên theo dõi, hướng dẫn và giúp đỡ em rất tận tình

Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, những người đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường.Cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình

Các chị học viên cao học Công nghệ sinh học K16, Công nghệ Thực phẩm và Đồ Uống K17 cùng bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K33 đã nhiệt tình đóng góp

ý kiến và động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Em cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường Cuối lời, con kính gởi đến cha mẹ và những người thân yêu của con lòng biết ơn sâu sắc nhất về những gì đã giành cho con, luôn bên con, tạo đầy đủ điều kiện cho con học tập và nghiên cứu

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn !

Cần Thơ, 06 tháng 12 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Thảo Oanh

TÓM TẮT

Mục tiêu của đề tài là khảo sát hiệu quả của quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ Aspergillus niger trong điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn (SSF) trên cơ chất gồm bã táo ta khô và vỏ bưởi tươi ở các tỷ lệ khác nhau

Sự thay đổi thành phần hóa học của cơ chất lên men cũng được xác định trong suốt quá trình nghiên cứu nhằm tạo điều kiện lên men tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase

Kết quả nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học của bã táo khô có khá đầy đủ những thành phần dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men sinh enzyme PME như hàm lượng pectin cao (34,83%) thêm vào đó kết hợp với vỏ bưởi tươi có độ DE đến 84,77% là một trong những điều kiện tối thích cho Aspergillus niger sinh tổng hợp PME Trên cơ chất bã táo khô

và vỏ bưởi tươi, tỷ lệ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME là 5:5 (bổ sung nước tạo độ

ẩm 60%) Hoạt tính enzyme đạt giá trị cao nhất sau 4 ngày lên men và hoạt tính thu được

khoảng 41,16 ± 4,18 U/mL, cao gấp 8,5 lần khi so sánh với môi trường lên men chỉ sử dụng

bã táo

Từ khóa: Aspergillus niger, PME, bã táo, vỏ bưởi, thời gian ủ, hoạt tính

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 0

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 0

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Cơ chất pectin 2

2.1.1 Tổng quan về cơ chất pectin 2

2.2 Enzyme pectin methylesterase (PME) 5

2.2.1 Giới thiệu chung 5

2.2.2 Các tính chất của PME 6

2.2.3 Các nguồn PME khác nhau trong tự nhiên và đặc tính của từng loại 7

2.2.4 Ứng dụng của PME 10

2.3 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus 10

2.3.1 Aspergillus 10

2.3.2 Aspergillus niger 11

2.4 Thu nhận enzyme PME từ nấm mốc Aspergillus niger 12

2.5 Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger 13

2.5.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME 13

2.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME 14

2.6 Giới thiệu sơ lược về táo bưởi, nguồn cơ chất giàu pectin 15

2.6.1 Táo ta 15

2.6.2 Bưởi 16

2.7 Các nghiên cứu có liên quan 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Phương tiện nghiên cứu 19

3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 19

3.1.3 Hóa chất 20

3.1.4 Đối tượng nghiên cứu 20

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 20

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 21

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 22

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22

3.3.1 Phân tích thành phần hóa học của cơ chất lên men 22

3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giữa bã táo và vỏ bưởi 22

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger 23 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25

4.1 Xác định thành phần hoá học (pectin, DE, đường tổng số, đạm ), và độ ẩm trong cơ chất lên men 25

4.2 Ảnh của tỷ lệ phối trộn của bã táo và vỏ bưởi đến khả năng sinh tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger 25

4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger 28

4.4 Xác định hàm lượng pectin, DE, pH và độ ẩm trong cơ chất lên men sau thời gian lên men 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Kiến nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH viii

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao 3

Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin 4

Hình 3: Sơ đồ thủy phân pectin của PME 6

Hình 4: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl 7

Hình 5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình 11

Hình 6: Aspergillus niger 11

Hình 7: Táo ta 16

Hình 8: Bưởi da xanh 17

Hình 9 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 23

Hình 10: Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME theo tỷ lệ cơ chất 27

Hình 11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính PME 30

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Hàm lượng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây 5

Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của một số PME tinh khiết từ thực vật 8

Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 21

Bảng 4 Hàm lượng đường, đạm, pectin, DE và độ ẩm của cơ chất lên men .25

Bảng 5: Hoạt tính enzyme theo tỷ lệ cơ chất 26

Bảng 6 : Hàm lượng pectin, DE theo từng tỷ lệ cơ chất sau khi thanh trùng 28

Bảng 7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính PME từ A.niger 29

Bảng 8: Hàm lượng pectin, DE, pH và độ ẩm cơ chất lên men sau thời gian nuôi cấy 30

Bảng PL1 Bảng tra lượng đường nghịch chuyển xii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại thì ngành công nghệ sinh học với những nghiên cứu, phát minh mới mẻ ngày càng khẳng định vai trò khoa học của mình trong đời sống Trong đó, công nghệ enzyme là một lĩnh vực không kém phần quan trọng của công nghệ sinh học

Enzyme là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học, bản chất của enzyme là protein

Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme, con người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp Trong lĩnh vực thực phẩm enzyme được ứng dụng khá rộng rãi Đặc biệt, trong quá trình sản xuất rượu vang, nước quả, nước uống không cồn thì nhóm enzyme pectinase đóng vai trò quan trọng Trong nhóm enzyme pectinase, pectin methylesterase (PME) đảm nhiệm chức năng thủy phân các pectin thành các phân tử pectin có độ methoxyl

thấp hoặc acid pectic (Martin et al., 2004) Enzyme pectin methylesterase được

chú ý quan tâm nhằm: hạn chế sự phá hủy cấu trúc của tế bào thực vật, tăng hiệu suất trích ly nước quả và thúc đẩy sự tách nước từ mô tế bào trong suốt quá trình sấy (Van Buren, 1979) Việc gia tăng hoạt động của PME trong quá trình chế biến rau quả có thể thực hiện bằng cách kích hoạt nội enzyme ở điều kiện thích hợp như nhiệt độ, áp suất, thời gian, nồng độ muối, (Duvetter, 2007) hay bổ sung chế

phẩm PME (Tran Thanh Truc et al., 2008) Đối với các loại rau quả có sự hiện

diện của PME trong nội bào thấp, việc nghiên cứu bổ sung chế phẩm PME là biện pháp khả thi nhất

