KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ XỬ LÍ DEMECOLCINE LÊN KẾT QUẢ LOẠI NHÂN TẾ BÀO TRỨNG LỢN PHỤC VỤ CHO NHÂN BẢN VÔ TÍNH

Tiếp theo cừu Dolly các nhà khoa học của các nước Mỹ, Nhật Bản, Ý, Anh, Hàn Quốc,… đã bắt đầu điền tên mình lên bản đồ nhân bản vô tính động vật trên thế giới bằng những thành công trên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG XUÂN ĐẠI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ

XỬ LÍ DEMECOLCINE LÊN KẾT QUẢ LOẠI NHÂN TẾ BÀO TRỨNG LỢN PHỤC VỤ CHO NHÂN BẢN VÔ TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010

LỜI CẢM ƠN

Franklin Roosevelt đã từng nói một câu nói bất hủ: “Trong đời người có một điều tệ

hại hơn cả thất bại, đó là không dám thực hiện việc mình muốn làm” Trước khi

thực hiện đề tài này tôi cũng đã suy nghĩ rất nhiều và cũng được cảnh báo rằng có thể tôi sẽ gặp thất bại, nhưng với tình yêu và sự đam mê dành lĩnh vực nhân bản vô tính, tôi đã bắt tay vào thực hiện việc mình muốn làm Dù kết quả thế nào đi chăng nữa, tôi cũng cảm thấy rất vui mừng vì qua 1 quá trình làm việc tôi được tích lũy thêm kiến thức, kinh nghiệm và được làm công việc mình yêu thích Tôi không biết công trình của mình thành công tới đâu nhưng có một điều chắc chắn rằng kết cuộc tôi vẫn sẽ là người thất bại nếu không có sự dạy dỗ, động viên, chỉ bảo của thầy, cô, bạn bè và những người thân trong gia đình Vì vậy bằng tất cả tấm lòng của mình tôi xin gửi đến lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

Trước tiên, để hoàn thành cuốn luận văn này tôi xin bày tỏ sự ngưỡng mộ và lời cảm ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên – Trưởng phòng công nghệ phôi - Viện công nghệ sinh học, người hướng dẫn khoa học cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài Mặc dù rất bận rộn với công việc nhưng thầy vẫn dành thời gian chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quí báu, tận tình giúp đỡ, sửa từng câu, chữ cho một người chưa có kinh nghiệm viết văn phong khoa học như tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn Thầy còn truyền cho tôi niềm đam mê khoa học, sự nghiêm túc, trách nhiệm trong công việc nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phan Kim Ngọc đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài luận văn này Xin cảm ơn thầy vì những lời chỉ dạy bổ ích, tôi đã học được rất nhiều từ một người tâm huyết với khoa học như thầy

Qua gần 3 năm được học tập, làm việc dưới mái trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong BGH, Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học…Đặc biệt, tôi xin gửi lời tri ân đến PGS.TS Nguyễn Tường Anh, PGS.TS Phạm Thành Hổ, những người thầy đã định hướng, dạy bảo, nhắc nhở tôi

từ những ngày đầu khi làm luận văn

Qua đây cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Dương Tấn Nhựt (Viện sinh học Tây nguyên) đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian làm đề tài, có những chỉ dẫn khoa học quí báu cùng với những nhận xét thẳng thắn để giúp tôi làm việc được tốt hơn

Cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Thuận (Đại học Konkuk) đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quí báu trong lĩnh vực nhân bản vô tính

Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thị Ước, anh Cao Xuân Hiếu, Luyện Quốc Hải, anh Nguyễn Xuân Hưng (Viện CNSH) đã có những chỉ dẫn quí báu

Xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Thị Loan (Viện Pasteur Đà Lạt), TS Nguyễn Xuân Tùng, ThS Lương Văn Dũng, ThS Nguyễn Bích Liên (Khoa Sinh học- Đại học Đà Lạt) đã động viên nhắc nhở tôi

Cảm ơn các bạn trên diễn đàn sinhhocvietnam.com: Nguyễn Trường Khoa (Viện di truyền nông nghiệp), Nguyễn Xuân Cường (Viện Lâm nghiệp), Huỳnh Như Ngọc Hiển, Nguyễn Văn Cương, Nguyễn Hữu Hoàng, Nguyễn Khuê (ĐHKHTN TPHCM), Dương Văn Cường (ĐH Thái Nguyên), Lê Ngọc Hưng (ĐH Bách khoa

Hà Nội), Trần Giang Vũ Vi (ĐH Bách khoa Đà Nẵng), Nguyễn Ngọc Lương (ĐH Huế) đã hỗ trợ các bài báo quốc tế trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Trong suốt hơn 1 năm làm việc cùng với các bạn phòng thí nghiệm Nghiên cứu và

Ứng dụng tế bào gốc tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Văn Phúc, Chị Thương

Huyền cùng các bạn Lê Trầm Nghĩa Thư, Lê Thành Long, Phạm Quốc Việt, Chung

Tố Nhi, Trương Hải Nhung, Nguyễn Mai Hương, Ngô Duy Bình, Nguyễn Thị Diệu Hằng, Đặng Thị Tùng Loan, Trần Thị Như Mai, Nguyễn Thành Trung, Vũ Bích Ngọc, Lê Thành Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên tôi

Đặc biệt, xin cảm ơn đến các cộng sự Nguyễn Mỹ Anh, Nguyễn Khánh Hòa, Trần

Thị Thu Phương, Võ Hồ Diệp Khánh đã cùng tôi thức trắng đêm trong hơn 1 năm

để thực hiện đề tài

Cảm ơn các bạn Nguyễn Thanh Hiền (ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội), Nguyễn Xuân

Đồng, Lê Bá Cung, Nguyễn Đức Huy, Nguyễn Thị Phương Mai (ĐH Đà Lạt) đã động viên, giúp đỡ, góp ý

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Đinh Thiện Mỹ, Đinh Văn Tí và 2 em Thiện Phú, Huyền Cơ

Cảm ơn các bạn Hồng Phúc, Hoàng Anh, Hữu Duy, Giang, Băng, Tâm, Nhàn, Thi, Chi, Sen, Hân, Thùy, Lâm, Khương, Thảo lớp SLĐV K17

Xin cảm ơn tập thể lãnh đạo Công Ty VISSAN, các cô chú bảo vệ, các anh chị trong công ty, chúc công ty ngày càng phát triển Cảm ơn các bạn trong lab của IVF Vạn Hạnh Cảm ơn các anh, chị, cô, chú phục vụ ở thư viện trung tâm thuộc ĐHQG TPHCM, thư viện Cao học ĐHKHTN, thư viện Khoa học tổng hợp TPHCM

Cảm ơn em đã bên cạnh, động viên anh trong những lúc khó khăn…

Cảm ơn em Đoàn đã động viên anh hai

Và hơn hết, từ đáy lòng mình, Con xin cảm ơn Ba, Má đã nuôi con khôn lớn, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được học hành, làm việc và là chỗ dựa cho con mỗi khi khó khăn

