Nghiên cứu khả năng tinh sạch sơ bộ và bảo quản lạnh đông enzyme cellulase từ trichoderma sp

Ở nhiệt độ này, sau 4 tuần bảo quản, hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng muối NH 4 2 SO 4 có sự giảm hoạt tính nhẹ so với hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng ethanol hoạt tính riê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUỲNH NGỌC DUY MSSV: 2071800

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE

TỪ TRICHODERMA SP

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Ths Nguyễn Thị Thu Thủy Huỳnh Ngọc Duy

MSSV: 2071800

Lớp: CNTP 33

Cần Thơ, 2011

LỜI CẢM TẠ

Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp là cơ hội giúp cho sinh viên vận dụng những kiến thức đã học để thực hiện nghiên cứu khoa học cho riêng mình Đây

đồng thời cũng là thách thức lớn cho sinh viên để rèn luyện kĩ năng làm việc một

cách độc lập và khoa học Sau hơn ba tháng thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp, mặc dù gặp không ít những khó khăn, ngoài sự cố gắng của bản thân thì sự giúp đỡ

và động viên kịp thời của thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp em hoàn thành quá trình nghiên cứu và đạt được những kết quả mong muốn Em xin chân thành gởi lời cảm ơn của mình đến:

Cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức chuyên môn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong thời gian em học ở trường

Con xin cảm ơn ba, mẹ đã tạo mọi điều kiện để con có thể học tập và nghiên cứu và luôn động viên con trong những lúc con khó khăn

Tôi cũng xin cảm ơn các bạn và các chị ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cần Thơ, ngày 1 tháng 5 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Ngọc Duy

TÓM TẮT

Các chể phẩm enzyme thô thu được thường còn lẫn rất nhiều tạp chất nên hiệu quả sử dụng không cao Vì thế đề tài tiến hành nhằm tinh sạch sơ bộ một phần chế phẩm enzymen cellulase thô từ Trichoderma sp nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho việc sử dụng ở các bước tiếp theo Ngoài ra, đề tài còn khảo sát khả năng bảo quản lạnh đông chế phẩm enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ

Kết quả thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme celulase thô từ Trichoderma sp bằng ethanol với tỷ lệ giữa ethanol và dịch chiết enzyme thô là 3:1 (w/v) là tốt nhất, thể hiện ở hoạt tính riêng là 0,110 U/mg protein ,hiệu suất thu hồi đạt 46,414% và độ tinh sạch tăng gấp 4,593 lần

so với mẫu enzyme thô Sau khi tinh sạch sơ bộ, enzyme được bảo quản lạnh đông ở nhiệt

độ -20 o C Ở nhiệt độ này, sau 4 tuần bảo quản, hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 có sự giảm hoạt tính nhẹ so với hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng ethanol (hoạt tính riêng giảm từ 0,065 U/mg protein xuống còn 0,046 U/mg protein , giảm khoảng 1,4 lần), còn phần enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol thì hoạt tính riêng thay đổi không đáng kể sau 4 tuần (hoạt tính riêng giảm từ 0,070 U/mg protein xuống còn 0,055 U/mg protein , giảm khoảng 1,27 lần).

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về enzyme cellulase 2

2.1.1 Phân loại enzyme cellulase 2

2.1.2 Một số đặc tính của cellulase từ vi khuẩn 2

2.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 3

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme 4

2.1.5 Trung tâm hoạt động của enzyme 10

2.1.6 Ứng dụng của enzyme cellulase 10

2.2 Sản xuất enzyme cellulase từ vi sinh vật 11

2.3 Tinh chế enzyme cellulase 13

2.3.1 Kết tủa bằng muối ammonium sulfate 13

2.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ 14

2.4 Ly tâm 14

2.5 Một số nghiên cứu có liên quan 14

2.5.1 Nước ngoài 14

2.5.2 Trong nước 15

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện 16

3.1.1 Thời gian và địa điểm 16

3.1.2 Nguyên liệu 16

3.1.3 Thiết bị và hóa chất 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 17

3.3.1 Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 17

3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát sự biến đổi hoạt tính và hàm lượng protein theo thời

gian bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông 18

3.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19

4.1 Ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 19

4.1.1 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp bằng ammonium sulfate 19