Lĩnh vực trích ly và ứng dụng PME có nguồn gốc từ thực vật trong công nghiệp chế biến các sản phẩm ở Việt Nam vẫn chưa được quan tâm đúng mức Trong khi

đó lại đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia (Suutarinen et al., 2002) Hiện

nay, PME thương mại vẫn chưa được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu các chế phẩm PME từ nước ngoài thường có giá rất cao Chính vì thế, nghiên cứu ly trích PME trong điều kiện hiện tại của Việt Nam là cần thiết, cần được quan tâm

PME có thể được sản xuất từ rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc bao gồm:

Aspergillus spp., Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp… (Polizeli et al.,1991), nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Torres et al.,2005) Aspergillus niger (A.niger) được sử dụng phổ biến trong công

nghệ thực phẩm trong nhiều thập kỷ qua và được đánh giá là an toàn đối với sức

khỏe con người (Taylor et al.,1979 &Dijck et al., 2003) Thêm vào đó, Aspergillus niger còn là loại nấm mốc có khả năng phát triển nhanh chóng trên các cơ chất rẻ

tiền và tiết ra enzyme trong môi trường, dễ dàng thu hồi (Oxenboll, 1994)

Trong trường hợp sinh tổng hợp pectin methylesterase (PME) cũng như các pectinase khác (enzyme thủy phân rau quả giàu pectin), cơ chất cảm ứng tương thích là yếu tố quan trọng, vì để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải tiến hành quá trình nuôi cấy thích hợp với sự tham gia của cơ chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Sự hiện diện của cơ chất cảm ứng thích hợp trong môi trường nuôi cấy sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả sinh tổng hợp enzyme Cơ chất được biết đến của PME

là pectin, acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác

(Sajjaanantakul &Pitifer, 1991) Vì thế, theo các nghiên cứu của Beg et al., 2000

&Martin et al., 2004 ; Joshi et al., 2006 ; Martin et al., 2000 ; Silva et al., 2002

&2005 ; Boccas et al., 1994 thì nhiều phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin đã được

sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men trạng thái rắn (SSF) để sản xuất PME từ

Aspergillus niger như :bã cam, bã táo, vỏ cam, bã cà phê , và bã táo là phế phẩm

được chú ý nhất

Táo (Ziziphus mauritiana) là một trong những loại quả được trồng phổ biến ở đồng

bằng sông Cửu Long Đây là loại quả được xếp hàng đầu trong việc cung cấp và

sản xuất pectin (Denes et al., 2000; Marcon et al., 2005), cơ chất cho quá trình lên

men và thu nhận nhiều loại enzyme và nguồn phân lập, tuyển chọn nấm mốc có

khả năng sinh pectinase nói chung (Martin et al., 2004) Trần Thanh Trúc và cộng

sự (2010) đã cho thấy hiệu quả khi nghiên cứu sử dụng bã táo ta và vỏ cam sành

làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme PME từ Aspergillus niger Ngoài

cam thì bưởi cũng là một trong những loại quả được trồng nhiều ở miền Nam, cùng họ citrus với cam Vỏ quả bưởi cũng chứa hàm lượng pectin cao, thêm vào

đó, bề mặt vỏ quả bưởi còn là môi trường thích hợp cho sự phát triển của một số

loài nấm mốc, trong đó có Aspergillus niger (Lê Thị Thanh Hương & Nguyễn

Thùy Châu, 2005) Việc sử dụng phụ phẩm từ táo và bưởi cho quá trình sinh tổng

hợp PME từ Aspergillus niger là hướng nghiên cứu mới, góp phần tích cực vào

việc nâng cao giá trị kinh tế cho một số loại cây ăn quả ở đồng bằng sông Cửu Long đồng thời giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme Chính vì thế, sử dụng bã táo ta và vỏ quả bưởi làm cơ chất chính cho quá trình lên men sinh tổng hợp PME

từ Aspergillus niger được đề nghị

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xác định tác động của thành phần cơ chất,

thông qua việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta và vỏ bưởi cho quá

trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lên men bề mặt

trên môi trường rắn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Cơ chất pectin

2.1.1 Tổng quan về cơ chất pectin

Pectin là một phụ gia thực phẩm thường được sử dụng để tạo gel trong chế biến các sản phẩm dạng đông như chế biến và bảo quản mứt, mứt đông, kẹo pectin Pectin thường được bảo quản ở dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng nhạt Trong tự nhiên, pectin có mặt trong quả, củ, thân cây Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: pectin hòa tan và protopectin, chuyển hóa giữa hai dạng tồn tại này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc rau quả Tiền thân của pectin là protopectin có nhiều trong mô trái cây còn xanh, quá trình chín sẽ kèm theo sự thủy phân protopectin thành pectin bị hoà tan, tế bào sẽ kém liên kết chặt chẽ với nhau, nên các tế bào trở nên mềm hơn Ngoài ra pectin còn có vai trò vận chuyển nước và lưu chất cho trái cây đang trưởng thành