TPHCM, ngày 23 tháng 8 năm 2010

Trương Xuân Đại

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục hình

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Đặt vấn đề

Phần I: Tổng quan tài liệu

1.1 Tế bào trứng, vai trò của nhân, nguyên sinh chất trong quá trình hình thành,

phát triển tế bào trứng và nhân bản vô tính 1

1.1.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng 1

1.1.2 Sự thành thục của tế bào trứng 2

1.1.2.1 Sự thành thục nhân 3

1.1.2.2 Sự thành thục tế bào chất 3

1.1.3 Hoạt động phân tử của tế bào trứng 4

1.1.3.1 MPF-nhân tố phát động chín trứng 4

1.1.3.2 CSF-nhóm ức chế tế bào 5

1.1.3.3 MAP kinase 6

1.1.3.4 APC- phức hợp phát động anaphase 6

1.1.4 Sự tái thiết lập chương trình khi thực hiện cấy nhân 6

1.2 Đại cương về loại nhân trong nhân bản vô tính động vật 7

1.2.1 Loại nhân bằng phương pháp “mò mẫm” (“Blind” enucleation) 7

1.2.2 Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng tia cực tím 8

1.2.3 Loại nhân bằng phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation enucleation) 8

1.2.4 Loại nhân bằng phương pháp telophase (Telophase enucleation) 9

1.2.5 Loại nhân bằng phương pháp sử dụng hóa chất hỗ trợ (Chemical assistant enucleation) 10

1.2.5.1 Tổng quan về demecolcine 11

1.2.5.2 Tính chất của demecolcine 11

1.3 Nhân bản vô tính lợn 12

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân bản vô tính ở lợn 14

1.3.1.1 Tế bào cho 14

1.3.1.2 Kĩ thuật chuyển nhân 14

1.3.1.3 Hoạt hóa 15

1.3.1.4 Sự tái thiết lập chương trình và phát triển phôi lợn 16

1.3.2 Những thay đổi khi loại nhân bằng phương pháp sử dụng demecolcine trong nhân bản vô tính ở lợn 17

1.3.3 Chuẩn bị tế bào nhận 17

1.4 Nhân bản vô tính ở Việt Nam 21

Phần II: Vật liệu- phương pháp 2.1 Đối tượng thí nghiệm 23

2.2 Dụng cụ và thiết bị 23

2.2.1 Dụng cụ 23

2.2.2 Thiết bị 24

2.3 Hóa chất và môi trường 25

2.3.1 Hóa chất 25

2.3.2 Môi trường 25

2.3.2.1 Môi trường thu nhận buồng trứng 25

2.3.2.2 Môi trường thu nhận và rửa tế bào trứng 26

2.3.2.3 Môi trường nuôi thành thục trứng in vitro 26

2.3.2.4 Môi trường ủ tế bào trứng trước khi loại nhân 26

2.3.2.5 Môi trường loại nhân tế bào trứng 26

2.4 Phương pháp 27

2.4.1 Phương pháp thu nhận buồng trứng lợn 28

2.4.2 Thu nhận tế bào trứng lợn 29

2.4.2.1 Thu nhận bằng phương pháp chọc hút 29

2.4.2.2 Thu nhận bằng phương pháp cắt nang 29

2.4.3 Phương pháp nuôi thành thục trứng in vitro 30

2.4.4 Phương pháp loại tế bào cumulus 31

2.4.5 Phương pháp khảo sát nồng độ demecolcine thích hợp cho loại nhân32 2.4.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian thích hợp cho việc loại nhân 32

2.4.7 Ảnh hưởng của thời gian IVM đến kết quả loại nhân 32

2.4.8 Khảo sát ảnh hưởng của demecolcine kết hợp cytochalasin B lên tế bào trứng 33

2.4.10 Phương pháp loại nhân tế bào 33

2.4.10.1 Phương pháp ép đẩy 34

2.4.10.2 Phương pháp xử lí demecolcine và kết hợp hút nhân 35

2.4.11 Phương pháp nhuộm Hoechst 33342 37

2.4.12 Phương pháp thống kê 37

Phần III: Kết quả -biện luận 3.1 Kết quả thu và nuôi trứng thành thục 38

3.1.1 Kết quả thu trứng 38

3.1.2 Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp cắt nang 40

3.1.3 Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp chọc hút 41

3.1.4 So sánh hiệu quả của 2 phương pháp 42

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine lên tế bào trứng 45

3.3 Kết quả khảo sát thời gian xử lí demecolcine thích hợp cho loại nhân 48

3.4 Ảnh hưởng của thời điểm xử lí loại nhân tế bào trứng bằng demecolcine 49

3.5 So sánh hiệu quả loại nhân giữa phương pháp ép- đẩy và phương pháp xử lí demecolcine kết hợp với hút nhân 52

3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của demecolcine và cytochalasin B lên hiệu quả tạo chỗ nhô của tế bào trứng 56

Phần IV: Kết luận-đề nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSA bovine serum albumin

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo tế bào trứng lợn 1

Hình 1.2 Các giai đoạn của quá trình sinh trứng 2

Hình 1.3 Các giai đoạn thành thục của nhân 3

Hình 1.4 Hoạt động của phân tử MPF trong tế bào trứng 4

Hình 1.5 Vai trò của CSF trong tế bào trứng 5

Hình 1.6 Công thức cấu tạo demecolcine 11

Hình 1.7 So sánh giữa sinh sản tự nhiên và sinh sản vô tính 12

Hình 1.8 Mô hình gen trị liệu khi sử dụng lợn nhân bản vô tính 13

Hình 1.9 Các bước trong kĩ thuật nhân bản vô tính lợn 14

Hình 2.1 Hệ thống vi thao tác và kính hiển vi đảo ngược 24

Hình 2.2 Tủ đựng hóa chất 25

Hình 2.3 Máy mài kim 25

Hình 2.4 Máy tạo dáng kim 25

Hình 2.5 Máy kéo kim 25

Hình 2.6 Tủ thao tác vô trùng 25

Hình 2.7 Buồng trứng lợn 28

Hình 2.8 Hình dạng các tế bào trứng loại A, B, C 30

Hình 2.9 Các bước loại bỏ tế bào cumulus của tế bào trứng 31

Hình 2.10 Các bước loại nhân bằng phương pháp ép- đẩy 35

Hình 2.11 Đĩa 4 giếng có vi giọt và đĩa Φ90 có phủ dầu khoáng 35

Hình 2.12 Các bước loại nhân tế bào trứng bằng cách hút 37

Hình 3.1 Tế bào trứng đã xử lí demecolcine 47

Hình 3.2 Hình dạng tế bào trứng thay đổi theo thời gian xử lí demecolcine 49

Hình 3.3 Tế bào trứng ở các thời gian IVM khác nhau 51

Hình 3.4 Tế bào trứng 30-32 giờ (xử lí demecolcine) 52

Hình 3.5 Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân ép - đẩy 52

Hình 3.6 Kết quả nhuộm với Hoechst 33342 sau khi loại nhân 53

Hình 3.7 Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân bằng cách hút 54

Hình 3.8 Kết quả nhuộm Hoechst 33342 sau khi xử lí demecolcine, loại nhân 54 Hình 1 Máy kéo iii

Hình 2 Hệ thống máy mài và ảnh kim đang được mài qua thị kính iv

Hình 3 Kĩ thuật cắt đầu kim v

Hình 4 Kĩ thuật tạo kim giữ v

Hình 5 Kĩ thuật tạo đầu nhọn kim tiêm vi

Hình 6 Bẻ cong kim thao tác và góc bẻ cong vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành tựu nhân bản vô tính lợn từ 2000-2006 19

Bảng 2.1 Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.3 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ De và CB 33

Bảng 3.1 Kết quả phương pháp cắt nang và phương pháp chọc hút 38

Bảng 3.2 Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp cắt nang 40

Bảng 3.3 Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp chọc hút 41

Bảng 3.4 So sánh 1 số chỉ tiêu của 2 phương pháp 42

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát nồng độ demecolcine 45

Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian xử lí demecolcine 48

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời điểm xử lí demecolcine 50

Bảng 3.8 Kết quả loại nhân bằng phương pháp ép - đẩy 53

Bảng 3.9 Kết quả xử lí loại nhân bằng demecolcine kết hợp với hút nhân 54

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của De và CB lên hiệu quả tạo chỗ nhô 56

