sử dụng chỉ thị phân tử xác định và chọn lọc gen kháng bệnh đạo ôn trên các giống lúa địa phương và một số dòng chỉ thị

muốn khai thác và sử dụng nguiồn gen này thì cần phảI có những nghiên cứu kỹ lỡng về các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh, bản đồ genom và vị trí của các gen kháng trong bản đ

Hiện nay trên thế giới có khoảng 100 nớc trồng lúa và tập trung chủ yếu ở Châu á, 85% sản lợng lúa thế giới đợc sản xuất bởi 8 nớc châu á: Trung Quốc, ấn

Độ, Inđônêxia, Banglades, Việt Nam, Thái Lan, Myanma và Nhật Bản [1]

Việt Nam là nớc có truyền thống sản xuất lúa nớc từ lâu đời, có diện tích trồng lúa đứng thứ 6 thế giới (7453000 ha), sau ấn Độ, Trung Quốc, Inđônêsia, Bănglades và Thái Lan [3] Trong những năm qua nớc ta không những sản xuất

đảm bảo an ninh lơng thực mà còn vơn lên là một nớc xuất khẩu gạo đứng thứ 2 thế giới Năm 2005, lợng gạo xuất khẩu của Việt Nam đã vợt con số 5,2 triệu tấn, chiếm 23% lợng gạo xuất khẩu toàn cầu [6]

Cho tới nay, cùng với tiến bộ của khoa học kỹ thuật, năng suất và chất ợng lúa gạo ngày cáng đợc nâng cao Với mục tiêu tăng nhanh sản lợng, các biện pháp thâmcanh đã đợc áp dụng triệt để, kỹ thuật canh tác cũng có nhiều thay đổi

l-so với trớc, các giống lúa mới đợc đa ra trồnh mà cha qua kiểm định kỹ lỡng đã làm cơ cấu giống mất cân đối.đó là cha kể đến một lợng khổng lồ phân bón và

thuốc trừ sâu bệnh đây có thể là những nguyên nhân làm cho sâu bệnh thay đổi

về thành phần, số lợng, mức độ gây hại và xuất hiện những nòi mới có tính độc cao, gây hại trên quy mô lớn các giống lúa mất dần tính kháng và dịch bệnh hình thành, phá hại nặng cho các vùng trồng lúa

Trong các bệnh hại lúa, bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia Oryzae Cav gây

ra đợc coi là bệnh hại quan trọng nhất và có ý nghĩa kinh tế ở các nớc trồng lúa Theo số liệu của Cục BVTV, từ năm 1999-2003, diện tích lúa nhiễm đạo ôn trung bình mỗi năm ở nớc ta khoảng 298.977 ha [4].năm 2003 trên cả nớc có 265.216 ha bị bệnh đạo ôn lá trong đó diện tích nhiễm nặng là 1.532 ha ; 25.715

ha bị bệnh đạo ôn cổ bông trong đó diện tích bị nhiễm nặng là 166 ha[1] chỉ riêng trong vụ hè thu và vụ mùa năm 2004 cả nớc có 779 ha bị bệnh đạo ôn lá ,

433 ha bị bệnh đạo ôn cổ bông[2].Năm 2005, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá khoảng 212.626 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng khoảng 4.275 ha Diện tích nhiễm đạo ôn cổ bông khoảng 23.751 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng là 494

đã có hơn 30 locus gen kháng bệnh.mỗi gen kháng đợc một số chủng nhất định

Có gen kháng mạnh với chủng này nhng lại bị nhiễm nặng bởi chủng khác

Để có thể tạo ra các giống kháng bền vững với bệnh đạo ôn, thì việc tìm ra nguồn gen kháng là việc cần thiết tập đoàn các giống lúa địa phơng Việt Nam là rất đa dạng và phong phú, đây là nguồn gen quý giá cho các nhà chọn giống sử dụng để lai tạo muốn khai thác và sử dụng nguiồn gen này thì cần phảI có những nghiên cứu kỹ lỡng về các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh, bản đồ genom và vị trí của các gen kháng trong bản đồ bằng các kỹ thuật tiên tiến của…công nghệ sinh học nh PCR, RFLP thì việc phát hiện các gen kháng đạo ôn…trong các giống này trở lên đơn giản hơn

Chính vì vậy chúng tôI tiến hành đề tài:”Sử dụng chỉ thị phân tử xác định

và chọn lọc gen kháng bệnh đạo ôn trên các giống lúa đị phơng và một số dòng chỉ thị ”

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

-Nghiên cứu khả năng kháng bệnh đạo ôn của các giống lúa địa phơng -sử dụng chỉ thị phân tử tìm gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu Pi-ta trong các giống này

1.2.2 Yêu cầu

-Nghiên cứu các đặc điểm nông sinh học liên quan tới tính kháng đạo ôn của các giống lúa địa phơng

-Nuôi cấy và lây nhiễm nhân tạo các Isolate mới phân lập ở miền bắc Việt Nam cho các giống này và đánh giá khả năng kháng bệnh của chúng.

-Sử dụng chỉ thị phân tử tìm gen kháng bệnh Pi-ta trong các giống lúa địa phơng này

Phần 2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nớc

Bệnh đạo ôn lần đầu tiên đợc phát hiện ở Italia năm 1560, sau đó ở Trung Quốc năm 1637 bởi Soong Ying Shin, ở Nhật năm 1740 bởi Tsuchiya (Goto,1953) Nguyên nhân gây bệnh là do nấm Pyricularia oryzae Cav đợc xác

định bởi Cavara ở Italia [21]

ở Mỹ Mct Calf (1906,1907) cho biết ở miền Nam Carolina bệnh đạo ôn xuất hiện sớm vào năm 1876

ở ấn Độ, bệnh đầu tiên đợc biết đến ở vùng đồng bằng Thajaru miền Nam

ấn Độ năm 1918 (Mc Rae, 1922) và gây thành dịch tàn phá nghiêm trọng vào năm 1919 (Padmanabhan, 1965)

Việc nghiên cứu ngày càng đợc đẩy mạnh ở Nhật, ấn Độ, Philippin và Mỹ Những công bố, nghiên cứu về bệnh đạo ôn trong thời gian qua ngày càng nhiều Padwick (1950), Ou (1985), Further và Pabmanabhan (1965), Gangopadhyay (1983), Gangopadhyay và Pabmanabhan (1987), và K.Manibhushan.Rao (1990)

2.1.1 Phân bố địa lý

Bệnh đạo ôn là bệnh hại phổ biến trên cây lúa, bệnh xuất hiện và gây hại ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, ngoại trừ bang California của Mỹ

Bệnh còn xuất hiện ở những vùng đất trũng ngập nớc hoặc ở vùng đất cao

ma nhiều, những vùng trồng lúa ngập nớc hay những vùng nớc sâu Trong điều kiện khô hạn, đặc biệt là vùng xích đạo, nơi nhiệt độ rất cao, ẩm độ thấp, ở nơi

