ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

TÓM TẮT Đề tài : “Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp PRRSV trên heo” được thực hiện từ ngày 16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN

VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2005 – 2009

Sinh viên thực hiện : LĂNG VĂN ĐỨC

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN

VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI LĂNG VĂN ĐỨC

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

 Chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt giúp

Chị Đặng Ngọc Thuỳ Dương và chị Lê Thị Kim Phượng đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 31 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận

 Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Thủ Đức, tháng 08 năm 2009

Lăng Văn Đức

TÓM TẮT

Đề tài : “Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) trên heo” được thực hiện từ ngày 16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, tại Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh Học và Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm đánh giá khả năng phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo giữa phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR

để lựa chọn phương pháp thích hợp trong xét nghiệm virus PRRS

Mẫu máu được thu thập trên các heo có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS được chiết lấy huyết thanh để ly trích RNA của virus Quy trình RT-PCR được dùng để phát hiện RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập Sử dụng quy trình nested RT-PCR phát hiện RNA của virus PRRS và phân biệt hai kiểu gene virus trên các mẫu vắc-xin và mẫu thu thập.Thiết lập quy trình so sánh khả năng phát hiện RNA của virus PRRS giữa hai phương pháp này

Khi sử dụng phương pháp RT-PCR đã phát hiện được 12/20 mẫu có kết quả dương tính và 8/20 mẫu có kết quả âm tính Với phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện được 18/20 mẫu có kết quả dương tính và 2/20 mẫu có kết quả âm tính trong những mẫu xét nghiệm Trong đó, có 2/18 mẫu nhiễm dòng châu Âu, 10/18 mẫu nhiễm dòng Châu Mỹ và 6/18 mẫu nhiễm cả hai dòng Khi so sánh độ nhạy của hai phương pháp trên mẫu huyết thanh pha loãng thì phương pháp RT-PCR phát hiện được RNA của virus ở độ pha loãng từ 100 đến 10-5, còn phương pháp nested RT-PCR phát hiện được ở độ pha loãng từ 100 đến 10-8 Tám mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR, được kiểm tra bằng nested RT-PCR cho kết quả 6/8 mẫu dương tính

Độ nhạy của phương pháp nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS cao hơn hẳn phương pháp RT-PCR Những mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR nên kiểm chứng lại bằng phương pháp nested RT-PCR

SUMMARY

Thesis: “Using the nested RT-PCR method to detect Porcine reproduction and

respiratory syndrome virus (PRRSV) in swine” had been done from 16/2/2009 to

16/7/2009, at Insitute of Biotechnological and environmental research of Nong Lam

university Ho Chi Minh city to compare of possibility to detect PRRSV in blood swine

between RT-PCR and nested RT-PCR methods to select a suitable method in diagnostic PRRSV

Blood samples taken from swine suspected of PRRSV infection was extracted to serum to prepare RNA of virus The RT-PCR protocol was used to determine RNA of PRRSV in collecting samples The nested RT-PCR protocol was used to determine RNA

of PRRSV and distinguish between the European and the American genotypes of the virus in collecting samples and vaccine samples The comparison procedure was carried out for testing the possibility in detection RNA of PRRSV between these two methods

The RT-PCR method could determine 12 positive samples in 20 samples, whereas the nested RT-PCR method could determine 18 positive samples in 20 samples In the results, there were 2/18 samples infected European strain only, 10/18 samples infected American strain only and 6/18 samples infected boths

In compairing the sensitivity of two methods, the RT-PCR method could determine virus RNA from 100 to 10-5 RNA extract dilution, the nested RT-PCR method could determine virus RNA from 100 to 10-8 RNA extract dilution Eight negative samples of the RT-PCR method were tested again by the nested RT-PCR method and the results showed 6/8 positive samples

In this research, the sensitivity of the nested RT-PCR method was higher than that of the RT-PCR method to detect RNA of PRRSV The negative samples of the RT-PCR method should be tested again by the nested RT-PCR method

