KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG DẦU CỦA MỘT SỐ DÒNG CỌC RÀO ( JATROPHA CURCAS L.)

Cây Cọc rào du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng [3]… So với các cây khác, cây Cọc rào có ưu điểm vượt t

NGUYỄN THỊ LÀI

KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG DẦU CỦA MỘT SỐ DÒNG CỌC RÀO

( JATROPHA CURCAS L.)

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS BÙI VĂN LỆ & TS THÁI XUÂN DU

TP HỒ CHÍ MINH - 2010

LỜI CẢM ƠN

Em muốn dành lời đầu tiên của quyển luận văn này để gởi lời cảm ơn

sâu sắc tới thầy, PGS TS Bùi Văn Lệ, TS Thái Xuân Du vì tất cả những gì

thầy đã dành cho em trong suốt những năm tháng qua Cảm ơn hai thầy đã định hướng, giúp đỡ và hỗ trợ em trong học tập, nghiên cứu và cả trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh, Ngành Di Truyền,

Bộ môn Công nghệ Sinh học và Chuyển gen trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM về những kiến thức chuyên ngành mà thầy cô đã trau dồi cho

em trong suốt những năm cao học

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ tế bào thực

vật, Viện Sinh học Nhiệt Đới Tp HCM đã cung cấp nguồn vật liệu thí

nghiệm cho quá trình thực hiện đề tài

Em xin gởi lời cảm ơn cô Th.sĩ Cung Hoàng Phi Phượng, Th.sĩ Kiều

Phương Nam, Th.sĩ Quách Ngô Diễm Phương, Th.sĩ Bùi Lan Anh Và xin

gởi lời cảm ơn đến các em Trần Lê Lưu Ly, Trần Minh Tuấn thuộc phòng

Công nghệ Thực vật và Chuyển gen trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM vì mọi sự giúp đỡ, động viên của các em trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây Cọc rào 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Nguồn gốc 4

1.1.3 Đặc điểm sinh học 5

1.1.3.1 Hình thái và đặc tính thực vật 5

1.1.3.2 Điều kiện sinh thái 8

1.1.4 Thành phần hóa học của cây Cọc rào 8

1.1.4.1 Thành phần hóa học 8

1.1.4.2 Thành phần độc tố 10

1.1.5 Công dụng tổng hợp của cây Cọc rào 13

1.1.5.1 Nhựa mủ 13

1.1.5.2 Lá, vỏ và rễ cây 14

1.1.5.3 Hạt và dầu 14

1.1.6 Cọc rào và nhiên liệu sinh học 14

1.2 Sự đa dạng di truyền 17

1.2.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền 18

1.2.2 Dòng chảy của gen 19

1.2.3 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền 19

1.3 Những phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học ở thực vật 20

1.3.1 Marker di truyền 20

1.3.2 DNA marker 21

1.3.3 RAPD – Random amplified polymorphic DNA 21

1.3.4 Ứng dụng nghiên cứu tính đa hình DNA trong xây dựng cây phát sinh loài 22 1.3.4.1 Một số thuât ngữ 22

1.3.4.2 Các phương pháp chủ yếu xây dựng cây phát sinh loài 23

1.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền của Cọc rào 24

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 24

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 24

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 26

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất 26

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.1.1 Hạt Cọc rào 26

2.1.1.2 Lá Cọc rào 27

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu 27

2.1.2.1 Dụng cụ 27

2.1.2.2 Thiết bị 27

2.1.3 Hóa chất 28

2.1.3.1 Hóa chất tách chiết DNA 28

2.1.3.2 Hóa chất điện di 29

2.1.3.3 Hóa chất phản ứng PCR 29

2.1.3.4 Thang DNA 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2 2.1 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA 30

2.2.2 Các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm DNA thu được sau khi tách chiết 32

2.2.3 Thiết lập phản ứng RAPD 33

2.2.3.1 Chương trình phản ứng RAPD 33

2.2.3.2 Thành phần phản ứng RAPD 33

2.2.3.3 Tối ưu hóa thành phần phản ứng RAPD 33

2.2.4 Phân tích kết quả đa hình từ phản ứng RAPD 34

2.2.4.1 Phân tích kết quả đa hình của các cá thể Cọc rào 34

2.2.4.2 Phân tích khoảng cách di truyền giữa ba quần thể Cọc rào: Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh 35

2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của hạt Cọc rào 35

2.2.5.1 Phương pháp AOCS Aa 4-38 35

2.2.5.2 Phương pháp AOCS Ce 1e-91 36

Chương 3 : Kết quả và biện luận 38

3.1 Kết quả khảo sát quá trình tách chiết DNA 38

3.2 Tối ưu hóa phản ứng RAPD 40

3.2.1 Khảo sát nồng độ Dntp 41

3.2.2 Khảo sát nồng độ DNA lam mạch khuôn 41

3.2.3 Khảo sát nồng độ mồi 42

3.2.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ 43

3.2.5 Khảo sát nồng độ Tag polymerase 44

3.3 Đa dạng di truyền của cây Cọc rào qua khảo sát bằng kỹ thuật RAPD 46

3.3.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR 46

3.3.1.1 Sàng lọc mồi 46

3.3.1.2 Kết quả khuếch đại DNA 46

3.3.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng

đơn giản (SM coefficient) 52

3.3.3 Phân nhóm di truyền các mẫu Cọc rào khảo sát 53

3.3.4 Khảo sát tính đa dạng và cấu trúc di truyền của 3 dòng Cọc rào Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh 58

3.3.4.1 Tính đa dạng và cấu trúc di truyền của 3 quần thể Cọc rào 62

3.3.4.2 Tương quan di truyền giữa 3 quần thể Cọc rào khảo sát dựa trên khoảng cách di truyền 64

3.4 Phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào 65

3.4.1 Phân tích hàm lượng của dầu hạt Cọc rào 65

3.4.2 Phân tích thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào 66

3.4.3 So sánh hàm lượng dầu và 4 acid béo chính giữa mẫu AĐ và AĐ/F1 71

Chương 4: Kết luận và đề nghị 73

4.1 Kết luận 73

4.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển kinh tế toàn cầu, nhu cầu năng lượng và nhiên liệu ngày càng tăng nhất là nhiên liệu dùng cho giao thông Trong khi đó nguồn năng lượng chính là dầu mỏ đang dần dần cạn kiệt Theo dự báo của các nhà khoa học, đến khoảng năm 2050-2060, nếu không tìm được những nguồn năng lượng mới thay thế, thế giới có thể lâm vào cảnh khủng hoảng năng lượng nghiêm trọng [3]

Việc tiêu thụ một khối lượng khổng lồ dầu mỏ như trong giai đoạn hiện nay đã, đang và sẽ gây nên hậu quả khủng khiếp về môi trường, sức khoẻ Hiệu ứng nhà kính do lượng khí cacbonnic thải ra từ việc đốt cháy dầu mỏ đã làm cho trái đất nóng dần lên [82] Quá tải cơ chế điều hòa khí hậu khiến nước biển dâng lên, bão tố, hạn hán, lũ lụt cũng tăng về tần suất và cường độ Khí thải từ dầu khí là một trong các nhân tố quan trọng làm tăng tỷ lệ ung bướu, bệnh tim mạch, bệnh hô hấp… Do vậy, nhiều quốc gia trên thế giới đã có chính sách kết hợp việc sử dụng tiết kiệm và hiệu quả các dạng năng lượng hiện có với chính sách sử dụng dạng năng lượng mới thân thiện môi trường [82]

Có nhiều nguồn năng lượng đã được đề xuất như khai thác năng lượng mặt trời, năng lượng gió, thủy triều, sử dụng nguyên liệu hydro … Và khoảng

30 năm trở lại đây, một hướng rất mới là sử dụng dầu diesel sinh học (biodiesel) nhằm thay thế một phần nguồn nhiên liệu hóa thạch Biodiesel được chiết xuất hoàn toàn từ thực vật như hạt cải dầu (Mỹ), hạt hướng dương (Ý và Miền nam nước Pháp), đậu nành (Mỹ và Braxil), hạt cây bông (Hy Lạp), dầu

cọ (Malaysia) và từ hạt cây Cọc Rào (Nicaragoa và Nam Mỹ) [10]