Protopectin không tan trong nước, tạo độ cứng cho quả xanh Cấu tạo hoá học của protopectin phức tạp, gồm pectin ở trạng thái liên kết với các vi sợi cellulose trong vách tế bào, các ion Ca2+, Mg2+… Dưới tác dụng của enzyme protopectinase, acid hay khi đun nóng, protopectin bị thủy phân giải phóng pectin hòa tan

Cấu trúc vách tế bào thực vật có thể được chia thành ba lớp: phiến giữa (lớp chung-middle lamella), vách sơ cấp (primary wall), vách thứ cấp (secondary wall) (Brett & Waldron, 1996) Phần đầu tiên của thành tế bào do tế bào non đang phát triển tạo ra gọi là thành sơ cấp Nơi thành của 2 tế bào chạm nhau, lớp giữa chúng

được gọi là tấm trung gian sẽ gắn chúng với nhau chính là pectin

Hình 1: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao

Nguồn: Davidson (2005) (URL: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/plants/cellwall.html)

Về mặt cấu trúc hoá học, pectin là một phức hệ sợi nhỏ trong tự nhiên (Vicken et al., 2003) Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp các

acid polygalacturonic (GalA) qua các liên kết α-1,4 glycoside Pectin gồm chủ yếu các đơn vị galacturonic acid mặc dù chúng có thể được cấu tạo từ 17 loại monosaccharide khác nhau Có 3 loại pectic polymer chính cấu thành pectin: homogalacturonan (HG), rhamnogalacturonan I (RGI) và rhamnogalacturonan II

(RGII) (Vincken et al., 2003; Caffall &Mohnen, 2009) Khối lượng phân tử của

pectin dao động trong khoảng 80.000 ÷ 200.000 Da tùy thuộc vào nguồn pectin (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Pectin thương mại thường có hàm lượng acid galacturonic hơn 75% và độ ester hóa từ 30 ÷ 80 %, tùy thuộc nguồn gốc (Ly Nguyen, 2004)

Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin

Nguồn: Caffall và Mohnen, 2009

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là: DE (Degree of Esterification) – chỉ số ester hóa, thể hiện mức độ ester hóa của phân tử

galacturonic acid trong phân tử pectin (Smout et al., 2004) và MI – chỉ số

methoxyl hóa, biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl (-OCH3) có trong phân tử pectin Dựa vào chỉ số mức độ ester hóa DE, pectin được chia thành

ba nhóm: pectin hòa tan, acid pectinic và acid pectic

• Pectin hoà tan: DE rất cao gần 100%, là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của

acid polygalacturonic được ester hóa bằng methanol Pectin được ester hóa

sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ cao (khoảng 60 ÷ 65%)

• Pectinic acid: DE trung bình, là polygalacturonic acid có 1 phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá trung bình bằng methanol (Nguyễn Đức Lượng, 2004), có muối là pectinase

• Pectic acid: DE rất thấp hoặc không có Pectic acid là polygalacturonic acid

đã giải phóng hoàn toàn ra khỏi 1 đơn vị galacturonic acid trong đó có chứa

một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid galacturonic Pectate là muối của pectic acid (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Chỉ số DE của một loại pectin chi phối khả năng tạo thành và mức độ bền vững của phức calcium - pectate Điều này được giải thích do khi 2 nhóm carboxyl tự do của 2 chuỗi HG đứng cạnh nhau sẽ tạo nên một vùng tích điện âm có thể gắn kết với ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+, bằng cách đó mà gel calcium - pectate có thể

được tạo thành Phải có ít nhất 9 đơn vị GalA không ester hóa để tạo nên phức bền

vững giữa các chuỗi (Liners et al., 1992)

Bảng 1: Hàm lượng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây

Loại trái cây Hàm lượng pectin % Mức độ ester hóa DE%

Nguồn: Wolfgang Aehle, 2004

Dựa vào chỉ số MI – chỉ số methoxyl hóa, pectin thương mại được chia thành 2 loại:

• Pectin có độ methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin -HMP): MI > 7% Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm

• Pectin có độ methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin - LMP): MI < 7% Tạo thành bằng cách tách nhóm methoxyl trong phân tử pectin Chất này có thể tạo gel trong môi trường không có đường và thường dùng làm màng bao bọc sản phẩm

Pectin là một phụ gia thực phẩm được nhiều người chấp nhận nhất và được chứng minh bởi hàm lượng ADI (lượng tối đa ăn vào hằng ngày) cho phép, ngoài ra nó ít

bị biến đổi trong quá trình bảo quản do vi sinh vật, vì đây không phải là môi trường dinh dưỡng thích hợp cho các vi sinh vật phát triển Trong công nghiệp, pectin được thu nhận từ dịch chiết của các nguyên liệu thực vật thường là táo hay các quả có múi như: cam, quýt, bưởi…

2.2 Enzyme pectin methylesterase (PME)

2.2.1 Giới thiệu chung

Pectin methylesterase (PME) thuộc nhóm enzyme pectinase - nhóm các enzyme sử dụng pectin như chất nền PME còn có tên khác là pectinesterase (PE) và được

đánh số trong hệ thống phân loại là 3.1.1.11 Vị trí thủy phân của PME là các

nhóm methylester (-COOCH3) của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa (-COOH) (Ly Nguyen, 2004) Sự thủy phân pectin bằng PME tạo thành acid pectinic và methanol Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này rất cao, có thể đạt 98%

Hình 3: Sơ đồ thủy phân pectin của PME

Nguồn: Reinikainen, 2004

Các thành viên khác của hệ enzyme pectinases như polygalacturonase (PG) và lyase pectate (PL) tác động thủy phân pectin theo các hình thức khác nhau Các loại PME được tìm thấy trong rất nhiều loại thực vật và cũng được sản xuất từ các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây

2.2.2 Các tính chất của PME

PME là những enzyme có kích thước trung bình và phân tử khối (MM) vào khoảng

25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003) Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đến 11

Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME có tính acid (Bordenave, 1996) Từ những nguồn khác nhau dẫn đến PME có những đặc trưng khác nhauvề phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa

Hình 4: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl

Nguồn: Duvetter, 2007

2.2.3 Các nguồn PME khác nhau trong tự nhiên và đặc tính của từng loại

PME có thể được thu nhận từ hai nguồn chủ yếu là thực vật và vi sinh vật

i PME từ thực vật

PME hiện diện trong hầu hết cây ăn trái với hàm lượng khác nhau Chúng thường nằm trong vách tế bào và gia tăng khi trái bắt đầu chín Các loại trái chứa PME

được nhắc đến nhiều nhất là cà chua, cam, chuối, kiwi, táo,… PME nội bào của

thực vật được tin là có liên quan đến sự thoái hóa của pectin trong suốt quá trình phát triển của cây (Bordenave, 1996) Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều khiển sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín

Khối lượng phân tử của PME thực vật nằm trong khoảng 21 ÷ 57 kDa (Ly Nguyen, 2004) Hầu hết chúng hoạt động trong khoảng pH hơi kiềm 6,0 ÷ 8,0 và

pI gần bằng 9,0 Trong khi đó, nhiệt độ tối ưu là trong khoảng 55 ÷ 60oC (Ly Nguyen, 2004) PME cà chua có pH tối ưu 7,6 và bị bất hoạt 50% sau khi đun 5 phút ở 67oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Tuy nhiên, hai loại PME từ jelly sung lại

là những enzyme có pI trong khoảng acid 3,5 ÷ 4,4 (Lin et al., 1989) Các cation

kim loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của

Bắt đầu ở nhóm carboxyl tự do

PME nấm mốc: pH tối ưu 4,5; khử nhóm ester theo phương thức tự do

PME thực vật: pH tối ưu > 7; khử ester hóa theo từng block

enzyme như ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng

độ lần lượt là 0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996) Ngoài ra, hoạt tính có thể được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt được cường độ hoạt động tối ưu ở áp

suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa và nhiệt độ từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al.,

Markovic, 1976; Markovic & Kohn, 1984; Willats et al., 2001) Do hoạt động cần

có nhóm carboxyl tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực vật ít hoạt động trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có độ ester hóa từ 20 ÷ 30%

(Evans &MacHale, 1978; Seymour et al., 1991)

Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của một số PME tinh khiết từ thực vật

Nguồn ly

trích PME

Khối lượng phân tử (kDa)

pI Nguồn tài liệu

Cà chua 23,8

24,2

9,30 8,90

Pressey& Woods, 1992

Cherry 27,2

55,9 55,9 55,9

> 8,66 7,05 6,36 5,24

PME thực vật thường tồn tại các dạng đồng phân, và các dạng đồng phân của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI hoặc khối lượng phân tử (Bondenave, 1996) Mối quan hệ tỷ lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy theo mức độ tăng trưởng của trái và các nguồn PME khác nhau (Bondenave & Goldberg, 1994)

Ví dụ như cà chua có hai loại đồng phân là PME1 và PME2 Trong giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hoặc như hai dạng đồng phân của PME trong cam, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI >11 Các đồng phân trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng

pI nhưng lại khác nhau về tính bền nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

ii PME từ vi sinh vật

Bên cạnh PME từ thực vật, nguồn giàu PME và được sử dụng nhiều nhất trong các chế phẩm pectinase thương mại là PME từ vi sinh vật PME từ vi sinh vật có khối lượng phân tử từ 27,8 ÷ 40 kDa Các PME của nấm mốc khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa dạng, các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly

Nguyen, 2004) PME từ nấm mốc (Aspergillus spp.) có thể phân cắt cơ chất một cách ngẫu nhiên (Ishi et al., 1979; Kohn et al., 1982; Limberg et al., 2000), ngoại trừ PME từ nấm mốc Trichoderma reesei khử ester hóa theo từng block (Markovic

&Kohn, 1984), và phản ứng khử nhóm ester của PME từ nấm Erwinia chrysanthemi cũng tương tự như ở PME từ thực vật (Cheristensen et al., 2001)

Tuy nhiên, các PME có nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiệt kém hơn so với các PME có nguồn gốc từ thực vật Các loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp PME gồm:

Nấm men: Saccharomyces fragilis

Nấm mốc: Aspergillus spp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma spp., Neurospora crassa…

Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes (Joshi el al., 2006)

• PME từ nấm mốc

PME thường được thu nhận từ các loại nấm sợi PME từ nấm mốc là các loại enzyme ngoại bào Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu 30 ÷ 45°C

và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55°C Giá trị pH tối ưu của nấm mốc trong

khoảng 3 ÷ 5,5 PME từ các loài Aspergillus là điển hình cho các PME có

điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid Hoạt động của PME từ A.niger

đạt tối đa ở pH 4,5 và nhiệt độ 40°C Trong khi pH tối ưu của PME từ

A.species là 3,7 ÷ 4,2 và PME từ A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

• PME từ vi khuẩn

Cùng có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng PME từ vi khuẩn không có tính acid

mà lại có tính hơi kiềm pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7 ÷ 8 và hầu hết bị vô hoạt ở 85°C (Nguyễn Đức Lượng, 2004) PME từ vi khuẩn Erwinia chrysanthemi có pI là 9,64 (Laratta et al., 1995)

