CHẨN ĐOÁN VIRUS H5N1 BẰNG NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG

Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H1N1 và H3N2 đang lưuhành và gây bệnh ở người.Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm hiện nay là H5N1 và được chia làm 2 nhóm: - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp Low

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



CHẨN ĐOÁN VIRUS H5N1 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG

GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

SVTH: Nhóm 1

Tài liệu tham khảo

A Đặt vấn đề 2

B Tổng quan 2

I Thông tin chung về cúm gia cầm 3

1.Cúm gia cầm là gì? 3

2 Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? 7

3 Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? 7

4 Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người 8

(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ con người 8

(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người 9

(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào 9

5 Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì? 10

(a) Yếu tố dịch tễ 10

(b) Lâm sàng 10

(c) Cận lâm sàng 11

II Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 11

1 Sự thu thập mẫu xét nghiệm 11

2 Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm 12

3 Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV 13

4 Phân lập và nhận dạng virus 16

4.1 Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi 16

4.1.1 Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus 16

4.1.1.1 Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt 16

4.1.1.2 Mẫu mô (cơ quan phổi) 16

4.1.1.3 Vật liệu 17

4.1.2 Thủ tục 17

1 Soi trứng 17

2 Sự tiêm chủng cho những quả trứng 18

3 khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng 19

4 Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng 19

5 Xét nghiệm hemagglutination 20

6 Đọc kết quả 20

a) Giải thích kết quả 20

b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart ® test 21

C Kết luận 23

D Tài liệu tham khảo 23

A Đặt vấn đề

Virus cúm và đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại rất lớn về kinh tế của mọi quốc giatrên thế giới và chúng là một thách thức lớn cho ngành y tế trong những năm qua ViệtNam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nhiều nhất của đại dịch này Mặc

dù chúng ta đã có nhiều biện pháp và nỗ lực trong việc phòng chống nhưng vẫn chưamang lại hiệu quả như mong muốn Trong công tác phòng chống việc chẩn đoán đểxác định chính xác virus gây bệnh là một khâu hết sức quan trọng Một trong những

kỹ thuật chẩn đoán virus cúm gia cầm có độ chính xác cao đó là kỷ thuật nuôi cấyphôi trứng

B Tổng quan

I Thông tin chung về cúm gia cầm

1 Cúm gia cầm là gì ?

Cúm gia cầm, còn được gọi là cúm gà, là

bệnh truyền nhiễm trên động vật, chủ yếu là

loài chim, đôi khi cũng thấy trên lợn do

vi-rút cúm gia cầm týp A gây ra Chủng vi-vi-rút

cúm này có độc tính cao, đôi khi vượt qua

hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho con người

Dựa trên kháng nguyên, người ta chia cúm gia cầm thành 16 phân nhóm H(Haemagglutinin: H1-H16) và 9 phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), trong đóphân nhóm H5 và H7 có độc tính cao Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H1N1 và H3N2 đang lưuhành và gây bệnh ở người.

Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm hiện nay là H5N1 và được chia làm 2 nhóm:

- Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thườnglưu hành trong loài chim hoang dã, không gây bệnh hay gây bệnh nhẹ: xù lông, giảmsản lượng trứng và thường không được phát hiện

- Vi-rút cúm gia cầm có độc tính cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): rấtnguy hiểm Chúng lan truyền rất nhanh trong đàn gia cầm, gây bệnh nặng ảnh hưởngđến nhiều cơ quan và cuối cùng gây tử vong gần 100% trong vòng 48 giờ kể từ khinhiễm bệnh

Bệnh lý

LPAI ( low pathogenic avian influenza virus )

Những thương tổn thay đổi với giống, loài virus và tuổi của kí chủ Thông thường,chỉ những gà tây và những con gà biểu lộ một vài sự thay đổi đặc biệt lớn và cực kỳnhỏ với những giống đã thích nghi với ký chủ ( Capua và Mutinelli 2001) Trong gàtây, bệnh viêm xoang, viêm khí quản và airsacculitis đã được phát hiện, mặc dầu sựtiêm nhiễm vi khuẩn sơ cấp có thể góp phần không có hại gì.Tuỵ của gà tây đã được

mô tả với những con gà bình thường, sự bọc nhẹ của đường hô hấp thì thường đượcthấy Thêm vào, những tổn thương tập trung trên những cơ quan sinh sản của nhữngcon gà đẻ trứng ( buồng trứng, vòi trứng, viêm màng noãn hoàn.)

HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses )

Những thay đổi lớn về bệnh lý và mô bệnh học của HPAI bộc lộ sự phụ thuộcgiống nhau để ghi vào danh sách cho sự hiện diện của triệu chứng lâm sàn Bốn loạithay đổi của tác nhân gây bệnh đã được thăm dò nguyên lí cơ bản ( Perkins andSwayne 2003):

thấy trong loài galliforme) và dạng cấp tính của bệnh biểu lộ những thay đổi bệnhtích không đặc thù: một sự hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ trong ruột vàthỉnh thoảng có những đóm xuất huyết trên màng treo và màng ngoài của màng óiđược mô tả không nhất quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004) Nhữngcon gà đã bị tác động bởi dòng H5N1 châu Á đôi lúc biểu hiện xuất huyết từngmảng và tổng lượng chất nhầy đáng kể trong khí quản ( Elbers 2004) Tiết dịch rỉhuyết thanh trong các khoang cơ thể và phù nề ở phổi có thể được trông thấykhông có hại gì Những đóm chảy máu trong màng nhầy của dạ dày tuyến, nóthường được mô tả trong phần chính của sách trong phần trước, chỉ có sự khác biệtđược gặp trong gia cầm đã nhiễm với dòng H5N1 châu Á (Elbers 2004) Những tổnthương mô học khác nhau gắn với kháng nguyên của virus có thể được phát hiện ởcác mô khác nhau ( Mo 1997) Virus được trông thấy đầu tiên trong màng trong

của những tế bào Vào một giai đoạn sau đó những tế bào bị nhiễm virus được pháthiện trong cơ tim, tuyến thượng thận và tuỵ tạng Những tế bàp thần kinh cũng như

tế bào thần kinh đệm của bộ não cũng bị nhiễm.Về bệnh lý, một tiến trình tương tựvirus màng trong khác có thể được thừa nhận nơi màng trong và sự hoạt hoá củabạch cầu chỉ dẫn đến một hệ thống và sự phân bào rời rạc phóng thích khả năng dễmắc bệnh đến tim phổi hoặc nhiều cơ quan hoạt động kém (Feldmann 2000, Klenk2005)

triệu chứng bệnh và một tiến trình kéo dài của bệnh, triệu chứng thần kinh và môhọc, những tổn thương bộ não gây mưng mủ trội hơn hẳn sự hình dung (Perkinsand Swayne 2002a, Kwon 2005) Tuy nhiên, virus cũng có thể được phân lập từnhững cơ quan khác Quá trình được mô tả trong ngỗng, vịt, đà diểu và những loàikhác tiêm thí nghiệm với dòng HPAI H5N1 châu Á Trong những chim cho trứng,chứng viêm của buồng trứng, vòi trứng, và sau đó nang bị vỡ, cái gọi là viêm phúcmạc lòng đỏ trứng, có thể được trông thấy

(iii) Ở vịt, mồng biển, chim sẻ, chỉ sự tái bản của virus được tìm thấy Nhữngloài chim này đã thể hiện viêm phổi nhẹ, viêm khí quản và thỉnh thoảng tế bàobạch cầu và viêm mô cơ tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003)

câu và chim sáo biển chứng tỏ khả năng kháng lại sự tiêm nhiễm của virus H5N1.Tuy nhiên, Werner và cộng sự ( công bố) đã có khả năng gây ra bệnh thần kinh, sựthừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), trong 5/16 chim

bồ câu dùng một chủng H5N1 HPAI phân lập cách đay không lâu

2 Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào?

Loài thủy cầm là nguồn của tất cả các loại vi-rút cúm trong tự nhiên qua hàngthế kỷ, kể cả týp H5 và H7 nhưng thường có độc tính thấp Tuy nhiên chính các chủngđộc tính thấp H5 và H7 này khi truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen đểtrở thành chủng độc tính cao gây nên dịch.

Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận một số loài chim di trú có khả năngkhuyếch tán vi-rút H5N1 độc tính cao này

3 Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào?

- Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy ra

vào giữa năm 2003 tại Đông Nam Á,

là dịch cúm gia cầm lớn nhất và

nghiêm trọng nhất trong lịch sử loài

người, làm chết hàng loạt các loài

chim Tác nhân gây bệnh là vi-rút

H5N1 tồn tại dai dẳng, đã giết chết

hay khiến con người tiêu hủy ước tính

khoản 150 triệu con chim và gia cầm

Hiện nay vi-rút này được xem là tác

nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, một số tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan

và Cộng Hoà Nhân Dân Lào Ngoài ra từ giữa tháng 12/2003 – đầu tháng 2/2004, cúmgia cầm do H5N1 được báo cáo ở 8 quốc gia Châu Á: Hàn Quốc, Việt Nam, NhậtBản, Thái Lan, Cambodia, Cộng Hoà Nhân Dân Lào, Indonesia và Trung Quốc Hầuhết các quốc gia này chưa bao giờ từng xảy ra dịch cúm gia cầm trong lịch sử của họ