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 So sánh tỉ lệ trứng của 2 phương pháp 43 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine 46 Biểu đồ 3.2 So sánh 2 phương pháp loại nhân 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Không phải ngẫu nhiên mà các nhà khoa học đều dự đoán rằng thế kỉ XXI sẽ

là thế kỉ của công nghệ sinh học Những năm cuối của thế kỉ XX và đầu của thế kỉ XXI nhân loại đã bắt đầu chứng kiến những thành tựu mang tính bước ngoặt và đột phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học Ngày 5/7/1996, đã đi vào lịch sử ngành công nghệ sinh học thế giới với sự ra đời của cừu Dolly, động vật có vú đầu tiên trên thế giới được sinh ra bằng phương pháp nhân bản vô tính Sự kiện này đánh dấu một bước tiến nhảy vọt trong lĩnh vực nhân bản vô tính, đồng thời mở ra một trang sử mới cho nhân loại Tiếp theo cừu Dolly các nhà khoa học của các nước

Mỹ, Nhật Bản, Ý, Anh, Hàn Quốc,… đã bắt đầu điền tên mình lên bản đồ nhân bản

vô tính động vật trên thế giới bằng những thành công trên các đối tượng động vật khác như: bò, chuột, ngựa, lợn, dê, thỏ, khỉ,… Những thành công bước đầu này sẽ góp phần quan trọng vào việc sử dụng các cơ quan thay thế cho con người, tìm hiểu

cơ chế của sự lão hóa, nghiên cứu mô hình bệnh lí, bảo tồn động vật quí hiếm hoặc

ra đời bằng phương pháp nhân bản vô tính trên thế giới được ghi nhận năm 2000

Từ đó, đã có nhiều cải tiến về mặt kĩ thuật và phương pháp để dần hoàn thiện nhằm nâng cao tỉ lệ thành công

Hai loại tế bào cần thiết cho quá trình nhân bản vô tính là tế bào cho nhân (donor nucleus - karyoplast) và tế bào trứng nhận (recipient oocytes - cytoplast) rất

được quan tâm Tế bào trứng nhận chứa đầy đủ các thành phần cần thiết cho phép

nhân tế bào cho tái lập trình (reprogramming) Vì vậy, loại nhân là chìa khóa quan trọng cho sự thành công của nhân bản vô tính động vật Trong qui trình nhân bản vô tính thì khâu loại nhân (enucleation) là một khâu then chốt, nó có ảnh hưởng rất lớn

đến sự phát triển phôi cũng như tỉ lệ thành công trong kĩ thuật nhân bản vô tính

(Ibánẽz và cs., 2003) Có nhiều phương pháp loại nhân được đưa ra, bổ sung, phát triển và hoàn thiện với mục đích nhằm nâng cao tỉ lệ thành công trong việc tạo động vật nhân bản vô tính Tại Việt Nam, cùng với xu thế khoa học trên thế giới, các nhà khoa học trong nước tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TPHCM cũng đã từng bước tiếp cận với kỹ thuật nhân bản vô tính và đã có những thành công đáng khích lệ

Mặc dù demecolcine hay colcemid là một hóa chất hỗ trợ rất tốt để xử lí loại nhân tế bào động vật trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc sử dụng hóa chất hỗ trợ demecolcine để loại nhân chưa được đề cập nhiều Nhằm góp một phần nhỏ bé của mình vào những nghiên cứu nhân bản vô tính ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề

tài “Khảo sát ảnh hưởng của chế độ xử lí demecolcine lên kết quả loại nhân tế

bào trứng lợn phục vụ cho nhân bản vô tính”

Với mục tiêu nâng cao hiệu quả tạo tế bào trứng lợn đã được loại nhân thông qua:

Kết quả khảo sát nâng cao hiệu quả thu và nuôi thành thục tế bào

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tế bào trứng, vai trò của nhân, nguyên sinh chất trong quá trình hình thành, phát triển tế bào trứng và nhân bản vô tính

1.1.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng

Buồng trứng lợn có dạng hình hạt đậu, cấu tạo gồm hai phần chính: vỏ và tủy Buồng trứng được nối với ống dẫn trứng để nhận các tế bào trứng và vận chuyển trứng đến nơi thụ tinh Cấu trúc của buồng trứng gồm nhiều nang trứng, mỗi nang trứng có chứa tế bào trứng Trong tế bào trứng, bao quanh nhân là nguyên sinh chất, tiếp đến là khoảng không quanh bào tương, bên ngoài là lớp màng trong suốt (zona pellucida) Ngoài cùng là lớp tế bào hạt (cumulus) (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo tế bào trứng lợn

Sau khi sinh, các tế bào trứng của cá thể cái bước vào chu kì giảm phân và dừng ở giai đoạn prophase I, hình thành tế bào trứng sơ cấp Giai đoạn này được gọi

là giai đoạn túi mầm (germinal vesicle stage), bên trong tế bào trứng toàn bộ nhiễm sắc thể (NST) được bao bọc bởi túi mầm và tế bào trứng dừng phát triển cho đến khi cơ thể đạt độ tuổi thành thục sinh dục

Đến giai đoạn tiếp theo, một hoặc vài tế bào trứng sơ cấp sẽ tiếp tục quá trình giảm phân và phát triển thành tế bào trứng thứ cấp Trong suốt giai đoạn này màng nhân bắt đầu gấp lại, các lỗ trên màng nhân biến mất, màng nhân bị phân rãnh

và được đóng gói lại trong các túi nhỏ rồi sau đó bị tiêu hủy Hiện tượng này được gọi là sự phá vỡ túi mầm (germinal vesicle breakdown - GVBD), đây là tín hiệu đầu

tiên cho thấy hoạt động giảm phân của tế bào trứng được tiếp tục Sau khi tiếp xúc với tế bào chất, NST cô đặc lại, tâm động xuất hiện và bộ NST phân bố trên thoi vô sắc, giai đoạn này được gọi là giai đoạn metaphase I (MI) Sự phân chia bộ NST tương đồng và hai nửa bộ NST di chuyển về hai cực của tế bào đây là giai đoạn anaphase I Tuy nhiên, thoi vô sắc không nằm ở trung tâm mà di chuyển ra phía rìa của tế bào và kết quả là sau telophase I, một trong hai tế bào giữ lại hầu hết tế bào chất và tế bào còn lại chỉ chứa 1 phần vật liệu di truyền gọi là thể cực thứ nhất (polar body 1-PB1) (hình 1.2)

Hình 1.2 Các giai đoạn của quá trình sinh trứng (B Cummings, 2001)

1.1.2 Sự thành thục của tế bào trứng

Sự thành thục của tế bào trứng (oocyte maturation) bao gồm sự thành thục nhân và tế bào chất Theo Schoevers, sự thành thục về tế bào chất và nhân không thể tách rời nhau mà nó có mối liên hệ chặt chẽ, tương tác qua lại trong tế bào trứng (Schoevers và cs., 2005)

1.1.2.1 Sự thành thục nhân

Quá trình này được thể hiện trong nhân và trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm, metaphase I, metaphase II và cuối cùng là sự phóng noãn (hình 1.3)

Hình 1.3 Các giai đoạn thành thục của nhân (Wilson, 1925)

Khả năng giảm phân của trứng có liên quan mật thiết với kích thước tế bào trứng hay của nang chứa tế bào trứng đó Ở lợn, các nang trưởng thành có kích thước từ 2 đến 3 mm Tế bào trứng ở giai đoạn MII có đường kính khoảng 110 -120

µm Đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho nuôi chín trứng in vitro nhằm

đạt hiệu quả cao

1.1.2.2 Sự thành thục tế bào chất

Sự thành thục tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng thụ tinh của trứng, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) Sự thay