2.2.4 Ứng dụng của PME

Hệ enzyme pectinase nói chung và PME nói riêng có nhiều ứng dụng trong công

nghiệp chế biến thực phẩm (Pilling et al.,2000) Chúng thường được áp dụng để

phân cắt thành tế bào, thủy phân pectin tạo điều kiện thu được nhiều dịch bào trong chế biến nước quả ép Quá trình này thường được kết hợp với việc sử dụng enzyme cellulase để sự phân cắt được tốt hơn

Pectinesterase có tác dụng hữu hiệu trong việc làm trong dịch quả trước khi lên men sản xuất rượu vang, chế biến các loại nước quả trong Sử dụng pectinesterase

sẽ cho hiệu quả làm trong cao, thay thế cho các phương pháp hóa-lý (lắng lọc tự nhiên) kém hiệu quả, dễ nhiễm khuẩn và thời gian dài Pectinase còn được ứng dụng trong việc tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm rượu do hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc trong nguyên liệu (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ứng dụng quan trọng nhất của PME trong công nghiệp chế biến thực phẩm là khả

năng cải thiện cấu trúc của rau quả đóng hộp ( Baker &Wicker, 1996) Khi được kích hoạt, PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+, tạo độ giòn và độ cứng chắc cho sản phẩm

Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào Do đó, nhiều phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật nguyên vẹn (Baker &Wicker, 1996) và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm – thấm thụ động Tuy nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô chỉ giới hạn ở bề mặt Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia

2.3 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus

2.3.1 Aspergillus

Nấm mốc Aspergillus được tìm ra vào năm 1729 bởi Micheli Giống Aspergillus

đã được tìm ra trên 180 loài và có vai trò quan trọng trong ngành nấm sợi

Ascomycetes Một trong các loài được sử dụng nhiều nhất là Aspergilllus niger, Aspergilllus oryzae, đã được FDA công nhận là an toàn Aspergillus thuộc nhóm

nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), cuống đính bào tử có đầu phình ra Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu

ngọn có cuống bào tử Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Sợi nấm có vách

ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng

Hình 5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình

Sharma, 1998

2.3.2 Aspergillus niger

Aspergillus niger là loại nấm bất toàn (Deuteromycetes) thuộc bộ Moniliales, họ Moniliaceae, giống Aspergillus Nấm mốc Aspergillus niger (A.niger) được biết đến như loại nấm mốc màu đen (Abarca et al., 2004), là thành viên của

Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) thuộc nhóm sinh sản vô tính Nhóm này gồm trên dưới 10 loài Chúng có màu đen khi quan sát bằng mắt thường do tạo bào tử

đính màu đen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng

đại thấp A.niger có 2 bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu hơi đen và

có gai Bọng và sợi cuống thường có màu nâu bóng

Hình 6: Aspergillus niger

http://www.google.com.vn/imglanding?q=aspergillus+niger&hl=vi&biw=1280&bih=608&gbv=2&tbs=is ch:1&tbnid=LClJxeJjFoKQDM:&imgrefurl

2.4 Thu nhận enzyme PME từ nấm mốc Aspergillus niger

Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống Việc thu nhận enzyme bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn rất khó khăn và tốn kém nên enzyme thường được thu nhận từ các nguồn sinh học (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu

được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng Việc phân bố của

enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài Chính vì thế, việc chọn lựa nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme

cần được quan tâm (Torres et al., 2005)

Enzyme pectin methylesterase có thể được thu nhận từ hai nguồn là thực vật và vi sinh vật Trong hầu hết các loại cây ăn trái, đều có sự hiện diện của PME với hàm lượng khác nhau Việc ly trích PME thực vật cũng được tiến hành trên nhiều loại

quả như cà chua (Pressey &Woods, 1992; Giovane et al., 1994), cà rốt (Alonso et al., 2003) hay bơ (Awad &Young, 1980) Mặc dù vậy, việc thu nhận PME từ thực

vật vẫn gặp nhiều hạn chế, rất khó sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm như:

• Chu kỳ sinh trưởng của thực vật khá dài,

• Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được,

• Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm, không có tính kinh tế khi sử dụng làm nguồn ly trích enzyme thương mại

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme là giải pháp khả thi do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật rất ngắn (16 ÷ 100 giờ), tốc độ sinh sản nhanh Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được Nhiều vi sinh vật sinh enzyme thường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, dễ tìm như các phế liệu của các ngành sản xuất Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ để nuôi vi sinh vật Chính vì thế, sử dụng vi sinh vật làm nguồn thu nhận enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao

(Nguyễn Đức Lượng, 2004; Favelar – Torres et al., 2006).

Mặc dù có nhiều giống nấm mốc và vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme PME,

tuy nhiên Aspergillus spp là nguồn chủ yếu ( Patil &Dayanand, 2006; Arotupin et al., 2008 ; Joshi et al., 2006) Đặc biệt, A.niger có thể sản xuất ra nhiều loại

enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử pectin, gồm pectin methylesterase,pectin acetylesterase ,endopolygalacturonase và exopolygalacturonase, Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và

pectate lyase Như đã đề cập, A.niger là loài nấm mốc phát triển dễ dàng trên cơ chất rẻ tiền, đồng thời việc thu nhận enzyme PME từ A.niger cho hoạt tính khá cao (Deraeve et al., 2003) Ngoài ra, A.niger còn được Viện nghiên cứu thực phẩm và

thuốc của Mỹ (FDA) đã chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS) Chính vì thế quá

trình sinh tổng hợp enzyme PME từ nguồn nấm mốc Aspergillus niger được ưu

tiên chọn lựa

Hiệu quả của quá trình lên men sinh PME còn phụ thuộc vào rất nhiều thông số khác như thành phần cơ chất, các vi chất dinh dưỡng và điều kiện lên men Khi đã tuyển chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính PME cao thì thành phần cơ chất và