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh đạo ôn hại lúa là bệnh truyền nhiễm do nấm Pyricularia oryzae Cav gây ra Bệnh đã đợc phát hiện từ lâu song phải đến năm 1871 Garovario ở Italia cho đó là bệnh do nấm Pleospora oryzae Cav Năm 1891, Cavara là ngời đầu tiên mô tả nấm bệnh trên lúa, xác định chính thức nấm Pyricularia oryzae Cav

là nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa, theo phân loại nấm của Saccardo Nấm

Pyricularia oryzae Cav còn có tên khác là Pyricularia grisea, Magnaporthe gresea Nấm Pyricularia oryzae Cav thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp

nấm Bất toàn

Cành bào tử phân sinh của nấm hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thờng sinh ra từ các cụm cành từ 3-5 chiếc Bào

tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, thờng có từ 2-3 ngăn ngang, bào tử không màu, kích thớc trung bình của bào tử nấm 19-23 x 10-12 àm.Nhìn chung kích thớc của bào tử nấm biến động phụ thuộc vào các isolate, điều kiện ngoại cảnh và các giống lúa

Nấm đạo ôn thờng sinh trởng và phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 25-280C và

ẩm độ không khí trên 93% Phạm vi nhiệt độ nấm sản sinh bào tử từ 10-300C

Điều kiện ánh sáng âm u có tác dụng thúc đẩy quá trình sản sinh của bào tử nấm

Bào tử nấm nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24-280C và có giọt nớc Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và

ánh sáng ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 240C và ẩm độ bão hoà là điều kiện thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây

Trong quá trình gây bệnh, nấm tiết ra một số độc tố nh nh axit α piconinic (C6H5N02) và piricularin (C18H14N2O3) kìm hãm hô hấp và phân huỷ các enzim chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trởng của cây lúa

2.1.3 Triệu chứng của bệnh đạo ôn

Nấm gây bệnh đạo ôn có thể tấn công gây hại ở hầu hết các giai đoạn sinh trởng của cây lúa Triệu chứng điển hình của bệnh là các vết đốm trên lá, lúc đầu

là các đốm nhỏ hình tròn hoặc hình bầu dục có màu xanh xám hoặc xám sẫm, vết bệnh lan rộng, nhanh trong điều kiện ẩm ớt và có hình dạng mắt én, hình thoi ở giữa có mầu xám trắng, có đờng viền xung quanh mầu nâu hoặc nâu đỏ Trên các giống lúa nhiễm bệnh, trong điều kiện độ ẩm cao, vết bệnh có thể phát triển kéo dài tới 1- 4,5 cm và rộng từ 0.3 – 0.5 cm

Nấm bệnh còn có khả năng xâm nhiễm gây hại trên bẹ lá, đốt thân, đặc biệt là ở giai đoạn trởng thành, bệnh trên cổ bông và trên các gốc của bông gây thiệt hại cho năng suất [12]

2.1.4 Những thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với sản xuất lúa

Bệnh đạo ôn là một bệnh hại nghiêm trọng trên lúa bởi vì sự phát tán và sức tàn phá của nó rất rộng Nó làm cho nhiều vùng trồng lúa không thể đạt đợc kết quả mong muốn mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống Hạt giống nhiễm bệnh thờng làm cây con chết, trong khi đó bệnh đạo ôn trên cổ bông làm mất một nửa thậm chí cả bông lúa, làm giảm năng suất

Những nghiên cứu về thiệt hại rất có ý nghĩa nh: ở Italia (Baldacci, 1947),

ấn Độ (Padmanabhan, 1967), Nhật (Goto, 1963), Hàn Quốc (Crill và cộng sự, 1982), Philippin (Ou, 1985), Ai cập (Readdy và Bon man, 1987)

ở ấn Độ, Padmanabhan (1967) đã nghiên cứu mối quan hệ của năng suất với tỉ lệ mắc bệnh đạo ôn, và đã tìm ra rằng khi tỉ lệ mắc bệnh là 2% thì năng suất giảm 4%

Kato (1974) đã đa ra phơng pháp tính thiệt hại năng suất theo đạo ôn trên

cổ bông, đốt thân và trên bông

Earlier Kuribayashi và Ichikawa (1982) đã tính toán sự thiệt hại do đạo ôn gây ra bằng phơng trình đờng thẳng:

y = 0.69x + 2,8 Trong đó y : là tỉ lệ thiệt hại

Theo Supad (1982) đã quan sát và thấy khi hạt giống nhiễm bệnh đạo ôn thì năng suất giảm 30% (Malaysia) Trong khi đó ở Brazil, Prabhu và Moris (1986) cho biết khi hạt giống nhiễm bệnh đạo ôn trồng ở vùng đất cao làm giảm năng suất tới 61% ở Thái Lan, Loehken (1980) thấy rằng năng suất sẽ giảm từ

44 – 54% khi trồng hạt giống đó ở vùng nớc chảy

Tác giả Reddy và cộng sự (1988) đã đa ra phơng trình thể hiện mối quan

Theo Torres và Teng (1989,1991 ) sử dụng phơng pháp cải tiến đánh giá thiệt hại năng suất cho cả đạo ôn lá (LBl ) và đạo ôn trên bông (PBl):

Y = 5.0725 + 0.3664LBl + 0.3301PBl (r2 = 0.72, p = 0.01) [21]

Về thiệt hại trên đồng ruộng, hàng năm ngời ta đều có những ghi nhận

đáng kể thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra ở nhiều địa phơng, mặc dù đã sử dụng rộng rãi nhiều loại thuốc hoá học Năm 1850, ở ấn Độ sản lợng bị thiệt hại lên tới 75%, ở Philippin đã có vài nghìn hecta bị hại vì bệnh đạo ôn và sản lợng thất thu ớc tính khoảng 50% ở Nhật Bản (1950-1960) thiệt hại bình quân 2,89% tổng sản lợng lúa, mặc dù đã có những nỗ lực sử dụng thuốc phòng trừ bệnh Năm 1988, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại nặng ở vùng duyên hải phía bắc Nhật Bản, tổng sản lợng bị thiệt hại ở quận Fukusima là 24%, có những nơi bị thiệt hại lên tới 90%

ở Philippin (1962 – 1963) năng suất lúa bị giảm do bệnh đạo ôn gây ra

-ớc tính là 90% ở một số nơi và từ 50-60% ở tỉnh Bicol và tỉnh Leyte

ở Hàn Quốc (1989) cũng báo cáo thiệt hại về sản lợng do đạo ôn gây ra là 4.2% năm 1978 và 3.9% năm 1980 [12]

2.1.5 ảnh hởng của dinh dỡng đến sự phát triển của nấm Pyricularia oryzae Cav gây bệnh đạo ôn