đổi hình thái, vị trí một số bào quan của trứng có ý nghĩa quan trọng đến sự thành

thục tế bào chất và chuẩn bị cho quá trình phát triển tiếp theo của tế bào trứng Trong đó, bộ phận quan trọng nhất để đánh giá sự thành thục của tế bào chất là bộ máy Golgi Trong tế bào trứng, bộ máy Golgi sẽ đảm nhiệm việc hình thành các tế bào hạt và màng trong suốt Số lượng thể Golgi hiện diện trong trứng tăng theo

đường kính của nang (Sosnowski và cs., 2003)

1.1.3 Hoạt động phân tử của tế bào trứng

Quá trình chuyển nhân tế bào sinh dưỡng (somatic cell nuclear transfer - SCNT) trong nhân bản vô tính động vật đạt hiệu quả cao hay thấp một phần được quyết định bởi hoạt động của các yếu tố phân tử của tế bào trứng Hiện nay, một số yếu tố phân tử được biết đến và có vai trò quan trọng như:

1.1.3.1 MPF - Nhân tố phát động chín trứng

Năm 1971, Massui và Markert đã chứng minh rằng tất cả các hiện tượng có liên quan đến tế bào trứng như: sự phá vỡ túi mầm, sự cô đặc của NST khi tiếp xúc với tế bào chất, giai đoạn MI, MII đều được điều hòa bởi 1 nhân tố gọi là nhân tố phát động trứng chín (maturation promoting factor - MPF) MPF là một protein kinase có cấu trúc dị phân tử kép (heterodimer) được mã hóa bởi gen cdc2 và điều hòa bởi tiểu đơn vị cyclin B (Nurse, 1990) Hoạt tính kinase của MPF khởi đầu cho hàng loạt phản ứng dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, đóng xoắn NST, tái cấu trúc bộ xương tế bào Ở tế bào trứng động vật có vú, MPF là nguyên nhân gây ức chế sự phát triển trứng ở giai đoạn MII Sự bất hoạt MPF và phân hủy cyclin B cũng gây ra

sự chuyển trạng thái trứng từ MII sang anaphase II (hình 1.4)

Hình 1.4 Hoạt động của phân tử MPF trong tế bào trứng (Staveley, 2004)

Cơ chất chính của MPF là protein histone H1 tham gia đóng gói NST Trong trường hợp cấy nhân hoạt tính MPF trong nội bào rất cao sau khi nhân của tế bào cho được chuyển vào trong tế bào chất của tế bào trứng nhận Ở đó sẽ xảy ra hiện tượng phá vỡ màng nhân và đóng xoắn NST Sự đóng xoắn của NST trong nhân tế bào cho sẽ được cảm ứng bởi tế bào chất nhận Mức độ đóng xoắn sớm hay muộn phụ thuộc vào hoạt tính MPF và thời gian tiếp xúc giữa chúng Hoạt tính của MPF

được điều hòa bởi yếu tố có tên gọi là nhóm ức chế tế bào (cytostatic factor - CSF)

(Endo và cs., 2008)

1.1.3.2 CSF - Nhóm ức chế tế bào

Trong các tế bào trứng ở giai đoạn MII, hoạt tính MPF cao hay thấp được

duy trì bởi các nhân tố thuộc nhóm ức chế tế bào Hoạt tính CSF liên quan tới

protein khác nhau như: MAP kinase (mitogen-activated protein kinase), cdk2 (cyclin-dependent kinase 2), các proto-oncogen c-mos… Trong đó, Mos là thành phần quan trọng của CSF, có vai trò ức chế sự phân hủy cyclin B, duy trì hoạt tính MPF đồng thời hoạt hóa MAP kinase Sự hoạt hóa MAP kinase lại ức chế hoạt tính phân hủy protein của ubiquitin và dẫn đến ức chế sự phân hủy cyclin B Do đó sự bất hoạt CSF làm cho quá trình phân hủy cyclin trở nên dễ dàng hơn từ đó làm giảm hoạt tính MPF (Cibelli và cs., 2002) (hình 1.5a)

Hình 1.5 Vai trò của CSF trong tế bào trứng (Inoue, 2007)

1.1.3.3 MAP kinase

MAP kinase giữ nhiều vai trò quan trọng trong điều hòa chu kì tế bào trong quá trình phát triển của tế bào trứng, đặc biệt là điều hòa sự cấu thành hệ vi ống Sau giai đoạn GVBD, MAP kinase phân bố ở các vị trí xảy ra sự tổng hợp các hệ thống vi ống như: (i) xung quanh vị trí các NST đóng xoắn, (ii) trong các thoi phân bào giảm ở giai đoạn MI, (iii) trong các vùng cực ở giai đoạn anaphase sớm, (iv) trong các vị trí trung tâm của thoi vô sắc được kéo dài ở giai đoạn chuyển tiếp từ anaphase sang telophase I và (v) trong thoi vô sắc ở giai đoạn MII (Fulka và cs., 2001) Ngoài ra, MAP kinase còn giữ trạng thái phosphoryl hóa cao từ giai đoạn MI

đến MII (là khoảng thời gian các vi ống lắp ráp hình thành thoi vô sắc) trong khi

hoạt tính MPF lại giảm trong khoảng thời gian từ anaphase I đến telophase I Ức chế sự hoạt hóa MAP kinase khi chuyển từ MI đến MII đã gây ra sai hỏng trong việc hình thành thể cực thứ nhất và thoi vô sắc (hình 1.5b) Vì vậy, việc hoạt hóa MAP kinase giữ một chức năng quan trong trong việc điều hòa hình thành hệ thống

vi ống Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc tái cấu trúc lại hệ thống bộ xương thế bào và tái lập chương trình sau khi thực hiện chuyển nhân

1.1.3.4 APC - Phức hợp phát động anaphase

APC (Anaphase promoting complex) ở tế bào sinh dưỡng là 1 phức hợp

protein nó gồm nhiều tiểu phần điều hòa chu kì tế bào (Peters, 2002) Trong giai

đoạn MII của tế bào trứng một phần là do CSF ức chế APC từ việc giảm cyclin B

Việc giữ cho cyclin B-cdc2 ở mức độ cao sẽ làm cho tế bào trứng ở giai đoạn nghỉ cho đến khi sự thụ tinh xảy ra Vào lúc thụ tinh, 1 chuỗi các tín hiệu Ca2+ tràn vào

và kết thúc bằng việc phân hủy cấu trúc cyclin B để bắt đầu chi kì phân chia tiếp theo của tế bào (Nixon và cs., 2002)

1.1.4 Sự tái thiết lập chương trình khi thực hiện cấy nhân

Ở động vật có vú, sự rụng trứng diễn ra ở giai đoạn MII và nghỉ ở kì này cho đến khi được thụ tinh, sau đó tiếp tục quá trình giảm phân, đẩy thể cực thứ 2 ra

ngoài, hình thành tiền nhân đực và tiền nhân cái Phôi đi vào quá trình nguyên phân

liên tục, biệt hóa thành các tế bào riêng biệt, kết quả là hình thành các mô và cơ quan Chương trình phát triển sinh học luôn đảm bảo sự chuyển tiếp thành công từ

tế bào trứng đến thế hệ con Thông thường, khi một chương trình đã bắt đầu không thể quay ngược lại được Sau trạng thái này, những tế bào riêng lẻ sẽ không thể phát triển thành những cá thể mới do có nhiều biến đổi xảy ra trong DNA, kéo theo sự

biểu hiện gen trong quá trình phát triển tự nhiên Tuy nhiên, khi chuyển nhân in

vitro các tế bào sinh dưỡng vào tế bào trứng, các yếu tố điều khiển của nguyên sinh

chất có thể làm quay ngược lại chương trình phát triển của các tế bào này Người ta gọi đây là quá trình tái thiết lập chương trình của nhân (nuclear reprogramming) Nói cách khác khi DNA được tái thiết lập chương trình thì nó có thể phát triển theo chiều hướng tạo thành phôi Khi đó các tế bào cấu thành cơ thể sinh vật đa bào đều thừa hưởng thông tin DNA nhân tương tự từ trứng đã thụ tinh Điều này cho thấy tế bào chất của trứng có khả năng giúp khôi phục lại tính toàn thế của tế bào sau khi chuyển nhân (Don và cs., 2001)

