ỨNG DỤNG CỦA ACETOBACTERIUM VỀ VIỆC TẠO MÀNG BACTERIAL CENLLULOSE TRONG Y HỌC

LỜI MỞ ĐẦUMàng sinh học Bacterial cellulose; Biocellulose; BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ỨNG DỤNG CỦA ACETOBACTERIUM

VỀVIỆC TẠO MÀNG BACTERIAL

CENLLULOSE TRONG Y HỌC

GVHD: NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

SV thực hiện:Nhóm 10

Lê Thị Ngọc Hạnh 2008100025 Nguyễn Đức Huy 2008100011 Đoàn Thành Duy 2008100058

Lớp: 01DHSH1

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH

PHỐ

HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI

TRƯỜNG

ỨNG DỤNG CỦA ACETOBACTERIUM VỀVIỆC TẠO MÀNGBACTERIAL

CENLLULOSE TRONG Y HỌC

GVHD: NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

SV thực hiện:Nhóm 10

Lê Thị Ngọc Hạnh 2008100025 Nguyễn Đức Huy 2008100011 Đoàn Thành Duy 2008100058

Lớp: 01DHSH1

TP.HCM, ngày 13 tháng 12 năm 2011

LỜI MỞ ĐẦU

Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…Do vậy, chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc

Trên thế giới, màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người

Chủng A xylinum có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A xylinumcó khả năng ứng dụng để tạo ra màng trị

bỏng cho thỏ là cơ sở để trị bỏng cho người

Hình 1.Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylium

MỤC LỤC

1 Đại cương về vi khuẩn Acetobacter xylinum -5

1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của A Xylinum -5

1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A Xylinum -6

2 Màng Bacterial Cenllulose (BC) -7

2.1 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng -7

2.1.1 Bỏng -8

2.1.2 bỏng với các nghiên cứu trên thỏ -8

2.2 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum -9

2.2.1 Quá trình hình thành màng cenllulose từ Acetobacter xylinum -8

2.2.2 Đặc điểm màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum -12

3 Các nghiên cứu liên quan đến màng BC -12

3.1 Trong lĩnh vực thực phẩm -12

3.2 Dùng màng BC làm màng lọc vi sinh -13

3.3 Các ứng dụng khác -13

Kết luận chung -17

Tài liệu tham khảo -18

NỘI DUNG

1 Đại cương về vi khuẩn Acetobacterxylinum:

1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của A Xylinum

Acetobacterxylinumtên khác là

Gluconoacetobacter xylium A.xylinum là một

mesophile không gây bệnh được xác định bởi

A.J.Brown vào năm 1886

Lĩnh giới: Bacteria - Haeckel, 1894) C.r Woese Et

Al., 1990

Giới: Bacteria - (Cohn, 1870) Cavalier-Smith, 1983 Ex Cavalier-Smith, 2002

Ngành: Proteobacteria - Garrity Et Al., 2005

Lớp: Alphaproteobacteria - Garrity Et Al., 2006

Bộ: Rhodospirillales - Pfennig & Triiper, 1971

Họ: Acetobacteraceae - Pribram, 1929 Ex Gillis & De Ley, 1980, Nom Rev.

Chi: Acetobacter

Loài: xylinum

Tên khoa học - Acetobacter xylinum

Tên gọi khác

1. Acetobacter aceti xylinum (Brown 1886) De Ley and Frateur 1974

2. Acetobacter aceti xylinus (Brown 1886) De Ley and Frateur, 1974

3. Acetobacter aceti xylinus corrig (Brown 1886) De Ley and Frateur, 1974

4. Acetobacter Xylinum

5. Acetobacter xylinus (Brown 1886) Yamada 1984

6. Acetobacterium xylinum (Brown 1886) Ludwig 1898

7. Bacillus Xylinus

8. Bacillus xylinus (Brown 1886) Trevisan 1889

9. Gluconacetobacter xylinus xylinus (Brown 1886) Yamada Et Al 1998

Hình 2.Acetobacterxylinum

A.xyliumcó dạng hình que dài khoảng 2µm,thẳng hay hơi cong, đứng

riêng lẻ hoặc sắp xếp thành chuỗi và có khả năng di chuyển di chuyển nhờ tiên mao hay không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường

Hình 3.Kết quả nhuộm Gram của A Xylinum

Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt

2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, chủ yếu là chuyển hóa glucose

mà nó sử dụng trong tổng hợp cellulose

1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A Xylinum:

A.xylium có khả năng tạo ván hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc

nhuộm Iod và H2SO4.

