TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN VỚI ALDEHYDE THƠM, AMONIUM BẬC BỐN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất trong công nghiệp chế biến thịt.... Do đó, một vấn đề được đặt ra là từ các vỏ phế liệu này, người ta có thể sản xuất ra chi

VÒNG BÍNH LONG

TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN VỚI ALDEHYDE THƠM, AMONIUM BẬC BỐN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành : Hóa sinh

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010

Thầy không chỉ tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, thầy còn luôn động viên, khích lệ để em cố gắng hoàn thành tốt luận văn này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa: cô

Phạm Thị Ánh Hồng, cô Đồng Thị Thanh Thu, thầy Trần Mỹ Quan, thầy Văn Đức Chín, cô Nguyễn Thị Huyên, cô Lâm Thị Kim Châu Các thầy cô đã tận tình

dạy dỗ cho em trong suốt thời sinh viên cũng như giai đoạn em làm việc tại bộ môn

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các anh chị, các đồng nghiệp trong bộ môn

Sinh hóa: cô Lê Phi Nga, chị Lương Bảo Uyên, anh Trần Quốc Tuấn, bạn Nguyễn Phan Cẩm Tú, Võ Mai Trâm và các em Thạch Thành Trung, Nguyễn Thanh Phong, Phạm Thị Mỹ Bình, Lê Quang Huy và Trần Văn Khuê Mọi

người đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian em làm việc và làm thí nghiệm ở bộ môn

Em cũng xin chân thành cám ơn các anh chị và các bạn học viên cao học K17 đã luôn giúp đỡ, động viên em Anh cám ơn các em Pha, Uyên, Sáng, Hạnh, Dịu

Con cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba má Ba má đã luôn

quan tâm, luôn ủng hộ cho con đường học vấn của con và là chỗ dựa tinh thần cho

con Anh cảm ơn Na, em đã luôn bên cạnh anh, lo lắng, quan tâm và động viên cho

anh trong những lúc anh gặp khó khăn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2010

VÒNG BÍNH LONG

Mục lục

Danh mục các thuật ngữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình ảnh

Danh mục các đồ thị

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các biểu đồ

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan chitin, chitosan 1

1.1.1 Tổng quan chitin 1

1.1.2 Tổng quan chitosan 3

1.1.2.1 Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan và dẫn xuất chitosan 3

1.1.2.2 Cấu tạo chitosan 4

1.1.2.3 Tính tan của chitosan 7

1.2 Ứng dụng chitosan và dẫn xuất chitosan 8

1.2.1 Chitin và chitosan trong công nghiệp màng bao thực phẩm 8

1.2.2 Ứng dụng chitosan trong công nghệ lọc và khử acid nước trái cây 10

1.2.3 Ứng dụng chitosan để thu hồi protein và chất béo từ whey phomat 10

1.2.4 Ứng dụng chitosan và chitin trong làm sạch nước 11

1.2.5 Ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất trong công nghiệp chế biến thịt 13

1.2.6 Ứng dụng chitin và chitosan để cố định enzyme 13

1.2.7 Tổng hợp chitin oligomer và chitosan oligomer ứng dụng trong thực phẩm chức năng 14

1.3 Một số dẫn xuất của chitosan 18

1.3.1 Dẫn xuất chitosan gắn đường 18

1.3.2 Dẫn xuất N-aryl chitosan 20

1.3.3 Dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan 21

1.3.4 Dẫn xuất carboxyalkyl của chitosan 23

1.4 Hoạt tính sinh học của chitosan và dẫn xuất chitosan 25

1.4.1 Hoạt tính kháng vi khuẩn của chitosan và các dẫn xuất 25

1.4.2 Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất 28

1.4.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và dẫn xuất 29

1.4.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 29

1.4.3.2 Chất oxy hóa và chất kháng oxy hóa 30

1.5 Tổng quan các chủng vi sinh thử nghiệm 35

1.5.1 Các chủng vi khuẩn thử nghiệm 35

1.5.1.1 Staphylococcus aureus MSSA 35

1.5.1.2 Staphylococcus aureus MRSA 36

1.5.1.3 Escherichia coli 37

1.5.1.4 Pseudomonas aeruginosa 38

1.5.1.5 Salmonella typhi 40

1.5.2 Các chủng nấm bệnh thử nghiệm 40

1.5.2.1 Sclerotium rolfsii 40

1.5.2.2 Fusarium sp 41

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và thiết bị 44

2.1.1 Vật liệu 44

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 45

2.2 Phương pháp 46 2.2.1 Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR): xác định độ

2.2.3 Phương pháp phân tích phổ NMR xác định độ thay thế của

phản ứng tạo dẫn xuất chitosan 50

2.2.4 Phương pháp tạo dẫn xuất chitosan 53

2.2.4.1 Tạo dẫn xuất chitosan với các aldehyde thơm 53

2.2.4.2 Tạo dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan 54

2.2.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 56

2.2.5.1 Phương pháp đục lỗ thạch 56

2.2.5.2 Phương pháp xác định MIC của các chất thử nghiệm 57

2.2.6 Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm 58

2.2.7 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa 59

2.2.7.1 Năng lực khử 59

2.2.7.2 Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do 61

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Xác định độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan 63

3.1.1 Xác định độ deacetyl hóa của chitosan 63

3.1.2 Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitosan bằng phương pháp đo độ nhớt 64

3.2 Tổng hợp các dẫn xuất chitosan 65

3.2.1 Hiệu suất thu nhận các dẫn xuất của chitosan 65

3.2.2 Xác định độ thay thế và độ amonium bậc bốn hóa của các dẫn xuất chitosan 66

3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 69

3.3.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất 69

3.3.2 MIC của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 73

3.3.2.1 MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 73

3.3.2.3 MIC của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng

vi khuẩn thử nghiệm 77

3.3.2.4 MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 79

3.3.2.5 MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 81

3.3.2.6 MIC của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 82

3.3.2.7 MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 84

3.4 Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuât trên các chủng nấm thử nghiệm 87

3.4.1 Hoạt tính kháng nấm của chitosan 87

3.4.2 Hoạt tính kháng nấm của N-Benzyl chitosan 89

3.4.3 Hoạt tính kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan 91

3.4.4 Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan 93

3.4.5 Hoạt tính kháng nấm của N- Benzyl chitosan-Quat 94

3.4.6 Hoạt tính kháng nấm của N- Metylbenzyl chitosan-Quat 96

3.4.7 Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxyl benzyl chitosan-Quat 97

3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 102

3.5.1 Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 102

3.5.2 Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 105

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 108

4.1.1 Độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan 108

4.1.2 Kết quả tạo các dẫn xuất của chitosan 108

4.2 Đề nghị 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BC : dẫn xuất N-Benzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và

benzalhyde MBC : dẫn xuất N-Metylbenzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và

metylbenzaldehyde HBC : dẫn xuất N-Hydroxylbenzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và

hydroxylbenzaldehyde BC-Quat : dẫn xuất N-Benzyl chitosan-Quat tổng hợp từ N-Benzyl

chitosan và Quat-188 MBC-Quat : dẫn xuất N-Metylbenzyl chitosan-Quat tổng hợp từ N-

Metylbenzyl chitosan và Quat-188 HBC-Quat : dẫn xuất N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat tổng hợp từ N-

Hydroxylbenzyl chitosan và Quat-188 Quat-188 : (3-cloro-2-hydroxyl) propyltrimetyl amonium chloride