1.2 Đại cương về loại nhân trong nhân bản vô tính động vật

Loại nhân tế bào trứng hay loại nhân (enucleation) là một trong những khâu quan trọng nhất của quá trình chuyển nhân (nuclear transfer) trong nhân bản vô tính

động vật Cho đến nay, có rất nhiều phương pháp loại nhân khác nhau về nguyên lí

và bản chất Có thể chia một số phương pháp loại được sử dụng phổ biến trong nhân bản vô tính động vật như sau:

1.2.1 Loại nhân bằng phương pháp “Mò mẫm” (“Blind” enucleation)

Phương pháp này được McGrath và Solter sử dụng lần đầu tiên năm 1983 trên tế bào trứng chuột Đối với tế bào trứng của các động vật như: thỏ, cừu, dê, lợn, chuột…, một đặc điểm rất dễ nhận thấy là vùng nhân (nuclear zone) của chúng rất khó nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học Do đó, muốn thực hiện mục tiêu loại bỏ vật chất di truyền (chủ yếu là DNA) của các loài này để thực hiện nhân bản vô tính

là hết sức khó khăn

Tuy nhiên, đúng như tên gọi của phương pháp này, hiệu quả loại nhân của phương pháp này rất thấp Theo Cheong, khi thực hiện phương pháp này khoảng 30% nguyên sinh chất của trứng bị loại bỏ trong quá trình thực hiện thao tác (Cheong và cs., 1993) Điều này ảnh hưởng không tốt đến sự phục hồi của tế bào trứng và sự tạo thành phôi nhân bản vô tính sau này Một nhược điểm nữa là ở một

số loài vị trí của nhiễm sắc chất thường không nằm vị trí dưới PB1 Ở bò, 40,7% nhiễm sắc chất được tìm thấy gần với vị trí của PB1 khi tế bào trứng ở giai đoạn

MII (Nour và Takahashi, 1999) Nghiên cứu trên thỏ, Mitalipov cho thấy rằng hơn 50% nhiễm sắc chất có vị trí khác với vị trí của PB1 (Mitalipov và cs., 1999) Do những nhược điểm như vậy nên phương pháp này ít được lựa chọn để thực hiện nhân bản vô tính động vật

1.2.2 Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng tia cực tím

Do nhược điểm khó dựa vào vị trí PB1 của phương pháp loại nhân “mò mẫm” để có thể loại nhân 1 cách chính xác nên các nhà nghiên cứu đã cố gắng tiến hành loại nhân dưới ánh sáng kính hiển vi huỳnh quang hay kết hợp với tia cực tím (Wilmut và cs., 1997) Đối với phương pháp này, khi di chuyển vật chất di truyền ra khỏi tế bào trứng chỉ một lượng nhỏ tế bào chất xung quanh thoi vô sắc bị loại ra,

do đó bảo vệ tế bào trứng ít bị ảnh hưởng đến khả năng phục hồi sau khi loại nhân Tuy nhiên, một thách thức đặt ra cho phương pháp này là tia UV có năng lượng cao

sẽ ảnh hưởng và có thể dẫn đến tổn thương các bào quan trong tế bào chất Mặc dù

đa số các ý kiến đều cho rằng thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng UV đều có ảnh

hưởng không tốt và làm tổn hại đến tế bào trứng và thao tác loại nhân cần thực hiện trong thời gian ngắn sẽ giảm đáng kể các tác hại nói trên

1.2.3 Loại nhân bằng phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation

thời gian (thời gian cho mỗi lần li tâm rất ngắn 2 - 4 phút) Tuy nhiên, phương pháp này cũng mang tính ngẫu nhiên vì kích thước và độ tương đồng giữa vật chất di truyền và tế bào chất của mỗi trứng không đồng đều dẫn đến số lượng trứng loại nhân và chất lượng phôi không cao Năm 1995, Tatham lần đầu tiên sử dụng phương pháp này để loại nhân của trứng bò Sau khi trứng được li tâm ở giai đoạn MII, các tế bào chất được xếp thành từng lớp và dễ dàng nhận thấy (Tatham và cs., 1995)

1.2.4 Loại nhân bằng phương pháp Telophase (Telophase enucleation)

Nguyên lí của kĩ thuật này là loại bỏ các nhiễm sắc chất ở giai đoạn telophase, bằng cách hút bỏ PB2 và tế bào chất xung quanh nó sau khi tế bào trứng

được hoạt hóa (oocyte activated) Để thực hiện phương pháp này, các tế bào trứng

được nuôi thành thục điều kiện in vitro (in vitro maturation - IVM) trong 30 giờ

(Bordignon và Smith, 1998) hoặc 32 giờ (Liu và cs., 2000) Ở giai đoạn telophase nhiễm sắc chất trong tế bào chất bên cạnh PB2 sẽ được loại ra Sau đó, trứng sẽ

được hoạt hóa với thể mang ion canxi (calcium ionophore) A23187 và

cycloheximide Kết quả thu được trên trứng bò là 100% nhiễm sắc chất ở gần PB2

bị loại bỏ, trong đó tỉ lệ loại nhân là 91,5% (Nour và Takahashi, 1999) Đây được xem là một phương pháp loại nhân khá hiệu quả Khi thực hiện loại nhân ở trứng bò giai đoạn telophase II thì tỉ lệ phát triển phôi đến giai đoạn phôi dâu/ phôi nang (morula/blastocyst) cao hơn khi loại nhân ở giai đoạn MII (Liu và cs., 2000) Phương pháp này có lợi thế là diễn ra tương tự quá trình sinh học của tế bào trứng,

vì trứng được loại nhân sau khi đã kích hoạt Ngoài ra, NST được liên kết chặt chẽ với PB2, do đó, có thể loại bỏ chúng mà không dùng thuốc nhuộm như Hoechst

33342 Tuy nhiên, việc giảm hoạt động của MPF sẽ làm giảm khả năng chuyển

nhân và tái cấu trúc của tế bào với nhân tế bào sinh dưỡng nhận (Louis, 2003)

1.2.5 Loại nhân bằng phương pháp sử dụng hóa chất hỗ trợ (Chemical

assistant enucleation)

Phương pháp này lần đầu tiên được Fulka và Moor đưa ra năm 1993, sau đó Fulka và cộng sự phát triển thêm (Fulka và cs., 1993) Thí nghiệm đầu tiên của

Fulka được thực hiện trên tế bào trứng chuột Đầu tiên, trứng chuột được nuôi in

vitro trong môi trường có chứa etoposide Etoposide là 1 dẫn xuất của

podophylotoxin, có tác dụng gây độc tế bào bằng cách tạo sự đứt gãy và phá hủy DNA của tế bào theo cơ chế làm biến đổi và ức chế sự tổng hợp DNA, etoposide thuộc nhóm thuốc chống ung thư Sau đó, cho tế bào trứng tiếp xúc với cycloheximide và tiếp tục bổ sung etoposide vào môi trường để loại toàn bộ vật chất

di truyền (Fulka và cs., 1993) Kết quả có 96% tế bào trứng chuột đã được loại nhân Tỉ lệ nhiễm sắc chất bị loại lần lượt là 93,5% và 98% khi sử dụng etoposide (nồng độ 36 g/mL) và cycloheximide (nồng độ 50 g/mL) (Elsheikh và cs., 1997) Hơn nữa, tỉ lệ phân chia tế bào, hình thái tế bào chất chuột không có sự khác biệt