Cây Cọc rào du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng [3]… So với các cây khác, cây Cọc rào có ưu điểm vượt trội hơn hẳn các loài cây cho dầu khác về khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường Ngoài sử dụng hạt để lấy dầu, việc trồng cây này còn giúp cải tạo đất và môi trường nhất

là ở những vùng đất hoang, khô cằn, nghèo dinh dưỡng [10] Cây Cọc rào

mang lại lợi ích kinh tế gắn chặt với đời sống và thu nhập cộng đồng nông thôn, có thể giúp người nông dân xóa đói giảm nghèo ngay trên những vùng đất

bỏ hoang mà nhiều cây trồng khác không phát triển được [6]

Qua điều tra thực tế ở Việt Nam cho thấy, cây Cọc rào mọc hoang dại trong tự nhiên ở độ cao tới trên 1000 m trên mặt biển, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh Có giống có hàm lượng dầu đạt 40% như ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng Sự phong phú về mặt phân bố này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với công tác bảo tồn nguồn gen cây Cọc rào cũng như việc tuyển chọn và tạo giống [3]

Hiện nay có rất nhiều công ty trong nước và ngoài nước đang đầu tư trồng và khai thác hạt cây này ở nhiều tỉnh thành của nước ta Nhưng theo nhiều nghiên cứu cho thấy cây Cọc rào ở nước ta vẫn là một cây hoang dại, nửa hoang dại, mới chuyển thành cây trồng trong thời gian ngắn Tài liệu nghiên cứu về cây này còn quá sơ sài, nhất là về khía cạnh kinh tế [4] Nước ta chưa có giống tuyển chọn năng suất cao được công nhận phổ biến cho sản xuất Cây Cọc rào được trồng đại trà ở nhiều vùng với nguồn giống nhập từ nước ngoài

và thu thập từ các địa phương trong nước chưa qua khảo nghiệm, thiếu kiểm nghiệm [4] Phương pháp nhân giống chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là bằng cách gieo hạt và giâm cành, do đó tính đa dạng di truyền của các dòng Cọc rào

và hàm lượng dầu cũng như thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào là điều rất đáng quan tâm đối với lĩnh vực bảo tồn và khai thác nguồn tài nguyên này

Mức đa dạng di truyền của quần thể càng cao thì quần thể càng có khả năng sống sót trước những biến đổi của điều kiện môi trường Tính đa dạng di truyền của quần thể còn giúp các nhà chọn giống có nhiều lựa chọn hơn trong việc chọn ra nguồn giống có năng suất và hàm lượng dầu cao phục vụ cho công tác nghiên cứu và cho sản xuất Ngoài ra, việc sử dụng marker phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể Cọc rào còn giúp nhà chọn giống xác định được giống của từng địa phương cũng như giống nhập từ nước ngoài

Dựa vào những kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng dầu cũng như thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào, chúng tôi bước đầu chọn kĩ thuật RAPD - PCR để khảo sát tính đa dạng di truyền giữa các cá thể Cọc rào

và khảo sát mức đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của các dòng Cọc rào thu thập được, phương pháp AOCS Aa 4 – 38 để phân tích hàm lượng dầu và phương pháp AOCS Ce 1e-91 để phân tích thành phần acid béo trong dầu hạt

Cọc rào thông qua đề tài “KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG DẦU CỦA MỘT SỐ DÒNG CỌC RÀO (

Jatropha curcas L.)”

Mục tiêu của đề tài:

1 Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa một số cá thể Cọc rào thu thập ở các tỉnh: Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng,

Tp Hồ Chí Minh và hai giống nhập ngoại từ Ấn Độ và Thái Lan bằng

kỹ thuật RAPD:

Cọc rào ở tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh

2 Phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào thu thập được

Hình 1.1: Cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) [75]

Tên Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Jatros (bác sĩ) và Trophe (thức ăn), đã ám chỉ công dụng làm thuốc của cây này [68]

Curcas là tên gọi thông thường của cây này Tuy nhiên, mỗi quốc gia tên gọi

này có khác: ở Anh thường gọi là Physic nut, ở Pháp thường gọi là Pourghère [68], ở Trung Quốc là Ma Phong hay là Tiểu Đồng tử Ở Việt Nam, cây này được gọi bằng nhiều tên khác nhau tùy theo địa phương như Cọc giậu, Đậu cọc rào, Cọc rào, Cây li, Ba đậu nam, Dầu mè [10]…

1.1.2 Nguồn gốc

Cọc rào (Jatropha curcas L.) là cây có lịch sử 70 triệu năm Có nhiều

bằng chứng cho thấy, cây này có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ Cọc rào được những thủy thủ người Bồ Đào Nha đưa sang đảo Cape Verde vào thế kỉ thứ 16, rồi lan sang nhiều quốc gia ở Châu Phi, Châu Á sau đó được trồng ở

nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới trên toàn thế giới [35]

Từ năm 1991, Giáo sư người Đức là Klause Becker của Trường Đại học Stuttgart đã nhận đơn đặt hàng của Tập đoàn Daimler Chrysler hợp tác với hãng tư vấn của Áo tiến hành nghiên cứu cây Jatropha ở Nicaragua để làm nguyên liệu sản xuất diesel sinh học, từ đó dấy lên cơn sốt Jatropha trên phạm

vi toàn cầu Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đang chạy đua phát triển cây này, nhất là các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaixia, Indonexia, Philippin, Mianma và nhiều nước Châu Phi, nhằm phục vụ nhu cầu năng lượng tại chỗ và xuất khẩu [10]

Cọc rào đã có mặt ở Việt Nam từ trước thế kỷ XIV Mọc hoang dại trong tự nhiên, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước Cho đến nay cây này đã được trồng rải rác ở nhiều địa phương: Đức Trọng, Bắc Bình, Lạng Sơn, Ninh Thuận, Bình Thuận, Ninh Sơn, Thanh Hóa, Lào Cai, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh [6]

1.1.3 Đặc điểm sinh học

1.1.3.1 Hình thái và đặc tính thực vật

rộng, vòng đời trên 50 năm Trong điều kiện chăm sóc tốt, cây có thể cao từ 8 – 10 m và cũng có thể sống lâu hơn Trong thực tế để tiện thu họach, người ta thường cắt cành, tạo tán cho cây chỉ cao khoảng 3 – 5 m Cành non mập và mọng nước, nhựa cây màu trắng sữa hay màu vàng nhạt Cây rậm lá, lá to bản

có màu xanh, hình ovan hoặc hình trái tim dài 7 cm - 16 cm, rộng 5cm - 10cm,

lá chẻ thùy 3 - 5 thùy cạn Cuống lá dài 6 cm - 23 cm Lá mọc theo kiểu xen kẽ, sắp xếp luân phiên nhau, thường tập trung nhiều ở ngọn [68]

Hình 1.2: Thân, lá, hoa, quả, hạt và dầu cây Cọc rào [76]

Cọc rào có hoa được hình thành từ nách lá hoặc ngọn cây Hoa mọc theo kiểu cụm hoa Là cây có hoa đơn tính, hoa đực và hoa cái mọc trên cùng một cụm hoa Đôi khi, hoa lưỡng tính tuy hiếm nhưng cũng được tìm thấy trên cây Hoa có kích thước nhỏ, màu vàng nhạt, hình chuông có hương thơm và mật ngọt Hoa đực nhỏ, đài 5 phiến, tràng có 5 cánh, gốc phiến đài hoa hơi liền lại Cánh hoa tròn dài, phần của dưới liền lại, dài khoảng 6 mm Hoa đực có 10 nhụy đực được chia thành 2 vòng riêng biệt: 5 nhị ở vòng trong dính vào phần chân đế, 5 nhụy ở vòng ngoài kết lại thành bó Hoa cái thường rời rạc với bầu nhụy hình elip có 3 noãn với đầu núm nhụy chẻ đôi Hoa cái thường lớn hơn hoa đực một ít [68] Tỷ lệ hoa đực so với hoa cái từ 13:1 hoặc từ 29:1 Trong trường hợp xảy ra sự mất cân bằng tỉ lệ hoa đực : cái thì thông thường số hoa

cái tăng cao hơn Số lượng hoa giảm cùng với tuổi cây Thông thường cây ra hoa một lần trong năm vào mùa mưa Ở những vùng ẩm ướt hoặc được tưới nước đầy đủ quanh năm (trong vườn ươm), cây có thể ra hoa quanh năm [24]