Những nghiên cứu về ảnh hởng của dinh dỡng đến nấm gây bệnh đạo ôn cho thấy một số axit amin rất cần thiết cho sự sinh trởng và phát triển của nấm nh: Biotin, Thiamime Theo nghiên cứu của Otani (1952) cho thấy KNO3, NaNO3, axit aspartic có tác dụng kích thích sự phát triển của sợi nấm Nguồn dinh dỡng cacbon dùng trong nuôi cấy nấm có thể sử dụng nhiều loại đờng khác nhau nh Maltose, Saccarose, Glucose, Insulin, Mannitol Ngoài ra có thể dùng các axit hữu cơ nh axit Succinic

Những môi trờng giàu dinh dỡng đạm từ Peptone và dịch chiết của nấm men cũng làm tăng khả năng sản sinh bào tử của nấm Pyricularia oryzae Cav Môi trờng bột mạch agar (OMA), cũng đợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy nấm bệnh để sản xuất bào tử cho lây nhiễm

Trong nuôi cấy nguồn nấm và sản xuất bào tử dùng để lây nhiễm bệnh nhân tạo luôn phải quan tâm đến dinh dỡng của môi trờng đợc sử dụng Nhiều loại môi trờng đã đợc dùng trong nghiên cứu để kích thích quá trình sản sinh bào

tử của nấm đạo ôn nh Rice Polish Agar, môi trờng này đợc sử dụng nhiều ở Mỹ

ở Đài Loan và Nhật Bản, sử dụng hạt lúa mạch để tạo môi trờng nuôi cấy

Nấm Pyricularia oryzae Cav có thể phát triển tốt trên nhiều loại môi trờng dinh dỡng có chứa mô thực vật hoặc dịch chiết của cây trồng Khi nuôi cấy, cho thêm vào môi trờng nuôi cấy dịch chiết của rơm rạ sẽ kích thích sự sinh trởng và sản sinh bào tử nấm [12]

2.1.6 Các chủng sinh lý nấm gây bệnh đạo ôn

Trong tự nhiên, khả năng gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae Cav luôn

biến đổi do sự đột biến của nấm, sự tác động của các yếu tố sinh thái và các giống lúa Từ đó hình thành nên các chủng sinh lý của nấm Pyricularia oryzae Cav khác nhau Những chủng này không khác nhau về hình thái mà khác nhau

về đặc tính gây bệnh trên từng nhóm giống lúa riêng biệt [8]

Năm 1922, ở Nhật Bản tác giả Sasaki lần đầu tiên nghiên cứu và phát hiện các nòi sinh học nấm Pyricularia oryzae Cav gây bệnh đạo ôn Nhng chỉ sau khi

sử dụng giống Futaba có gen Pi-a vốn là giống kháng nòi nấm A dần dần trở thành giống nhiễm nặng thì việc nghiên cứu về nòi nấm Pyricularia oryzae Cav mới thực sự đợc bắt đầu ở Nhật, Mỹ và một số nớc khác Tuy nhiên, cha có sự

đồng nhất về việc sử dụng các giống lúa dùng để xác định loài giống gây bệnh

đó ở các nớc khác đợc Để khắc phục tình trạng này từ năm 1963 trở đi, với sự hợp tác nghiên cứu quốc tế đã thống nhất sử dụng một số bộ giống chỉ thị tiêu chuẩn quốc tế (8 giống) để xác định chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav Các nớc trên thế giới đã xác định đợc 32-64 nhóm nòi nấm gây bệnh đạo ôn hại lúa, với 256 nòi sinh học ở nhiều nớc.

Theo Goto (1956) nghiên cứu trên 12 giống lúa gồm 2 giống nhiệt đới, 4 giống Trung Quốc, 6 giống Nhật Bản khởi thuỷ, giám định đợc 123 chủng sinh lý gây bệnh và phân loại chúng thành 3 nhóm đặt tên là N, T, C ở ấn Độ, Padmanabhan (1965) đã xác định đợc 31 chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav Từ năm 1976, Nhật bản đã sử dụng bộ giống chỉ thị gồm 12 giống có đơn gen kháng để tiến hành xác định các chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav gây bệnh đạo ôn cho lúa Cho tới nay các nớc trồng lúa đã và đang tiếp tục dùng

bộ giống tiêu chuẩn để xác định các chủng gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae

Cav

Theo báo cáo của Chung (1974), khi đa một giống lúa mới vào sản xuất là nguyên nhân xuất hiện một chủng nấm mới Số chủng nấm gây bệnh tuỳ thuộc vào vùng địa lý, trong một vùng sản xuất lúa có thể có nhiều chủng nấm gây bệnh khác nhau

2.1.7 Tính chống chịu bệnh đạo ôn của các giống lúa

Nguồn gen trong cây lúa quyết định tính kháng hoặc nhiễm bệnh của giống lúa Phản ứng của cây lúa đối với bệnh phụ thuộc vào giống lúa, thời kỳ sinh trởng của cây và các chủng sinh lý nấm gây bệnh Cây lúa thờng nhiễm bệnh nặng ở giai đoạn mạ và thời gian từ đẻ nhánh tối đa đến giai đoạn trớc khi trỗ bông

tính kháng đạo ôn của các giống lúa do hệ thống các gen kháng quy định Tuỳ theo loại gen kháng lớn hay nhỏ, loại đơn gen hay đa gen của từng giống láu

mà ta thấy có giống kháng dọc đơn gen hay kháng ngang đa gen giống kháng dọc có một gen kháng tơng ứng với một gen độc của nòi nấm đạo ôn nhất định nào đó đó là các giống có tính chống chịu rất cao đối với một số ít nòi đặc hiệu thể hiện bằng các “phản ứng siêu nhạy” tạo vết bệnh không hoàn chỉnh sau 24h xâm nhiễm các sợi nấm trong mô bệnh chết dần Các giống kháng tạo ra các phytoalexin, các hợp chất phenon để chóng lại sự phát triển của nấm

ở các giống kháng ngang đa gen thờng có phổ kháng rộng nhng mức độ kháng trung bình Các giống kháng đạo ôn sau khi bị nhiễm tạo ra lợng phytoalexin ít hơn các giống nhiễm

lịch sử chọn tạo và sử dụng giống kháng bệnh đạo ôn bắt đầu từ những năm 1904 tại Nhật Bản , bằng phơng pháp chọn lọc dòng thuần đã tạo ra giống Kameli và Aikoku Từ 1910 đã sử dụng phơng pháp lai hữu tính để chọn tạo giống kháng từ đó nhiều giống kháng đạo ôn đã đợc sử dụng nh giống Norin6 kháng đạo ôn cổ bông, Norin8 kháng đạo ôn lá, Norin22 kháng cả đạo ôn lá và

đạo ôn cổ bông Với mục tiêu tạo giống mới năng suất cao, kháng bệnh đạo ôn…cần phảI phát hiện, khai thác và sử dụng triệt để nguồn gen kháng đạo ôn của tập