đáng kể khi xử lí epotoxide và cycloheximide ở giai đoạn MI và MII (Elsheikh và

cs., 1997) Qua các nghiên cứu khác nhau, tác giả nhận ra rằng epotoxide và cycloheximide không chứa yếu tố phát động thành thục trứng Hai chất này đã đem lại kết quả tốt khi xử lí loại nhân tế bào trứng chuột ở giai đoạn MII (Baguisi, Overstrom và cs., 2000, Ibanez và cs., 2003, Gasparrini và cs., 2003) Tuy nhiên, sự phát triển phôi đến giai đoạn phôi dâu/phôi nang vẫn còn thấp

Trong quá trình phát triển của kĩ thuật loại nhân bằng phương pháp sử dụng hóa chất, nhiều tác giả đã tìm ra các hóa chất có chức năng tương tự và đem lại hiệu quả cao để hỗ trợ loại nhân tế bào như: colchicine, demecolcine, ethanol, nocodazole,… Việc sử dụng demecolcine đã được đề cập và sử dụng ngày càng nhiều trong loại nhân để thực hiện nhân bản vô tính động vật (Yin và cs., 2002) Loại nhân bằng phương pháp sử dụng demecolcine nhằm giải quyết những khó khăn của các phương pháp trên để cải thiện hiệu quả của việc loại nhân Nguyên lí của phương pháp loại nhân bằng cách sử dụng hóa chất nói chung và demecolcine nói riêng là để ngăn chặn sự tách rời NST của tế bào trứng ở giảm phân II Khi sử

dụng phương pháp này, tất cả vật chất di truyền bị đẩy ra gần PB2 Một điểm thuận lợi rất quan trọng đối với phương pháp này là có thể loại bỏ vật chất di truyền một cách dễ dàng mà lại ít tổn hại đến tế bào chất bên trong của tế bào trứng, điều này rất cần thiết cho sự phát triển phôi nhân bản vô tính sau này trong việc tái cấu trúc

nhân tế bào sinh dưỡng và nguyên sinh chất trong tế bào trứng

1.2.5.1 Tổng quan về demecolcine

Demecolcine hay Colcemid là một chất có dạng rất gần với colchicine cũng

được sử dụng trong di truyền học tế bào Mặc dù demecolcine có liên quan đến

colchicine nhưng nó ít độc hơn,

có khả năng ngăn chặn quá

trình polymer hóa tạo vi cấu

trúc và bất hoạt thoi vô sắc

*Tên quốc tế:

Sử dụng demecolcine với nồng độ thích hợp có khả năng ngăn chặn quá trình nguyên phân ở các tế bào động vật có vú Ngoài ra, khả năng ức chế của demecolcine cũng còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh lý của tế bào (Haber, và cs., 1972)

Hình 1.6 Công thức cấu tạo demecolcine

1.3 Nhân bản vô tính lợn

Lợn là động vật có chu kì sinh sản ngắn, đẻ nhiều con trong 1 lứa, vòng đời dài, kích cỡ cơ quan giải phẫu sinh lí tương tự như ở người, dễ nuôi Bộ gen (genome) của lợn gần giống người hơn bộ gen của chuột (Swanson và cs., 2005)

Đến cuối năm 2009 hơn 90% trình tự bộ gen của lợn nhà (Sus scrofa) đã được giải

trình tự Ngoài ra, lợn còn là công cụ nghiên cứu y học và mô hình bệnh học hữu hiệu Nếu so với sử dụng động vật thuộc nhóm linh trưởng để nghiên cứu thì việc sử dụng lợn rẻ hơn rất nhiều, điều kiện vô trùng dễ kiểm soát, ít bệnh, tạo ra lợn thịt với chất lượng tốt và đồng nhất về chất lượng

Hình 1.7 So sánh giữa sinh sản tự nhiên và sinh sản vô tính

Ngoài ra nhân bản vô tính còn có thể cung cấp phôi đông lạnh không qua con

đường giải phẫu chuyển phôi thông thường, rút ngắn đáng kể thời gian sinh sản

(hình 1.7) Công nghệ nhân bản vô tính được ứng dụng trong chăn nuôi tạo giống vật nuôi có năng suất cao, chất lượng tốt về sản phẩm (thịt, giống,…) đồng đều về tốc độ tăng trưởng phục vụ cho nông nghiệp qui mô lớn, kết hợp với các phương pháp chuyển gen của công nghệ gen tạo giống lợn chống chịu bệnh tật, thích nghi với điều kiện chăn nuôi Ngoài ra, việc nhân bản vô tính còn có thể phục vụ y học

trong việc thay thế các mô, cơ quan, bảo tồn động vật quí hiếm và có nguy cơ tiệt chủng Với những ưu điểm và ứng dụng tốt như trên thì việc nghiên cứu nhân bản lợn là rất cần thiết và mang tính cấp bách

Hình 1.8 Mô hình gen trị liệu khi sử dụng lợn nhân bản vô tính

Lịch sử nhân bản vô tính ở động vật được đánh dấu vào năm 1952, khi hai nhà khoa học người Mỹ là Robert Briggs và Thomas J King đã thực hiện thí

nghiệm chuyển nhân ở ếch (Rana pipiens) Sau đó, nhiều nghiên cứu khác nhau

cũng đã tiến hành chuyển nhân ở giai đoạn phân cắt của phôi

Năm 1984, Willadsen (Đan Mạch) tạo dòng cừu vô tính bằng cách chuyển 1

tế bào của phôi 8 tế bào vào trứng đã loại nhân (Willadsen và cs.,1986) Từ những nghiên cứu chuyển nhân này, cùng với một loạt các nghiên cứu làm tiền đề của các nhà khoa học khác trên thế giới trên đối tượng khác như chuột, thỏ, bò, Robl và First lần đầu tiên mô tả kĩ thuật loại nhân và nhân bản vô tính lợn vào năm 1985 (Robl và First, 1985)

Hình 1.9 Các bước trong kĩ thuật nhân bản vô tính lợn (Polejaeva, 2000) 1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân bản vô tính ở lợn

1.3.1.1 Tế bào cho

Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau với nhiều mức độ biệt hóa khác nhau: nguyên bào sợi (Onishi và cs., 2000), tế bào da (Park và cs., 2002.), tim, thận (Yin và cs, 2002), phổi (Hoshino và cs, 2005), gờ sinh dục (Betthauser và cs,2000)… Các tế bào cho nhân có thể được nuôi cấy trong thời gian ngắn hay dài (điều này rất quan trọng) trước khi chuyển nhân vào tế bào trứng đã loại nhân Sự phù hợp giữa chu kì của tế bào cho nhân và trạng thái nguyên sinh chất của tế bào trứng nhận có ảnh hưởng đến sự thành công trong nhân bản vô tính động vật

1.3.1.2 Kĩ thuật chuyển nhân

Năm 1989, Prather đã thực hiện chuyển nhân tạo phôi lợn ở giai đoạn phôi sớm bằng cách li tâm các tế bào phôi ở giai đoạn nhân nguyên (pronuclear stage embryo), sau đó xử lí với hóa chất ức chế cấu trúc bộ xương của tế bào trứng và tiến hành loại nhân (Prather và cs., 1989)

Tiếp theo vào các năm sau đó quá trình này được cải thiện đáng kể nhờ những nghiên cứu của Macháty và Prather khi sử dụng các tác nhân hóa học như: Guanosine-5’-O-(3’-thiotriphosphate) (Macháty và cs., 1995), sulphydryl, thimerosal (Macháty và cs., 1997) để làm tác nhân loại nhân tế bào trứng Năm