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở lợn 3

2.1.1 Giới thiệu 3

2.1.2 Lịch sử bệnh 3

2.1.3 Phân loại, đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS 4

2.1.3.1 Phân loại virus PRRS 4

2.1.3.2 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc virus PRRS 4

2.1.4 Phân kiểu gene của virus 6

2.2 Chẩn đoán 7

2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng 7

2.2.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 7

2.3 Phương pháp RT-PCR 10

2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR 10

2.3.2 Các enzyme sử dụng trong phiên mã ngược 10

2.3.3 Các primer trong phiên mã ngược 11

2.4 Phương pháp nested-PCR 11

2.4.1 Giới thiệu chung về nested-PCR 11

2.4.2 Các bước của nested-PCR 12

2.5 Những nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 13

2.5.1 Trên thế giới 13

2.5.2 Tại Việt Nam 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Đối tượng và số lượng mẫu 15

3.3 Nội dung nghiên cứu 15

3.4 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu và hóa chất sử dụng 15

3.4.1 Thiết bị và dụng cụ sử dụng 15

3.4.2 Vật liệu, kit và hóa chất sử dụng cho RT-PCR và nested RT-PCR 16

3.4.3 Vật liệu và hóa chất sử dụng cho điện di .17

3.4.4 Phương pháp lấy mẫu và xét nghiệm 17

3.4.5 Ly trích RNA 17

3.4.6 Điện di sản phẩm PCR .18

3.5 Các bước và nội dung thực hiện 18

3.5.1 Các bước thực hiện 18

3.5.2 Nội dung tiến hành thí nghiệm 19

3.5.2.1 Xác định sự nhiễm virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR 19

3.5.2.2 Xác định sự nhiễm virus PRRS và phân biệt các dòng bằng nested RT-PCR 20

3.5.2.3 So sánh độ nhạy của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR 22

3.6 Xử lý số liệu 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả xác định sự nhiễm virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR .23

4.2 Kết quả sự nhiễm và phân biệt hai dòng virus PRRS bằng nested RT-PCR 24

4.3 Kết quả so sánh độ nhạy và đặc hiệu của RT-PCR và nested RT-PCR .26

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate

- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide

- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

- EMEM: Eagle Minimum Essential Medium

- FA: Formaldehyde agarose

- FITC : Fluorescein isothiocynate

- HRPO: Horseradish Peroxidase

- IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay

- IHC: Immunohistochemistry Staining

- IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay

- Lad: Ladder

- MSD: Mystery Swine Disease

- nested RT-PCR: Reverse transcriptase - nested - polymerase chain reaction

- OIE: Office International Epizooties

- ORF: Open reading frame

- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage

- PEARS: Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome

- PRRS: Porcine reproduction and respiratory syndrome

- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus

- RNA: Ribonucleotide Acid

- RT- PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction

- SIRD: Swine Infertility and Respiratory Disease

- SNV: Serum neutralization virus

- TBE: Tris borate EDTA

- μl: Micro lit

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong phương pháp RT-PCR để phát hiện virus .16

Bảng 3.2 Trình tự nucleotide của các cặp primer dùng cho phản ứng 17

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng RT-PCR 20

Bảng 3.4 Quy trình nhiệt theo bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR ……20

Bảng 3.5 Liều lượng cho các thành phần của phản ứng nested-PCR (Promega) 21

Bảng 3.6 Chu kì nhiệt cho nested-PCR (Promega) 21

Bảng 4.1 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS bằng RT-PCR 24

Bảng 4.2 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS bằng nested RT-PCR 26

Bảng 4.3 Kết quả phân biệt hai kiểu gene virus PRRS của nested RT-PCR 26

Bảng 4.4 Kết quả so sánh độ nhạy của hai phương pháp 26

Bảng 4.5 Kết quả phát hiện virus PRRS của hai phương pháp .28

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Virus PRRS .4

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gene của virus PRRS .6

Hình 2.3 Các bước của phản ứng nested-PCR 12

Sơ đồ 3.1 Quy trình điện di và chụp gel 18

Hình 4.1 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh bằng RT-PCR 23

Hình 4.2 Kết quả phát hiện virus PRRS trong mẫu vaccine bằng nested RT-PCR 24

Hình 4.3 Kết quả phát hiện virus PRRS bằng nested RT-PCR 25

Hình 4.4 Độ nhạy của hai phương pháp với virus PRRS trong huyết thanh heo 27

Hình 4.5 Độ nhạy của nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trong mẫu 28