4.1.2 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp bằng ethanol 21

4.3 So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase thô theo hai phương pháp kết tủa protein khác nhau 22

4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến sự ổn định của enzyme cellulase sau các bước tinh sạch sơ bộ 23

4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản 23

4.4.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản 23

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25

5.1 Kết luận 25

5.2 Đề nghị 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

PHỤ LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase 12 Bảng 2: Hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO420 Bảng 3: Hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa với ethanol 21 Bảng 4: Kết quả so sánh hai phương pháp kết tủa khác nhau 22 Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản 23 Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản 24

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose 4

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng 5

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng enzyme 5

Hình 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme 6

Hình 5 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng của enzyme 7

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, công nghệ enzyme đang phát triển rất nhanh và được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau Bởi đây là chất xúc tác đặc hiệu, có tính ưu việt hơn các chất xúc tác khác Ngành công nghiệp enzyme hiện nay không những khai thác enzyme từ động vật, thực vật mà còn tiến thêm một bước xa hơn là khai thác chúng từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Bên cạnh đó, vi sinh vật là sinh vật duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzyme quy mô công nghiệp, vì vi sinh vật có tốc độ sinh sản rất nhanh, cho enzyme có hoạt tính cao, nguồn nguyên liệu ban đầu rẻ tiền và dễ tìm Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai trên quy mô công nghiệp vì những hạn chế về sinh lí, kĩ thuật, giá thành… Trong các ngành công nghiệp hiện nay, các enzyme được sử dụng nhiều như: amylase, pectinase, protease, cellulase, polyphenoloxydase,…Trong đó, enzyme cellulase được sử dụng rộng rãi trong: công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất giấy, xử lí môi trường,… Enzyme này được sản xuất từ nhiều nguồn

vi sinh vật khác nhau như: nấm mốc (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,

Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Penicillium spp,…), vi khuẩn (Acetobacter, Bacillus,…), xạ khuẩn (Actinomyces spp, Thermomonospora,…) (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Hữu Phúc, 1996) Và đây

cũng là enzyme được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với các enzyme amylase và protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Các ngành công nghiệp nước ta đang phát triển nhanh nên nhu cầu sử dụng enzyme rất cao Nhưng công nghệ sản xuất trong nước chưa đáp ứng được nhu cầu đó nên chúng ta phải nhập nguồn enzyme từ nước ngoài với giá thành cao gây không ít khó khăn cho việc sử dụng rộng rãi

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme

cellulase được tổng hợp từ Trichoderma sp bằng muối ammonium sulfate và cồn

nhằm loại bỏ những tạp chất có lẫn chế phẩm enzyme thô để tăng hoạt tính, hiệu

quả sử dụng và tính kinh tế

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu đề tài nghiên cứu những vấn đề sau:

- Khảo sát nồng độ muối ammonium sulfate bão hòa và tỉ lệ ethanol thích hợp cho việc tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase với hoạt tính cao nhất

- Xác định sự thay đổi hoạt tính, hàm lượng protein của enzyme cellulase trong điều kiện bảo quản lạnh đông theo thời gian

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về enzyme cellulase

2.1.1 Phân loại enzyme cellulase

Enzyme cellulase tham gia phản ứng phân hủy cellulose Phức hệ enzyme này được các nhà khoa học phân ra thành ba nhóm chủ yếu sau:

- Endoglucanase (EG), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là:

Endo-1,4-β-D-glucan-4 glucanohyrolase, EC 3.2.14 Enzyme này tham gia phân giải liên kết

β-1,4 glucoside trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của qua trình phân giải này là: cellodextrin, cellobiose, glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh Enzyme này còn có một số tên khác như: endocelulase, endo 1,4-β-glucanase, CMC-ase và Cx-cellulase