đoàn giống lúa thế giới Cho đến nay các gen kháng ổn định của các giống lúa

địa phơng ở các vùng trên thế giới là rất đa dạng và phong phú cần đợc khai thác

và sử dụng(Bệnh đạo ôn hại lúa_Lê lơng Tề_NXBNN 1988)

2.1.8 ứng dụng marker phân rử trong nghiên cứu bệnh đạo ôn hại lúa

DNA marker có thể đợc dùng để lập bản đồ genom, chọn lọc gián tiếp trong lai tạo giống lúa

Phân tích quần thể ký sinh

Bệnh đạo ôn do nấm P.oryzae gây ra, ở giai đoạn vô tính bao gồm các dòng vô tính đối với quần thể nh vậy, các dòng DNA thăm dò, có tính chất lặp lại(repetitive) là những marker rất tốt vì chúng cho phép ta đánh giá cùng một lúc nhiều locus Ngơi ta đã phân lập đợc1”repetitive element” từ nấm bệnh đạo ôn ký hiệu là MGR586(Harmer và ctv 1989) Nó đợc áp dụng phổ biến cho phân tích quần thể nấm đạo ôn “repetitive element”này còn đợc dùng trong cả 2 trơng hợp:

kỹ thuật “DNA fingerprinting” và phân tíchquan hệ di tuyền huyết thống(Levy& ctv 1991), nó còn đợc dùng trong việc lập bản đồ genom của ky sinh(Harmer & Given 1990, Rámao &Harmer 1992)

Phân tích tính kháng của ký chủtính kháng bệnh đạo ôn từ lâu vẫn đợc xem là thách thức lớn trong công tác chọn giống lúa Nhìn chung tính kháng đơn gen có hiệu quả cao hơn, nhng trong nhiều trờng hợp thì tính kháng này rất phức tạp tính kháng đa gen thờng có quan hệ vơíơ tính kháng ổn định Trong điều kiện nh vậy , có rất ít hoặc không có một dòng nấm ký sinh nào vợt qua nổi sự kiểm soát của một nhóm gen đó Nhiều chơng trình tạo giống lúa muốn đa tính kháng đa gen vào một giống nào đó Tuy nhiên rất khó có thể nghiên cứu tính kháng đạo ôn có tính chất số lợng nh vậy Các gen kháng này có thể đợc tích luỹ một cách dễ dàng hơn trên cơ sở chọn lọc gián tiếp đối với những marker có liên kết chặt chẽ với gen kháng bệnh đạo ôn DNA marker có thể đơc sử dụng để:

-phân tích di truyền tính kháng của các giống lúa có tính kháng ổn định.-phát triển các dòng đẳng gen (NIL) trong đó các gen đơn kháng bệnh đạo

ôn đã đợc xác định bản chất tổng quát về di truyền

Vì một gen kháng nào đó phải đối đầu với 1 quần thể ký sinh trên ruộng lúa cho nên điều quan trọng là phải hiểu đợc đặc tính của mỗi gen kháng trong phổ kháng bệnh đạo ôn với những quần thể phụ của nấm ký sinh đã có nhiều nghiên cứu xác định gen kháng bệnh đạo ôn và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể

đã đợc công bố Theo Zheng & ctv thì hiện nay trên thế giới đã tìm thấy 30 locus gen kháng bệnh đạo ôn, trong đó có 38 gen kháng chủ lực và một số gen đợc xác

định vị trí trên bản đồ genom của cây lúa ở các NST khác nhau

Nhờ kỹ thuật đánh dấu phân tử(MAS – marker assisted selection) ngời ta

đã xác định đợc vị trí của hơn 15 gen kháng chủ lực và 13 gen di truyền số ợng(QLTs) kháng đạo ôn lúa Nh gen Pi-z5 trên NST số 6 liên kết chặt với marker RG64, khoảng cách di truyền là 2.1 cM; gen Pi-ta trên NST 12, liên kết chặt với marker RZ397 với khoảng cách di truyền là 3.3cM và marker RG 241 với khỏng cách di truyền là 5.2 cM, các gen này có phổ kháng rộng đợc sử dụngtrong quá trình chọn giống

l-2.2 Tình hình nghiên cứu trong nớc

2.2.1 Sơ lợc về lịch sử xuất hiện và thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra ở nớc ta

ở nớc ta, bệnh đạo ôn đợc phát hiện vào đầu thế kỷ 19 dới các tên gọi khác nhau nh bệnh tiêm lụi, bệnh cháy lá lúa Năm 1921, nhà bệnh cây ngời Pháp là Fivin-Cens đã phát hiện bệnh ở Nam Bộ và Roger phát hiện ở Bắc Bộ vào năm

1951, nhng ông cho biết bệnh này ít phổ biến, gây hại nhẹ nên không đợc chú ý nghiên cứu Năm 1956, ở nông trờng Đồng Giao bệnh đạo ôn bùng phát trên diện tích rộng làm chết lụi 200 ha Trong những năm 1956-1960, dịch bệnh phát sinh

ở Miền Bắc gây hại nghiêm trọng ở các tỉnh nh Hải Phòng, Ninh Bình, Hà

Đông Những nghiên cứu gần đây của Trần Lệ Chi cho biết bệnh xuất hiện nhiều ở Thừa Thiên Huế, Tiền Giang và các tỉnh ven sông Cửu Long nhất là vùng

có ma nhiều Theo Lê Lơng Tề và cộng sự, ở các vùng lúa thuộc đồng bằng sông Hồng nh Hải Phòng, Hải Dơng, Hng Yên bệnh thờng hại nặng vào vụ chiêm, các tỉnh miền núi và trung du phía bắc bệnh hại nặng hơn vào vụ mùa Tuy nhiên cũng có vùng lúa bị hại nặng cả vụ chiêm và vụ mùa, đặc biệt là các vùng trồng

lúa cao sản, do đặc tính mẫn cảm của giống với bệnh Theo thống kê của cục BVTV và các tỉnh năm 1975, bệnh hại có xu thế tăng lên ở tỉnh Hà Nam Ninh, có

3 điểm phát sinh bệnh với diện tích trên 5 ha/giống N18 [8]

Năm 1976, bệnh đạo ôn đã tàn phá trên 5.000 ha đợc thông báo ở 68 điểm

điều tra trong cả nớc, trong đó có 300 ha lúa ở Tiền Giang và nhiều tỉnh khác thuộc đồng bằng sông Mê Công nh Hậu Giang, An Giang mặc dù đã đợc ngăn chặn bằng thuốc hoá học