1996, Li đưa ra phương pháp chuyển phôi lợn không phẫu thuật (non-surgical) nhằm tăng hiệu hiệu quả thụ thai khi thực hiện nhân bản vô tính (Li và cs., 1996) Sau khi cừu Dolly ra đời được 1 năm thì năm 1998 các nhà khoa học trên cũng đã tạo ra phôi lợn nhân bản vô tính đầu tiên trên thế giới theo phương pháp trên nhưng cũng chỉ phát triển đến giai đoạn phôi sớm (Prather và cs.,1998) Dù sao đây là một kết quả đáng khích lệ cho các nhà khoa học, phòng thí nghiệm khác trên thế giới tiếp tục nghiên cứu và đến năm 2000 thì con lợn nhân bản vô tính đầu tiên trên thế giới cũng đã ra đời (Polejaeva và cs., 2000, Onishi và cs., 2000) Các nghiên cứu về nhân bản vô tính trên lợn trước năm 2000 đã tỏ ra có hiệu quả và phục vụ cho những nghiên cứu chuyên sâu hiện nay và sau này Trong thời gian từ năm 2000 trở lại đây nhân bản vô tính tập trung các hướng nghiên cứu chính nhằm nâng cao tỉ lệ thành công trong nhân bản vô tính ở động vật có vú nói chung và lợn nói riêng là: (i) nâng cao tỉ lệ nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm, (ii) sử dụng các phương pháp loại nhân có hiệu quả nhất, ít làm tổn thương đến tế bào nhất, (iii) nghiên cứu tăng tỉ lệ sống của việc nuôi phôi ở giai đoạn phôi sớm (early embryo culture) SCNT ở lợn có thể thực hiện đồng bộ hóa (Irina và cs., 2006) hoặc không

đồng bộ hóa chu kì tế bào tế bào cho (Betthauser và cs., 2000; Bondioli và cs.,

2001) Đồng bộ hóa tế bào là 1 trong 2 bước của kĩ thuật SCNT để tăng sự sự tái lập chương trình Bước còn lại trong kĩ thuật SCNT là loại nhân tế bào trứng nhận Năm 2002, Yin và cộng sự đã thu được kết quả hết sức khả quan khi sử dụng hóa chất hỗ trợ để loại nhân tế bào nhận (Yin và cs., 2002) Hóa chất được Yin sử dụng

là demecolcine với mục đích tạo chỗ nhô trên màng tế bào nhằm loại bỏ vật chất di truyền 1 cách dễ dàng

1.3.1.3 Hoạt hóa

Quá trình chuyển nhân cơ bản đòi hỏi phải loại NST của tế bào nhận ở giai

đoạn MII NST của tế bào cho sẽ thay thế vào vị trí bị loại nhân của tế bào trứng

Sau đó là giai đoạn dung hợp và tái lập trình lại cấu trúc của tế bào Ngoài ra, tế bào cho có thể được tiêm trực tiếp vào trong tế bào chất của tế bào trứng đã được loại nhân Tế bào trứng phát triển bằng vật chất di truyền mới Do đó, cần phải có sự

kích thích và hoạt hóa nhằm làm phát triển chương trình tái lập trình của tế bào trứng Đa số các nghiên cứu đều cho rằng Ca2+ có vai trò quan trọng trong việc khởi

động quá trình hoạt hóa tế bào trứng thông qua sự gắn kết các tín hiệu thông tin với

các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng trong suốt Quá trình này diễn ra trong vài giờ Dựa vào cơ chế này các nhà khoa học trong lĩnh vực nhân bản vô tính động vật

có vú nói chung và lợn nói riêng đã thực hiện việc hoạt hóa tế bào trứng bằng các tác nhân vật lí và hóa học Một trong những cách để tăng hàm lượng Ca2+ bằng phương pháp vật lí là tạo lỗ trên màng trong suốt bằng xung điện để Ca2+ có thể đi vào bên trong tế bào trứng Ngoài ra, có thể sử dụng điện thế nhằm thay đổi tính thấm Ca2+ của màng tế bào để làm tăng nồng độ Ca2+ Đối với các phương pháp hóa học, để làm tăng nồng độ Ca2+ có thể sử dụng thể mang ion A23187 Ở tế bào trứng lợn, quá trình tăng nồng độ Ca2+ bên trong được cho là do một phần của Ca2+ nội bào Khi tiêm 25-1000 µM CaCl2, quá trình hoạt hóa tế bào trứng sẽ xảy ra và phôi

có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang

Một chất khác thường được đề cập đến trong các nghiên cứu hoạt hóa tế bào trứng là ionomycin Chất này là một dạng khác của thể mang ion, nó thực hiện quá trình đưa Ca2+ vào trong tế bào trứng gồm 2 giai đoạn (i) vận chuyển ion và (ii) giai

đoạn xâm nhập, đưa ion vào bên trong (Kato và cs., 1992)

Terlouw và Nagashima đã cho thấy rằng sự phát triển của phôi lợn ở điều

kiện in vitro đến giai đoạn phôi nang là rất thấp Do đó, các ông đã sử dụng nghiên cứu việc loại nhân của tế bào nhận được nuôi in vitro, sử dụng các tế bào cho có

nguồn gốc từ các dòng tế bào phôi và sử dụng thimerosal để làm tác nhân hoạt hóa trứng Từ các cải tiến trên đã cho những kết quả khả quan Tỉ lệ nhân nguyên (pronuclear) là 48% (12/25) và tỉ lệ phôi dâu hay phôi nang là 22,2% (39/176) (Nagashima và cs., 1992,Terlouw và cs., 1993)

1.3.1.4 Sự tái thiết lập chương trình và phát triển phôi lợn

Mayes cùng các cộng sự đã nghiên cứu và giải thích cơ chế về sự tái lập trình của tế bào trứng sau khi chuyển nhân của tế bào phôi ở giai đoạn phôi nang vào bên

trong trứng đã loại nhân (Mayes và cs., 1995) Tuy nhiên, các kết quả tạo phôi sau khi dung hợp tế bào không cao lắm do chưa có nhân tố hoạt hóa trứng thích hợp giống như quá trình tự nhiên Ở lợn, nhân của tế bào phôi ở giai đoạn 2 tế bào lớn hơn 18 µm và giảm xuống còn 14,5 µm khi phôi chuyển sang giai đoạn 8 tế bào (Samiec và cs., 2005) Khi thực hiện chuyển nhân sinh dưỡng một hiện tượng được các nhà khoa học ghi nhận là sự trương phồng lên của nhân Sự trương phồng này

được cho là nhân tố gián tiếp của việc trao đổi protein xảy ra sau khi chuyển nhân

Các protein này là nguyên nhân trong sự phân mảnh của phôi (Thuan, và cs., 2006; Paul và cs., 2006)

1.3.2 Những thay đổi khi loại nhân bằng phương pháp sử dụng demecolcine trong nhân bản vô tính ở lợn

Các nghiên cứu trên tế bào trứng lợn cho thấy demecolcine bắt đầu có ảnh hưởng lên thoi giảm phân sau khi xử lí 15 phút Khi xử lí các trứng lợn được nuôi

cấy in vitro với demecolcine sẽ dẫn đến sự phá vỡ vi ống, kết quả là màng tế bào sẽ

nhô lên ở chỗ chứa khối NST của trứng (Yin và cs., 2002) Khảo sát ở các đối tượng khác nhau các tác giả đã chỉ ra rằng demecolcine có khả năng xử lí tối thiểu 30 phút làm cho màng tế bào trứng xuất hiện chỗ nhô (protrusion) ở giai đoạn metaphase II, chỗ nhô này là do sự depolymer hóa