điều kiện lên men là những nhân tố thiết yếu, có ảnh hưởng sâu sắc đến hiệu quả

của quá trình nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme mong muốn (Rao, 2005)

2.5 Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger

2.5.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME

Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật, trong đó thành phần pectin giữ vai trò rất quan

trọng (Patil, 2006) Các phụ phẩm nông nghiệp như cám mì (Taragano et al., 1997), bã mía, bã củ cải đường (Solis-Pereira et al., 1993), xác đậu cô ve (Boccas

et al., 1994), vỏ chanh (Larios et al., 1989), vỏ cam, vỏ bưởi (Hamdy, 2005) và bã táo (Hours et al., 1988; Joshi et al., 2006) có hàm lượng pectin cao (15 ÷ 25%)

được biết đến như nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase cũng như

PME nguồn gốc vi sinh vật

Ngoài ra, độ methoxyl hóa cao (65 – 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông

nghiệp chính là điều kiện thuận lợi cho hoạt động của PME (Jayani et al., 2005)

Một ưu điểm khác của việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất cho quá trình nuôi cấy sinh enzyme PME là sự hiện diện trong nguyên liệu của một số

thành phần nitơ, chất xơ và khoáng cần thiết cho quá trình lên men (Martin et al., 2004; Favelar – Torres et al., 2006)

Đối với từng loại enzyme chuyên biệt, tỷ lệ tối ưu cho hoạt động cảm ứng của cơ

chất thay đổi khác nhau Tỷ lệ pectin dao động trong khoảng 2% thường được lựa

chọn cho quá trình lên men sinh enzyme pectin esterase (Grebechova et al., 2007)

Tuy nhiên, việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có hiệu quả rất tích cực trong việc

đẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonad

& Callieri, 2005) Ở cùng một tỷ lệ pectin sử dụng, nguồn gốc nguyên liệu khác

nhau cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính PME thu nhận được (Grebechova et al.,

2007) Chính vì thế, việc khảo sát tỷ lệ pectin thích hợp cho quá trình lên men sinh enzyme cần phải được tiến hành cho từng cơ chất chuyên biệt và điều kiện nuôi cấy cụ thể

2.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME

Bên cạnh ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện môi trường như độ ẩm, pH, nhiệt độ… Tùy thuộc vào đặc điểm của chủng vi sinh vật nuôi cấy, phương thức lên men và tính chất enzyme mà điều kiện tối thích cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme có thay đổi khác nhau Việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave & Goldberg, 1993)

i Độ ẩm

Độ ẩm cao của môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí, khi đó độ ẩm thấp quá sẽ

kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme Bên cạnh đó, độ ẩm của môi trường còn liên quan đến sự kết dính, từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng tạo enzyme

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 ÷ 60% và phải giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi Độ ẩm vượt quá 70% làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50 ÷ 55% thì kiềm hãm sự sinh

trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme (Ashok et al., 2000)

Ảnh hưởng của không khí: A.niger là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển

bình thường khi đầy đủ oxy Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp, rải thành lớp dày không quá 2,5 ÷ 3 cm, phòng nuôi phải thoáng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

ii Nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật và tổng hợp enzyme Nếu không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt lực của các

enzyme Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30°C Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của nấm mốc, đến một mức tới hạn nào đó sẽ ức chế hoàn toàn sự phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;

Joshi et al., 2006)

Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng như hoạt tính của enzyme Thời gian nuôi cấy để thu được lượng enzyme lớn thường

được xác định bằng thực nghiệm Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì

thường làm giảm hoạt tính enzyme Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo

enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức

Lượng et al., 2004) Nấm mốc Aspergillus niger thường được nuôi cấy trong thời gian 48 đến 96 giờ cho quá trình sinh tổng hợp PME (Schmitz, 2002; Joshi et al.,

2006)

iii Nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Cation Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme MgSO4

sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi Lưu huỳnh kích thích tạo enzyme (Lưu huỳnh có trong thành phần các acid amin quan trọng như methionine, cystein) Ngoài ra, calcium, mangan, corban, … cũng ảnh hưởng đến

sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Theo nhiều tác giả, các ion K+, Na+, Ca2+ có ảnh hưởng tới hiệu quả tác dụng của PME Kretovits và Iarovenko (1982) thừa nhận rằng muối Ca2+ và Mg2+ nâng cao hoạt độ của enzyme, còn các ion Ca2+, Mg2+ và Cu2+ là nhân tố ức chế hoạt động của enzyme PME Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl2, H2O2 không có tác dụng tới hoạt

độ PME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO3 với nồng độ thấp có khả năng

nâng cao hoạt độ của enzyme này Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đưa ra kết luận EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của

Aspergillus repens, làm giảm hoạt tính PME

Ngoài các yếu tố ảnh hưởng như trên, khả năng sinh PME còn chịu ảnh hưởng của các nhân tố khác như: pH, điều kiện thoáng khí, acid amin Hiểu rõ đặc tính sinh

PME của Aspergillus niger sẽ giúp cho khả năng thu enzyme đạt được hiệu quả

cao nhất (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.6 Giới thiệu sơ lược về táo bưởi, nguồn cơ chất giàu pectin