Năm 1985, diện tích lúa bị bệnh là 7.951 ha trong đó có 920 ha bị nhiễm nặng và 1,2 ha bị cháy lụi Năm 1986, có 3.900 ha bị nhiễm nặng đạo ôn, riêng

vụ đông xuân 1979 trên 15 nghìn ha bị nhiễm đạo ôn lá và 59.377 ha nhiễm đạo

ôn cổ bông trong đó có nhiều vùng bị nhiễm nặng là: Nghệ Tĩnh, Thái Bình, Hà Nam Ninh, Hải Phòng Đến năm 1987, có trên 150.000 ha bị nhiễm đạo ôn trong đó có trên 10% diện tích bị nhiễm nặng Năm 1991, đạo ôn cổ bông hại 138.000 ha và 217.000 ha vào năm 1992 ở đồng bằng sông Hồng ở miền Nam năm 1992, diện tích lúa bị đạo ôn là 165.000 ha Theo báo cáo của Bộ NN& PTNT (1999) cho biết, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá trong cả nớc là 2.000.666

ha, diện tích bị nhiễm nặng là 6.994 ha, diện tích bị lụi là 77 ha, diện tích bị đạo

ôn cổ bông là 40.627 ha, diện tích bị nặng là 2.768 ha và 44 ha bị giảm năng suất trên 77% Năm 2000, trong cả nớc diện tích bị đạo ôn là 2.162.912 ha, trong đó diện tích bị nhiễm nặng là 64.726 ha Năm 2001, diện tích nhiễm đạo ôn trong cả nớc là 2.456.841 ha, bị nhiễm nặng 4.290 ha và lụi 624 ha, diện tích bị đạo ôn cổ bông là 8.240 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 4.935 ha Năm 2005, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá khoảng 212.626 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng khoảng 4.275 ha Diện tích nhiễm đạo ôn cổ bông khoảng 23.751 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng là 494 ha [4]

2.2.2 Quần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam

Trớc những diễn biến về tình hình dịch bệnh đạo ôn tại Việt Nam, các nhà khoa học trong và ngoài nớc đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về quần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam, để từ đó làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn ở trong nớc Từ năm 1996 đến nay, dựa trên bộ giống chỉ thị quốc tế, các nhà khoa học đã xác định đợc nhiều nhóm nòi đạo ôn ký hiệu là IA,

IB, IC, ID, IE, và IG phân bố từ các tỉnh Nam Trung Bộ đến các tỉnh Đồng bằng Bắc Bộ Các nòi có khả năng gây bệnh cao ở các tỉnh miền Bắc là IB, IE, IC-1, vàIC-23 các nhóm IA,ID và IG lại có khả năng gây bệnh cao ở Đồng bằng Sông Cửu Long(Lê Lơng Tề, Vũ Triệu Mân 1998) Năm 1996,Lã Tuấn Nghĩa và Cs đã dùng kỹ thuật RFLP để tiến hành nghiên cứu đan dạng quần thể nấm đạo ôn ở 10 tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam, đã xác định đựơc 23 nòi

Từ các kết quả nghiên cứu quần thể nấm đạo ôn, các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu tính kháng đạo ôn ở các giống lúa địa phơng của Việt Nam Nguyễn Trịnh Toàn và ctv(1996) đã tiến hành phân tích đa hình DNA của 12 giống lúa kháng đạo ôn nh Chiêm Bắc, Tám Thơm, DT12, DT10 bằng phơng pháp RFLP và thấy tính đa hình giữa các giống lúa là rất cao Nguyễn Thị Ninh Thuận và ctv(1996) đã nghiên cứu sự tơng tác giữa các nòi nấm bệnh đạo ôn đại diện ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam với các dòng lúa chỉ thị và giống lúa

địa phơng Kết quả là có nhiều giống địa phơng biểu hiện tính kháng rất cao nh Tám Thơm, Tẻ Tép ngợc lại, một số giống lúa đợc chọn tạo tại Việt Nam nh DT12, DT10, DT13 và CR203 lại bị nhiễm cao Theo các nhà chọn giống, để chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn ở Việt Nam thành công thì cần phải tổ hợp các gen kháng bệnh gồm Pi-1, Pi-z5, Pi-ta, Pi-ta2, Pi-k8 và Pi-b

Theo PGS.Ts Phan Hữu Tôn(2004), muốn tạo giống kháng bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam thành công thì cần phải sử dụng các gen kháng lại hầu hết các chủng gây bệnh nh gen Pi-k5, Pi-k, Pi-ta, Pi-ta2, Pi-z5, Pi-3 và Pi-5(t)

2.2.3 Quy luật phát sinh phát triển

Sự phát sinh, phát triển của bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại cảnh và mức độ nhiễm bệnh của giống, điều kiện nhiệt độ 20-280C, ẩm độ không khí bão hoà và thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân rất thích hợp cho bệnh phát sinh gây hại nặng ở miền Bắc, trà lúa mùa muộn vào giai đoạn trỗ chín, hoặc vụ lúa chiêm xuân vào giai đoạn đứng cái, làm đòng là những cao điểm của bệnh trong năm

ẩm độ không khí và ẩm độ đất có tác dụng lớn đến sự lây lan và phát triển của nấm bệnh ở những vùng nhiệt đới, có ma thờng xuyên kéo dài là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển nhanh

2.2.4 ảnh hởng của đất đai, phân bón đến bệnh.

Những chân ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nớc, những vùng đất mới vỡ hoang, đất nhẹ giữ nớc kém, khô hạn, những chân ruộng có lớp sét nông rất phù hợp cho nấm bệnh đạo ôn phát triển và gây hại

Phân bón giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự phát sinh, phát triển của bệnh đạo ôn, ngay cả những năm thời tiết không thuận lợi cho nấm phát triển, nhng do bón phân không hợp lý tạo điều kiện thúc đẩy bệnh phát sinh và gây hại mạnh Bón phân đạm quá nhiều, quá muộn, bón khi cây còn non, nhiệt độ không khí thấp đều làm tăng tỉ lệ bệnh và mức độ gây hại của bệnh Phân lân ảnh hởng

ít đén mức độ nhiễm bệnh của cây Nhng nếu bón không hợp lý bệnh vẫn có thể tăng Bón kali trên nền đạm cao cũng có thể làm tăng tốc độ bệnh của cây Phân silic có tác dụng làm giảm độ nhiễm bệnh của cây Mức độ nhiễm bệnh của cây

tỷ lệ nghịch với hàm lợng silic trong cây, do đó bón nhiều silic sẽ làm giảm mức

độ bệnh của cây

2.2.5Phơng pháp chọn tạo giống kháng bệnh

Đạo ôn là một bệnh gây hại nghiêm trọng cho lúa, vì vậy đã có rất nhiều nghiên cứu để tìm hiểu, xác định số lợng gen kháng đạo ôn và vị trí cửu nó trên NST cửu lúa, nghiên cứu môI trờng phân lập, cách phân lập, lây nhiễm, và đánh…giá sự đa dạng di truỳên về tính kháng đạo ôn cửu các giống lúa phục vụ cho công tác chon tạo giống kháng bệnh hiệu quả Tuy nhiên việc nghiên cú và chọn giống kháng bệnh đạo ôn vẫn còn nhiều khó khăn do:

-Số lợng gen kháng đạo ôn rất nhiều và tồn tại dới các alen khác nhauvì thế vấn đề tổ hợp chúng lại để tạo giống kháng bệnh còn khó khăn