Hình 1.3: Hoa đực và hoa cái cây Cọc rào [77]

Quả mọc thành chùm Mỗi chùm hoa có khả năng đậu hơn 10 quả Quả non hình trứng, màu xanh về sau chuyển dần sang màu vàng nâu rồi chuyển sang màu đen (khô) và được thu hoạch thường xuyên gần như quanh năm Quả

có dạng nang, kích thước 2,5 – 4 cm Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này Hạt chín có màu đen, thuôn dài kích thước 2 x 1 cm, trọng lượng khoảng 5,8 gram [68]

Cọc rào thường ra hoa trong suốt mùa nóng từ tháng 4 đến tháng 6, tạo quả vào mùa đông từ tháng 10 đến tháng 12 Quả chín sau khoảng 60 ngày kể

từ ngày thụ phấn [68] Khi nhu cầu nước được đảm bảo (trong vườn ươm), cây

có thể ra hoa tạo quả ngay từ mùa mưa đầu tiên Hạt chín rơi xuống đất và nẩy mầm trong suốt thời gian có gió mùa Cây con có thể được trồng ngay vào mùa mưa năm sau đó [68]

Cây Cọc rào thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Cọc rào được thụ phấn nhờ vào bướm đêm vì có hương thơm ngào ngạt và có nhiều mật ngọt [68] Nếu trồng trong nhà kính, không có côn trùng, hạt khó đậu quả nếu không thụ phấn nhân tạo Trường hợp hoa lưỡng tính rất hiếm gặp nhưng có thể tự thụ phấn [35] Người ta đã quan sát được một số loại côn trùng khác nhau tới và thụ phấn cho hoa trên những cánh đồng thử nghiệm ở Senegal và cũng đã phát

hiện, nhị hoa nở muộn hơn nhụy hoa trên cùng một cụm hoa nhờ cơ chế này đã thúc đẩy quá trình thụ phấn chéo [35] Cọc rào là loài có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội là 2n = 22 Tuy nhiên, bộ nhiễm sắc thể 3n hoặc 4n tuy hiếm nhưng cũng đã được phát hiện Bộ gene của cây Cọc rào có kích thước nhỏ khoảng

430 Mbp [26]

1.1.3.2 Điều kiện sinh thái

Cọc rào là loài có khả năng thích nghi cao Chúng có thể phát triển tốt ở mọi nơi ngay cả ở những vùng đất ngập mặn, đất cằn cỗi, bạc màu hoặc đất cát nghèo dinh dưỡng và trên các kẽ đá (trừ các vùng đất ngập nước) [20] Cọc rào được tìm thấy ở phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng thích nghi với khí hậu nóng Cây chịu được sương giá nhẹ thậm chí có khả năng chịu đựng được băng giá trong thời gian ngắn Cây càng già khả năng chịu đựng càng tốt Trời lạnh sẽ làm cây rụng lá Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5oC [68]

Nhu cầu nước của cây Cọc rào vô cùng thấp Cây có thể tồn tại được với lượng mưa trung bình năm từ 250 đến 300 mm Cây ra hoa tạo quả, lượng mưa trung bình năm ít nhất là 600 mm Nhiệt độ tối ưu của cây trong khoảng 1000 –

1500 mm Nếu lượng mưa trung bình năm lớn hơn 3000 mm, cây sẽ bị nấm tấn công và hạn chế sự phát triển của rễ Ở những vùng có lượng mưa thấp, khô hạn kéo dài, cây thường diễn ra sự rụng lá nhằm hạn chế thoát hơi nước [24]

Vào những tháng mùa đông, Cọc rào rụng lá hình thành lớp che phủ bên dưới gốc cây giúp cây hạn chế sự thoát hơi nước Chất hữu cơ từ lá rụng tăng cường họat động của giun đất tại vùng đất quanh rễ, giúp cải thiện chất dinh dưỡng trong đất [68]

1.1.4 Thành phần hóa học của cây Cọc rào

phân tử lượng 296, điểm cháy tương tự nhau khoảng 238oC) Jatrophol (công thức C20H24O3, phân tử lượng 312, điểm cháy 195oC) Caniojane có công thức

C20H24O5, phân tử lượng 244, điểm cháy khoảng 167 – 168oC Diterpene trong dầu hạt Cọc rào và chất dẫn xuất của chúng đều có hoạt tính kháng ung thư Ngoài ra còn 2 chất curculathyranes A và curculathyranes B đều là chất dẫn xuất của curcusones (công thức C20H28O4, phân tử lượng 332) Trong triterpene

có thể chiết tách β-amyrine và taraxerol, iso-β-amyrine

v Flavon: Trong Cọc rào có thể chiết tách 9 chất flavon Trong lá tươi chiết tách 5 loại là apigenin, vitexin, isovitexin, 5,4’-dihydroxyflavon-6,7-glucoside và 5-hidroxyflavon-3,7,4’-rhamnetin Từ rễ chiết tách được 4 loại

pyrimidine-2,4-dione, có tác dụng tiêu viêm, cầm máu

đã chiết tách được acid palmitic (khoảng 13,3%), acid palmitoleic (khoảng 1,4%), acid stearic (khoảng 8,8%), acid oleic (khoảng 41,6%), acid linoleic (khoảng 33,8%) , acid linolenic (khoảng 1,1%), ngoài ra còn một số chất khác

v Coumarin: Trong rễ Cọc rào đã chiết tách được 4 loại coumarin gồm fraxetin, Jatrophin, 5-hydroxy-6,7-dimethoxyxcoumarin và tometin, 6-methoxy-7-sitosterol, daucosterol, sterols stigmasterol và steroid sapogenins

gam hạt có 18,2 gam protein Đến nay đã nghiên cứu 2 loại protein gồm cercain

là một loại pankrin chiết tách được trong nhựa cây Cọc rào, có tác dụng thúc đẩy làm lành vết thương, phòng ngừa thối rữa và curcin là một loại albumin độc (toxalbumin), có độc tính tương tự toxalbumin Thầu dầu (ricin) và toxalbumin hạt Bã đậu (crotin) Curcin là RNA N-glycosidase thông qua ribosome của vi sinh vật nhân thực bất hoạt để kìm chế tổng hợp protein, cũng được gọi là protein bất hoạt ribosome Jatropha (RIPs) Curcin có khả năng ức chế khả năng tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày (SGC-7901), tế bào u bướu tủy của chuột (Sp 2/0), tế bào ung thư gan của người Từ nhựa Cọc rào có thể chiết tách được curcacyclin A, bao gồm 1 threonine, 1 valine, 2 glycine và 4 leucine, xếp thứ tự gly-leu-leu-gly-thr-val-leu-leu, có tác dụng kìm chế tăng

sinh tế bào T của người

hoạt tính kháng ung bướu, cũng có thể chữa trị bệnh da liễu Ngoài ra còn chiết tách được một số loại đường như sucrose, dulcitol, β-sitosterol, β-D-sitosterol

và một ít aldehyd, acid như 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde và 4-hydroxy-benzoic acid, dầu của hạt chiết tách được 2-propyldecan-1-ol và 2-octydodecan-1-ol-1,2-benzennedicarboxylic acid

3-methoxy-1.1.4.2 Thành phần độc tố [18]

Cọc rào là cây có chứa nhiều độc tố và các chất kháng dinh dưỡng gây độc hại cho người và vật nuôi, nhất là trong khô dầu sau khi ép dầu Thành phần độc tố chính trong dầu Cọc rào chủ yếu là phorbol este, là một hợp chất

có trong thiên nhiên, phân bố rộng rãi trong các loài thuộc họ Thầu dầu và họ Đay Những chất này là este của các diterpene tiglian Chất gốc, bán alcohol của hợp chất này là tigliane, một tetraterpene