Sơ đồ 3.2 Cách thực hiện chạy RT-PCR và nested RT-PCR trong 3 nội dung 18

Sơ đồ 3.3 Sử dụng RT-PCR phát hiện virus PRRS trên heo 19

Sơ đồ 3.4 Cách thực hiện so sánh độ nhạy của hai phương pháp …… 22

Sơ đồ 3.5 Cách thực hiện kiểm tra độ nhạy của phương nested RT-PCR 22

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh

tế ở nước ta Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lượng heo nuôi ngày càng tăng cao Ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lượng cũng như chất lượng cho người tiêu dùng

Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo như: bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại và gần đây nhất là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome) Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi Bệnh gây sẩy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn

Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng Việc chẩn đoán virus bằng các triệu trứng lâm sàng thường không chính xác, và khi đã chẩn đoán được thì bệnh đã nặng và khả năng lây lan thành dịch cao Một số phương pháp được dùng để chẩn đoán như ELISA, FA, IFA, IMPA, nuôi cấy tế bào được sử dụng chưa có hiệu quả cao lắm, phức tạp, mất thời gian Tất cả những hạn chế của các phương pháp trên gây trở ngại trong việc chẩn đoán virus trong tình hình bệnh dịch hiện nay

Cho đến những năm gần đây, phương pháp sinh học phân tử đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó phương pháp PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn Đây là một phương pháp có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được Phương pháp RT-PCR dùng cho việc chẩn đoán RNA của virus cũng rất hiệu quả, nhưng điều đó không phải lúc nào cũng đúng khi nghiên cứu virus PRRS (Wagstrom và ctv, 2000) Tồn tại của phương pháp được nhiều tác giả nhìn nhận đó là khó phát hiện được RNA của virus trong mẫu khi nồng độ của virus thấp Phương pháp này có thể cho kết quả âm tính

và dương tính giả, không đủ cơ sở đánh giá bệnh, đặc biệt khi heo mới vừa bị nhiễm (Bierk MD và ctv, 2000; U Truyen và ctv, 2006; C.Fetzer và ctv, 2006)

Nested-PCR cũng là một phương pháp PCR nhưng chỉ cần một lượng mẫu nhỏ hơn PCR truyền thống Phương pháp nested-PCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Độ nhạy của nested-PCR có thể cao hơn khoảng 10.000 so với phương pháp PCR thông thường

Việc so sánh độ nhạy giữa phương pháp nested RT-PCR với các phương pháp RT-PCR truyền thống hoặc phương pháp phân lập virus (được xem là tiêu chuẩn

“vàng” để chẩn đoán virus trên thế giới) là điều hết sức cần thiết nhằm áp dụng phương pháp nested RT-PCR, một phương pháp được cho là rất nhạy so với phương pháp RT-PCR truyền thống và chưa được thực hiện ở Việt Nam trong việc phát hiện virus PRRS trên heo Do đó, đề tài: “Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” đã được thực hiện

- Ly trích RNA từ mẫu vaccine và mẫu nghi ngờ nhiễm virus PRRS thu thập ở các trại heo

- Sử dụng quy trình RT-PCR phát hiện RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập

- Sử dụng quy trình nested RT-PCR để phát hiện và phân biệt hai kiểu gene virus PRRS trên mẫu vaccine và các mẫu thu thập

- Thiết lập quy trình so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của hai phương pháp trong phát hiện virus PRRS

1.3 Nội dung thực hiện

- Phát hiện virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR

- Phát hiện và phân biệt các kiểu gene của virus PRRS trên heo bằng phương pháp nested RT-PCR

- Thực hiện so sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trên heo

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở lợn

2.1.1 Giới thiệu

Trong chăn nuôi heo, một trong những bệnh mới xuất hiện trong thời gian gần đây và được nhắc đến nhiều đó là hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (porcine productive and respiratory syndrome - PRRS) Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện ở Châu Âu và Châu Á và được xác

định là do một loại virus thuộc họ Arteriviridae, có khả năng xâm nhiễm vào đại thực

bào và mô Virus PRRS là một virus RNA có vỏ bọc, gây cả thiệt hại về sinh sản trong đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo thịt Heo nái biểu hiện kém

ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn Sẩy thai, đặc biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số lượng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và xảy ra tử vong ở heo con Ở heo nuôi thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thường kết hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001)

Ở ổ dịch cấp tính, ước tính giảm sản lượng 5-20 %, giảm từ 1-3,8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (Hoàng Văn Năm, 2001)

Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”

Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh PRRS trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau,

từ 1,3 % cho tới 68,29 % Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6 - 75 %, Mỹ là 36 % (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y, 2007)

2.1.3 Phân loại, đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS

2.1.3.1 Phân loại virus PRRS

2.1.3.2 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS

Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40 - 70 nm, có vỏ bọc, kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và ctv, 2005)

Bộ gene của virus PRRS gồm 8 khung đọc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 5, 6 và 7 quy định tổng hợp các protein tương ứng: nucleocapsid (N) 15 - kDa, matrix (M) 19 - kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25 - kDa Đây là

những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90 - 95 % lượng protein cấu trúc của virus (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, được mã hóa lần lượt bởi ORF7, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm

từ 20 - 40 % lượng protein của phân tử virus Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo

Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa, được mã hóa lần lượt bởi ORF6 Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và ctv, 2001)

Protein E có trọng lượng phân tử khoảng 24 - 25 kDa, được mã hóa lần lượt bởi ORF5 là một loại protein có nhiều biến đổi nhất Bằng phương pháp xác định trình tự gen của virus PRRS, Umthun và Mengeling (1999) đã khẳng định rằng protein E rất hữu dụng trong việc phân kiểu gene các virus PRRS (Trần Thị Bích Liên, 2008)

Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, được mã hóa lần lượt bởi ORF5, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và ctv, 2003; Võ Ngọc Thơ, 2007)

Protein GP2 (29 - 30kDA) và GP4 (31 - 35kDa) được mã hóa lần lượt bởi ORF2 và ORF3 là các glycoprotein màng chúng chứa trình tự tận cùng N, một đoạn xuyên màng tận cùng là C (Meulenberg, 2000)

Hiện nay, có các dữ liệu khác nhau về sự hiện diện của glycoprotein GP3 được

mã hóa từ ORF3 trong hạt virus Nieuwstadt phát hiện protein GP3 (45 - 50kDa) bằng phương pháp Western blot trên virus Lelystad đã tinh sạch với các kháng thể đơn kiểu gene đặc hiệu nhưng không phát hiện được Protein GP3 của virus kiểu gene canadian IAFkop bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Tuy nhiên, protein GP3 được phát hiện trong tế bào bị phân giải và được giữ trong lưới nội chất, và một lượng protein được tìm thấy ở dạng GP3 dạng lỏng Các protein GP3, GP4, GP5, M, N mang tính kháng nguyên (Meulenberg, 2000)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của virus PRRS

(http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp)

2.1.4 Phân kiểu gene của virus

Về mặt di truyền, khi phân tích các kiểu gene virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác định được 2 kiểu gene của virus: kiểu gene Châu Âu (Lelystad) và kiểu gene Châu Mỹ (VR-2332)

Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các kiểu gene PRRS, người ta đã xác định rằng ở kiểu gene Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của kiểu gene virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa kiểu gene virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 kiểu gene virus này chỉ vào khoảng 57-59 %, ORFs 6 là 70-81 % và ORFs 5 là khoảng 51-59 % Sự tương đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các kiểu gene Châu Mỹ và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58 %

và 68 % (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa

do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gene (Trần Đức Minh, 2006) Sự khác biệt

về kiểu gene liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán kiểu gene virus và ngược lại Như vậy, trên cơ sở về kiểu gene, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng virus nhược độc để làm vaccine (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.2 Chẩn đoán

2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng

Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS

Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi:

− Tỷ lệ chết lúc sinh >20 %

− Tỷ lệ sảy thai >8 %

− Tỷ lệ heo con chết trước khi cai sữa >26 %

− Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25 %

Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (Võ Thị Đan Thanh, 2006)

2.2.2 Chẩn đoán phi lâm sàng

2.2.2.1 Phân lập virus trên môi trường tế bào

Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại

tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621) Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này Han-Kook Chung

và ctv (2002) cho rằng PRRSV kiểu gene Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, ngược lại PRRSV kiểu gene Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM

2.2.2.2 Phương pháp phát hiện kháng thể

* Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay)

Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS được gọi là phương pháp miễn dịch peroxidase một lớp Phương pháp này có thể thực hiện trên các kiểu gene tế bào PAM, CL2621, MARC-145 Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với PRRSV và được ủ ở 37oC trong 24 giờ Sau đó

tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 37oC và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase) Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-

50 % tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong

30 phút Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính IPMA được sử

dụng nhiều ở Châu Âu Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Nhược điểm của phương pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lượng kháng thể bảo vệ

* Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay)

Giống như trong phương pháp IPMA, phương pháp IFA (phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate) Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang, sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5 % và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn

* Phản ứng SN (Serum Neutralizing)

Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, được

sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus Nhược điểm của phản ứng này là đắt tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm) Tuy nhiên, đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

* Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy

và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp này là dễ cho kết quả dương tính giả Tỷ số S/P (sample/position) ≥ 0,4 thì kết quả được ghi nhận là dương tính Các phản ứng IFA, SN, ELISA được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Nhiều dạng ELISA đã được mô tả: ELISA trực tiếp sử dụng tỉ số S/P (sample/positive); ELISA trực tiếp sử dụng giá trị OD trực tiếp, ELISA ngăn trở Trong một bộ ELISA kit thương mại (HerdChek® PRRS ELISA, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine), tỉ số S/P ≥ 0,4 thì kết quả là dương tính Sử dụng tỉ số S/P ≥ 0,4 như

là một giá trị giới hạn, kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRS được phát hiện đối với

những heo nhỏ từ 10 đến 14 ngày sau nhiễm trong những điều kiện thí nghiệm và cao nhất là 2 đến 3 tháng sau nhiễm (Yoon và ctv,1995) Độ đặc hiệu của bộ kit nằm trong khoảng 99,3 % đến 99,5 % (http://www.porkboard.org/docs/PRRSchapter3.pdf)

2.2.2.3 Phương pháp phát hiện kháng nguyên

Phương pháp FA (flourescent antibody staining - kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining - hoá mô miễn dịch) có thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô

Phương pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh Phương pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh

Phương pháp IHC cũng được thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phương pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã được cố định bằng formol Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhưng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.2.2.4 Chẩn đoán gen

Phương pháp PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm Phương pháp này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy

tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 kiểu gene virus thì Han-Kook Chung và cộng sự (2002)

đã sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) Fun

In Wang (1994) đã sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực Trong thí nghiệm này với tỉ lệ huyết thanh dương tính là 85,4 % (205/240), nhưng chỉ có 11/140 mẫu máu chứa lượng virus có thể phát hiện được bằng RT-PCR Ông kết luận kết quả phản ứng RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào mẫu phân tích Wagstrom và cộng sự trong nghiên cứu của mình đã chứng minh phương pháp RT- PCR trực tiếp có khả năng phát hiện RNA virus PRRS với độ đặc hiệu cao (99,4 %) (Wagstrom và ctv, 2001)

Fun in wang (1994) đã sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp để phát hiện

sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực

Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chưa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình

độ kỹ thuật cao Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau

2.3 Phương pháp RT-PCR

2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR

Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai Tùy thuộc vào mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết vào nhiều vị trí trên mRNA

2.3.2 Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược

Ngày nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp

cDNA invitro tương ứng với RNA mẫu

Enzyme phiên mã ngược của avian myeloblastosis virus (AMV) và dòng Moloney của virus murine leukemia (Mo-MLV) Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi primer sử dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có nhóm 3’-OH Loại enzyme này không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease Khi sử dụng loại enzyme này đòi hỏi trong phản ứng phải có nồng độ dNTP cao

Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có

sự hiện diện của Mn2+ (Myers và Gelfand, 1991) Đặc điểm thuận lợi của loại enzyme này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube phản ứng Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1- 2 kb, thêm vào đó việc sử dụng Mn2+ trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp cDNA có độ

đặc hiệu thấp Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT và random

hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại đó enzyme phiên mã ngược hoạt động