- Cellobiohydrolase (CBH), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme

là:1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91 Enzyme này phân cắt liên kết βglucoside ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc cellodextrin để giải phóng cellobiose Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose dạng kết tinh

-1,4-mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lí của chúng, giúp cho endocellulase bị phân hủy Enzyme này còn có một số tên khác như: exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase

- β-glucosidase (BGL), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là:βglucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21 Enzyme này tham gia phản ứng phân hủy cellobiose và các cellodextrin phân tử thấp tạo thành glucose, chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Nó còn có tên là cellobiase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

-D-2.1.2 Một số đặc tính của cellulase từ vi khuẩn

(i) Endoglucanase (EG):

EG được tổng hợp bởi Trichoderma reesei Các nhà khoa học chia chúng thành hai

loại EG 1 và EG 2

- EG 1 chứa 459 amino acid, có trọng lượng phân tử 48,212 kD

- EG 2 chứa 418 amino acid, có trọng lượng phân tử là 42,2 kD

Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao Ngoài ra endoglucanase còn

được tìm thấy ở Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật

khác Các endoglucanase thường có tính chất không khác biệt nhiều (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

(ii) Cellobiohydrolase (CBH):

CBH được tổng hợp bởi Trichoderma reesei, gồm hai loại: CBH 1 và CBH 2

- CBH 1 chiếm đến 60% khối lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma

reesei Chúng có trọng lượng phân tử khoảng 65 kD, gồm khoảng 496 amino acid,

điểm đẳng điện pI 4,4 Enzyme này tác động lên cả cellulose định hình và cellulose

kết tinh Nhưng chúng lại không tác động lên các dẫn xuất của cellulose như: carboxy methyl cellulose (CMC) hay hydroxy ethyl cellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β-glucan

- CBH 2 có trọng lượng phân tử khoảng 53 kD với khoảng 471 amino acid, pI 5,0 Chúng không tác động lên CMC, nhưng chúng có khả năng tác động lên cellulose

vô định hình và kết tinh

Cellobiohydrolase của Cellulomonas fimi gồm 443 amino acid Enzyme này có ba

cầu nối disulfite Hai cầu nối disulfite nằm trong trung tâm hoạt động, còn cầu nối còn lại nằm ngoài trung tâm hoạt động

Cellobiohydrolase của Clostridium thermocellum có trọng lượng phân tử từ 68 - 75

kD (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

(iii) β-glucosidase (BGL)

BGL là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8), trọng lượng phân tử từ 50 – 98 kD, pI 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

BGL của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với trọng lượng phân tử là

75,34 kD Trong dịch chiết, chúng chiếm khoảng 1% so với tổng lượng protein thu

được

BGL của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại: BGL A và BGL B Loại

A gồm khoảng 448 amino acid với trọng phân tử lượng khoảng 51,482 kD Chúng hoạt động mạnh ở pH từ 6,0 – 6,5 ở nhiệt độ 60oC, chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Trong tự nhiên, khi thủy phân cellulose phải cần sự có mặt của ba loại ezyme: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-glucosidase Các loại enzyme này thay nhau phân hủy cellulose và sản phẩm tạo thành là glucose

Trước tiên, endoglucanase sẽ tác động mạnh đến vùng cellulose vô định hình, cắt bất kì cho ra những đoạn cello-oligomers Sau đó, cellobiohydrolase sẽ tác động vào phần kết tinh và phân hủy cho ra các cellobiose Cuối cùng, β-glucosidase sẽ thủy phân cellobiose cho ra glucose (một cellobiose bị thủy phân cho ra hai glucose)

Cơ chế tác dụng của phức hệ enzyme cellulase lên mạch cellulase được minh họa qua hình ảnh dưới đây:

Hình 1 Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose

(Nguồn từ http://www.scribd.com/doc/19835831/Enzyme-Hoc)

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme

(i) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Khi có đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc tuyến tính vào nồng