Gốc hydro hoạt động ở các vị trí khác nhau và liên kết với các phân tử acid bằng các liên kết este của các chất được gọi là phorbol este Các tác dụng sinh học của các hợp chất này bao gồm thúc đẩy khối u, tăng sinh tế bào, hoạt hóa các tiểu cầu, gián phân tế bào lympho, chứng viêm (ban đỏ trên da), sản sinh prostaglandin và kích thích chống kết dinh trong các bạch cầu trung tính Các tác dụng này liên quan mật thiết tới cấu trúc của các phorbol este và có liên quan tới sự hoạt hóa proteinkinase C dẫn tới các đáp ứng khác nhau ở cấp độ tế bào do sự phosphoryl hóa các protein đích trên phần còn lại của serine hoặc threorine

Nhân của hạt Cọc rào chứa ít nhất 4 phorbol este Cấu trúc của hợp chất chính là 12-deoxy-16-hydroxyphorbol-4’-[12’,14’-butadienyl]-6’-[16’-18’20’-

nona-trienyl]-bicyclo[3,1,0]hexane-(13-O)-2’-[carboxylate]-(16-O)-3’-[8’butenoic-10’]ate (DPHB) Phần bán alcohol của hợp chất khác được tìm thấy là 12-deoxy-16-hydroxyphorbol Phần acid được dự kiến là một acid dicarboxylic không no bao gồm một vòng epocide Cấu trúc của hai hợp chất chính vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ [18]

Các phorbol este trong dầu là chất độc có thể kích thích u bướu và gây

viêm, đòi hỏi phải khử độc dầu khi được sử dụng trong nông nghiệp và ngay cả khi có khả năng tiếp xúc trực tiếp với con người Nếu đưa ra một phương pháp khử độc dầu bằng cách sử dụng ethanol để chiết các phorbol este Phương pháp này tiêu tốn lượng dung môi lớn, đòi hỏi hoàn thiện về quy trình kỹ thuật để hạ giá thành khi khử độc trên quy mô lớn [68]

Thành phần gây độc trong khô dầu là curcin Curcin là độc tố thực vật (toxalbumin – albumin độc) được tìm thấy chủ yếu trong hạt, cũng có trong quả

và nhựa Bản chất hóa học của curcin là các protein tạp có độc tính cao, tương

tự độc tố vi khuẩn về cấu trúc và chức năng sinh lý Độc tố thực vật bền với nhiệt độ và có thể nhận biết bằng phản ứng tạo kết tủa với kháng thể có trong huyết thanh Curcin không thể xâm nhập qua thành tế bào Curcin được tìm thấy trong cây Cọc rào giống như ricin là độc tố thực vật được tìm thấy trong hạt Thầu dầu [68]

Cấu trúc ricin do 2 cầu nối polipeptide: Cầu nối A gồm tiểu phần của

256 acid amin (phân tử lượng tương đối là 30625), cầu nối B gồm tiểu phần của 260 acid amin (phân tử lượng tương đối là 31358) Ricin có hàm lượng 3%

- 5% trong khô dầu Thầu dầu, là chất cực độc, chỉ cần vài µg có thể gây chết người Liều lượng tối thiểu gây chết người của ricin tinh khiết là 0,2 µg/kg thể trọng [18]

Nghiên cứu về liệu lượng gây độc của curcin đưa vào cơ thể, các triệu chứng nhiễm độc bắt đầu xuất hiện, nhanh hơn nhiều so với crotin (chất phân

lập từ hạt cây Bã đậu (Croton tiglium) cũng thuộc họ Thầu dầu) Đối với các

động vật nhai lại còn nhỏ, khi cho ăn với liều 0,5 – 10 g/kg/ngày, con vật sẽ chết sau 1 ngày hoặc tới khoảng 2 tuần Một nghiên cứu về đánh giá ngộ độc cấp tính của Cọc rào qua đường miệng cho thấy các động vật nhai lại khác nhau có độ nhạy cảm khác nhau đối với độc tố này Những con bê bị nhiễm độc

tố với liều lượng trên, bê sẽ chết trong vòng 7 – 21 ngày Gà ăn hạt sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng, xuất hiện các bệnh gan, thận và xung huyết

Trong phòng thí nghiệm, độc tố thực vật gây nên sự dính kết của các hồng cầu Các protein chứa trong hạt Cọc rào có độc tính với động vật và ức chế quá trình tổng hợp protein trong hỗn hợp của tế bào chất với các thành

phần nhân tế bào nhưng không có trong toàn bộ các tế bào [18]

Trong hạt Cọc rào có chứa các thành phần kháng dinh dưỡng Các yếu

tố ức chế trypsin cản trở quá trình tiêu hóa thông qua sự cản trở chức năng bình thường của các enzim thủy phân protein của tụy động vật nhai lại, ngăn cản nghiêm trọng quá trình tăng trưởng [18]

Hàm lượng phytate cao trong khô dầu Cọc rào có thể làm giảm giá trị sinh học của khoáng chất, nhất là Ca và Fe Các phytate góp phần làm giảm khả năng tiêu hóa của protein thông qua việc tạo phức cũng như tương tác với các enzyme như trypsin và pepsin Hàm lượng phytate trong khô dầu Cọc rào cao hơn nhiều so với trong khô dầu Lạc [35]

Khô dầu Cọc rào có hàm lượng protein cao Trừ lysine, còn các amino acid cơ bản khác đều có trong khô dầu Cọc rào với hàm lượng cao hơn cả mức

mà FAO khuyến cáo dùng cho trẻ em trước tuổi đến trường Nếu khử hết các độc tố, khô dầu Cọc rào sạch được sử dụng làm nguyên liệu giàu protein để sản xuất thức ăn giàu đạm cho gia súc, gia cầm, thủy sản, trở thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao [68]

1.1.5 Công dụng tổng hợp của cây Cọc rào

Hình 1.4: Công dụng tổng hợp của cây Cọc rào [22]

1.1.5.1 Nhựa mủ

Nhựa cây Cọc rào có chứa các alkaloid như jatrophine, jatropham, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thư Lá có chứa apigenin, vitecin và isovitecin Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastenes là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và oxy hóa Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic acid, oleic acid và linoleic acid Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của

nó Nhựa cây được dùng để trị các bệnh ngoài da như u nhọt, hắc lào, xuất huyết da Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng [68]

1.1.5.2 Lá, vỏ và rễ cây

Lá cây được chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung huyết da

và kháng kí sinh trùng Lá được sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u xơ

Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn Vỏ cây dùng để thuốc cá và dùng điều trị các vết thương ngoài da Nước sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp, bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy [68]

1.1.5.3 Hạt và dầu

Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về da [2] Dầu cây Cọc rào có tính tẩy rửa [68]

1.1.6 Cọc rào và nhiên liệu sinh học

Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây Cọc rào được chú ý đặc biệt bởi

nó là nguồn nguyên liệu để sản xuất diesel sinh học Hạt của cây có độ ẩm (6,62%), protein (18,2%), chất béo (38%), cacbohydrate (17,3%), sợi (15,5%)

và tro (4,5%) Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt Trong dầu chứa 21% các acid béo bão hòa và 79% acid béo chưa bão hòa [68] Hạt được xay và

ép lấy dầu hoặc dầu được tách bằng dung môi Dầu sau khi lọc được sử dụng ngay như là nguồn nguyên liệu ở dạng bổ sung, dầu Cọc rào có thể pha với dầu thường với tỉ lệ lên đến 20% (B20) Đây là nguồn năng lượng mới an toàn, chi phí thấp, tái sinh được, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lượng thay thế cho thủy điện, dầu diesel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi Nguồn năng lượng này sẽ giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lượng giữa các vùng Ưu điểm là khói từ dầu Cọc rào không có mùi và không cay như khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu [22]

Việt Nam phải chi khoảng một khoảng tiền khổng lồ để nhập khẩu các sản phẩm dầu và ngày càng tăng theo các năm Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hưởng đến toàn bộ nền kinh tế Trong tương lai, dầu Cọc rào sẽ thay thế một phần diesel dầu mỏ bởi nó có những đặc tính lý hóa tương tự như dầu diesel, các động cơ phải chạy bằng dầu diesel khi chuyển sang sử dụng dầu Cọc rào cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ

Hình 1.5: Dầu thô được ép từ hạt Cọc rào và sử dụng dầu để thắp sáng [78],

[79]

v Hiệu quả kinh tế của dầu Cọc rào

Bảng 1.1: Năng suất dầu của cây Cọc rào

6 trở lên 10.000

Nguồn: NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006

Như vậy với 1 ha cây Cọc rào 6 năm tuổi hằng năm có thể thu được 10 tấn dầu Hiện nay giá dầu Jatropha được bán trên thị trường thế giới với giá khoảng 300 USD/tấn [10]

v Dầu Jatropha so với các loại dầu thực vật khác

Trên thế giới hàng năm sản xuất khoảng 110 tỉ tấn dầu thực vật, 70% trong số đó được sản xuất từ 4 loại cây sau: Đỗ tương (26%), Dầu cọ (18%), Hướng dương (13%), Cải dầu (12%) Cây Cọc rào so với những cây trên là một cây khá mới mẻ, chưa được biết đến nhiều Nhưng nếu tính về phương diện sản xuất dầu sinh học thì cây Cọc rào cho hiệu quả kinh tế lớn hơn nhiều bởi Cọc rào là là lọai cây lâu năm, trồng một lần có thể thu hoạch từ 10 năm trở lên Cây có thể phát triển mà không cần chăm sóc nhiều trên những vùng đất khô cằn [22]

Hình 1.6: Sản lượng dầu của một số cây có dầu [80]

Cọc rào hấp thụ nhiều CO2 trong không khí Theo tính toán sơ bộ, một cây Cọc rào có khả năng hấp thụ 100 g CO2/ngày trong không khí, tính ra mỗi cây có khả năng hấp thụ 30 kg CO2/năm, mỗi ha có thể hấp thụ 48 tấn CO2-

/năm, góp phần giảm thiểu khí thải gây hiệu ứng nhà kính [68]

Trồng cây Cọc rào với độ che phủ tốt, tuổi thọ dài (30 – 50 năm), bộ rễ sâu, khối lượng lá rụng hàng năm lớn, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc chống xói mòn, tăng khả năng giữ nước, nâng cao độ che phủ của đất, cải tạo vùng đất xấu, đất sa mạc hóa, đất bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần phục hồi hệ sinh thái các vùng này [35]

Hình 1.7: Cọc rào cải tạo vùng đất xấu [81]

Cọc rào còn là cây chống cháy tốt, có thể trồng làm đường băng cản lửa,

bảo vệ rừng nhất là rừng nguyên sinh và các vườn quốc gia [68]

Phương pháp nhân giống cây Cọc rào chủ yếu theo lối cổ truyền là giâm

cành và gieo hạt Nuôi cấy mô chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở

lại đây

1.2 Sự đa dạng di truyền [12]

Sự đa dạng di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính

sinh sản của các cá thể trong quần thể Một quần thể là một nhóm cá thể giao

phối với nhau để sản sinh ra các thế hệ con cái hữu thụ Một quần thể có thể chỉ

vài cá thể đến hàng triệu cá thể

Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau, dù chỉ là rất

ít Gen là một đơn vị di truyền Những dạng khác nhau của một gen được gọi là

allen Tập hợp một nhóm allen trên một vùng nhiễm sắc thể (NST) được gọi là

một hallotype Sự khác nhau giữa các allen của cùng một gen thường là do đột

biến

Tổng các gen và allen trong một quần thể là nguồn gen của quần thể và

những tổ hợp của các allen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền Kiểu

hình của mỗi cá thể được thể hiện bằng các tính chất về hình thái, sinh lý, hóa

sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định

Số lượng khác biệt nhau về gen trong một quần thể được xác định bởi số

gen trong vốn gen đó mà có nhiều hơn một allen (được gọi là các gen đa hình)

và số các allen cho mỗi một gen đa hình Sự tồn tại của các gen đa hình cho

phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gen dị hợp tử, điều đó có nghĩa là

các cá thể có thể nhận được những allen khác nhau từ các gen trong mỗi bố mẹ

Sự khác biệt về gen cho phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường Nói chung, những loài quý hiếm thường đơn điệu về gen hơn so với những loài phổ biến, phân bố rộng và hậu quả là những loài quý hiếm thường rất nhạy cảm với sự biến đổi môi trường và dễ bị tuyệt chủng

1.2.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền

Biến dị di truyền là một trong những đặc điểm phổ biến của hầu hết các sinh vật Mục tiêu chính của việc bảo tồn sinh học là sự duy trì về đa dạng di truyền trong quần thể Đa dạng di truyền có vai trò rất quan trọng trong sự sống của quần thể bởi vì nó giúp cho quần thể phát triển và thích nghi trước những thay đổi của môi trường Do đó, biến dị di truyền là nền tảng cho quá trình tiến hóa

Cấu trúc di truyền là sự phân bố tỉ lệ của các dạng di truyền như là số allen hay kiểu hình trong quần thể Bất cứ sự thay đổi nào về cấu trúc di truyền của một quần thể đều liên quan đến ít nhất một vị trí của gen và điều này được xem như là điều kiện của sự tiến hóa Tác nhân làm thay đổi cấu trúc di truyền của một quần thể được gọi là nhân tố tiến hóa, bao gồm: đột biến, dòng chảy và

sự di chuyển của gen, sự phân mảnh di truyền, chọn lọc tự nhiên và hệ thống giao phối Nói một cách khác, các nhân tố tiến hóa có tác động phối hợp với nhau lên cấu trúc di truyền của tất cả các cá thể sinh vật trong quần thể

Sự biến đổi về cấu trúc di truyền không thể tìm thấy ở một cá thể riêng

lẻ mà nó chỉ xảy ra ở cấp độ quần thể Từ thông tin di truyền của một sinh vật

có thể truyền cho con cháu của chúng tạo nên nhiều điển hình khác nhau Việc theo dõi về cấu trúc di truyền trong một quần thể hay vài quần thể đòi hỏi phải điều tra nghiên cứu về hệ thống di truyền và tiến hóa

1.2.2 Dòng chảy của gen

Hệ thống dòng chảy của gen được mô tả bằng sự trao đổi của các thông tin di truyền ở trong và giữa các quần thể Vì thực vật không di chuyển được nên cơ quan giao tử cái cũng ở dạng cố định Do đó, có hai hướng nghiên cứu

cơ bản quan trọng cho sự biến động của gen chủ yếu là sự di chuyển của hạt phấn và hạt giống Dòng chảy của gen về sự di chuyển của hạt phấn có ý nghĩa hạn hẹp, còn sự di chuyển của cả hạt phấn và hạt giống thì có ý nghĩa rất lớn Điều này như là một nhân tố thiết yếu cho không gian cấu trúc di truyền của sự phân bố các loài trong cùng một khu vực

1.2.3 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền

Sự đa dạng di truyền giúp cho một loài sinh vật cụ thể có khả năng đáp ứng lại những biến đổi của điều kiện môi trường sống và tồn tại theo thời gian Đánh giá sự đa dạng di truyền của một quần thể là một trong những việc làm

cần thiết giúp chúng ta phác thảo ra những chiến lược bảo tồn in situ và ex sit

Hiểu biết về sự đa dạng di truyền của quần thể còn giúp ta có hướng khai thác nguồn tài nguyên di truyền một cách phù hợp

Sự đa dạng di truyền ở những loài cây có giá trị sử dụng cao là điều mong mỏi của các nhà lai tạo vì như thế họ có thể tạo ra một nguồn nguyên liệu phong phú cho công cuộc tạo ra những giống mới hoặc cải tiến một số đặc tính của một loài nào đó Do đó, việc bảo tồn nguồn gen cũng đồng nghĩa với việc bảo vệ nguồn nguyên liệu sống cho việc sử dụng trong một thời gian dài nhằm tạo ra thực phẩm, dược phẩm, quần áo, nhiên liệu cũng như những sản phẩm công nghiệp khác cho cuộc sống

Được trồng để sản xuất nhiên liệu sinh học, Cọc rào là loài cây rất có giá trị nhờ cung cấp dầu của hạt Tuy nhiên một số nghiên cứu ban đầu cho thấy khả năng cho dầu và thành phần acid béo của các giống khác nhau là khác nhau, trồng ở điều kiện khác nhau thì hàm lượng dầu cũng khác nhau [68] Do