Khi trứng xuất hiện thể cực thứ nhất nếu đem xử lí demecolcine sau 1h với nồng độ thích hợp thì hơn 70% trứng có xuất hiện chỗ nhô của màng (membrane protrusion) và khối NST tập trung ở vị trí vỏ ngoài của tế bào trứng Khi đó việc loại nhân sẽ diễn ra dễ dàng và tỉ lệ loại nhân thành công rất cao, đạt 93% (Yin và cs., 2002) Mặc dù có một số thay đổi so với kĩ thuật ban đầu nhưng nói chung những thay đổi này đều góp phần nhằm nâng cao hiệu quả của tỉ lệ nhân bản vô tính

và cũng để thích hợp với từng đối tượng động vật khác nhau được nhân bản vô tính

1.3.3 Chuẩn bị tế bào nhận

Sử dụng các tế bào trứng được nuôi cấy in vitro để làm tế bào nhận trong kĩ

thuật chuyển nhân được quan tâm đặc biệt Xu hướng này bắt đầu phát triển khi 2 nhóm tác giả Onishi và Polejaeva lần đầu tiên thành công trong việc tạo ra lợn con

bằng phương pháp nhân bản vô tính vào năm 2000 khi sử dụng trứng in vivo

(Onishi và cs., 2000; Polejaeva và cs., 2000) Cũng trong năm này, Betthauser và cộng sự đã sử dụng tế bào trứng lợn thu từ lò mổ để nuôi thành thục sử dụng cho

SCNT Có nhiều ý kiến cho rằng tế bào trứng nuôi cấy in vivo tốt hơn tế bào trứng nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, Lee và cộng sự khi khảo sát phôi nhân bản vô tính ở

lợn không tìm thấy bằng chứng nào chứng tỏcác tế bào trứng in vivo tốt hơn các tế bào trứng thu và nuôi trong điều kiện in vitro (Lee và cs., 2003) Ngoài ra, tế bào trứng trưởng thành in vivo rất hiếm Cho nên, hiện nay hầu hết các qui trình nhân

bản vô tính lợn, buồng trứng được thu ngay sau khi mổ tại lò mổ và chuyển vào dung dịch sinh lí ở 28 - 350C, sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 2 - 6 giờ và thực hiện thao tác

Trong đa số các qui trình tạo dòng, tế bào trứng nhận (recipient oocyte) thường được sử dụng ở giai đoạn MII Mặc dù có 1 số báo cáo khác cho rằng sử dụng tế bào trứng ở giai đoạn telophase, hay hợp tử cũng cho kết quả tốt (Koo và cs., 2000) Tuy nhiên, khi sử dụng tế bào trứng MII sẽ cải thiện sự tái thiết lập chương trình của nhân cho Khi đó, sự xuất hiện của MPF hoạt hóa cao sẽ cảm ứng

sự phá vỡ màng nhân, ức chế việc đóng xoắn nhiễm sắc thể tiền trưởng thành khiến chúng bị “phơi” ra, tạo điều kiện tiếp xúc với toàn bộ NST và các nhân tố cần thiết cho sự phát triển có sẵn trong trứng (Miyoshi và cs., 2001) Các khảo sát của Hyun cũng cho thấy rằng: (i) thời gian lưu trữ và nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến chất lượng trứng và sự trưởng thành nhân của tế bào trứng sử dụng nhân bản vô tính, (ii) nang trứng có đường kính >5 mm tốt hơn nang trứng có đường kính < 3 mm (Hyun và cs., 2003)

Trong thời gian 6 năm (từ 2000 - 2006), nhân bản vô tính lợn trên thế giới đã

có những thành tựu đáng kể (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thành tựu nhân bản vô tính lợn từ 2000-2006 (Vajta và cs, 2007)

Số lượng phôi chuyển

Số lượng thai (số lượng con mang)

Số lợn

đượ c sinh

ra

Số lượng lợn sống

Tác giả

Lợn con

Polejaeva và cs., 2000 Thai 24

ngày

Nguyên

Onishi và cs., 2000

Kolber-cs, 2004 Thai 25

40 ngày bào sợi 2006

* Lợn có yếu tố chuyển gen

1.4 Nghiên cứu nhân bản vô tính ở Việt Nam

Tại Việt Nam, sau sự kiện cừu Dolly các nhà khoa học tại phòng công nghệ phôi, viện CNSH thuộc viện Khoa học và công nghệ Việt Nam cũng đã bắt tay vào việc nghiên cứu nhân bản vô tính ở động vật có vú bằng phương pháp cấy nhân tế bào sinh dưỡng Công việc này được bắt đầu từ những năm 1999 - 2000 Năm 2000,

phòng công nghệ phôi, viện công nghệ sinh học đã tạo được phôi Saola (Pseudoryx

nghetinhensis) (N.T.Ước và cs., 2002) Đây là nhóm nghiên cứu đầu tiên và duy

nhất trên thế giới cho đến nay làm nghiên cứu trên đối tượng Saola Phôi Saola nhân bản này phát triển đến giai đoạn phôi nang Bằng phương pháp nói trên các nhà khoa học cũng đã tạo ra 1 số phôi động vật như trâu, bò (B.X.Nguyên và cs., 2000) Ngoài ra cũng đã có những kết quả khả quan trên Khỉ (B.X.Nguyên và cs., 2000) và lợn mini (B.X.Nguyên và cs., 2006b; N.T.Ước và cs., 2008)

Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa tạo được con vật nhân bản vô tính Do một số khó khăn như chưa có nhiều đơn vị, nhóm nghiên cứu tham gia hướng nghiên cứu lĩnh vực này Kĩ thuật nhân bản vô tính động vật đòi hỏi rất phức tạp, trang thiết bị chuyên dùng còn thiếu Ngoài ra, cần số lượng con vật mang lớn vì tỉ lệ thụ thai và

tỉ lệ thành công của kĩ thuật chuyển nhân còn rất thấp

Do vậy, để có thể tạo một lượng lớn tế bào trứng đã loại nhân một cách hiệu quả, dễ dàng và phù hợp với điều kiện hiện tại trong nước để phục vụ cho nhân bản

vô tính Với những ưu điểm của demecolcine đã trình bày ở trên chúng tôi tiến hành

thực hiện khảo sát các chế độ loại nhân tế bào trứng lợn bằng các sử dụng demecolcine để nâng cao khả năng loại nhân trong điều kiện của Việt Nam và tạo phôi lợn nhân bản vô tính, từng bước tạo ra 1 số lượng lớn phôi lợn phục vụ cho việc chuyển phôi vào vật mang để tạo ra lợn nhân bản vô tính ở Việt Nam

PHẦN II

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng thí nghiệm

Trong thí nghiệm này, nguồn mẫu được sử dụng là buồng trứng lợn nhà (Sus

domesticus) giống lợn thuần Yorkshire (Đại bạch) được nuôi tại xí nghiệp chăn nuôi

Gò sao của công ty TNHH một thành viên Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Địa chỉ: 420 Nơ Trang Long, Phường 13, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí

Minh

2.2 Dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Dụng cụ

Bảng 2.1 Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm

STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước

1 Đĩa petri nhựa Φ35 mm Nunclon Đan Mạch

2 Đĩa 4 giếng,4 ngăn Nunclon Đan Mạch

3 Đĩa petri nhựa Φ90 mm Nunclon Đan Mạch

4 Ống tiêm 5 mL, kim tiêm 18G Vinahankook Việt Nam

9 Kim giữ (Holding pipette)

10 Kim tiêm (Injection pipette)

11 Một số dụng cụ khác: bình tam giác, bình định mức, ống đong, kéo,…