A.xylium sinh trưởng trong môi trường có pH < 5, to khoảng 28-32oC Nhiệt

độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid

acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của A.xylium

Chúng có thề tích lũy 4.5% acid acetic Nhưng khi lượng acid acetic vượt quá

mức cho phép sẽ quay ngược lại làm ức chế hoạt động A.xylium.

Acetobacter xylium hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy

Trong tế bào vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào Khi đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với

một enzyme Enzyme này có thề là polymer chuyển hóa glucose thành cellulose

Acetobacter xylium tạo nên lớp cellulose dày là môi trường nuôi cấy

nước dừa có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A xylinum :

Vi khuẩn Acetobacter xylinum cho phản ứng tacalase(chỗ này cô khoanh tròn nói sai rùi nè)dương tính, có khả năng oxi hóa tiếp tục ethanol thành acid acetic,

CO2 và H2O Ngoài ra, vi khuẩn Acetobacter xylinum còn có thể chuyển hóa glucose thành acid, glyxerol thành dihydroxyaceton và tổng hợp cenllulose (cellulose tinh khiết như là một sản phẩm ngoại bào)

CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH DANH TRONG SÁCH THỰC HÀNH VI SINH ẤY BI, CỦA GLUCONOBACTER…

4.5- Chi Acetobacter

DD-Không oxy hoá acid DL-lactic tới CO

2và H2O

Lên men xenlullose

2 Màng Bacterial Cenllulose (BC):

Màng Bacterial Cenllulose (BC): là lớp màng đặc do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo nên trên bề mặt môi trường có bản chất là hemicenllulose

Hemicenllulose là những polysaccharide không hòa tan vào nước nhưng hòa tan trong dung dịch kiềmtính

Về mặt cấu trúc, BC có cấu trúc dạng bó sợi đan xen lẫn nhau Mỗi sợi rộng khoảng 100nm và dày 3-8 nm Đường kính của BC là nhỏ hơn so với tự nhiên và sợi nhân tạo

Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy đặc trưng Tùy thuộc vào yêu cầu ứng dụng mà ta chọn điều kiện nuôi cấy tĩnh hay động

Bacterial Cenllulose (BC) sản xuất bởi Acetobacter xylinumcó đặc tính cấu trúc

và cơ học rất giống với cenllulose thực vật, kết hợp với khả năng tạo màng có độ bền, chắc và dai nên được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực

2.1 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng:

Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm,

bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc

và không gây dị ứng Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, công nghiệp

2.1.1 Bỏng:

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và

sinh hoạt hằng ngày Ngoài tổn thương da, trường hợp

bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại di chứng

nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của

người bệnh

Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến.Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng… Từ năm 2000,nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn

Thanh và cộng sự đã có một sốcông trình nghiên cứu về màng BC từ A xylinum và

bước đầu nghiên cứu vềcác đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam

Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt

và biểu mô hóa hình thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật

Bỏng là một chấn thương đòi hỏi công tác điều trị dài ngày, nhiều mặt và chi phí điều trị rất tốn kém Hiện nay, người ta có nhiều dược phẩm để điều trị bỏng như Madecassol, Polyvinyl, Polymethan… Trong đó, những công trình nghiên cứu điều trị bỏng tạo các chế phẩm màng sinh học như màng ối, da lợn, màng da ếch… đã

được chứng minh có hiệu lực tốt Màng sinh học từ sản phẩm của A.xylinum có

mang chất tái sinh mô chứa dầu mù u ở qui mô pilot Màng được đem thử nghiệm

invitro trên thỏ thực nghiệm, từ đó đưa ra thị trường sản phẩm màng sinh học điều trị bỏng và các tổn thương về da có hiệu quả điều trị cao và có giá trị kinh tế từ

A.xylinum.