độ enzyme Biểu thức biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ

enzyme:

V= k[E]

Trong đó:

• V: Vận tốc phản ứng

• k: Hằng số tốc độ phản ứng

• [E]: Nồng độ enzyme

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng

Nồng độ enzyme càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh, nhưng nếu nồng độ này quá cao thì tốc độ phản ứng chậm lại

(ii) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi có enzyme, phản ứng trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng tuyến tính với nồng độ cơ chất

(iii) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme Vận tốc phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì tốc độ phản

ứng của enzyme sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu Do bản chất của enzyme là protein

nên nó kém bền khi nhiệt độ tăng cao

Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC Tại khoảng mà enzyme có thể tồn tại, vận tốc phản ứng có thể tăng 1,4 – 2 lần khi nhiệt độ tăng 10oC

Hình 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme

Hệ số nhiệt Q10 được sử dụng để biểu thị sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme Phần lớn enzyme hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40 – 50oC Mỗi loại enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau và phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng Một số enzyme có nhiệt độ tối thích ở 60oC, số khác lại là 70oC Enzyme cellulase

có nguồn gốc từ nấm mốc có nhiệt độ tối thích từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ

55 – 62oC

Khi nhiệt độ cao hơn mức tối ưu thì hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm khi đó hoạt tính của enzyme không thể phục hồi Ngược lại, ở nhiệt độ thấp 0oC thì hoạt tính của enzyme cũng sẽ bị giảm nhưng có khả năng phục hồi hoạt tính khi tăng dần nhiệt độ lên đến mức tối ưu Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự

có mặt của kim loại, pH, cơ chất,…

Phần lớn enzyme cellulase có nhiệt độ tối thích từ 30 – 50oC, hoạt động mạnh ở 35 – 40oC và bị vô hoạt khi nhiệt độ trên 70oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn theo phương trình bậc nhất:

• E0: Nồng độ ban đầu của enzyme

• E: Nồng độ của enzyme hoạt động theo thời gian t

Yếu tố nhiệt độ thường được sử dụng để điều khiển hoạt động của enzyme, tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

(iv) Ảnh hưởng của pH

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, vì nó ảnh hưởng đến mức

độ ion hóa của cơ chất enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein trong enzyme

Đa số enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 và 9, độ bền của enzyme của enzyme

có thể tăng lên khi có cơ chất, coenzyme, Ca2+,…mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH gọi là pH tối thích pH của môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, độ bền của enzyme Vì thế, pH có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme

Hình 5 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng của enzyme

Enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên cũng có enzyme hoạt động mạnh ở

pH acid Enzyme cellulase từ Trichoderma có điểm đẳng điện và pH tối thích nằm

trong khoảng acid khoảng pH 5

Dựa trên sự thay đổi của pH mà người ta điều hòa phản ứng trong bảo quản, trong chế biến lương thực, thực phẩm, tuyển chọn giống vi sinh vật,…

(v) Ảnh hưởng của các chất ức chế

Chất ức chế là chất có khả năng làm suy yếu hay chấm dứt hoàn toàn khả năng hoạt

động của enzyme Các chất ức chế có thể là: các ion kim loại, các anion, các hợp

chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein Các chất ức chế có khả năng ức chế thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp chất ức chế thuận nghịch, phản

ứng giữa enzyme và chất ức chế sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng:

- Các chất ức chế không cạnh tranh:

Chất kìm ức chế không cạnh tranh kết hợp với các enzyme ở các vị trí khác với trung tâm hoạt động Chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, làm giảm hoạt động xúc tác dẫn đến giảm vận tốc phản ứng

Phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme Sau khi kết hợp với chất ức chế để tạo thành phức hợp EI, enzyme vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như sau:

ES + S ↔ ESS

(vi) Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạt hóa enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion,các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của Bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học Mendeleev Những chất này có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt

động sang trạng thái hoạt động, từ trạng thái hoạt động yếu sang trạng thái hoạt động mạnh Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có

- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử của proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động

Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 – 1,65 Ao (K+, Na+, Ca+, Mg+)

và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme Trong quá trình hoạt hóa, các ion kim loại có khả năng kết hợp để tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác enzyme

Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu, ) có ảnh hưởng dến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Fe, Mn, Zn có tác dụng kích thích để tạo thành enzyme này từ nhiều chủng Nồng độ tối thích của Fe là 2 – 10 mg/l, Zn là 0,11 – 2,2 mg/l, Mn 3,4 – 27,2 mg/l (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.5 Trung tâm hoạt động của enzyme

Hoạt tính xúc tác của enzyme phần lớn thường được thể hiện và quyết định bởi các trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động thường là một phức hoặc một nhóm liên kết chặt chẽ với mạch protein của enzyme Các phản ứng thường xảy ra trên bề mặt của trung tâm hoạt động Các cơ chất tiến tới gần trung tâm hoạt động tạo phức enzyme - cơ chất Về mặt nhiệt động học, phức enzyme - cơ chất làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng làm cho phản ứng xảy ra dễ dàng

Các nhóm chức gắn trong mạch protein có thể từng cặp tạo thành trung tâm hoạt

động cùng hỗ trợ tham gia vào quá trình xúc tác (Trần Đình Toại, 2005)

2.1.6 Ứng dụng của enzyme cellulase

Trong thời đại mà ngành công nghiệp enzyme phát triển nhanh chóng, enzyme cellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật đang được sản xuất với quy mô công nghiệp

để đáp ứng cho nhu cầu rất lớn như hiện nay Enzyme cellulase tuy là được nghiên

cứu và ứng dụng chậm hơn so với các enzyme khác nhưng đó là một enzyme có vai trò rất quan trọng trong cộc sống của chúng ta

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy: enzyme CHB được dùng làm sợi để tiết kiệm năng lượng và làm tăng độ mềm dẻo của sợi Các enzyme cellulase khác

sẽ tham gia phản ứng tách các phần tử mực ra khỏi bề mặt sợi giấy hoặc dùng để thủy phân chất mang phần tử mực

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được dùng để thủy phân vách tế bào của malt làm tăng hiệu quả lắng, lọc, giảm cặn lắng, làm tăng năng suất trong chế biến bia Bên cạnh đó, chế biến nước trái cây và rượu vang cellulase cũng được dùng cùng với pectinase và hemicellulase để làm mềm lớp vỏ quả, tăng hiệu suất lắng,

lọc nước quả, tăng chất lượng và ổn định rượu (Tenkanen et al.,2003)

Trong chăn nuôi, nếu dùng hỗn hợp các enzyme trong đó có enzyme cellulase để sản xuất thức ăn dễ tiêu hóa cho động vật, đặc biệt là động vật còn non thì sẽ làm

tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (Phạm Thị Trân Châu et al., 2007)

Trong công nghiệp sản xuất bột giặt và các chất tẩy, dùng cellulase các loại:

CBH 1, CBH 2, EG 1, EG 2, EG 3, EG 5, EG 6 Các enzyme này tẩy các chất bẩn

có phân tử nhỏ bám vào quần áo bằng vải sợi, enzyme sẽ loại phần sợi cellulose mảnh ở trên bề mặt đã bị bẩn ra khỏi bề mặt sợi vải Còn đối với ngành công nghiệp sản xuất sợi, vải người ta dùng enzyme cellulase để làm bóng sợi, loại các sợi xù xì, giữ cho vải luôn được mới

Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc từ thực vật, trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp: cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất có trong thực vật được dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Trong xử lý chất thải hữu cơ có chứa cellulose như rác thải ở các nhà máy chế biến rau quả, bãi rác ở những khu đô thị, enzyme cellulase được dùng để phân hủy tránh được sự ô nhiễm đất, nước, không khí, Vì vậy rất có ý nghĩa trong công

nghệ bảo vệ môi trường (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

Từ nguồn nguyên liệu cellulose sẵn có sử dụng enzyme cellulase của Trichoderma

viride để chuyển hóa thành dịch đường Dịch đường này được sử dụng để dùng cho

nấm men lên men tạo thành ethanol, đây là dạng nguyên liệu trong tương lai đang

được nghiên cứu, áp dụng (Lê Ngọc Tú et al., 2002)