-Việc phân lập nấm bệnh đạo ôn là rất phức tạp và khó khăn cần có tay nghề chuyên môn cao

- Cha có dòng chỉ thị để so sánh đánh giá khi chọn tạo mà mới có giống chỉ thị nên phổ so sánh, đánh giá còn hạn chế

Đã có nhiều phơng pháp chọn giống kháng bệnh nh: phơng pháp lai hữu tính, phơng pháp gây đột biến các ph… ơng pháp này cũng đã chọn đợc các giống kháng có hiệu quả nhất định Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một số nhợc điểm sau:

-Mất nhiều thời gian để chọn tạo ra một giống mới thờng từ 7-10 năm.-Tạo ra những giống có phổ di truyền hẹp

Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã góp phần vào conng tác chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn một trong những hớng đi mới hiện nay là ứng dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để phát hiện và chọn lọc gen kháng u điểm của phơng pháp này là:

- Rút ngắn thời gian chọn tạo và giảm giá thành trong việc chọn lọc các tính trạng

- Có thể tìm đợc những cá thể chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể

đang phân ly, trên cơ sở tìm ra sự có mặt của một đoạn DNA liên kết chặt với gen

đó mà không cần dựa vào kiểu hình Do đó có thể đánh giá cá thể trong bất kỳ

giai đoạn sinh trởng nào, trong bất kỳ môi trờng nào và cùng một lúc đánh giá nhiều tính trạng khác nhau trên cùng một cơ thể sinh vật.

- Do tính đa hình của đoạn DNA là rất cao nên tạo khả năng phân biệt đợc sự khác nhau giữa 2 cá thể sinh vật có quan hệ họ hàng gần nhau, phân biệt đợc sự sai khác giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh

Trong các phơng pháp chỉ thị phân tửl khác nhau đang đợc sử dụng thì phơng pháp PCR đợc áp dụng nhiều nhất do:

- Mất ít thời gian phân tích một mẫu

- Chỉ cần một lợng nhỏ DNA, không cần tính tinh sạch cao; do đó tốn ít công, chi phí cho sự chiết suất DNA tinh khiết

-Nhận biết đa hình rất đơn giản, chỉ cần sử dụng phơng pháp điện di

Phần 3 nội dung và phơng pháp nghiên cứu

3.1 Đối tợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tợng

Bệnh đạo ôn và nấm Pyricularia oryzae Cav

3.1.2 Vật liệu

* Nguồn nấm

Từ các mẫu nấm Pyricularia oryzae Cav đã đợc phân lập trong phòng thí nghiệm

STT Mẫu phân lập Phân lập từ giống lúa Địa điểm lấy mẫu

* Thuốc BVTV

- Thuốc Rabcide 30WP

* Môi trờng nuôi cấy nấm.

- Môi trờng PSA (Potato Sugar Agar):

+ Thành phần: 200 khoai tây+20g agar+20g đờng +1 lít nớc cất

+ Dùng để giữ nấm

- Môi trờng OMA

+ Thành phần: 50g oatmeal+20g đờng+1lít nớc cất

+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo và để sản xuất bào tử

- Môi trờng Cám agar:

+ Thành phần: 20g cám + 20g agar + 5g đờng + 1lít nớc cất

+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo và để sản xuất bào tử

- Môi trờng Bột ngô agar:

+ Thành phần: 20g bột ngô + 20g agar + 5g đờng + 1lít nớc cất

+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo

- Môi trờng Bột gạo agar:

+ Thành phần: 20g bột gạo +20g agar + 5g đờng + 1lít nớc

+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo

* Một số giống lúa

- 12 giống lúa chỉ thị (Nhật Bản) sử dụng để xác định chủng sinh lý nấm

Pyricularia oryzae Cav (giống chỉ thị).

- 7 giống lúa của Việt Nam : DT13, Si23, X30, C70, C71, DT10, Nếp 532

- 8 giống lúa của Trung Quốc: Q5, Nông u, Khang dân18, Nhị u 63, Hơng thơm số1, Nam u1, Bồi tạp Sơn Thanh, Hơng thơm

- 12 dòng, giống lúa đang khảo nghiệm : TBL06-1, TBL06-2, TBL06-3, TBL06-4, TBL06-5, TBL06-6, TBL06-7, TBL06-8, TBL06-9, TBL06-10, TBL06-

11, TBL06-12 đợc lấy từ Công ty Giống cây trồng Miền Nam

- 18 giống lúa lấy từ Công ty Giống cây trồng Nam Định : CR203, Bắc thơm số 7, VHC, Nếp 97, KD nguyên chủng, Q5, ải 32, NĐ1, MS4, CL9, 903, Nhị u 838, KD18, VQ14, VB2, Phúc Tiên, BoA

* Các dụng cụ khác

- Hộp petri, que cấy, bình tam giác, đũa thuỷ tinh, panh, ống đong, đèn cồn, cốc thuỷ tinh …

- Tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy, kính hiển vi, bình bơm…

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu

3.1.3.1 Địa điểm nghiên cứu

- Những nghiên cứu trong phòng đợc tiến hành tại phòng bệnh cây phân tử JICA – Trờng ĐH NNI

- Những nghiên cứu trong nhà lới đợc tiến hành tại khu nhà lới Khoa Nông học - Trờng ĐH NNI

3.1.3.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài đợc thực hiện từ 1/7/2006-15/1/2007

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Xác định chủng sinh lý của một số mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav.

3.2.2 Đánh giá khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav của một số dòng giống lúa.

- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav của một số dòng, giống lúa khảo nghiệm

- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav của một số giống lúa Việt Nam đang sử dụng trong sản xuất

- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav của một số giống lúa Trung Quốc nhập nội đang sử dụng trong sản suất

- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav của một số giống lúa từ Công ty giống cây trồng Nam Định

3.2.3 Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm Pyricularia oryzae Cav trên một số môi trờng.

3.2.4 Khảo sát hiệu lực của thuốc Rabcide 30WP đối với nấm Pyricularia oryzae Cav và đối với bệnh đạo ôn

- Hiệu lực của thuốc Rabcide 30WP đối với nấm Pyricularia oryzae Cav

- Hiệu lực của thuốc đối với bệnh.