đó việc chọn được đúng giống tốt là việc làm tối cần thiết Quần thể với tính đa dạng di truyền cao sẽ cung cấp nhiều lựa chọn hơn cho nhà chọn giống trong việc lựa chọn dòng mẹ ban đầu Ngoài ra, việc xác định được marker di truyền đối với những dòng có khả năng cho hàm lượng dầu cao, có thành phần acid

béo mong muốn cũng có thể giúp cho nhà chọn giống trong việc lựa chọn giống tốt cho nghiên cứu và sản xuất

1.4 Những phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học ở thực vật

1.3.1 Marker di truyền

Marker di truyền là những đặc điểm hình thái được kiểm soát bởi một hay vài gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó Gen thể hiện bản chất di truyền

sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà có thể đo đếm được, gen đó

có thể xem như marker gen Có nhiều loại marker di truyền khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu di truyền như: marker hình thái, con đường biến dưỡng các hoạt chất thứ cấp, các isozyme và các DNA marker

Trước đây, khi sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền chưa phát triển thì marker hình thái thường được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng này Tuy nhiên, các marker này có nhiều điểm hạn chế như: 1) các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài; 2) các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái nói chung thường giới hạn trong một locus; 3) nhiều đặc điểm hình thái chỉ

có thể quan sát được vào cuối chu kì sống; 4) nhiều đặc tình hình thái không riêng biệt mà liên tục và chồng lấp ở giữa

Từ sau thập niên 70, việc áp dụng những kỹ thuật mới về sinh hóa và sinh học phân tử cho phép giải quyết được những khó khăn về nghiên cứu đa dạng di truyền Theo sau đó, isozyme marker đã làm thay đổi theo chiều hướng tốt hơn, kỹ thuật này vẫn có một số ưu điểm mà ngày nay chúng vẫn còn được

sử dụng phát triển cao hơn dựa trên các kỹ thuật điện di 2 chiều, 3 chiều nhằm

có thể phân biệt các protein ít khác nhau nhất Isozyme marker nổi bật ưu điểm

là rẻ tiền, nhanh, vật liệu có thể được sử dụng trong một thời gian dài tuy nhiên, khả năng phát hiện nhiều bản sao enzyme ở cùng một locus thấp và số lượng marker isozyme còn ít không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu

Trong những năm gần đây, khi sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền phát triển mạnh mẽ, thì nhiều marker di truyền dựa trên DNA cũng được phát triển và mở ra một kỉ nguyên mới cho ngành sinh học quần thể và bảo tồn Các marker này giúp chúng ta hiểu và từ đó có biện pháp quản lý và sử dụng sự đa dạng di truyền của quần thể một cách tốt hơn

1.3.2 DNA marker

DNA marker là những marker phân tử được tạo ra dựa trên việc sử dụng các chuỗi mã DNA để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau DNA marker rất phong phú do sự đa dạng của DNA và chúng không phụ thuộc vào yếu tố môi trường Trong chọn lọc nhờ DNA marker, các gen mục tiêu được phát hiện nhờ các marker mà không cần sự biểu hiện thành kiểu hình của gen đó Hiện nay, các loại DNA marker được sử dụng trên thế giới: RFLP, AFLP, RAPD, SSR, … đã giúp phân tích tinh vi hơn cấu trúc di truyền của quần thể và các sự kiện khác trong quá trình sinh học tiến hóa của chúng Sự phát triển mạnh mẽ cùng với số lượng nhiều các kĩ thuật phân tử trên đã giúp chúng ta giải quyết được nhiều vấn đề liên quan đến sự di truyền cũng như bảo tồn các quần thể thực vật Các kĩ thuật này cho phép khảo sát để thu lượng lớn

dữ liệu về sự biến đổi trong quần thể và loài

1.3.3 RAPD – Random amplified polymorphic DNA [19], [38]

RAPD ra đời vào năm 1990 do nhóm nghiên cứu của William và cộng

sự Theo William, từ RAPD là từ viết tắt của “random amplified polymorphic DNA“ và được phát âm là “rapid“ (ra - bit), nghĩa là “đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên“ Một kĩ thuật tương tự cũng được phát triển đồng thời với kĩ thuật này là AP-PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction ) do nhóm nghiên cứu độc lập của Welsh và McClelland

RAPD dựa trên kĩ thuật PCR, sử dụng những mồi ngẫu nhiên, ngắn (khoảng 9-10 nucleotide) nhằm nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA tạo ra

sự đa hình Theo nguyên tắc, khi có đột biến làm thay đổi, mất đi hay thêm vào một hay một vài nucleotide ngay tại giữa các vị trí gắn mồi sẽ tạo ra số lượng

và chiều dài các đoạn khuếch đại khác nhau Theo nguyên tắc này, DNA của những cá thể khác nhau với những khác nhau về chủng loại cũng như trật tự sắp xếp các nucleotide hoặc những cá thể khác nhau do mang những đột biến khác nhau trong quá trình tiến hóa thì khi được khuếch đại với cùng điều kiện,

sử dụng các mồi ngẫu nhiên ngắn, sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn khuếch đại khác nhau, và do đó tạo ra sự đa hình

Hầu hết các mồi sử dụng trong kĩ thuật PCR đều được thiết kế giàu G-C

(trên 40%) và không chứa trình tự palindrome Do sử dụng các mồi ngắn nên nhiệt độ bắt cặp của phản ứng thường dưới 40oC Sự bắt mồitrong phản ứng RAPD về cơ bản là bắt cặp bổ sung một cách hoàn toàn Đoạn khuếch đại thường có chiều dài trong khoảng 200-2000 bp

RAPD là marker di truyền trội nên không phân biệt được đồng hợp tử hay dị hợp tử của cùng một kiểu gene, dựa trên kĩ thuật PCR nhưng không cần biết trước trình tự của DNA bản mẫu, do đó được xem là một marker di truyền đơn giản và kinh tế trong việc lập bản đồ gen, hay trong các ứng dụng của ngành lai tạo giống, trong việc xác định dấu vân tay DNA và đặc biệt là rất hữu dụng trong ngành di truyền học quần thể

1.3.5 Ứng dụng nghiên cứu tính đa hình DNA trong xây dựng cây phát

sinh loài

1.3.4.1 Một số thuât ngữ

Phylogenetic tree (cây tiến hóa hay cây phát sinh loài): là một mô phỏng quá trình tiến hóa của các cá thể và trình tự xảy ra Một cây tiến hóa thường bao gồm các điểm: điểm cùng, điểm giữa, điểm gốc và các điểm nối với nhau bởi các nhánh

Điểm cùng: biểu diễn cho các cá thể, loài hay dòng các đơn vị mà

chúng ta quan tâm Điểm cùng chính là đơn vị tiến hóa OTU (Opertional

Taxonomic Units)

Điểm giữa: biểu diễn cho các tổ tiên của các OTU, là một đơn vị trung

gian, phát sinh ra các OTU

Điểm gốc: biểu diễn cho tổ tiên của tất cả các đơn vị nghiên cứu, là

điểm bắt đầu của cây tiến hóa Điểm gốc này có thể có hoặc không tùy theo loài cây tiến hóa

Có hai loại cây tiến hóa thường sử dụng: cây có gốc và cây không gốc

Cây có gốc: là loại cây tiến hóa phát sinh từ một điểm, điểm gốc Qua

cây tiến hóa này có thể biết được thứ tự các đơn vị tiến hóa

Cây không gốc: trong loại cây tiến hóa này không có điểm phát sinh, nó

không diễn tả được thứ tự tiến hóa của các điểm cũng như mối quan hệ giữa các đơn vị trong cây

Khi chuyển từ loại cây tiến hóa không gốc sang cây có gốc thì điểm gốc

có thể được đặt ở nhiều vị trí mà không thể định hướng Các đơn vị kế cận nhau được biểu diễn trong cây tiến hóa không gốc thì không có nghĩa là nó sẽ nằm gần nhau trong cây tiến hóa có gốc