NMP : N-metyl-2-pyrrolidone

PGA : Potato Glucose Agar

TSB : Trypton Soya Bean

N-aryl chitosan : dẫn xuất chitosan gắn với aldehyde thơm

MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

pháp đo độ nhớt bằng nhớt kế Ubelloge 64 Bảng 3.2 Hiệu suất phản ứng thu nhận các dẫn xuất chitosan 65 Bảng 3.3a: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo

công thức của Mrunal 67 Bảng 3.3b: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo

công thức của Warayuth 67 Bảng 3.3c: Độ amonium bậc bốn hóa (DQ) của các dẫn xuất amonium bậc bốn

chitosan 68 Bảng 3.4 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm của chitosan và các

dẫn xuất chitosan 70 Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử

nghiệm 73 Bảng 3.6: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi

khuẩn thử nghiệm 75 Bảng 3.7: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng

vi khuẩn thử nghiệm 77 Bảng 3.8: Nồng độ kìm hãm tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các

chủng vi khuẩn thử nghiệm 79 Bảng 3.9: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng

vi khuẩn thử nghiệm 81 Bảng 3.10: Nồng độ ứu chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các

chủng vi khuẩn thử nghiệm 83 Bảng 3.11: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên

các chủng vi khuẩn thử nghiệm 84 Bảng 3.12: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của chitosan và các dẫn xuất chitosan

trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 86

khác nhau 89

Bảng 3.15: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan ở các nồng độ khác nhau 91

Bảng 3.16: Hiệu suất kháng nấm của N-Hyroxylbenzyl chitosan ở các nồng độ khác nhau 92

Bảng 3.17: Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 94

Bảng 3.18: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 95

Bảng 3.19: Hiệu suất kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 97

Bảng 3.20: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau 102

Bảng 3.21: Kết quả kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau 104

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 1

Hình 1.2 Cấu tạo của α-chitin và β-chitin 2

Hình 1.3 Công thức cấu tạo chitosan 4

Hình 1.4 Các nhóm chức hoạt động trên phân tử chitosan 5

Hình 1.5: Công thức cấu tạo chitin và chitosan 5

Hình 1.6 Phân tử chitosan “kẹp” ion Niken 12

Hình 1.7: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất maltose-chitosan 18

Hình 1.8 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất lactose-chitosan 20

Hình 1.9 Tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan 21

Hình 1.10 Phản ứng giữa chitosan và metyl iod tạo dẫn xuất trimetyl chitosan 22

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-carboxymetyl chitosan 24

Hình 1.15 Công thức một số chất chống oxy hóa 33

Hình 1.16: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MSSA 35

Hình 1.17: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MRSA 36

Hình 1.18: Vi khuẩn Escherichia coli 37

Hình 1.19: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39

Hình 1.20: Vi khuẩn Salmonella typhi 40

Hình 1.21: Nấm Sclerotium rolfsii 40

Hình 1.22 Đặc điểm cấu tạo nấm Fusarium sp 43

Hình 2.1: Phổ IR của chitosan và các thông số để tính độ deacetyl hóa 47

Hình 2.2 Phổ 1H NMR của N-benzyl chitosan trong dung dịch acid acetic 1% dùng để xác định mức độ thay thế 51

Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp các N-aryl chitosan 53

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan 55

Hình 3.1: Khả năng kháng S aureus MRSA của chitosan và các dẫn xuất chitosan 71

Hình 3.2 : Khả năng kháng E coli của chitosan và các dẫn xuất chitosan 71

Hình 3.3: Kết quả MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 74

Hình 3.4: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 75

Hình 3.5: Kết quả MIC của N-Metyl benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 78

Hình 3.6: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 79

Hình 3.7: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 81

Hình 3.9: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng

Đồ thị 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ và độ nhớt của chitosan 46

Đồ thị 3.2: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 103

Đồ thị 3.3: Hiệu suất kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở

chitosan 90 Biểu đồ 3.4: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ

N-Metylbenzyl chitosan 92

chitosan-Quat 95 Biểu đồ 3.7: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ

N-Metylbenzyl chitosan-Quat 97 Biểu đồ 3.8: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Hydroxyl

đứng sau cellulose Chitin không chỉ có nhiều trong vỏ các loại tôm, cua, mai mực…mà còn là thành phần chính của vách tế bào nhiều loại nấm Các nguồn chitin nếu không được xử lý đúng cách sẽ tạo ra nguồn chất thải lớn ra môi trường và gây

ô nhiễm Do đó, nếu các nguồn chitin này được tận dụng một cách khoa học thì không những tạo ra được những hợp chất mới có những hoạt tính ưu việt mà còn tránh lãng phí và giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường.

Chitosan là một polymer sinh học được tạo ra từ phản ứng deacetyl hóa chitin Trên thế giới hiện nay ngày càng có nhiều những công trình nghiên cứu về loại polymer sinh học này, do chitosan có những tính chất ưu việt mà không một loại polymer nào khác có được Chitosan không gây độc hại đến cơ thể con người,

có khả năng tương hợp với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có những hoạt tính quý báu như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh, kháng oxy hóa Ngoài ra, các nhà khoa học đã tổng hợp nên những dẫn xuất mới có hoạt tính tốt hơn so với chitosan, thậm chí các dẫn xuất này còn có những hoạt tính mới mà chitosan ban đầu không có Gần đây, chitosan và các dẫn xuất còn được phát hiện thêm nhiều đặc tính ưu việt khác như khả năng dẫn truyền và giải phóng thuốc ứng dụng trong dược phẩm, khả năng liên kết với DNA ứng dụng trong vector chuyển gen, ứng dụng trong kỹ thuật mô

Vì thế, hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của chitosan đang thu hút rất nhiều nhà khoa học trên thế giới Trong khi đó, ở Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện hướng nghiên cứu này nhằm tìm ra những dẫn xuất mới có những đặc tính mới và ưu việt hơn, từ đó ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau Các hoạt tính thường được nghiên cứu là hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa,

để từ đó có thể ứng dụng vào trong lĩnh vực nông nghiệp, thực phẩm, thậm chí y dược

dung sau:

- Tổng hợp các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm, tổng hợp dẫn xuất chitosan với Quat

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất

- Khảo sát hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất

CH ƯƠ NG 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan chitin, chitosan

1.1.1 Tổng quan chitin

Chitin là một polymer sinh học có trữ lượng nhiều thứ hai trong tự nhiên, chỉ sau cellulose [21], [54] Cấu trúc hóa học của chitin gần tương tự như cấu trúc hóa học của cellulose, do nhóm acetomido ở vị trí C-2 của đơn phân chitin thay thế cho nhóm hydroxyl ở vị trí C-2 của đơn phân cellulose Thuật ngữ “chitin” được bắt nguồn từ Hy Lạp “chiton” có nghĩa là áo giáp ngoài và được sử dụng lần đầu tiên bởi Bradconnot năm 1811 Chitin là polymer sinh học có các đơn phân là 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose hay N-acetyl glucosamine (hình 1.1) Chitin là thành phần cấu trúc chính tạo nên lớp vỏ ngoài của các loài động vật không xương sống cũng như vách tế bào nấm

Ở các loài này, chitin đóng vai trò tương tự như vai trò của collagen ở các loài động vật

có xương, và cellulose ở các loài thực vật trên cạn Chitin là một polymer sinh học có tính chất ổn định về mặt hóa học, do bên trong và ở giữa phân tử chitin chỉ chứa các liên kết hydro

Mức độ deacetyl của chitin thông thường nhỏ hơn 10% và trọng lượng phân tử của chitin khoảng 1,0 - 2,5 x 106 Da tương ứng với mức độ polymer khoảng 5000 – 10.000 Chitin còn có cấu trúc đa hình, tức là trong tự nhiên chitin tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, trong đó chitin có 3 dạng chính Dạng α-chitin là dạng phổ biến nhất