Sử dụng enzyme cellulase trong tế bào vi sinh vật như một loại phân bón vi sinh vật Khi bón chế phẩm vi sinh vật này vào đất trồng, chúng sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ có trong đất trồng thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh (Nguyễn

Đức Lượng, 2004)

2.2 Sản xuất enzyme cellulase từ vi sinh vật

Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase được cho ở bảng sau:

Bảng 1 Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase

α -amylase

Cellulase Glucoamylase

Aspergillus oryzae Hemicellulase

Lipase Pectinase

Protease Cellulase

Pennicilium emersonii Glucanase

Xylanase

Cellulase

Cellobiase

Dextranase Glucanase

Pennicilium funiculosum Glucoamylase

Glucosidase Pectinase Xylanase Cellulase

Glucanase

Trichoderma harzianum Glucosidase

Hemicellulase Xylanase

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2004)

Enzyme cellulase từ vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể Cellulase có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn

2.3 Tinh chế enzyme cellulase

Việc tinh sạch enzyme cellulase có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau Phổ biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký

ái lực, sắc ký lọc gel) (Ishii et al.,1979)

Trong phạm vi nghiên cứu này, đề tài được thực hiện với phương pháp kết tủa Phương pháp này được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học, đặc biệt là các phân tử có bản chất protein như enzyme Cấu tạo phân tử enzyme rất phúc tạp, chúng có cả những nhóm kỵ nước lẫn các nhóm ưa nước nên tính tan phụ thuộc vào các nhóm ưa nước trên bề mặt

Có thể dùng nhiều cách khác nhau để tủa enzyme như tủa bằng muối, bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa enzyme Các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái lực mạnh hơn enzyme nên có thể lôi kéo nước ra khỏi phân tử enzyme, làm cho chúng mất lớp áo nước và tủa xuống

Kết tủa được xem như là bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch enzyme thô Sau khi kết tủa, tiến hành ly tâm hoặc lọc hỗn hợp lỏng-rắn để thu được phần rắn Tiếp theo hòa tan phần rắn bằng dung dịch đệm, sau đó là khử muối nếu cần thiết (Harris, 1995)

2.3.1 Kết tủa bằng muối ammonium sulfate

Ammonium sulfate rất thường được sử dụng để tủa enzyme ở bước đầu trong quy trình tách chiết và tinh sạch Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh liên kết hydro tạo lớp áo nước quanh phân tử Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Banerjee, 2006)

Các loại muối thường được dùng là (NH4)2SO4, NaCl, MgSO4 Nhiều nghiên cứu cho thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì có khả năng ổn định hầu hết các loại enzyme Có thể dùng muối (NH4)2SO4 dạng rắn hoặc dạng dung dịch bão hòa (tính theo phần trăm bão hòa)

Phương pháp này cũng được sử dụng để kết tủa và thu phân đoạn các enzyme trong hỗn hợp dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở mỗi nồng độ muối khác nhau

Enzyme bị kết tủa bằng muối ít bị biến tính nhưng cần phải tiến hành thêm bước thẩm tách để loại muối ra khỏi dung dịch trước khi tiến hành sắc ký

2.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với phân tử nước Khả năng hydrate hóa của enzyme sẽ bị giảm khi thêm dung dịch các dung môi hữu

cơ, các phân tử enzyme liên kết lại với nhau và kết tủa xuống Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu

Ở phương pháp này cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới 5oC) nhằm tránh biến tính enzyme Có thể dùng các dung môi hữu cơ này để tách phân đoạn enzyme dưới