1.3.4.2 Các phương pháp chủ yếu xây dựng cây phát sinh loài

Khi nghiên cứu về di truyền tiến hóa, kết quả có được chính là các vạch trên bản gel (RAPD), các tín hiệu trên màng lai (RFLP), những kết quả này rất phức tạp Do đó, các nhà nghiên cứu phải cần đến sự trợ giúp của máy tính với các phần mềm chuyên dụng như chương trình NTSYS-pc 2.1, POPGENE 1.31

để tính được các thông số: hệ số tương quan di truyền, khoảng cách gen giữa các đơn vị tiến hóa được tính theo các phương trình của Nei (1987) Từ các kết quả đó, việc xây dựng cây phát sinh loài thường sử dụng các phương pháp UPGMA, Neighbor - Joining, Maximum likehood,… Trong đó có hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là UPGMA và Neighbor joining, chúng đều dựa trên việc giải quyết các ma trận về khoảng cách gen và độ tương đồng gen giữa các đơn vị tiến hóa

* UPGMA – Unweighted Pair – Group Method with Arithmetic

Đây là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất để xây dựng cây phát sinh loài Phương pháp này ra đời từ năm 1973 sử dụng thuật toán phân cụm, mối quan hệ giữa các cụm được xác định dựa trên thứ tự mức

độ giống nhau giữa các cá thể

Với ma trận cho trước, các thông số là các kết quả có được từ phân tích marker phân tử Thuật toán sẽ nhóm 2 đơn vị tiến hóa (ví dụ: OTU A và OTU B) có khoảng cách nhỏ nhất (mức độ tương đồng cao nhất) Hai OTU vừa nhóm được xem là một OTU mới trong việc giải quyết ma trận tiếp theo Thuật toán tiếp tục nhóm 2 OUT có khoảng cách nhỏ nhất và cứ thế cho đến hết Cuối cùng là nó tạo ra một cây tiến hóa có gốc

* Neighbor – Joining

Neighbor – Joining là một trong những phương pháp tạo ra cây tiến hóa với ít nhánh nhất Nguyên tắc của phương pháp này là tìm ra các cặp hàng xóm hợp lí nhất làm giảm thiểu tổng chiều dài của cây tiến hóa Phương pháp này

khởi đầu với một cây hình sao, trong đó, các OTU không nối với nhau Trong các cặp OTU được lựa chọn để sắp xếp, phải thỏa điều kiện là có tổng chiều dài nhánh nhỏ nhất Cặp OTU này được tạo ra xem như là một OTU mới và là bước tiếp theo của thuật toán lại lựa chọn cặp OTU sao cho tổng chiều dài nhánh nhỏ nhất Quá trình cứ thế lặp lại cho đến khi cuối cùng tạo ra một cây tiến hóa không gốc

1.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền của Cọc rào

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Hai mươi năm sau khi được phát minh (1990 - 2010), kỹ thuật RAPD đã được sử dụng trong hàng ngàn nghiên cứu về đa dạng di truyền của rất nhiều loài trên thế giới Riêng Cọc rào, có đã rất nhiều nghiên cứu về đặc tính di

truyền của các loài thuộc chi Jatropha và giữa các giống Cọc rào ở các địa

phương khác nhau

Năm 2007, S Ganesh Ram cùng cộng sự đã sử dụng kĩ thuật RAPD để

nghiên cứu mối tương quan di truyền giữa bảy loài trong chi Jatropha và năm mẫu Jatropha curcas L trồng ở các địa phương khác nhau [32]

Năm 2008, Ikbal cùng cộng sự sử dụng kĩ thuật RAPD để phân tích tính

đa dạng di truyền của 40 mẫu Cọc rào thu thập từ nhiều địa phương khác nhau [38] Shweta Gupta đã phân tích sự đa dạng di truyền các kiểu di truyền khác nhau của Cọc rào bằng kỹ thuật ISSR and RAPD [34] K Subramanyam cùng

mẫu Cọc rào thu thập từ các vùng khí hậu, sinh thái khác nhau của Ấn Độ [64]…

Năm 2009, Mohamad Abdulla Jubera cùng cộng sự đã nghiên cứu tính

đa dạng di truyền của giống Cọc rào tuyển chọn bằng kỹ thuật RAPD [46]

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, những ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học ở thực vật khá phát triển Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng sinh học phân tử để phân tích đa dạng di truyền Trong đó, RAPD được xem là

kỹ thuật tương đối đơn giản, kinh tế được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên một số đối tượng thực vật

Năm 1999, Võ Thương Lan đã bảo vệ thành công đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng của một số loài rong câu ở vùng ven biển miền nam Việt Nam

Năm 2007, Văn Hồng Thiện đã khảo sát đặc điểm di truyền và tinh dầu

các quần thể Tràm (Melaleuca cajuputi) ở một số khu vực thuộc các tỉnh Miền

Nam Việt Nam [12]

Trần Thị Ngọc Diệp (2009) đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của

một số giống ngô (Zea mays L.) [84] Nguyễn Thị Ngọc Tuyết nghiên cứu tính

đa dạng di truyền của quần thể Thông đỏ (Taxus wallichiana zucc.) tại Lâm

Đồng [13]

Năm 2010, Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã phân tích mối quan hệ di truyền

của một số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) dựa trên chỉ thị RAPD

[83]

Đối với cây Cọc rào (Jatropha curcas L.), những nghiên cứu trước đây

chủ yếu tập trung vào các điều kiện sinh thái, thổ nhưỡng, hình thái, năng suất, hàm lượng dầu của các giống thử nghiệm… vẫn chưa có nghiên cứu nào về đa dạng di truyền Chính vì vậy, mục đích của luận văn này chúng tôi tiến hành khảo sát mối quan hệ di truyền của các cá thể Cọc rào thu thập từ một số địa phương của nước ta và các cá thể Cọc rào nhập từ nước ngoài Đặc biệt thông qua kết quả của kỹ thuật RAPD có thể tìm ra marker nhận diện một số giống Cọc rào của một số đia phương

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.1 Hạt Cọc rào

Hạt được thu thập gồm: 7 mẫu thu thập ở Bình Thuận, 5 mẫu ở Ninh Thuận, 1 mẫu ở Phú Yên, 1 mẫu ở Khánh Hòa, 1 mẫu ở Lâm Đồng, 2 mẫu nhập từ Ấn Độ, Úc và 2 mẫu ở Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2008 đến tháng 3/2009 Tất cả các mẫu hạt được bảo quản trong điều kiện khô, mát (4oC)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu Cọc rào

STT Ký hiệu Nơi thu mẫu Ngày thu mẫu

(Nhà máy dầu Tường An)

6/2008

15 BT6 Xã Lợi Hải – Huyện Thuận Bắc – Tỉnh Bình Thuận 12/2008

Tỉnh Bình Thuận

12/2008

- Bể ổn nhiệt (Fisher scientific)

- Tủ âm (-) 86oC Nuaire ILS-DF8517E

- Máy đo pH Digimed DM-21

- Bộ thiết bị điện di ngang Advance

- Máy PCR BioRad MyCycle

- Máy ly tâm Mikro 22R (HettechZentrifugen - Germany)

- Máy đo quang phổ hấp thụ Genequant pro

2X CTAB: 2% hexadecyltrimethylammonium bromide CTAB (w/v);

100 mM Tris (pH 8,0); 20 mM EDTA (pH 8,0); 1,4 M NaCl; 1% PVP (polyvinylpyrrolidone)

Quy trình 2: Không sử dụng nitơ lỏng

- Dung dịch tách chiết A (EBA): 2% CTAB (w/v); 100mM Tris (pH 8,0); 20mM EDTA (pH 8,0); 1.4M NaCl; 4% PVP (w/v); 0,1% ascorbic acid (w/v); 10mM β-mercaptoethanol (BME)

- Dung dịch tách chiết B (EBB): 100mM Tris-HCl (pH 8,0); 50mM EDTA; 100mM NaCl; 10mM β-mercaptoethanol (BME); 20% sodium dodecyl sulphate (SDS) (w/v)

Dung dịch biến tính protein

- Dung dịch Ethium bromide 10 mg/ml

- Dung dịch nạp mẫu điện di (loading dye): bromophenol blue; 30% glycerol trong nước cất; 0,25% xylen cyanol

acid 1,14 ml; thêm nước cất cho đủ 1000ml

2.1.3.3 Hóa chất phản ứng PCR

- Tag DNA polymeras nồng độ 1,5 U/µl (Fermentas)