+ Lây bệnh trớc - phun thuốc sau

+ Phun thuốc trớc - lây bệnh sau

3.3 Phơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị dụng cụ nghiên cứu.

- Hộp petri rửa sạch, để khô sau đó gói vào giấy báo, tiếp tục khử trùng ở nhiệt độ 150-1600 C trong 3 giờ

- Các bình phun đợc rửa trớc và sau khi sử dụng

- Các dụng cụ nh que cấy, đũa thuỷ tinh phải khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn trớc và sau khi cấy nấm

3.3.2 Chuẩn bị môi trờng

Các môi trờng sau khi đợc pha chế và nấu xong thì cho vào 2/3 bình tam giác 500 ml bọc giấy bạc và đợc khử trùng bằng nớc nóng Khử trùng xong, phân môi trờng ra các hộp petri, để nguội sau đó cho vào các túi nilon buộc chặt miệng túi để chống nhện xâm nhiễm Khi cần thì lấy ra sử dụng

Đối với môi trờng nghiêng trong ống nghiệm, sau khi nấu môi trờng PSA dùng bơm, bơm môi trờng vào từng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10 ml, sau đó dậy nút rồi hấp khử trùng bằng hơi nớc nóng, sau khi hấp khử trùng để các ống nghiệm nghiêng trên giá tạo mặt thạch nghiêng

3.3.3 Phơng pháp lây bệnh nhân tạo

- Chuẩn bị nguồn bào tử: Chuẩn bị đĩa OMA hoặc cám Agar đã đợc khử trùng để cấy nấm Lấy nấm từ ống PSA cấy vào đĩa OMA, mỗi isolate cấy 2 đĩa, mỗi đĩa cấy 3 điểm, đặt đĩa vào tủ 260 C trong 2 tuần, sợi nấm sẽ mọc kín đĩa môi trờng

- Lấy đĩa môi trờng ra khỏi tủ, dùng bình tia, tia nớc phun không ion vào, dùng chổi lông quét lại nhiều lần trên mặt đĩa bằng bình tia cho hết sợi nấm, vảy cho chổi hết nớc rồi quét cho khô mặt thạch Mỗi isolate rửa bằng một chổi, rửa xong đặt chổi trong nớc sôi.

- Đặt đĩa vào buồng sáng (12 giờ sáng, 12 giờ tối), mở nắp đĩa, đậy bằng giấy nilon có lỗ, để đĩa ở buồng sáng tối 3 ngày)

- Pha nớc rửa bào tử: Nớc cất có Tween 20 nồng độ 1/10.000

- Sau 3 ngày đa đĩa ra, cho 20 ml nớc rửa bào tử vào đĩa, rửa bào tử bằng chổi lông Đặt phễu trên bình tam giác loại 100 ml, đặt giấy lọc tha hoặc 2 lớp vải màn lên phễu, lọc nớc rửa bào tử, rửa và lọc tử 2-3 lần sẽ đợc khoảng 60 ml dung dịch bào tử, lọc xong, cho chổi, giấy lọc, phễu vào xoong nớc sôi, buộc thẻ vào bình tam giác, ghi tên isolate Mỗi isolate đợc rửa bằng một chổi và đợc lọc bằng một phễu riêng, đựng trong một lọ riêng và có thẻ ghi tên isolate riêng, tránh nhầm lẫn

Lấy một giọt dung dịch bào tử ở mỗi bình nhỏ lên lam, đặt lam trên kính hiển vi, đếm số bào tử trên một quang trờng, đếm 3 quang trờng

- Chuẩn bị cây con: Gieo 20 hạt lúa trên một hộp, có lần nhắc lại, 21 ngày sau khi gieo hạt cây lúa có từ 5-6 lá thì có thể sử dụng cho lây nhiễm bệnh

- Lây nhiễm: Phun dung dịch bào tử ớt đều lá lúa, cắm thẻ thí nghiệm vào khay lúa, đặt các khay lúa này trong buồng sơng hoặc trong buồng có ẩm độ > 90% trong thời gian 20 giờ, sau đó đa khay ra khỏi buồng sơng, đặt khay lúa vào trong chậu nớc, hàng ngày kiểm tra nớc của các chậu có khay lúa, luôn luôn giữ khay có đủ nớc

3.3.4 Đánh giá

Sau lây nhiễm đợc 7 ngày kiểm tra mức độ bệnh của từng cây lúa, lá lúa Thang điểm đánh giá theo Kato (1993)

Cấp 0 : Không có vết bệnh – kháng cao (HR).

Cấp 1 : Vết bệnh chỉ là một chấm nhỏ bằng đầu kim- kháng (R)

Cấp 2 : Vết bệnh to hơn, màu nâu nhạt đến nâu tối- kháng (R)

Cấp 3 : Vết bệnh to hơn và có màu xám ở giữa- nhiễm (S)

Cấp 4 : Vết bệnh đặc trng hình thoi- nhiễm nặng (HS)

3.3.5 Phơng pháp xác định chủng sinh lý của các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav.

- Đánh giá khả năng kháng bệnh của 12 giống lúa chỉ thị của Nhật Bản với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav bằng phơng pháp lây bệnh nhân tạo Mỗi giống lúa này đều có gen kháng bệnh đạo ôn khác nhau đã đợc xác định

3.3.6 Phơng pháp nghiên cứu sự phát triển của nấm trên các môi trờng nhân tạo

- Chuẩn bị môi trờng nghiên cứu: Chuẩn bị 5 loại môi trờng: PSA, OMA, cám agar, bột gạo agar, bột ngô agar

- Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm vào đĩa môi trờng PSA, cấy một điểm chính giữa, sau 4-7 ngày dùng làm nguồn để cấy nấm

- Cấy nấm: Từ nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav thuần đã mọc trên đĩa PSA, dùng đột tròn có đờng kính 5mm, đột nấm ở đĩa nguồn theo đờng tròn đồng tâm sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh nấm trên 5 loại môi trờng (mỗi đĩa cấy một khoanh ở chính giữa, mỗi loại môi trờng cấy 3 đĩa)

+ Đo đờng kính tản nấm sau cấy 2, 4, 6, 8, 10 ngày, mỗi đĩa đo 2 lần theo hình dấu cộng.

+ Quan sát đặc điểm của tản nấm và mô tả sau cấy 10 ngày

3.3.7 Phơng pháp xác định hiệu lực của thuốc Rabcide 30WP

- Hiệu lực của thuốc đối với nấm trong môi trờng nuôi cấy PSA: khử trùng môi trờng, để nguội ở nhiệt độ 50-600C, sau đó cân lợng thuốc cần thí nghiệm hoà với 100 ml môi trờng, mỗi công thức chia ra 3 đĩa, mỗi đĩa ứng với 33 ml Công thức đối chứng không xử lý thuốc Dùng đột, đột từng khoanh nấm có đờng kính từ 3-5 mm, cấy một khoanh nấm vào giữa đĩa (phải chuẩn bị nguồn nấm từ trớc 7-10 ngày)

- Xác định hiệu lực của thuốc đối với tản nấm: Để các đĩa nấm vào tủ định

ôn 26-280 C, sau đó đo đờng kính tản nấm (đo gián tiếp qua đáy hộp petri) Đo vào các ngày thứ 2, 4, 6, 7, 10 sau cấy

- Quan sát sự hình thành bào tử: Dùng chổi lông và nớc cất quét và loại bỏ sợi nấm, sau đó đặt đĩa vào buồng sáng 3 ngày Rửa bào tử bằng 10 ml nớc chứa 1/100.000 Tween 20 đợc dung dịch bào tử Lấy một giọt dung dịch bào tử nhỏ lên lam và tiến hành đếm bào tử trên quang trờng của kính hiển vi