2.1.2.Bỏng với các nghiên cứu trên thỏ:

Ứng dụng sản phẩm lên men của Acetobacter xylinum làm

màng cenllulose vi khuẩn tẩm dầu mù u có tác dụng sinh học trong điều trọ thỏ gây bỏng thực nghiệm Vết bỏng của thỏ gây bỏng nông thực nghiệm lành sau 22 ngày điều trị bằng màng sinh học tẩm dầu mù u so với lô thỏ dùng gạc tẩm dùm mù u và so với

lo chứng dương đều là sau 29 ngày Tiến trình làm lành vết bỏng của màng sinh học tẩm dầu mù u tốt hơn so với gạc tẩm dầu mù u Các vết bỏng dần dần thu hẹp diện tích, sạch, khô và không bị nhiễm trùng Màng sinh học tẩm dầu mù u có nguồn gốc

vi khuẩn ngăn không cho vết thương nhiễm trùng và giúp vết thương mau lành Kết quả nghiên cứu này cho phép tiến hành những nghiên cứu sâu hơn về màng cenllulose vi khuẩn tẩm dầu mù u thu được nhờ quá trình nuôi cấy vi khuẩn

Acetobacter xylinum để hoàn thành hồ sơ nghiên cứu và đưa ra thị trường sản phẩm

màng sinh học tẩm dầu mù u

Như vậy, dùng màng BC tẩm dầu mù u cho kết quả tốt nhất khi điều trị bỏng độ II nông

Acetobacter xylinum có tác dụng điều trị bỏng Màng có kích thước 10x10 cm,

màu sắc trắng trong, không mùi, đạt về mặt cảm quan Kết quả thử nghiệm tác dụng sinh học in vitro của màng trên thỏ gây phỏng thực nghiệm:

• Màng sinh học tẩm glycerol có tác dụng điều trị bỏng, làm lành vết thương sau 29 ngày

• Màng sinh học tẩm dầu mù u cho kết quả tốt hơn, làm lành vết thương sau

22 ngày

• So sánh với lô dùng gạc tẩm dầu mù u và Madecassol: lô dùng gạc tẩm dầu mù u tiến triển tốt hơn nhưng hơi chậm so với dùng màng BC tẩm dầu mù u

• Lô Madecassol làm vết thương khô hơn, hoại tử khó bong, chậm hơn, đến

29 ngày mới thấy diện tích co bằng ngày 22 của màng BC tẩm dầu mù u

2.2 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum:

Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất cónguồn gốc

từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng

2.2.1.Quá trình hình thành màng cenllulose từ Acetobacter xylinum

Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum

Glu: glucose

G6P: glucose-6-phosphat

PGM: phosphoglucoemutase

PGA: phosphogluconic acid

FHK: fructose hexokinas

F6P: fructose -6-phosphat

F1P: fructose -1-phosphat

FDP: fructose -1,6-phosphat

GHK: glucose hexokinas

G1P: glucose -1-phosphat UGP: UDP glucose pyro-gluco - 6 - phosphat

PGI: phosphoglucose isomerase Frc: fructose

1PFK: fructose-1-phosphate kinas PTS: phosphotranfer system G6PD: glucose-6-phosphate dehydrogenase

Hình 4 Quá trình tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum

Trong môi trường nuôi cấy Acetobacter xylinum thì các sợi nhỏ phát triển càng

dài

Các tế bào Acetobacter xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện

quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ màng đường glucose, kết hợp đường với một acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế ào Tiền chất này tiết

ra ngoài nhờ 1 hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thế pholyme hóa glucose thành cenllulose

Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn

Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng Vì nếu thu sớm, độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC Ngược lại, nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng, màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào

Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lớn các tế bào

liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dịch thể Vì vậy, việc nghiên

cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng

để thu được màng BC với năng suất cao nhất

Trong quá trình lên men, các vi khuẩn Acetobacterium xylinumđã chuyển động

hỗn loạn không theo quy luật nên cấu trúc mạng polysaccharide đan xen vào nhaunhau rất chằng chịt theo mọi phía, sắp xếp không theo trật tự Vì vậy, nó tạo nên tính dai, bền, chắc về mọi phía của màng

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A Xylinumhình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi

nhữngbó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose haymàng BC

Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopyranose mạchthẳng Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấutrúc và đặc tính lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạothành

sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợilớn hơn- sợi

vĩ mô (microfibril), những sợi này kếthợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm Những dải ribbonđược kéo

ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khácbằng liên kết hiđro hoặc lực vandecvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay mộtlớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của

PC, chỉ số kếttinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ họccao, khả năng hấp thụ nước lớn

Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A xylinum được nghiên cứu đầutiên

bởi Brown năm 1886 Nó được thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX,những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc vàđặc tính của cellulose

3 Các nghiên cứu liên quan đến màng BC:

3.1 Trong lĩnh vực thực phẩm:

Vi khuẩn Acetobacterium xylinumcó bao nhầy cấu tạo bởi cenlullose, người ta

dùng vi khuẩn này để nuôi cấy trên nước dừa để tạo ra thạch dừa, nên gọi là