Nuôi cấy tế bào cây nghệ đen trong hệ lên men FERMENTER

Với những lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài ”NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY NGHỆ ĐEN TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN ” nhằm bước đầu xác định một số điều kiện như tốc độ khuấy, khối lượng mẫu đưa vào ban

NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY NGHỆ ĐEN

Luận văn Thạc sỹ Chuyên ngành: Hoá sinh- SLTV Khóa 10 (2002-2005)

Người hướng dẫn khoa học: PGS-TS Nguyễn Hoàng Lộc

Học viên thực hiện: Trần Thị Triêu Hà

Huế, 2005

Bộ Giáo dục và Đào tạo

Đại học Huế Trường Đại học Khoa Học

MỞ ĐẦU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

MỞ ĐẦU

Nghệ đen ( Curcuma zedoaria) là một trong những

loại cây dược liệu quý Những chất tách chiết từ củ nghệ đen như sesquiterpenoid, curcuminoid có khả năng chữa bệnh ung thư, bệnh về tim mạch, dạ dày, chống viêm nhiễm, Tuy nhiên, sản lượng củ nghệ thu hoạch hạn chế do nhiều nguyên nhân khác nhau Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật trong những năm gần đây với các kỹ thuật nuôi cấy trong hệ lên men, nuôi cấy hai pha, các biện pháp kỹ thuật hỗ trợ cung cấp điều kiện sinh trưởng tối ưu cho tế bào đã mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp

Với những lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài

”NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY NGHỆ ĐEN TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN ” nhằm bước đầu xác định một số điều kiện như tốc độ khuấy, khối lượng mẫu đưa vào ban đầu, tốc độ dòng khí thích hợp cho sự sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Curcuma zedoaria Roscoe

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Môi trường nuôi cấy

- Sơ đồ bố trí thí nghiệm

SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM

Dịch nuôi cấy

Phân tách tế bào

Thu sinh khối

Nuôi cấy trong bình tam giác có lắc

Nuôi cấy

tạo callus

Phiến lá, bẹ lá,

gốc lá của cây

Hệ lên men

Chuẩn bị môi trường Pha chế môi trường Khử trùng môi trường

- Xác định sinh trưởng tế bào

Sinh trưởng tế bào được xác định thông qua thông qua sinh khối của tế bào bằng việc xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô hai ngày một lần để lập đường cong sinh trưởng của tế bào

* Trọng lượng khô

* Trọng lượng tươi

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHỞI ĐẦU (Callus)

1.1 Chọn vật liệu nuôi cấy

Bảng 1 Hiệu quả chọn mẫu vật liệu nuôi cấy tạo callus

Bộ phận Số lượng Chỉ tiêu theo dõi

Đánh giá nuôi cấy mẫu cấy Tỷ lệ mẫu nuôi tạo

Callus có màu trắng, mọng nước, xốp, sinh trưởng kém, chết sau một lần cấy chuyền

Callus có màu vàng, rắn chắc, có dạng hạt, sinh trưởng tốt qua các lần cấy chuyền

1.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành callus

Bảng 2 Ảnh hưởng của BAP và 2,4-D đến khả năng tạo callus của cây nghệ in vitro.

Ký hiệu môi trường Chất điều hòa sinh trường (mg/L) Khả năng tạo callus

2 NUÔI CẤY TẾ BÀO NGHỆ ĐEN TRONG HỆ NUÔI CẤY LẮC

Bảng 3 Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác

250 mL với thể tích môi trường và khối lượng mẫu ban đầu khác nhau.

V X0 X max Δx= (Xo – Xmax) Tmax

0,073 0,074

Hình 1a sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 1g.

1 2 3 4 5

Hình 1b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 1g.

0 0.1

Hình 2a Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 2g.

Hình 2b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 2g.

Hình 3a Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 3g.

3 4 5 6 7 8 9 10

Hình 3b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các thể tích môi trường khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 3g.

0.2 0.4 0.6 0.8

3 NUÔI CẤY TẾ BÀO NGHỆ ĐEN TRONG HỆ THỐNG FERMENTER

3.1 Ảnh hưởng của khối lượng mẫu ban đầu và tốc độ khuấy đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nghệ đen khi nuôi cấy trong hệ lên men.

Bảng 4 Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men

Ra X0 X max Δx= (Xo – Xmax) Tmax

Hình 4a Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 50g

Hình 4b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 50g

4 8 12

Hình 5b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 100g

100 125 150 175 200

Hình 5b: sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 100g

3 NUÔI CẤY TẾ BÀO NGHỆ ĐEN TRONG HỆ THỐNG FERMENTER

Bảng 4: sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men

Ra X0 X max Δx= (Xo – Xmax) Tmax

Hình 6a Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các tốc độ dòng khí khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 50g, tốc độ khuấy là 150 vòng/phút.

50 100 150 200 250 300

Hình 6b Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong nuôi cấy dịch huyền phù ở các tốc độ dòng khí khác nhau với lượng mẫu cấy ban đầu là 50g, tốc độ khuấy là 150 vòng/phút.

4 9 14 19 24 29 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm, chúng tôi bước đầu rút ra một số kết luận sau:

1.1 Callus của tế bào nghệ đen được hình thành tốt nhất từ gốc lá (leaf base) của cây nghệ in vitro.

1.2 Môi trường cơ bản MS bổ sung saccharose 20g/L, agar 8g/L, BAP 3mg/L và 2,4-D 3mg/L thích hợp nhất cho sựtạo thành calllus của nghệ đen

1 KẾT LUẬN

1.3 Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL dung dịch môi trường với 3 g mẫu khởi đầu cho kết quả tốt nhất.

1.4 Sinh trưởng tế bào nghệ đen trong hệ lên men đạt kết quả tốt nhất khi nuôi cấy 50 g mẫu trong 5 L môi trường, tốc độ khuấy là 150 vòng/phút, tốc độ dòng khí là 2,5 L/phút

Chúng tôi có một số đề nghị trong nghiên cứu cây nghệ đen nhưsau:

2.1 Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹthuật như tốc độ khuấy, tốc độ khí, thành phần môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào nghệđen nuôi cấy trong hệ lên men cũng như khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp có giá trị cao (sesquiterpenoid, curcuninoid )trong các tế bào đó

2.2 Tiến hành tách chiết tinh dầu của tế bào nghệ nuôi cấy trong hệ lên men, làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị

2 ĐỀ NGHỊ

Ảnh 1 Cây nghệ đen in vitro

Ảnh 2 Nuôi cấy callus nghệ đen trên môi trường đặc

Ảnh 3 Nuôi cấy dịch huyền phù

tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 mL

Ảnh 4 Nuôi cấy tế bào nghệ đen

trong hệ lên men

XIN CHÂN THÀNH CÁM ƠN

QUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC ANH CHỊ ĐÃ QUAN TÂM

THEO DÕI !