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin

gồm những mạch đơn xếp chồng lên nhau, trong đó những mạch kề nhau được định hướng ngược chiều nhau (hình 1.2) Không phổ biến bằng dạng α-chitin, dạng β-chitin cũng có cấu trúc tương tự với những mạch đơn xếp song song nhau, nhưng theo cùng một hướng, do đó làm cho liên kết giữa các mạch trong β-chitin yếu hơn so với α-chitin Dạng thứ ba là dạng γ-chitin, gồm hai chuỗi song song cùng hướng và một chuỗi ngược hướng Dạng γ-chitin cũng có thể coi là một dạng biến đổi của dạng α-chitin và β-chitin [73]

Do quá trình phân hủy sinh học của chitin xảy ra rất chậm như ở các vỏ sò, vỏ các loài giáp xác, nên đã tích lũy một lượng rất lớn các phế liệu này trong công nghiệp chế biến thủy hải sản Ở Mỹ, tổng lượng chất thải hằng năm thải ra ngoài môi trường thì trong đó có 50% - 90% là từ phế liệu vỏ các loài giáp xác, thủy hải sản Còn trên thế giới, ước tính hàng năm lượng chất thải này lên đến 5,118 x 106 tấn các nguồn phế liệu thủy hải sản Trong nhiều loài giáp xác khác nhau, người ta chủ yếu sử dụng vỏ tôm và cua để tách chiết thu lấy chitin, vì hàm lượng chitin trong nguồn này chiếm khá cao,

Hình 1.2 Cấu tạo của α-chitin và β-chitin

α-chitin

β -chitin

chiếm đến 69-70% trọng lượng khô của vỏ [46] Dù ở các nước có nền công nghệ chế biến thủy hải sản phát triển thì vấn đề xử lý các vỏ phế liệu thủy hải sản cũng là một thách thức rất lớn Do đó, một vấn đề được đặt ra là từ các vỏ phế liệu này, người ta có thể sản xuất ra chitin, chitosan và các dẫn xuất có những đặc tính sinh học hữu ích, từ

đó ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong các lĩnh vực thực phẩm và y dược

1.1.2 Tổng quan chitosan

1.1.2.1 Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan và dẫn xuất chitosan

Năm 1811, giáo sư Henri Braconnot thuộc khoa Lịch sử Tự nhiên kiêm giám đốc vườn thực vật Viện Hàn Lâm Khoa Học Nacy- Pháp đã tìm thấy chitin lần đầu tiên

ở nấm Năm 1823, Galier đã phân lập được chitin từ côn trùng và gọi đó là “chitin”

Năm 1959, giáo sư D Rouget đã phát hiện ra chitosan, một dạng dẫn xuất deacetyl của chitin Từ đó đã có nhiều nghiên cứu cơ bản về chitin và chitosan nhưng những hạn chế về mặt công nghệ và sự cạnh tranh của vật liệu polymer tổng hợp nên

đã cản trở sự phát triển của các hợp chất sinh học mới này [46]

Đến những năm 1970, nguồn phế thải hải sản như vỏ tôm, cua, mai mực ngày càng nhiều Để tránh tình trạng ô nhiễm môi trường cũng như để tận dụng nguồn phế liệu dồi dào này, các nhà khoa học đã nghĩ đến việc tận dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu hữu ích này Chính vì vậy các nghiên cứu về chitin và chitosan ngày càng nhiều hơn và sâu hơn [46]

Từ những năm thập niên 70 của thế kỉ XX, chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống con người như thực phẩm, dược phẩm, bảo vệ môi trường, công nghệ sinh học… Một ví dụ điển hình là loại thuốc chữa thoái hóa khớp làm từ vỏ tôm - glucosamine - đang được sử dụng thịnh hành và thương mại hóa trên toàn thế giới Nước Mỹ tiêu thụ hơn 1 tỷ viên nang glucosamine mỗi năm Người ta vẫn đang tích cực nghiên cứu để khám phá thêm nhiều ứng dụng hữu ích của

Hình 1.3 Công thức cấu tạo chitosan

chitosan, đồng thời cải biến chitosan để nâng cao khả năng sử dụng, trong đó có nhiều dẫn xuất mới có tiềm năng ứng dụng rất cao [46]

Ở Việt Nam, tác giả Trần Thị Luyến đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất chitosan từ chitin, đồng thời cũng có một số nghiên cứu ứng dụng chitosan như nghiên cứu ảnh hưởng của màng bao chitosan đến một số tính chất hóa lý của trứng gà trong quá trình bảo quản Ngoài ra, còn có một số các nghiên cứu tạo dẫn xuất chitosan của tác giả Nguyễn Thị Huệ ứng dụng kháng khuẩn và xử lý nước thải

Hướng nghiên cứu tạo dẫn xuất mới từ chitosan đang được thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới nhằm tạo ra những hợp chất mới có những hoạt tính sinh học mới, tốt hơn và ưu việt hơn Nhờ đó, chitosan và các dẫn xuất mới của chitosan phát hiện ra các ứng dụng mới như dẫn truyền và giải phóng thuốc trong điều trị các tế bào ung thư mục tiêu, chuyển gen, ứng dụng trong kỹ thuật mô…[14], [27], [93]

1.1.2.2 Cấu tạo chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin hay chitosan là dạng có mức acetyl hóa thấp của chitin Đơn phân chủ yếu của chitosan là D-glucosamine hay 2-amino-2-deoxy- β-D-glucose (hình 1.3) Chitosan có các mức độ deacetyl khác nhau, từ 40% đến 98% và trọng lượng phân tử của chitosan trong khoảng 5 x 104 đến 2 x 106 Da Mức độ deacetyl và mức độ polymer là hai thông số quan trọng ảnh hưởng đến trọng lượng phân tử của chitosan cũng như ảnh hưởng đến các tính chất hóa học, vật lý, sinh học của chitosan Ngoài ra trình tự nhóm amino và nhóm acetomido, và độ tinh sạch của chitosan cũng ảnh hưởng đến các tính chất này của chitosan, từ đó cũng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của chitosan [45], [62], [73]

Hình 1.4 Các nhóm chức hoạt động trên phân tử chitosan

Công thức cấu tạo của chitosan có 3 nhóm chức hóa học có chức năng hoạt động biểu hiện hoạt tính sinh học: một nhóm amino ở vị trí carbon thứ 2, một nhóm hydroxyl sơ cấp ở vị trí carbon thứ 3 và một nhóm hydroxyl thứ cấp ở vị trí carbon thứ

6 (hình 1.4) Các biến đổi hóa học ở các nhóm chức này đều có thể tạo ra các dẫn xuất

có những tính chất ưu việt được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau [73]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo chitin và chitosan