2.6.1 Táo ta

Táo là một trong các loại cây ăn trái phổ biến nhất được tiêu thụ rộng rãi ở hầu hết

quốc gia, hiện có hơn 7500 loại táo được biết đến (Denes et al., 2000) Bên cạnh

một số giống táo được nhập khẩu và tiêu thụ ở Việt Nam, hai giống táo ta (họ

Rhamnaceae) phổ biến ở Việt Nam là Ziziphus mauritiana và Ziziphus nummularia cũng được biết đến, tuy nhiên, phổ biến nhất là giống Ziziphus mauritiana Táo ta là loại cây ăn quả vùng nhiệt đới Quả là loại quả hạch, khi chín

nó mềm, chứa nhiều nước, có vị ngọt Quả có dạng hình trứng xuôi, hình trứng ngược, tròn hay thuôn dài, lớp vỏ trơn, bóng hay sần sùi, mỏng nhưng cứng, chuyển từ lục nhạt sang vàng, nếu để chín kỹ sẽ trở thành một trong các màu như cam cháy, nâu đỏ, đỏ một phần hay toàn bộ Quả chứa một hột cứng hình ôvan hay thuôn dài, cứng Hột chứa 2 hạt hình elip, màu nâu, dài 6 mm (0,25 inch)

Hình 7: Táo ta

http://www.tropicalfruitandveg.co.uk/images/boratree.jpg

Táo là nguyên liệu quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm Khoảng 30% sản lượng táo được sử dụng cho chế biến các sản phẩm khác nhau như nước ép táo,

táo cô đặc, rượu vang táo,…(Joshi et al., 2005).Táo là loại trái cây ăn tươi rất ngon

và tốt cho sức khoẻ

Ngoài ra, đây còn là loại quả được xếp hàng đầu trong việc cung cấp pectin, chính

vì thế táo ta được biết đến như nguồn sản xuất pectin, cơ chất cho lên men và thu nhận nhiều loại enzyme từ bã táo và nguồn phân lập, tuyển chọn nấm mốc có khả

năng sinh pectinase nói chung (Martin et al., 2004; Joshi et al., 2005)

được phân bố ở vùng đồng bằng sông Cửu Long với diện tích lớn

Hình 8: Bưởi da xanh

http://www.gocbep.net/imgupload/im12223598701

Ngoài phần thịt quả có giá trị kinh tế, vỏ quả bưởi còn lại chiếm 35% được biết

đến như là nguyên liệu chứa hàm lượng pectin cao Hàm lượng pectin hòa tan

trong nước, có độ methoxyl hóa cao (69,32 ÷ 78,68%) chiếm đến 8,12 ÷10,87%, trong khi pectin hòa tan trong oxalate (có độ methoxyl hóa thấp, từ 21,01 đến

55,41%) chiếm khoảng 4,89 ÷ 8,62% (Chaidedgumjorn et al., 2009) Nghiên cứu trước đó của Phuangsinou et al (2008) cho thấy, một giống bưởi lai tạo tại địa

phương (Thái Lan) có thể có độ ester hóa (DE) rất cao (91,4%) Thêm vào đó, bề mặt vỏ quả bưởi còn là môi trường thích hợp cho sự phát triển của một số loài nấm

mốc, trong đó có Aspergillus niger – đây cũng là nấm mốc được tuyển chọn cho

khả năng sinh pectinase hoạt tính cao (Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn Thùy Châu, 2005) Chính vì vậy, phần vỏ quả là một trong nhũng nguyên liệu dồi dào cho việc phát triển khả năng ứng dụng thành phần này vào quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme nói chung và PME nói riêng

2.7 Các nghiên cứu có liên quan

Việc xác định đặc tính, ly trích và tinh sạch enzyme PME từ thực vật và nấm mốc

đã được thực hiện và áp dụng vào thực tế ở nhiều nơi trên thế giới

PME của nhiều loại rau quả khác nhau cũng được trích ly để nghiên cứu các dạng tồn tại và đặc điểm của chúng như nghiên cứu PME trên quả đào (Javeri &Wicker

1991); đu đủ (Fayyaz et al.,1995), cà chua (Giovane et al, 1994); cam (Van den Broeck et al., 2000); chanh (Macdonald et al.,1993); táo (Denès et al., 2000); dâu tây, chuối (Ly-Nguyen, 2004); cà rốt (Alonso et al., 2003; Ly-Nguyen et al., 2004); cherry ngọt (sweet cherry) (Alonso et al., 1996); quả hồng vàng (persimmon) (Alonso et al., 1997b) hay bưởi (Cameron & Grohmann, 1995)… PME đã được phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991),

với từng yếu tố môi trường tác động riêng rẻ đã được khảo sát, có quan tâm đến

việc sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau (Joshi et al., 2006, Schmitz, 2002) Wastes (1998) đã nghiên cứu sản xuất PME bởi Aspergillus foetidus trên cơ chất

bã táo trong môi trường rắn Nghiên cứu sản xuất PME từ Curvularia inaequalis trên cơ chất vỏ cam trong môi trường rắn cũng đã được Afifi et al., (2002) nghiên

cứu Nhìn chung, đặc điểm thành phần cơ chất giàu pectin và điều kiện môi trường

là yếu tố chi phối mạnh đến hiệu quả lên men sinh PME từ vi sinh vật Với thành phần pectin trong hạt hướng dương là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hướng dương trong sản xuất PME từ

Aspergillus niger cho cả hai trường hợp lên men rắn và lên men chìm Joshi et al., (2006) sử dụng bã táo (apple pomace) như nguồn cơ chất cho sự phát triển của A niger sinh PME đồng thời các nghiên cứu của ông về việc sản xuất pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo cho thấy, nhiệt độ ủ

25oC, điều kiện pH phản ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ưu cho việc lên men sinh PME ở môi trường rắn (SSF)