- Dung dịch đệm PCR 10X (đi kèm với ) có thành phần 500 mM KCl; 15

- dNTP có 4 loại: dATP; dCTP; dGTP; dTTP

- Mồi ngẫu nhiên: sử dụng 18 mồi

Bảng 2.2 Bảng mồi ngẫu nhiên cho phản ứng RAPD [32]

STT Tên mồi Trình tự Nhà cung cấp

2.1.3.4 Thang DNA

- Sử dụng thang 100 bp (Fermentas)

- Thang 100 bp được sử dụng trong việc khảo sát và tối ưu phản ứng RAPD được chạy điện di trên gel Agarose 2% trong 60 phút ở hiệu điện thế 80V

Hình 2.1: Thang chuẩn 100bp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2 2.1 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA

Bằng thực nghiệm cho thấy, mô của cây Cọc rào chứa tanin và các hợp chất phenol ở mức cao Khi tế bào bị phá vỡ, các hợp chất này có thể tiếp xúc với nhân và các bào quan khác Ở dạng oxy hóa, các phenol này liên kết hóa trị với DNA làm chúng có màu nâu, khó nghiên cứu Để tìm ra một phương pháp tách chiết DNA tối ưu: dễ thực hiện, cho kết quả DNA tinh sạch và nguyên vẹn, chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình tách chiết DNA trên 5 mẫu Cọc

rào: BT1, BT2, NT1, NT2 và giống nhập từ Ấn Độ

Quy trình 1: Có sử dụng nitơ lỏng khi nghiền mẫu

DNA của các mẫu Cọc rào được chiết xuất và tinh sạch từ nguồn lá tươi,

áp dụng phương pháp CTAB của Steward 1993 [62]

Bước 1: Mẫu lá non tươi được rửa sạch, lắc cồn 70o trong 5 phút và rửa lại

Bước 4: Thêm 0,5ml phenol/chloroform (1:1 v/v), đảo đều trong 5-10 phút ,

sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút

Bước 5: Cẩn thận chuyển lớp dịch trong bên trên sang tuýp 1,5 ml mới, sau

đó thêm 500µl isopropanol lạnh và lắc nhẹ Ủ ở nhiệt độ -20oC trong 1h hoặc có thể ủ qua đêm

Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút Hút bỏ dịch nổi, thu cắn

Bước 9: DNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng

Quy trình 2: Không sử dụng nitơ lỏng khi nghiền mẫu

DNA của các mẫu Cọc rào được chiết xuất và tinh sạch từ nguồn lá tươi, áp dụng phương pháp CTAB của Keb-Llanes đã được bổ sung 2002 [43]

Bước 1: Mẫu lá non tươi được rửa sạch, lắc cồn 70o

trong 5 phút và rửa lại bằng nước cất 3 lần

Bước 2: Cân khoảng 0,1g – 0,15g lá non, cắt nhỏ cho vào ependorf 1,5ml

Dùng chày giã nhuyễn

Bước 3: Thêm vào mẫu 300 µl EBA, 900 µl EBB và 10 µl SDS

Bước 4: Trộn đều mẫu và ủ 65oC trong 10 phút

Bước 5: Đặt ependorf trên đá và thêm 410 µl potassium acetate trong 30

phút Đảo đều hỗn hợp và đặt trở lại trên đá trong 3 phút

Bước 6: Ly tâm 13200 vòng trong 15 phút (tốt nhất ở nhiệt độ 4oC)

Bước 7: Cẩn thận chuyển 1 ml lớp dịch trong bên trên sang tuýp 1,5 ml

mới, sau đó thêm 540 µl isopropanol lạnh Ủ trong tủ lạnh (- 20oC) trong 20 phút

Bước 8: Ly tâm 10200 vòng trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi, thu cắn Thêm

500 µl cồn 70 % lạnh (rửa cồn 3 lần) Để khô nhiệt độ phòng

Bước 9: Hòa tủa với 600 µl TE Thêm 60 µl sodium acetate và thêm 360 µl

isopropanol lạnh Ủ trên đá trong 20 phút

Bước 10: Lặp lại bước 8 và 9 hai lần

Bước 11: Hòa tủa với 50 µl TE và bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng

2.2.2 Các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm DNA thu được sau khi tách chiết

DNA thu được từ 2 quá trình tách chiết được so sánh với nhau dựa trên các chỉ tiêu:

Độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tách chiết: chỉ tiêu này được xác định bằng cách đo độ hấp thu ánh sáng của các mẫu ở bước sóng 260 nm (OD260nm) và ở bước sóng 280 nm (OD280nm) từ đó tính tỷ số OD260nm / OD280nm

để xác định độ tinh sạch của mẫu Mẫu DNA thu được tinh sạch khi tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 Tỉ lệ thấp hơn 1,8 cho thấy mẫu bị nhiễm protein hoặc các chất hấp thụ UV khác Tỉ lệ cao hơn 2 thì mẫu bị nhiễm chloroform, phenol hoặc RNA và được xử lí lại với ethanol hoặc RNase Đồng thời cũng ghi nhận hàm lượng của DNA tách chiết

Độ nguyên vẹn của mẫu DNA thu được: Xác định độ nguyên vẹn của mẫu DNA bằng cách chạy điện di sản phẩm thu được trên gel agarose 1% và so sánh kết quả trên bảng điện di Mẫu DNA có độ nguyên vẹn cao khi trên bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn

2.2.3 Thiết lập phản ứng RAPD

2.2.3.1 Chương trình phản ứng RAPD

Dựa trên nguyên tắc cơ bản của phản ứng RAPD đồng thời cùng với việc nghiên cứu tài liệu về phản ứng RAPD trong và ngoài nước, chúng tôi đã tiến hành thiết lập phản ứng RAPD trên máy PCR BioRAP C1000 có quy trình sau:

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt trong phản ứng RAPD [32]

Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kì

2.2.3.3 Tối ưu hóa thành phần phản ứng RAPD

Phản ứng RAPD thực hiện dựa trên sự bắt cặp các mồi ngẫu nhiên xảy

ra trong tình trạng không nghiêm ngặt Do đó, mọi yếu tố đều có ảnh hưởng đến kết quả phản ứng Vì vậy để có được kết quả RAPD ổn định, các băng sáng

và rõ ràng, chúng tôi tiến hành xác định các thành phần tạo ra một phản ứng RAPD cho kết quả tối ưu

Chúng tôi thực hiện tối ưu các thành phần của phản ứng PCR lần lượt ở nồng độ ở bảng 2.4

Bảng 2.5: Các thành phần và nồng độ tương ứng tiến hành tối ưu

Kết quả được thực hiện lặp lại nhiều lần trên mỗi khảo sát cho đến khi cho kết quả ổn định , các băng (vạch) rõ, sáng mới tiến hành bước khảo sát tiếp theo

Dựa trên kết quả tối ưu của phản ứng RAPD-PCR, chúng tôi cũng tiến hành sàng lọc các mồi hữu hiệu cho nghiên cứu

2.2.4 Phân tích kết quả đa hình từ phản ứng RAPD

2.2.4.1 Phân tích kết quả đa hình của các cá thể Cọc rào

Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD-PCR với nguyên tắc nhị phân: Với “1” nghĩa là có sự xuất hiện vạch khuếch đại, với “0” là không có vạch khuếch đại Chỉ các băng rõ, ổn định và lặp lại có kích thước khoảng 200-

2000 bp được dùng trong phân tích dữ liệu Các vạch không rõ được loại bỏ

Để hiển thị mối quan hệ di truyền giữa các mẫu khảo sát, 1 sơ đồ hình cây được xây dựng trên chỉ số tương ứng đơn giản SM (Simple Matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-Groug Method with Arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1

2.2.4.2 Phân tích khoảng cách di truyền giữa ba dòng Cọc rào Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh

Ma trận nhị phân được sử dụng để tính các tham số di truyền bằng chương trình POPGENE version 1.31 Các tham số quan tâm là: Hệ số đa dạng