Chitin

Chitosan

Mặc dù cấu trúc hóa học của chitin và chitosan gần tương tự nhau (hình 1.5), tức là chỉ có nhóm acetomido của chitin được thay bằng nhóm amino ở chitosan, nhưng tính chất vật lý và các phản ứng hóa học của hai loại polymer này lại rất khác nhau Cả hai phân tử polymer này đều có các nhóm phản ứng hóa học là hydroxyl và amino nhưng chitosan lại thường ít kết tinh hơn so với chitin Điều này cho thấy chitosan có thể phản ứng với nhiều chất hóa học hơn chitin Một điểm khác biệt rõ ràng nhất giữa chitin và chitosan chính là đặc tính tan của hai polymer này Trong khi chitin chỉ có thể tan được trong một số dung môi như : dung dịch LiCl trong N-metyl-2-pyrrolidone, dung dịch CaCl2 bão hòa trong metanol…, thì chitosan lại tan được trong hầu hết các acid hữu cơ, phổ biến nhất là acid formic và acid acetic Chitosan có các đơn phân là D-glucosamine do đó trong môi trường acid yếu, rất nhiều vị trí trên chuỗi chitosan có điện tích dương làm tăng tính phân cực, tăng lực đẩy tĩnh điện trong phân

tử chitosan, nhờ đó tính tan của chitosan cũng tăng lên Ngoài ra một số muối của chitosan cũng có khả năng tan trong nước như formate, acetate, lactate, malate, citrate, tartarte, glyoxylate, pyruvate, glycolate, malonate và ascorbate [54]

Trong các biến đổi hóa học của chitosan, nhóm chức năng amino có thể xảy ra các phản ứng hóa học như phản ứng acetyl hóa, phản ứng tạo base bậc bốn, phản ứng với các aldehyde và cetone hình thành nên các base Schiff, phản ứng ghép, phản ứng kẹp kim loại … từ đó tạo ra các hợp chất khác nhau có những đặc tính ưu việt hơn như kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng virus, kháng acid, kháng ung bướu, không độc, không dị ứng, hoàn toàn có tính tương hợp sinh học và tự hủy sinh học Còn ở vị trí nhóm hydroxyl cũng có thể xảy ra một vài phản ứng hóa học như phản ứng o-acetyl hóa, liên kết hydro với nguyên tử phân cực, phản ứng ghép… Do chitin có khả năng phản ứng và tính hòa tan kém, nên chitosan đã thu hút được nhiều nhà nghiên cứu

để tạo các dẫn xuất có cấu trúc được rõ ràng với những tính chất và chức năng tốt hơn [54]

1.1.2.3 Tính tan của chitosan

Trong khi chitin không tan trong hầu hết các loại dung môi hữu cơ, chitosan có thể tan được trong nhiều acid hữu cơ ở pH ≤ 6 Chitosan được coi như là một base tương đối mạnh do trên mạch chitosan có chứa nhiều nhóm amino sơ cấp có giá trị pKa

là 6,3 Ở pH thấp các nhóm amino này có thêm một proton và mang điện tích dương

Do đó khi hòa tan trong môi trường acid yếu, chitosan được coi là một chất đa điện phân Ngược lại khi pH ≥ 6, các nhóm amino bị mất đi proton, không còn mang điện tích dương và trở nên không hòa tan Sự thay đổi từ trạng thái tan sang trạng thái không tan của chitosan xảy ra ở ngay giá trị pKa của chitosan, tức là khoảng giữa pH 6 đến 6,5 Tính hòa tan của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl hóa (DD) và phương pháp sử dụng trong quá trình deacetyl hóa chitin [54]

Hằng số hòa tan Ka của nhóm amino được tính theo cân bằng phương trình sau:

-NH2 + H2O ↔ -NH3+ + OH

-Ka = [-NH2].[H2O]/[NH3+] và pKa = -log Ka

Đối với chất đa điện phân, hằng số phân ly không phải là một hằng số Sự biến thiên của pKa được tính theo công thức Kaschlsky sau:

pKa = pH + log [(1-α)/α] = pKo - ε∆Ψ(α)/kT

Trong đó: ∆Ψ là sự chênh lệch điện thế, α là độ phân ly, kT là hằng số Boltsman

và ε là điện tích electron

Chitosan có thể dễ dàng hình thành dạng muối nitơ bậc bốn ở pH thấp, do đó nhiều acid hữu cơ có thể hòa tan được chitosan Dung môi tốt nhất hòa tan chitosan được cho là acid formic nồng độ từ 0,2 đến 100% Còn dung môi được sử dụng phổ biến nhất dùng để hòa tan chitosan lại là acid acetic 1% ở pH khoảng 4, nhưng nếu sử dụng acid acetic với nồng độ đậm đặc ở nhiệt độ cao có thể xảy ra sự phân hủy chitosan Chitosan cũng có thể tan trong acid hydrocloric 1% và acid nitric loãng nhưng chitosan không tan trong acid sulfuric và acid phosphoric [54]

Lượng acid dùng để hòa tan còn phụ thuộc vào tính chất của chitosan Nồng độ proton cần thiết phải ít nhất bằng với nồng độ của –NH2 của chitosan Có rất nhiều yếu

tố ảnh hưởng đến tính tan của chitosan như nhiệt độ, các yếu tố của quá trình deacetyl hóa chitin tạo chitosan, kích thước phân tử chitosan Mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử là hai yếu tố quan trọng không chỉ ảnh hưởng đến tính tan của chitosan

mà còn ảnh hưởng đến nhiều tính chất khác của chitosan Ngoài ra, sự phân bố nhóm acetyl và nhóm amino trên chuỗi chitosan cũng ảnh hưởng đến tính tan và các tính chất khác của chitosan [7], [54]

1.2 Ứng dụng chitosan và dẫn xuất chitosan

1.2.1 Chitin và chitosan trong công nghiệp màng thực phẩm

Những lợi ích của màng bảo quản thực phẩm dùng để bao các loại thực phẩm tươi, thực phẩm đông lạnh và thực phẩm nhân tạo đã được biết nhiều năm trước Màng bao thực phẩm không chỉ làm tăng chất lượng sản phẩm mà còn thân thiện với môi trường và có khả năng tự phân hủy sinh học một cách tự nhiên Những lớp màng thực phẩm này được sử dụng theo phương cách bổ sung, phụ trợ là chủ yếu, nhưng đôi khi cũng là thành phần cần thiết để điều khiển các thay đổi lý sinh, hình thái và lý hóa của thực phẩm Hiện nay vật liệu dùng làm màng bao thực phẩm được sử dụng phổ biến nhất là màng polyetylen Tuy nhiên màng polyetylen có nhiều khuyết điểm như oxy sẽ

bị sử dụng hết dẫn đến quá trình lên men yếm khí, nhiệt độ bảo quản dao động lên xuống làm cho nước bị ứ đọng và các yếu tố này thúc đẩy sự phát triển của nấm mốc,

từ đó làm hư hỏng thực phẩm Có nhiều cơ chế liên quan đến quá trình bảo quản thực phẩm bằng các màng bao Trong đó có cơ chế kiểm soát trao đổi độ ẩm giữa thực phẩm

và môi trường bên ngoài, cơ chế kiểm soát giải phóng các tác nhân hóa học như các chất kháng vi sinh, kháng oxy hóa, làm giảm một phần áp suất oxygen, từ đó làm giảm tốc độ trao đổi chất, kiểm soát tốc độ hô hấp, kiểm soát các chất không thấm nước như dầu, mỡ, kiểm soát nhiệt độ, củng cố cấu trúc của thực phẩm, tẩm lên các chất gia vị và các chất thấm nở dưới dạng vi ống [21], [35], [73]

Chitin và chitosan do có đặc tính tạo màng mỏng nên đã được sử dụng thành công trong công nghiệp bảo quản thực phẩm Màng N,O-carboxymetyl chitin đã được dùng để bảo quản trái cây trong một thời gian dài ở cả Canada và Mỹ Bởi vì chitosan

có khả năng hình thành nên lớp màng bán thấm nên màng chitosan có thể làm thay đổi

áp suất bên trong cũng như làm giảm sự thoát hơi nước từ đó làm chậm quá trình chín của trái cây