2.3.3 Các primer trong phiên mã ngược

Có ba loại primer thường được sử dụng cho phiên mã ngược trong phản ứng RT-PCR : Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là thường tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’ Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược, primer oligo

T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung Mồi oligo T thường được

sử dụng như là một “mồi phổ dụng” cho việc tổng hợp ra một cDNA thông thường

Oligonucleotide antisense: Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình tự đích đặc biệt của mRNA Tuy nhiên, khi sử dụng oligonucleotide làm mồi cho quá trình phiên mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết

kế sao cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của oligonucleotide sử dụng làm primer cho việc tổng hợp cDNA

Random hexanucleotide: Loại primer này thường được sử dụng khi mRNA đích có kích thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai Khi đó việc tổng hợp cDNA không thể được thực hiện một cách hiệu quả bằng cách sử dụng mồi oligo

dT hay mồi oligonucleotide antisense

Trong kỹ thuật RT-PCR những primer oligonucleotide antisense được thiết kế

để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của mRNA đích là những primer được ưu tiên chọn lựa Primer oligo dT là lựa chọn tốt nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn cuối cùng (Nguyễn Nhất Bảo Quốc)

2.4 Phương pháp nested-PCR

2.4.1 Giới thiệu chung về nested-PCR

Phương pháp nested-PCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và

độ đặc hiệu của phản ứng PCR Phương pháp này được Lo và cộng sự công bố vào

năm 1996 Trong phương pháp này có hai cặp primer khác nhau được sử dụng nhưng

chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gene và phản ứng PCR phải thực hiện hai lần Lần đầu, phản ứng PCR phải thực hiện trong 15 đến 30 chu kì với cặp mồi thứ nhất Cặp mồi thứ nhất ở lần chạy thứ nhất cho phép khuếch đại đoạn gene dài hơn đoạn gene cần xác định Cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần thứ nhất Phản ứng PCR lần hai sau đó sẽ khuếch đại đoạn gene cần xác định Phương pháp nested-PCR gia tăng độ nhạy của phản ứng nhờ tổng số chu kì được thực hiện nhiều hơn, điều này dẫn tới việc gia tăng độ nhạy của nested-PCR lên khoảng 10.000 lần, ngay cả trong trường hợp ở chu kì đầu, sản phẩm PCR ít hiện diện

như một sản phẩm không đặc hiệu, nó sẽ được khuếch đại bởi nested-PCR primer Nested-PCR chỉ cần một lượng mẫu nhỏ hơn PCR truyền thống Nhược điểm lớn nhất của nested-PCR đó là gia tăng mức tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR Tuy nhiên có thể khắc phục được bằng cách cải tiến chạy nested-PCR trong một ống (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Ngược lại những sản phẩm không đặc hiệu của phản ứng PCR thứ nhất thì thường có những trình tự không tương hợp với những primer nested, ngay cả nếu không thể thiết kế hai primer chuyên tính (http://www.davidson.edu/)

2.4.2 Các bước của nested-PCR

Bước 1: Đoạn DNA khuôn được tách làm hai mạch Thực hiện phản ứng PCR

với cặp mồi thứ nhất (có màu xanh) Quá trình thực hiện PCR lần nhất có thể cho rất nhiều sản phẩm tuy nhiên chúng ta chỉ lựa chọn những sản phẩm PCR có trình tự như mong muốn Cặp mồi thứ nhất ở lần chạy thứ nhất cho phép khuếch đại đoạn gene dài hơn đoạn gene cần xác định và đoạn gene cần xác định nằm trong đoạn gene được khuếch đại lần 1 Sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 sẽ là mẫu cho phản ứng PCR thứ hai

Bước 2: Những sản phẩm PCR của lần PCR thứ nhất sẽ là mẫu cho bước PCR

lần hai, tuy nhiên bước này sẽ thực hiện PCR với cặp primer thứ hai (màu đỏ)

Hình 2.3 Các bước của phản ứng nested-PCR

(http:/nestedpcr/New Folder/drfer.htm)

Phương pháp này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là phương pháp PCR cổ

điển, số đoạn DNA được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng

Jane Christopher-Hennings và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật này để tiến hành phát hiện virus PRRS trên tinh dịch của heo (Jane Christopher-Hennings và ctv, 1995)