0oC, như vậy sẽ có tác dụng tốt đến sự ổn định của enzyme Khi đã có kết tủa, phải tách nhanh kết tủa ra bằng máy ly tâm Phương pháp này có ưu điểm là không cần loại muối, các dung môi hữu cơ có nhiệt độ bay hơi thấp nên dễ dàng tách ra khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay có màu (Lương Đức Phẩm, 2004)

2.4 Ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được sử dụng khá rộng rãi trong thu nhận dung dịch enzyme Dung dịch enzyme sau khi khuấy trộn với các hóa chất gây tủa và để ổn

định thì sẽ được đem ly tâm để thu phần protein kết tủa, trong đó có phần enzyme

cần nghiên cứu

Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta

thường tiến hành ly tâm lạnh

- Yasushi Morikawa et al (1998) đã nghiên cứu khả năng tinh sạch enzyme CBH từ

Trichoderma reesei Kết quả thu được là độ tinh sạch của enzyme CBH tăng 1,66

lần so với ban đầu, hoạt tính riêng tăng từ 1,11 U/mg lên 1,84 U/mg

2.5.2 Trong nước

Ngoài việc kết tủa sơ bộ hỗn hợp protein chứa enzyme sau quá trình lên men bằng (NH4)2SO4, thì dung môi ethanol lạnh cũng được sử dụng làm tác nhân kết tủa

enzyme trước khi tinh sạch Enzyme cellulase từ Bacillus subtilis có thể được tinh

sạch bằng ethanol lạnh với tỷ lệ dung môi: dịch chiết là 4: 1 ở nhiệt độ 4oC Kết quả thu được là hoạt tính enzyme tăng 4,5% so với ban đầu (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy., 2010)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Bể điều nhiệt Lauda 2000

- Máy ly tâm Hermle Z323K

- 3,5-dinitro salicylic acid (DNS) – (Phân tích, Merk)

- Sodium potassium tartrate (tinh khiết, Trung Quốc)

- Glucose (tinh khiết, Trung Quốc)

- NaOH (tinh khiết, Trung Quốc)

- (NH4)2SO4 (tinh khiết, Trung Quốc)

- Carboxy methyl cellulose (CMC) (tinh khiết, Trung Quốc)

- CH3COOH (tinh khiết, Trung Quốc)

- CH3COONa (tinh khiết, Trung Quốc)

- NaCl (tinh khiết, Trung Quốc)

- BSA (Bovine serum albumin) (Phân tích, Merk)

- CuSO4.5H2O , C2H5OH (tinh khiết, Trung Quốc)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát các nồng độ ammonium sulfate và các tỉ lệ ethanol thích hợp cho việc tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase

Mục đích: tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa cellulase tốt nhất mà không làm biến tính enzyme này Enzyme sẽ được đo hoạt tính

và hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch để xác định khả năng tinh sạch của hai chất trên

Hoạt tính của enzyme cellulase được xác định với 1% (w/v) carboxy methyl cellulose (CMC) làm cơ chất (theo phương pháp Miller, 1959) 1ml dung dịch enzyme cellulase được ủ trong 30 phút với 1ml CMC 1% và 1ml dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5) ở 60oC Sau khi phản ứng kết thúc, xác định nồng độ

đường khử tạo thành bằng cách cho 3 ml thuốc thử DNS đun sôi trong vòng 10 phút

rồi đem làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem đo độ hấp thu bằng máy quang phổ ở bước sóng 575 nm Đơn vị hoạt tính của enzyme (IU/ml) được tính dựa vào đường chuẩn glucose

Hàm lượng của protein được định lượng theo phương pháp phản ứng Biuret

3.3.1 Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp

(i) Mục đích:

Tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa enzyme

cellulase từ Trichoderma sp tốt nhất mà không làm biến tính cellulase từ

Trichoderma sp

(ii) Tiến hành:

Thí nghiệm được tiến hành theo phương thức kết hợp 2 nhân tố với 3 lần lặp lại

Nhân tố A: Hóa chất dùng để kết tủa enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp, có 2