Màng chitosan cũng có thể được tạo ra bằng cách thêm các tác nhân liên kết như glutaraldehyde, kim loại hóa trị II, chất đa điện phân hoặc thậm chí là polysaccharide

âm Tính chất của màng chitosan dai, có thể kéo dài, mềm dẻo và rất khó xé rách Tất

cả các đặc tính này của chitosan được so sánh với nhiều loại polymer vừa và tốt trên thị trường Kittur và cộng sự nghiên cứu thấy màng chitosan làm giảm đi trị số thấm nước

và có thể làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm tươi và cả các loại thực phẩm có nhiều nước Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Wong và Butler thấy rằng màng chitosan là một hàng rào ngăn chặn sự trao đổi oxy và bằng cách liên kết với các chất béo, tính kị nước sẽ tăng lên từ đó tạo nên màng phức hợp ngăn chặn sự thấm nước Từ

đó, khả năng bảo quản thực phẩm được nâng cao

Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu sự ảnh hưởng của màng chitosan đến khả năng lưu trữ và chất lượng của trái cây tươi Màng chitosan đã được sử dụng để bảo quản rất tốt đào và lê Nhật Tương tự vậy rất nhiều loại trái cây tươi như dưa chuột, tiêu, dâu và cà chua đã được bảo quản lâu hơn sau khi đã được bao lớp chitosan Kết quả bảo quản tốt như vậy là chủ yếu là do chitosan có khả năng làm giảm tốc độ hô hấp, kìm hãm sự phát triển của nấm, làm chậm quá trình chín trái bởi khả năng khử etylen và khí carbonic tăng

Chitosan và màng chitosan có hoạt tính kháng vi sinh Chitosan và màng mỏng chitosan chứa các tác nhân kháng vi sinh vừa có khả năng gắn trên màng chitosan, không bị thấm ra bề mặt trái cây, vừa có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Các chất bảo quản trên màng chitosan làm giảm lực hút tĩnh điện bên trong phân tử

chitosan và thuận tiện cho việc hình thành liên kết hydrogen trong nội phân tử [21], [73]

1.2.2 Ứng dụng chitosan trong công nghệ lọc và khử acid nước trái cây

Trong quá trình lọc nước trái cây, các nhà máy thông thường sử dụng các tác nhân lọc như gelatin, bentonit, silica gel, tannin, potassium caseinat và polyvinyl pyrrolidon Muối chitosan mang điện tích dương mạnh nên có hiệu quả như chất làm trong và cũng có hiệu quả kiểm soát acid trong nước trái cây Chitosan là một tác nhân lọc trong nước nho rất tốt dù có hay không có bổ sung pectinase Chitosan rất có hiệu quả khi là tác nhân lọc trong nước táo, có thể đưa giá trị đục của sản phẩm về không khi sử dụng 0,8kg/m3 chitosan Trong bài nghiên cứu tương tự, Spagna quan sát thấy chitosan có ái lực mạnh với các hợp chất polyphenol như catechin, proanthocyanidin, acid cinnamic và các dẫn xuất khác Các chất này sẽ làm cho rượu ban đầu có màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng đậm do tạo các sản phẩm oxy hóa Khi bổ sung chitosan vào nước nho với nồng độ 0,015g/ml, tổng hàm lượng acid giảm khoảng 52,6% do các acid citric, acid tartaric, acid malic, acid oxalic và acid ascorbic đều giảm lần lượt 56,6%, 41,2%, 38,8%, 36,8% và 6,5% [21] Do đó, chitosan không những có tác dụng làm giảm độ đục mà còn làm giảm lượng các acid thừa trong sản phẩm nước trái cây [46]

1.2.3 Ứng dụng chitosan để thu hồi protein và chất béo từ whey phomat

Fernandez và Fox nghiên cứu sử dụng chitosan để tách protein và peptide từ whey phomat Urea-PAGE cho thấy chitosan có khả năng tách tốt các phân đoạn protein trong whey ở pH 2, 3 và 4 Còn ở pH 5, 6 và 7 hầu hết nitơ trong whey vẫn còn tan trong chitosan 0,02% Tuy nhiên khi giảm pH từ từ thì thu phân đoạn tốt nhất ở pH

4 Khi đưa chitosan 0,01 - 0,016% vào whey ở pH 4,5 thì hầu hết các phân đoạn hạt chất béo trên màng đều được loại bỏ Bởi vì pKa của nhóm amino của glucosamine là khoảng 6,3 nên chitosan tích điện tích dương tốt nhất ở pH 4,5 Điều này tạo điều kiện

thuận lợi cho tương tác tĩnh điện giữa chitosan và các phân đoạn hạt chất béo trên màng mang điện tích âm Phương pháp khả thi này có thể được đưa vào sản xuất công nghiệp để loại bỏ lipid trong whey phomat Phương pháp này chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lực ion, pH, lượng chitosan, kích thước hạt dầu cũng như loại dầu sử dụng Một số tác giả cho rằng khi bổ sung hàm lượng NaCl nhất định có thể giảm lượng chitosan cần thiết [21]

1.2.4 Ứng dụng chitosan và chitin để làm sạch nước

Ngày nay vấn đề sinh thái và vấn đề sức khỏe liên quan rất nhiều đến nguồn nước, thế nhưng nguồn nước đang bị ô nhiễm nặng bởi các kim loại nặng và các thuốc trừ sâu Do đó, cần có một nền công nghiệp xử lý nước, tinh sạch nước để tạo ra nguồn nước sạch cung cấp cho các nhu cầu của con người Các phương pháp truyền thống loại bỏ kim loại từ nguồn nước thải công nghiệp vừa không hiệu quả vừa tốn kém, đặc biệt khi kim loại chỉ tồn tại ở nồng độ thấp [21], [73]

Kỹ thuật “kẹp” kim loại là một kỹ thuật có thể dùng để thu lấy các ion kim loại trong nước thải Các polymer sinh học vừa an toàn với môi trường vừa có giá trị thương mại Các polymer này có khả năng làm giảm nồng độ các kim loại chuyển tiếp xuống hàng tỉ lần Các polymer này có các nhóm chức năng khác nhau như nhóm hydroxyl và nhóm amino, các polymer này được sử dụng để làm tăng hiệu quả thu hút các ion kim loại Chitosan được dùng như một công cụ trong công nghiệp xử lý nước thải do chitosan có tính hấp thu kim loại rất cao Khả năng tạo phức hợp với ion kim loại của chitin và chitosan đã được khai thác ở Nhật trong công nghiệp xử lý nước thải Nhóm -NH2 của chitosan rất được quan tâm do nhóm này có khả năng tạo nên liên kết đồng hóa trị phối trí với các ion kim loại Bột chitosan và màng mỏng sấy khô dễ dàng tạo phức hợp với kim loại hơn do chitosan ở dạng này phơi bày ra nhiều nhóm amino

tự do

Giá trị thương mại của chitosan càng được thấy rõ hơn khi Sở bảo vệ tài nguyên môi trường Mỹ đã sử dụng chitosan trong công nghiệp tinh sạch nước uống lên mức tối

đa 10mg/lít Ngoài ra, Muzzarelli và cộng sự đã cho thấy dẫn xuất N-carboxymetyl chitosan cũng có hiệu quả trong việc loại bỏ chì và cadmium trong nước uống Một nghiên cứu khác cho thấy chitosan có khả năng liên kết mạnh với kim loại đồng và vanadium Tuy nhiên, khi hàm lượng đồng từ 10 đến 100 ppm thì carboxymetyl chitosan và resin trao đổi ion hấp thụ tốt hơn so với chitosan Chitosan còn có khả năng loại bỏ polychlorinated biphenyl (PCB) từ nguồn nước sông, suối bị ô nhiễm Thome

và Daele đã chứng minh rằng chitosan có hiệu quả tốt hơn so với than hoạt tính trong việc loại bỏ PCB từ các nguồn nước bị ô nhiễm