3.3.8 Hiệu lực của thuốc đối với sự xâm nhập và gây bệnh trên lúa.

- Chuẩn bị khay lúa

- Chuẩn bị nguồn bào tử

- Chuẩn bị các nồng độ thuốc cần thí nghiệm

+Thí nghiệm phun thuốc trớc lây bệnh sau: Tiến hành phun thuốc khi cây lúa đợc 3-4 lá Lây bệnh nhân tạo sau khi phun thuốc 2 ngày bằng phơng pháp lây bệnh nhân tạo Theo dõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau lây nhiễm 7, 12,

17 ngày Tính hiệu lực thuốc theo công thức Abbot

+ Thí nghiệm lây bệnh trớc phun thuốc sau: Lây bệnh nhân tạo, sau

thuốc, sau khi phun thuốc 7, 12, 17 ngày Tính hiệu lực thuốc theo công thức Henderson-Tilton.

a: Số lá dảnh bị bệnh ở mỗi cấp N:Tổng số lá, dảnh điều tra

b: Trị số cấp bệnh tơng ứng T: Trị số cấp bệnh cao nhất

- Công thức Abbott, đợc sử dụng để xác định hiệu lực của thuốc đối với tản nấm, trong thí nghiệm ngoài đồng ruộng (phun thuốc trớc - lây bệnh sau)

HL(%) = − ì100

C

T C

HL(%): Hiệu lực của thuốc

b a

T C

C T

HL(%) : Hiệu lực thuốc

Ta : Mức độ bệnh (%) ở công thức thí nghiệm sau xử lý thuốc

Tb : Mức độ bệnh (%) ở công thức thí nghiệm sau xử lý thuốc

Ca : Mức độ bệnh (%) ở công thức đối chứng sau xử lý thuốc.

Cb : Mức độ bệnh (%) ở công thức đối chứng sau xử lý thuốc

3.3.10 Xử lý số liệu

Số liệu đợc thu thập và xử lý theo chơng trình IRRISTART

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

4.1 Kết quả xác định chủng sinh lý từ các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav.

Từ những mẫu nấm Pyricularia ôryzae Cav đã đợc phân lập từ trớc (49,

50, 51, 52, 54, 55, 57), chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định chủng sinh lý bằng phơng pháp lây bệnh nhân tạo.Trong điều kiện nhà lới, chúng tôi đã lây nhiễm các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav trên 12 giống lúa chỉ thị của Nhật Bản Kết quả phản ứng của các giống lúa Nhật Bản với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav đợc trình bày ở bảng 4.1

Phản ứng của các giống lúa chỉ thị với các mẫu phân lập nấm Pyricularia

oryzae Cav khác nhau thì mức độ biểu hiện trên các giống lúa là khác nhau.

Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy:

Giống lúa Shin 2 khi lây nhiễm bởi các mẫu phân lập 49, 51, 57 thì biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 2, với mẫu phân lập 50, 52, 54 thì biểu hiện trên lá ở cấp

3, còn với mẫu phân lập 55 thì biểu hiện trên lá ở cấp 1

Giống lúa Tsuyuake khi lây nhiễm bởi mẫu phân lập 50, 55 thì biểu hiện nhiễm bệnh trên lá ở cấp 1, với mẫu phân lập 49, 51, 52, 54, 57 thì biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 2

Giống lúa K59 khi lây nhiễm bởi mẫu phân lập 49 thì biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 1, với mẫu phân lập 50, 51, 52, 54, 57 thì biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 4, còn với mẫu 55 biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 3

Các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav khi lây nhiễm trên các giống lúa khác nhau thì mức độ biểu hiện cấp bệnh là khác nhau.

Mẫu phân lập 49 khi lây nhiễm trên các giống lúa cho thấy: Các giống Aichi-asahi, Fukunishiki, K59 biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 1 Các giống Shin 2, Ishikari-shrroke, Kanto59, Tsuyuake, PiNo.4, Toride, K60, BL1 biểu hiện bệnh trên lá ở cấp 2, còn giống Yashiromochi biểu hiện bệnh ở cấp 3

Mẫu phân lập 51 khi lây nhiễm trên các giống lúa cho thấy các giống lúa Kanto51, Fukunishiki không nhiễm bệnh, các giống Shin2, Aichi-asahi, Tsuyuake, Toride1, biểu hiện bệnh ở cấp 2, giống PiNo.4 biểu hiện bệnh ở cấp 3, các giống còn lại là Ishikari-shrroke, Yashiromochi, K60, BL1, K59 biểu hiện bệnh ở cấp 4

Bảng 4.1 Cấp bệnh đạo ôn trên nhóm lúa chỉ thị của Nhật thông qua lây

nhiễm bệnh nhân tạo trong nhà lới vụ mùa 2006.

B¶ng 4.2 Ph¶n øng kh¸ng nhiÔm cña c¸c gièng lóa chØ thÞ bëi c¸c

mÉu ph©n lËp nÊm Pyricularia oryzae Cav.

Gièng lóa Shin2 cã ph¶n øng kh¸ng víi c¸c mÉu ph©n lËp 49, 51, 55, 57,

cã ph¶n øng nhiÔm víi c¸c mÉu ph©n lËp 50, 52 vµ 54

Gièng lóa Tsuyuake cã ph¶n øng kh¸ng víi tÊt c¶ c¸c mÉu ph©n lËp

Giống lúa K59 có phản ứng kháng với chủng 51, có phản ứng nhiễm với chủng 55 và có phản ứng nhiễm nặng với các chủng còn lại là 50, 51, 52, 54, và 57.

Từ kết quả mức độ kháng bệnh của nhóm giống lúa chỉ thị, với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav chúng tôi đã xác định đợc chủng sinh lý của các mẫu phân lập, kết quả đợc trình bày ở bảng 4.3

Bảng 4.3 Kết quả xác định các chủng sinh lý của nấm Pyricularia oryzae

Cav từ các mẫu phân lập tơng ứng

STT Tên mẫu

phân lập Tên giống Địa điểm thu mẫu

Chủngsinh lý

1 49 Nếp HP Bình Xuyên – Vụ Bản – Nam Định 100.0

2 50 Nhị u 63 Bình Xuyên – Vụ Bản – Nam Định 647.4

3 51 Bắc thơm số 7 Bảo Xuyên – Vụ Bản – Nam - Định 304.7

5 54 Khang dân Nam Mỹ – Nam Trực – Nam Định 701.6

Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy:

Mẫu phân lập 49 lây bệnh trên giống lúa nếp HP ở Bình Xuyên – Vụ Bản – Nam Định là chủng 100.0

Mẫu phân lập 50 gây bệnh trên giống lúa Nhị u 63 ở Bình Xuyên – Vụ Bản – Nam Định là chủng 647.4