- Đầu tháng 8/2004: cúm gia cầm do H5N1 lần đầu tiên bùng nổ tại Malaysia, kế đến

là Nga vào cuối tháng 7/2005, một số tỉnh Cộng Hoà Kazakhtan và Mông Cổ vào đầu8/2005 Vào đầu 9/2005 cúm cũng ghi nhận tại Thổ Nhĩ Kỳ và Romania Hiện nayNhật Bản, Hàn Quốc và Malaysia được đưa ra khỏi danh sách các quốc gia bị dịch

- Tính đến 24/08/2006 có 59 quốc gia có gia cầm bị nhiễm vi-rút cúm H5N1

4 Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

như thế nào?

(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ con người:

- Nguy cơ lây nhiễm trực tiếp vi-rút cúm từ gia cầm bị bệnh, gây bệnh rất nặng, trong

đó chủng vi-rút H5N1 gây bệnh nghiêm trọng và có tỉ lệ tử vong cao (>50%), chủ yếu

là bệnh viêm phổi và suy đa cơ quan

Đa số xảy ra trên những bệnh nhân trước khi mắc bệnh thì hoàn toàn khoẻ mạnh

- Quan trọng hơn, nguy cơ vi-rút bị đột biến, biến đổi gen nên dễ lây truyền từ gia cầmsang người, rồi từ người sang người Sự biến đổi này là khởi phát đại dịch

(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người:

- 1997: có 18 trường hợp đầu tiên xảy ra ở Hong Kong, gây tử vong 6 trường hợp(chiếm tỉ lệ 33,33%)

- 2003: có 2 trường hợp xảy ra ở Hong Kong trong 1 gia đình có tiền sử đi du lịchTrung Quốc gần đây, gây tử vong 1 trường hợp (chiếm tỉ lệ 50 %)

- 2004: tại Thái-lan có 17 ca và tử vong 12 (chiếm tỉ lệ 70,59%), Việt Nam có 29 ca

và tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %)

- 2005: có 5 quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca và tử vong 41 (chiếm tỉ lệ43,16 %)

- Tính đến 23/08/2006: các trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 được xác định bằngxét nghiệm được báo cáo tại 9 quốc gia với 96 ca bị nhiễm và tử vong 64 (chiếm tỉ lệ66,67 %) trong đó không có Việt Nam

Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) ở người đã ghi nhận tại 10 quốc gia trên thế giới, với

232 trường hợp mắc bệnh và có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%)

- Riêng tại Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến nay gần 9 tháng không ghi nhận trườnghợp mắc mới cúm A (H5N1) ở người Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) đầu tiêntại Việt Nam (26/12/2003) đến nay đã ghi nhận 93 trường hợp mắc tại 32 tỉnh/thànhphố, trong đó có 42 trường hợp tử vong (xem chi tiết số liệu bảng 1)

(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào?

- Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễmphân của gia cầm bị bệnh

- Hầu hết các trường hợp xảy ra ở nông thôn, ngoại ô hay nơi có nuôi gia cầm

- Phân và chất tiết của chim nhiễm bệnh thảy ra môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gâybệnh xuống môi trường rất lớn

- Nghiêm trọng hơn cả là người nuôi gia cầm trong vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệuchứng nhiễm bệnh là làm thịt, chế biến rồi dùng hay bán ra thị trường

Nguồn tiếp xúc có nguy cơ cao là khi con người giết gia cầm, nhổ lông và chế biếntrước khi đem nấu chín

5 Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì?

Dựa trên các yếu tố và triệu chứng sau:

(a) Yếu tố dịch tễ:

- Tiếp xúc với gia cầm bị bệnh trong vòng 2 tuần trước đó (nuôi, buôn bán, vậnchuyển, giết mổ, ăn thịt gia cầm bị bệnh, ăn tiết canh v.v ), hoặc sống ở vùng có dịchcúm gia cầm

- Tiếp xúc gần với người bệnh đã xác định cúm, hoặc người bệnh tử vong vì viêmphổi chưa rõ nguyên nhân.