Bên cạnh chitosan có nhóm amino gắn trên mạch có khả năng liên kết với nhiều kim loại khác nhau, thì một số dẫn xuất tan trong nước của chitosan cũng được biết là

có khả năng liên kết rất tốt với các ion kim loại nặng như Sn2+, Sn4+, Hg2+, Pb2+, U6+;

và các ion kim loại chuyển tiếp như Cd2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, V4+… Khả năng hấp thụ các kim loại này của chitosan và các dẫn xuất thường phụ thuộc vào kích thước phân tử

và số lượng chitosan và dẫn xuất có trong vật liệu hấp thụ Ngoài ra khả năng hấp thụ còn phụ thuộc vào nồng độ các ion kim loại cần được loại bỏ [21], [35], [46]

Hình 1.6 Phân tử chitosan “kẹp” ion Niken

1.2.5 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất trong công nghiệp chế biến thịt

Các sản phẩm thịt rất dễ bị mất hương vị và có mùi hôi, nguyên nhân là do sự oxy hóa các lipid không no có rất nhiều trong thịt Gia cầm và thịt qua chế biến thường không còn giữ được hương vị tự nhiên của thịt Các nghiên cứu của Darmadji và Izuminoto cho thấy hiệu quả của chitosan khi xử lý trên thịt bò Kết quả cho thấy khi

bổ sung chitosan 1% làm giảm 70% trị số acid 2-thiobarbituric (TBA) của thịt sau 3 ngày dự trữ ở 40C St Angelo và Vercellotti nghiên cứu N-carboxymetyl chitosan cũng

có hiệu quả ngăn cản Warmed-over flavour (WOF) trong thịt chưa qua chế biến Các tác giả này cho rằng N-carboxymetyl chitosan có hiệu quả kiểm soát WOF trong khoảng nhiệt độ rất rộng Khi sử dụng N-carboxymetyl chitosan nồng độ 5000 ppm xử

lý trên thịt bò thì kết quả kìm hãm 93% TBA và làm giảm 99% hàm lượng hexanal trong sản phẩm Quá trình kìm hãm này xảy ra liên quan đến khả năng “kẹp” các kim loại tự do được giải phóng từ phân tử hemoprotein của thịt trong suốt quá trình đun nóng Qua đó sẽ kìm hãm hoạt tính xúc tác của các ion sắt Các kết quả càng được khẳng định hơn khi Li và cộng sự nghiên cứu thấy rằng N-carboxymetyl chitosan ở nồng độ 3000ppm xử lý trên thịt lợn đã nấu chín sẽ ngăn cản được đáng kể sự oxy hóa gây hôi thối sản phẩm Weist và Karel còn chứng minh tính khả thi khi sử dụng bột chitosan trong bộ phận cảm biến huỳnh quang để kiểm soát sự oxy hóa lipid trong sản phẩm thịt Các nhóm amino sơ cấp của chitosan hình thành nên các hạt hình cầu huỳnh quang ổn định khi liên kết với các aldehyde dễ bay hơi như malondiadehyde, một loại aldehyde tạo ra từ sự phân hủy chất béo [21]

1.2.6 Ứng dụng chitin và chitosan để cố định enzyme

Một trong các phương pháp cố định enzyme là phương pháp nhốt các phân tử enzyme trong một pha riêng biệt, tách khỏi pha chính mà khi đó vẫn có sự trao đổi giữa hai pha này Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để cố định enzyme như

tạo liên kết đồng hóa trị, liên kết tĩnh điện, đồng polymer hóa, tương tác kị nước và đóng gói trong các vi hạt Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị với một polymer không tan như cellulose, chitin và chitosan Enzyme cố định có nhiều ưu điểm như có thể tái sử dụng, ổn định và thích hợp cho việc xúc tác với quy mô công nghiệp [21]

Sự cố định các enzyme như α-amylase, β-amylase, γ-amylase và amylo glucosidase trên chitosan của các loài nhuyễn thể được hoạt hóa bằng formaldehyde Synowiecki đã đưa ra được cơ chế của quá trình cố định các enzyme trên Ông cho rằng ban đầu là quá trình hình thành nên dạng mất nước của formaldehyde do formaldehyde liên kết với nhóm -NH2 tự do của chitosan tạo nên dạng base Schiff và dẫn xuất dihydroxymetyl của aldehyde Sau đó, các base Schiff này có khả năng cố định các enzyme bằng các phản ứng với các nhóm chức năng của enzyme, từ đó hình thành nên cầu nối metylen Trong một nghiên cứu tương tự của Han và Shahidi cho thấy protease vẫn giữ được 20-29% hoạt tính khi được cố định trên chitin được hoạt hóa bởi glutaraldehyde Braun còn nghiên cứu khả năng cố định penicillin G acylase trên các dạng chitosan khác nhau như dạng hạt to, hạt vừa và dạng bột mịn Kết quả nhận thấy hoạt tính enzyme giữ được 40% đối với dạng hạt to, 93% đối với dạng hạt vừa và giữ được 100% hoạt tính đối với dạng bột mịn [21], [35]

1.2.7 Chitin oligomer và chitosan oligomer ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Ngày nay, các nghiên cứu tạo ra chitin oligomer và chitosan oligomer vẫn còn thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học Do chitin oligomer và chitosan oligomer có những hoạt tính sinh học rất tốt nên có khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ thực phẩm và dược phẩm, trong đó có hoạt tính chống khối u, hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch, có hiệu quả ngăn cản một số bệnh truyền nhiễm ở chuột, hoạt tính kháng nấm bệnh và hoạt tính kháng khuẩn [21]

Có hai phương pháp thủy phân chitin và chitosan thường dùng để tạo ra chitin oligomer và chitosan oligomer là phương pháp thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme Phương pháp thủy phân bằng các acid vô cơ thường tạo ra một lượng lớn chủ yếu là các phân đoạn từ monomer đến trimer Còn các phân đoạn có DP (degree of polymerization) cao hơn như từ tetramer đến heptamer thì tạo ra rất ít, trong khi đó các phân đoạn này lại là các phân đoạn có hoạt tính sinh học mạnh Trái với phương pháp thủy phân bằng acid, phương pháp thủy phân chitin và chitosan bằng các enzyme như chitinase, chitosanase, lysozyme và cellulase cho phép tạo ra các oligomer có DP cao hơn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau Các phương pháp tạo chitin oligomer

và chitosan oligomer đã được các nhà nghiên cứu trình bày cụ thể ở trong nhiều nghiên cứu và đã được công bố khoa học [12], [21], [87]

Khi nghiên cứu các đặc tính chức năng của chitin oligomer và chitosan oligomer, các nhà nghiên cứu thấy rằng các đặc tính này phụ thuộc rất nhiều vào DP Kết quả của nhiều nhà nghiên cứu cho rằng các oligomer có DP từ 5-6 sẽ có những đặc tính chức năng tốt hơn khi so với các oligomer có DP thấp hơn [21]