Gần đây, ảnh hưởng của loại môi trường lên men khác nhau đến hiệu quả sinh PME từ nấm mốc cũng được thực hiện bởi Trần Thanh Trúc và cộng sự (2009) Ba loại môi trường gồm có: hỗn hợp các chất hữu cơ (bột cám, bột mì, gạo lức), bã táo

và vỏ cam được tác giả sử dụng trong nghiên cứu của mình Kết quả cho thấy, hoạt

tính PME cao nhất khi A.niger được nuôi cấy trên cơ chất bã táo và cao gấp 5,1 lần

so với hai loại môi trường còn lại Díaz (2004) cũng có nghiên cứu sản xuất các

loại enzyme thủy phân từ A.awamori sử dụng cơ chất lên men là hỗn hợp tỉ lệ 1:1

(w/v) của bã nho và vỏ cam

Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát và điều kiện thực tế, việc

đánh giá ảnh hưởng của điều kiện lên men ( thông qua hàm lượng pectin, DE,

đường hòa tan, khoáng dinh dưỡng, ẩm, loại dung dịch đệm, pH, thời gian ủ) của

quá trình nuôi cấy đến hiệu quả sinh enzyme pectin methylesterase từ Aspergillus niger bằng cách sử dụng hai phụ phẩm nông nghiệp (bã táo và vỏ bưởi) được tiến

hành

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp

và Sinh học ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ; Phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học - Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: Từ ngày 09/08/2010 đến 02/12/2010

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị

Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức)

Máy đo độ Brix (ATALA, Nhật bản)

Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc)

Thuốc thử methylen xanh, phenolphtalein (Merck )

NaCl (Merck)

NaH2PO4.2H20 (Merck)

Acid citric (Merck)

Pectin táo DE = 75% (Sigma)

Môi trường PDA (Merck)Một số hóa chất cần thiết khác sử dụng trong phân tích

3.1.4 Đối tượng nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus niger đã được phân lập và tuyển chọn phù hợp cho quá trình

nuôi cấy sinh pectin methylesterase

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bã táo (Ziziphus nummularia): Táo sau khi ép lấy nước, phần bã còn lại được cho

vào tủ sấy ở nhiệt độ 70ºC Tiến hành sấy mẫu trong khoảng 12 giờ đến độ ẩm 4,0

± 0,5% Bã táo khô được nghiền thành bột và đóng trong các bao PE nhỏ hay để

trong keo thủy tinh cách ẩm (Joshi et al., 2006)

Vỏ bưởi (Citrus maxima): vỏ bưởi tươi (phần vỏ xanh bên ngoài), rửa sạch, cắt

nhỏ, sư dụng ngay (điều chỉnh độ ẩm của vỏ bưởi cho tất cả các nghiệm thức khảo sát là 75%)

Chủng vi sinh vật: Nấm mốc A.niger So2 được chọn lựa ra từ nhiều chủng khác

nhau, đã phân lập và được nuôi cấy trên môi trường rắn, chọn chủng sinh PME có

hoạt tính cao nhất Cho 5 mL dung dịch NaCl 0,025M vào ống nghiệm A.niger đã

được nuôi cấy sau 4 ngày để thu nhận dung dịch có chứa bào tử nấm A.niger Đo

độ truyền quang %T của Aspergillus niger ở bước sóng 530 nm để xác định mật số

trước khi pha loãng với nước cất đến mức độ mong muốn (105 bào tử/mL) Lấy 2

mL huyền phù nấm mốc cho vào các bình tam giác có sẵn cơ chất

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích, đo đạc theo phương pháp được tổng hợp ở bảng 3

Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ pH (theo Crelier et al, 1995; trích

dẫn bởi Duvetter, 2007), sử dụng pectin táo (DE 75%) trong NaCl 0,12M làm cơ chất phản ứng, NaOH 0,01N làm dung dịch chuẩn độ

Hàm lượng protein tổng

(mg/mL)

Phương pháp Bradford (1976), sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn, với chỉ thị màu Coomassie Brillant Blue và đo ở bước sóng 595 nm

Hiệu suất thu hồi PME, Y%

100 (%)

TA 0 : Tổng hoạt tính PME có trong mẫu thô (U)

TA 1 : Tổng hoạt tính PME có trong mẫu sau khi hòa tan kết tủa (U)

Hoạt tính riêng S (U/mg)

protein

A S

C

=

A: Hoạt tính PME (U/mL) Cprotein: Nồng độ protein trong mẫu tương ứng (mg/mL)

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Phân tích phương sai (ANOVA) theo kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Statgraphic 4.0

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.3.1 Phân tích thành phần hóa học của cơ chất lên men

Mục đích : Xác định các thành phần hóa học của bã táo và vỏ bưởi, làm cơ sở cho

việc tính toán tỷ lệ phối trộn và điều chỉnh độ ẩm môi trường thích hợp

Các chỉ tiêu cần khảo sát: Độ ẩm, đường hòa tan, hàm lượng pectin và xác định mức độ ester hóa của pectin (độ DE), protein

Số lần phân tích cho một chỉ tiêu: 3 ÷ 5 lần.

3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giữa bã táo và vỏ bưởi

Mục đích: Xác định được tỷ lệ phối trộn thành phần cơ chất với giá trị dinh dưỡng

thích hợp (độ ẩm, hàm lượng pectin, DE, lượng đường hòa tan) cho quá trình sinh

tổng hợp PME từ Aspergillus niger đạt hiệu quả cao

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại

Nhân tố A: Tỷ lệ của bã táo: vỏ bưởi sử dụng

A 1: 10 : 1 A 5: 5 : 5

A2 : 8 : 2 A6: 4 : 6

A3 : 7 : 3 A7 : 1 : 10

A 4: 6 : 4

Nhân tố cố định: Độ ẩm môi trường (60%)

Số nghiệm thức thí nghiệm : 7 x 1= 6 nghiệm thức

Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 = 18 mẫu

ẩm môi trường đến 60% đồng thời bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy bằng

cách hoà tan vào nước cất trên Khoáng bổ sung bao gồm: CaCl ; ure; MgCl với