(b) Lâm sàng:

Bệnh diễn biến cấp tính và có thể có các biểu hiện sau đây:

- Có dấu hiệu nhiễm khuẩn: sốt trên 38oC, có thể rét run

- Các triệu chứng về hô hấp:

o Ho, thường ho khan, đau ngực, ít gặp triệu chứng viêm long đường hô hấp trên

o Khó thở, thở nhanh, tím tái,

o Ran nổ, ran ẩm khi nghe phổi

o Có thể dẫn đến suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS)

- Triệu chứng tuần hoàn: nhịp tim nhanh, đôi khi có sốc

- Các triệu chứng khác: đau đầu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn ý thức

o Công thức máu: số lượng bạch cầu: bình thường hoặc giảm

o Khí máu: giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng

+ PaO2 giảm (< 85 mmHg), có thể giảm nhanh (dưới 60 mmHg) Tỷ lệ PaO2/FiO2 dưới

300 khi có tổn thương phổi cấp (ALI), dưới 200 khi có suy hô hấp cấp tiến triển(ARDS)

- Chẩn đoán vi sinh vật:

o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5

o Phân lập vi khuẩn theo thường quy

II Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm

1 Sự thu thập mẫu xét nghiệm

Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từnhững chim bị bệnh của một ßock Theo lý tưởng, sự lấy mẫu đầy đủ được nhìn lạibằng phương pháp thống kê và sự chẩn đoán được làm trên một đế ßock Khi thu thậpmẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải được khảo sát để tránh sự phơi bàycủa những người sưu tập mẫu đến khả năng của HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắcchỉ đạo được đề nghị bỡi CDC (CDC 2005).

Khi xét nghiệm virus, những bông thấm thu được từ lỗ huyệt và vùng hầu thôngthường cho phép một phòng thí nghiệm điều tra đầy đủ và hoàn chỉnh Vật liệu thuthập trên những mẫu bông nên được trộn vào trong 2-3ml mẫu đại diện của một môitrường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung và một proteinnguồn (e.g 0,5%[ w/v] albumin huyết thanh bò, 10% huyết thanh bò hoặc một dungdịch pha lấy ở giữa não)

Khi mổ xẻ để phân tích, mang ra ngoài dưới những điều kiện an toàn và tránh pháttán mầm bệnh (xem trọng), những mẫu bệnh phẩm của não, khí quản/phổi, lách và cái

gì đó chứa trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus.Mục đích của huyết thanh học, những mẫu máu tự nhiên được lấy Một số mẫu đãthu thập nên phát hiện bằng một khoảng thời gian tin cậy 95% cho một giới hạn vớimột sự phổ biến 30%

2 Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm

Những mẫu bông thấm, mô và máu nên được

giữ lạnh khi vận chuyển nhưng không cho phép

đông đá Nếu những trở ngại gặp phải trên

đường vận chuyển làm thời gian kéo dài hơn

48h, những mẫu xét nghiệm nên được đóng

băng và vận chuyển trên cacbondioxit đậm đặc

Trong tất cả các trường hợp, những điều chỉnh

an toàn khi vận chuyển (e.g IATA rules) nên

được khảo sát kỹ để tránh phát tán mẫu bệnh và

sự phơi nhiễm của con người trong suốt quá

trình vận chuyển Nó là thích hợp cao để tiếp xúc phòng thí nghiệm được bổ nhiệmcho việc chẩn đoán trước khi gửi những mẫu phân tích đến và, lý tưởng, troen trutrước khi thu thập chúng

3 Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV

Cơ bản, đó là hai (parallel) con đường của những phương pháp chẩn đoán chúngđược thử để phân lập và kiểu phụ của virus bằng những phương pháp cơ bản ( xem sổtay OIE 2005 ) và phát hiện phân tử và đặc trưng của bộ gen virus

Thông thường, AI virus được phân lập bỡi sự tiêm miễn dịch của những miến gạtướt hoặc những mô đồng chất của trứng gà có phôi từ 9- 11 ngày tuổi, thường bằngmàng đệm túi niệu ( Woolcock 2001 ) Phụ thuộc dạng tác nhân, những phôi có thểhoặc không thể chết với 5 ngày khảo sát , và thừơng đó là những thương tổn đặc thù

để được trông thấy trong phôi này hoặc màng túi niệu ( Mutinelli 2003b) Những quảtrứng được tiêm chủng với HPAIV bao gồm vật liệu thường chết trong vòng 48 giờ

Sự xuất hiện của một tác nhân ngưng kết có thể được phát hiện trong tấm gạt của túiniệu Sự ngưng kết (HA) là một kỹ thuật vô tình yêu cầu ít nhất 106.0 mảnh nhỏ trongmỗi ml Nếu chỉ tập trung một lượng thấp virus được hiện diện trong chất để tiêmchủng, tuỳ vào hai sự đi qua được đẩy mạnh trong những trứng được thụ tinh có thể