Các nghiên cứu trên hoạt tính chống lại các khối u ung thư của chitin oligomer

và chitosan oligomer thấy rằng các oligomer này kìm hãm sự phát triển của tế bào khối

u bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch Suzuki và cộng sự khi nghiên cứu trên acetyl chitooligosaccharide thấy rằng các DP từ 4-7 sẽ thu hút sự đáp ứng mạnh mẽ với các tế bào dịch tiết màng bụng ở chuột BALB/c, trong khi đó các DP từ 2-4 thì lại không có đặc tính như vậy Suzuki còn cho thấy các chitin oligomer DP 6 và chitosan oligomer DP 6 có hiệu quả kìm hãm sự phát triển của khối u trong hệ thống đồng sinh

N-và dị sinh ở chuột, gồm các khối u 180 N-và khối u MM46 Còn đối với tác giả Tokoro thì cho rằng các oligomer này cũng có hoạt tính kìm hãm sự phát triển của khối u Meth-A được cấy ghép vào trong BALB/c của chuột Cơ chế kháng khối u được thừa nhận là cơ chế làm tăng cường sự tạo ra lymphokine, bao gồm interleukin-1 và interleukin-2 Thông qua quá trình tạo nhiều tế bào lympho T sẽ làm tăng hiệu quả

kháng khối u Tsukada còn cho rằng (GlcNA)6 có hiệu quả đáng kể kháng lại sự di căn của tế bào ung thư biểu mô ở chuột Cơ chế kháng tế bào khối u của các oligomer còn được các nhà khoa học cho là các oligomer này sẽ tăng cường hoạt tính của các tế bào lympho T độc bằng cách làm tăng nhanh sự biệt hóa tế bào T giúp một cách đáng kể và song song đó cũng làm giảm hoạt tính của các tế bào T tiêu diệt [87]

Chitosan oligomer cũng như chitosan còn có hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số nấm và vi khuẩn đặc biệt là các chủng gây bệnh Hirano và Nagao nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính kìm hãm và DP Kết quả cho thấy chitosan oligomer có

DP 2-8 có hoạt tính kìm hãm sự phát triển các nấm và vi khuẩn tốt hơn so với chitosan

có trọng lượng phân tử cao hơn Còn theo Uchida, các oligomer có trọng lượng phân tử tương đối cao, chỉ mới qua thủy phân nhẹ bằng chitosanase, thì lại có hoạt tính kháng

cả nấm lẫn vi khuẩn tốt hơn so với chitosan và oligomer có trọng lượng phân tử thấp Jeon và Kim nhận thấy rằng trong ba phân đoạn thu nhận được từ hệ thống phản ứng enzyme kết hợp màng siêu lọc thì phân đoạn oligomer có trọng lượng phân tử cao nhất (MW 5000-10.000 Da) có hoạt tính tiêu diệt cả vi khuẩn lẫn nấm tốt nhất [21], [87] Kết quả của các tác giả này khác nhau bởi vì chitosan ban đầu sử dụng trong nghiên cứu của các tác giả này không giống nhau

1.2.8 Ứng dụng trong mỹ phẩm và da nhân tạo

Chitosan là một polycation tự nhiên có khả năng tạo thành dạng nhớt khi hòa tan trong môi trường acid nhẹ Đặc tính này được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực mỹ phẩm, đặc biệt như các sản phẩm làm tóc, các tác nhân làm se và khô lại, xà bông và dầu dưỡng tóc Chitosan còn là một vật liệu “vá ghép” tự nhiên Tức là ở đây, ngoài hoạt tính kháng khuẩn thì chitosan còn có khả năng giúp cho vết thương vô trùng, do

đó hỗ trở cho quá trình làm lành vết thương, biểu hiện hoạt tính sinh học của chitosan Ngoài ra, chitosan còn đóng một vai trò trực tiếp trong quá trình lành vết thương của động vật hữu nhũ bằng cách kích thích các tế bào bạch cầu đa nhân

Chitosan còn là tác nhân làm tăng khả năng thực bào, nhờ vậy các vi khuẩn gây bệnh bị tiêu diệt ở mức độ tế bào Các sản phẩm chitosan được ứng dụng trong y sinh học gồm có găng tay, vải và băng sinh học [27], [46]

1.2.9 Ứng dụng trong dẫn truyền và phóng thích thuốc

Ngoài những đặc tính ưu việt được ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm như tính tương thích sinh học và rất ít độc tính, thì chitosan và các dẫn xuất còn có khả năng tự hủy sinh học, trao đổi chuyển hóa với một số enzyme của người, đặc biệt là lysozyme

Do có những tính chất này, trong những năm gần đây chitosan và các dẫn xuất đã bắt đầu được ứng dụng trong việc dẫn truyền và giải phóng thuốc Ngoài ra, một tính chất quan trọng mà các dẫn xuất chitosan có được là khả năng tan trong nước và mang điện tích dương, nhờ đó các dẫn xuất này tương tác với các polymer, đại phân tử mang điện tích âm và polyanion trong môi trường nước

Chitosan và các dẫn xuất chitosan như N-trimetyl chitosan và N-carboxymetyl chitosan đều có những đặc tính chuyên biệt có khả năng bám dính vào bề mặt của màng nhầy, do đó được ứng dụng trong việc vận chuyển và phóng thích thuốc ở một số màng nhầy [47]

Một số nghiên cứu cũng liên quan đến sự dẫn truyền và giải phóng thuốc nội bào của các dẫn xuất chitosan được dùng trong liệu pháp gen Một trong những dẫn xuất được ứng dụng để đóng gói và phóng thích DNA là dẫn xuất N-alkyl chitosan, đặc biệt là dẫn xuất dodecyl-chitosan Hiệu quả biến nạp khi sử dụng N-alkyl chitosan được cho là do quá trình xâm nhập vào tế bào thuận lợi hơn, hiệu quả hơn nhờ các tương tác kị nước Các chất vận chuyển N-alkyl chitosan cũng có thể dễ dàng phóng thích DNA do giữa DNA và N-alkyl chitosan chỉ tương tác với nhau bằng tương tác tĩnh điện yếu

Dẫn xuất chitosan liên kết kị nước với acid deoxycholic, một thành phần chính trong acid mật, có khả năng tự gắn kết với các đại phân tử được dùng trong hệ thống

Hiện nay, chitosan và các dẫn xuất của chitosan có tiềm năng rất lớn, được sử

dụng như những tác nhân kháng vi sinh hiệu quả và không đắt tiền Một trong những nhóm dẫn xuất rất được quan tâm hiện nay là nhóm dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan Có rất nhiều công bố của các nhóm nghiên cứu, trong đó kết quả mà nhóm nghiên cứu của giáo sư W H Daly đã cho thấy nhóm amonium bậc bốn trên phân tử chitosan đóng vai trò then chốt trong hoạt tính kháng vi sinh của nhóm dẫn xuất này Ngoài ra, chitosan và các dẫn xuất cũng đang được nghiên cứu trong lĩnh vực kỹ thuật

mô, chuyển gen [27], [47], [65]

1.3 Một số dẫn xuất của chitosan

1.3.1 Dẫn xuất chitosan gắn với đường

Hall và Yalpani là những tác giả đầu tiên tạo dẫn xuất đường với chitosan theo phương pháp khử nhóm N-alkyl của chitosan bằng sodium cyanoborohydride và các loại đường khác nhau Chitosan có thể thực hiện phản ứng với các loại aldehyde, monosaccharide và disaccharide như glycolaldehyhde, D,L-glyceraldehyde, D-ribose, D-arabinose, D-xylose, 2-deoxy-D-ribose, D-glucose, 2-deoxy-D-glucose, 3-O-Me-D-

glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose, L-rhamnose, GlcNAc (Hình 1.7 và 1.8)… Lúc ban đầu, dẫn xuất chitosan gắn với đường chủ yếu dành cho nghiên cứu lưu biến học, nhưng từ khi phát hiện các loại đường có khả năng nhận biết đặc hiệu tế bào, virus

và vi khuẩn thì dẫn xuất này được sử dụng trong các nghiên cứu tế bào [73]

Morimoto và cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn xuất chitosan với các loại đường như D,L-fucose và thấy rằng có những phản ứng đặc hiệu giữa dẫn xuất này với lectin và tế bào Strendaska và cộng sự tổng hợp dẫn xuất chitosan với đường lactose ứng dụng trong chữa các bệnh sụn khớp cũng với phương cách tương tự

Kato cũng tổng hợp dẫn xuất lactoaminated-N-succinylchitosan và dẫn xuất flourescein thiocarbanyl để ứng dụng làm chất vận chuyển thuốc chuyên biệt đến gan của chuột thông qua thụ quan asialoglycoprotein Hơn nữa, lactoaminated-N-succinylchitosan cũng được cho là một chất vận chuyển thuốc cho mitomycin C trong điều trị bệnh ung thư di căn ở gan

Galactosylated chitosan được tổng hợp từ acid lactobionic và chitosan với etyl-3-(3-dimetyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) và N-hydroxy succinimide (NHS) cho thấy khả năng như một chất nền ngoại bào tổng hợp dùng để liên kết với các tế bào gan Ngoài ra, khi galactosylated chitosan được gắn thêm polyetylen glycol (PEG) hoặc polyvinyl pyrrolidone (PVP) và dextran cũng trở thành các chất vận chuyển DNA đến tế bào gan Bởi vì, PEG làm giảm kích thước phân tử của phức hợp và PVP có khả năng ngăn chặn albumin phản ứng với phức hợp [73]

1-1.3.2 Dẫn xuất N-aryl chitosan

Bên cạnh N-alkyl chitosan, là một dẫn xuất quan trọng của chitosan đã được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới quan tâm, dẫn xuất N-aryl chitosan vẫn chưa được nghiên cứu nhiều N-aryl chitosan cũng được hình thành thông qua dạng base Schiff từ phản ứng giữa nhóm amino của chitosan với nhóm aldehyde của aldehyde thơm trong môi trường acid yếu Sau đó base Schiff được khử bởi sodium borohydride (sự khử Borch) để tạo thành dẫn xuất N-aryl chitosan Phản ứng ở hình 1.9 [77], [78], [79]

Hình 1.8 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất lactose-chitosan

1.3.3 Dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì nhóm dẫn xuất amonium bậc bốn là một nhóm dẫn xuất của chitosan có hoạt tính sinh học rất ưu việt Nhóm dẫn xuất này có nhiều hoạt tính sinh học rất cao là do trong phân tử có chứa nhóm nitơ bậc bốn (-N+) Trong nhóm này, dẫn xuất đơn giản nhất là muối trimetyl amonium của chitosan Dẫn xuất này được tạo thành do phản ứng giữa chitosan với sodium iod (NaI), metyl iod (CH3I) và sodium hydroxide (NaOH) trong môi trường có sự hiện diện của N-metyl-2-

Hình 1.9 Tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan

base Schiff

pyrrolidone (NMP) Sau đó sử dụng phản ứng trao đổi ion I- bằng Cl- từ đó tạo ra sản phẩm ở dạng bền hơn Phản ứng được minh họa như hình 1.10 [12], [46], [77], [78]

Lang và cộng sự đã sử dụng glycidyl trimetyl amonium cloride làm tác nhân phản ứng để tổng hợp nên muối amonium bậc bốn của chitosan Trong một nghiên cứu tiếp theo, H Daly và Guerrini đã cải tiến phương pháp bằng cách sử dụng Quat-188 [(3-cloro-2-hydroxyl) propyltrimetyl amonium cloride] để tổng hợp nên các dạng dẫn xuất tương tự (Chit-Quat), phản ứng này còn được gọi là phản ứng base bậc bốn hóa chitosan và được minh họa như hình 1.11

Hình 1.10 Phản ứng giữa chitosan và metyl iod tạo dẫn xuất trimetyl chitosan

Muối trimetyl amonium iod của chitosan

Trao đổi ion

Muối trimetyl amonium clorua của chitosan

Hình 1.11 Phản ứng giữa chitosan và Quat 188 tạo dẫn xuất chitsan-Quat 188

Glycidyl trimetylamonium

cloride

Không chỉ có chitosan, chitin cũng có khả năng thực hiện phản ứng amonium bậc bốn hóa để tạo thành dẫn xuất trietylaminoetyl chitin (TEAE-chitin) nhưng trước hết phải có phản ứng hoạt hóa nhóm hydroxyl sơ cấp ở vị trí carbon thứ 6 của N-acetyl-glucosamine Phản ứng hoạt hóa này được tiến hành ở nhiệt độ thấp (0oC) giảm đến mức tối thiểu sự deacetyl hóa không mong muốn [46] Chitin sau khi được hoạt hóa được phản ứng với dietylaminoetyl cloride, dạng muối trung gian (DEAE-chitin) tạo thành tiếp tục được amonium bậc bốn hóa bằng etyl iod (CH3CH2I) Phản ứng được minh họa như hình 1.12

Các dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan và chitin đều cho thấy khả năng hòa tan tốt ngay cả trong môi trường pH trung tính và base Tuy nhiên theo nhiều nhóm nghiên cứu, trong đó có nhóm nghiên cứu của tác giả H Daly, cho rằng hoạt tính sinh học của nhóm dẫn xuất này chỉ biểu hiện tốt nhất trong môi trường acid

1.3.4 Dẫn xuất carboxyalkyl của chitosan

Phản ứng carboxyakyl hóa chitosan là phản ứng gắn nhóm acid (R-COOH) vào mạch chitosan Do chitosan có sẵn các nhóm amino (-NH2) nên các dẫn xuất carboxyalkyl chitosan là các dẫn xuất lưỡng tính Đương nhiên các dẫn xuất này cũng

sẽ có một điểm đẳng điện (pI) như các phân tử polypeptide lưỡng tính, và tại điểm đẳng điện thì các phân tử lưỡng tính đều sẽ không mang điện tích và không hòa tan được Các dẫn xuất này sẽ hòa tan trong nước khi pH của dung dịch lớn hơn hoặc nhỏ

Hình 1.12 Phản ứng giữa chitin và DEAE-cloride tạo dẫn xuất TEAE-chitin

Hình 1.13 Dẫn xuất N và O carboxylalkyl chitosan

hơn so với pI Để tổng hợp được dạng N-carboxyalkyl chitosan và dạng carboxyalkyl chitosan người ta sử dụng các điều kiện phản ứng khác nhau để có được phản ứng chọn vị trí N hay vị trí O Phản ứng được minh họa như hình 1.13 [21], [46]

O-Ngoài ra còn có một con đường tổng hợp nên N-carboxyalkyl chitosan bằng cách sử dụng một carboxyaldehyde làm tác nhân khử nhóm amino trên chitosan Phản ứng được thực hiện ở các điều kiện đồng nhất, aldehyde được sử dụng phải tan tốt trong nước, phản ứng sẽ cho hiệu suất cao và các nhóm thay thế phân bố đều trên chuỗi chitosan Tuy nhiên nếu mức độ thay thế quá cao sẽ dẫn đến sự hình thành dẫn xuất bis-carboxymetyl chitosan như trong trường hợp sử dụng acid glyoxylic (Hình 1.14)

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-carboxymetyl chitosan

base Schiff