tìm hiểu về quy trình sản xuất ezyme amylase từ Aspergilus Oryzae trong thực phẩm

Phần 2:Nội dung đề tài Chương I: Tổng quan lý thuyết1.1Tổng quan về nấm mốc Aspergilus Oryzae Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào vi sinh vật trong môi trường,quá trình này xả

1.Mục tiêu đề tài :

Hàng năm có khoảng 300000 tấn enzyme được sản xuất trên toàn thế giới

Để sản xuất hiệu quả và tiết kiệm chi phí, ta có thể sãn xuất enzyme thừ nhữngnguồn phế thải như trấu, cám gạo, bã mía …trong ngành thực phẩm nói riêng,enzyme amylase có vai trò vô cùng to lớn trong việc sãn xuất ra các sãn phẩm thực

phẩm Đó củng là lý do mà em thực hiện đề tài “tìm hiểu về quy trình sản xuất ezyme amylase từ Aspergilus Oryzae trong thực phẩm”

2.Nhiệm vụ:

Tìm hiểu về enzyme amylase và nấm mốc aspergilus,nguyên liệu, và quá

trình sản xuất enzyme amylase từ Aspergilus Oryzae.Tìm hiểu ứng dụng của nó

trong nghành thực phẩm

3.Ý nghĩa thực tế và các vấn đề liên quan:

Trong ngành thực phẩm nói chung, và ngành chế biến tinh bột, đường nóiriêng Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọngnhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản Sau đó, chủ yếu trên cơ sởđường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọngnhư: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…

Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá

và giai đoạn đường hoá Trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ

phân tinh bột bằng acid và bằng enzym Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã

sử dụng acid vô cơ như HCl vàH2SO4 Nhưng thực tế, thuỷ phân bằng acid rấtkhó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đápứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm.Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym đểthuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển

Amylase được dùng để thay thế acid ngày càng mang tính quy mô côngnghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệtcao mà không bị mất hoạt tính.Chẳng hạn như amylase được tách từ vi sinh vật, cụthể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ suối nước nóng Ngoài ra,amylase có nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng acid để thủy phân tinh bột: nănglượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quátrình tinh sạch dịch đường

Amylase có thể lấy từ nguồn mầm thóc, mầm đại mạch, hạt bắp nảy mầm,nấm mốc …

Nguyên liệu sản xuất là gạo, bắp, khoai mì.đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền

và dể kiếm ở nước ta.Do đó,đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ

sở phát triển cho nhiều ngành công nghiệp khác phát triển như sản xuất bánhkẹo,bia,cồn,siro,chất làm mềm vải …

Phần 2:Nội dung đề tài Chương I: Tổng quan lý thuyết

1.1Tổng quan về nấm mốc Aspergilus Oryzae

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào vi sinh vật trong môi trường,quá trình này xảy ra trong diều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp.Bản chất của hai quá trình này có thể nói như nhau nhưng về mặt hình thức vàphương diện khác thì khác nhau hoàn toàn

Quá trình lên men trong tự nhiên là một quy luật sống còn của vi sinh vật Tựtham gia tổng hợp chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên, các vi sinh vật

và các vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồngđều về chủng loại và về số lượng Mặt khác, quá trình lên men này không đượckiểm soát, nhiều pha lên men và không định hướng Sản phẩm lên men đa dạng,không ổn định, do đó chất lượng lên men kém và không đồng nhất

Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu từ phân lậpgiống vi sinh vật, cơ chất, pH, nhiệt độ, độ ẩm …các quá trình phản ứng sinh học,quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn Sản phẩmtạo ra có định hướng rỏ ràng ngay từ khâu chọn giống vi sinh vật cho đến cuối quátrình thu nhận sản phẩm Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện rất nhiều

1.1.1: Vai trò của chọn giống trong công nghệ enzyme

Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:

 Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

 Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (Trong côngnghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định)

 Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

 Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạttính enzyme)

 Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

 Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm

1.1.2: Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đượcsản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống vi sinh vật dung trong công nghệenzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:

 Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn, sảnphẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụkhác Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinhchất gấp hàng nghìn lần khối lượng cơ thể mình trong một khoảng thờigian cực kỳ ngắn, thì cơ thể vi sinh vật cần phải tổng hợp nhiều chất Do

đó sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác nhau Chính vì thế, giống visinh vật dung trong sản xuất một loại sản phẩm nào đó, thì sản phẩmnày phải trội hơn các sản phẩm khác về cả số lượng và chất lượng

 Giống vi sinh vật cần phải cho năng suất sinh học cao

 Giống vi sinh vật phải có khả năng thích nghi và phát triển mạnhtrong điều kiện sản xuất công nghiệp

 Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻtiền và dể kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt động

 Giống vi sinh vật sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải lànhững giống vi sinh vật thuần khiết và tốc độ sinh sản nhanh

 Tốc độ trao đổi chất mạnh mẽ để nhanh chóng tạo ra sãn phẩm mongmuốn, và dể dàng tách sản phẩm ra khỏi những tạp chất môi trường vàsinh khối vi sinh vật giống

 Giống vi sinh vật phải ổn định trong điều kiện bảo quản và dể dàng bảoquản

=> Để tạo điều kiện thuận lợi nhất về chủng Giống vi sinh vật cung cấp choquá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuầnkhiết.

1.1.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergilus Oryzae

Aspergilus Oryzae là một loại nấm mốc thuộc bộ Plectascales,lớp comycetes

( nang khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ bao gồm những sợi rất mảnh,phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế bào Từ những sợinằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có

những cơ quan sinh sãn vô tính Cuống đính bào tử của Aspergilus Oryzae thường

dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường, phía cuống đính bào tử phònglên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành các tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi lànhững tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành các bào tử đính

vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử của Aspergilus Oryzae có màu vàng

lục hoặc màu vàng hoa cau …

Hình 1.1 nấm mốc Aspergilus Oryzae

Đặc điểm của giống Aspergilus Oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào

và thủy phân ngoại bào như amylase, protease, pectinasa…Ta rất hay gặp chúng ở

các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo…đã hết nhưng không được rửasạch, ở cặn bã bia, rượu, ở lỏi ngô, bã sắn…Chúng mọc và phát triển có khi thànhlớp mốc, màu đen, vàng…Màu này được quyết định bởi các bào tử già có màusắc Các bào tử này dể bị gió cuốn đi xa và có thể rơi ở bất cứ đâu, khi gặp điềukiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

1.1.4: Quá trình phân lập giống vi sinh vật

Vi sinh vật phân bố rộng trong tự nhiên, từ nơi có địa hình bình thường đếnnơi có địa hình phức tạp, ở đâu củng có vi sinh vật Ở những nơi giàu chất hữu cơ,trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thể người, động vật, nơi nhiệt độcao nhất đến nơi có nhiệt độ thấp nhất Vi sinh vật có khả năng thích ứng trongmọi môi trường Chính vì khả năng tuyệt vời này mà vi sinh vật có thể tồn tạitrong những điều kiện khắc nghiệt nhất

Thông thường, để phân lập một giống vi sinh vật nhằm thu nhận enzyme ta

có thể dung ba cách phân lập:

 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

 Phân lập giống từ mẩu giống đã hỏng

Tùy vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập saocho có hiệu quả nhất Mổi cách phân lập đều có những ưu điểm khác biệt:

1.1.4.1: Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

Trong điều kiên tự nhiên, vi sinh vật để có thể tồn tại và thích ứng nhanh thì

vi sinh vật cần phải có khả năng sinh tổng hợp thập nhiều loại enzyme, để chuyểnhóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào Điềunày không phù hợp để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp với loại enzyme

Ở điều kiện tự nhiên và trong sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng

kể giữa khả năng sinh tổng hợp enzyme của các giống vi sinh vật Các vi sinh vậtsinh tổng hợp được trong điều kiện tự nhiên được gọi chung là vi sinh vật hoangdại Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của tự nhiên Khi chúng

ta đưa vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định,đòi hỏi các loài vi sinh vật giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sảnxuất công nghiệp Tập cho chúng thích nghi với điều kiện trong sản xuất côngnghiệp là một điều cần thiết

Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài vi sinh vật, visinh vật trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra thường biến và đột biến Những độtbiến thường cho ra hai hiệu ứng: một là gây cho các cá thể chết, hai là nhiều độtbiến tạo ra các loài vi sinh vật mới có khả năng sinh tổng Các loài vi sinh vật cókhả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở môi trường cơchất tương ứng Dựa vào đặc điểm này chúng ta có thể dể dàng xác định vị trí cầnphân lập loài vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme mà chúng ta cần

ta Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao,

ta phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV

có khả năng sinh tổng hợp amylase cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tựnhiên

hợp enzyme rất cao Việc gây ra những đột biến này rất có ý nghĩa và cầntiến hành Những đột biến kiểu này thường bền vững, rất thích hợp để đưa vào sảnxuất ở quy mô công nghiệp

1.1.4.2: Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi vớiđiều kiện môi trường sản xuất Nhờ đó sau khi phân lập, các giống này không cầnqua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đãđược chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen Và có những đặc điểm sinh hóahơn hẳn những giống vi sinh vật hoang dại.

Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất ( trong dịch lên men, dịchnước thải, chất thải của quá trình lên men ) thường rất cao Do đó, khả năng thunhận được những chủng vi sinh vật có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao

1.1.4.3: Phân lập giống trong những mẫu giống đã hư hỏng

Các ống giống có thể bị nhiễm trong quá trình bảo quản do bị nhiễm, có thểrất nhiều tế bào giống vi sinh vật bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào vi sinhvật chưa bị thoái hóa Việc phân lập lại từ loại giống này có thể đạt được nhữngkết quả tốt

1.1.5: Quá trình phân lập nấm mốc Aspergilus Oryzae

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzymeamylase Ở nấm mốc, nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzimamylase là tinh bột Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trựctiếp từ nhà cung cấp nấm mốc giống Ưu điểm của giống mua là thời gian bảoquản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn Tuy nhiên, quá trìnhphân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc

bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm

Quá trình lấy mẩu: có thể lấy từ mẩu đất ẩm khoảng 100g hoặc mẩu lấy từkhoai tây cắt lát đem chon xuống đất Khoảng 8 ngày thì đào lấy nhưng lát khoaitây lên,rủ sạch đất cát bám trên bề mặt khoai

Tiến hành phân lập :

 Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây

 Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây đã nghiền cho vào 90mlnước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu

 Dùng pipet hút 10ml dung dịch mẫu ban đầu cho vào 1 ốngnghiệm khác chứa 90ml nước cất vô trùng

 Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3,10-4 ở những ống nghiệmtiếp theo

 Hút 0,1ml cho vào đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng chọnlọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato DextroAgar)

 Dùng que trải, trải đều chất dinh dưỡng trên bề mặt môi trường,đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày

 Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chổ này

sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh thể lạc

 Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trướckhi cấy Có tác dụng làm chất chỉ thị cho tinh bột

 Cấy truyền những nấm mốc đặt trưng trong môi trường PDAtrong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong72h, sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông

Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).

Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môitrường sinh trưởng của nấm

pH=6,5

NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01

Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởiAutoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó đem

ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút Sau khi nhân giốngthành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quảcao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp

1.1.6: Phương pháp bảo quản

Mục đích bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sãn xuất enzyme là đảm bảotính ổn định trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, và tính ổn định của các hoạttính của các enzyme Sau đây là một số phương pháp bảo quản:

 Cấy truyền và bảo quản lạnh: dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật

sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh, trong mộtkhoảng thời gian nhất định Trong thời gian này vi sinh vật bảo tồnđược khả năng sinh tổng hợp enzyme

 Bảo quản giống trong đất hoặc cát: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩmthấp, vi sinh vật có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trongthời gian dài Phương pháp này rất phù hợp để bảo quản giống mốc

Aspergilus Oryzae

 Bảo quản giống trong hạt ngủ cốc: Bào tử nấm mốc được dữ trong hạtngủ cốc đã được xử lý nhiệt có độ ẩm < 8 %, và giữu được khả năngsinh tổng hợp enzyme trong một khoảng thời gian dài

1.2 Tổng quan về enzyme amylase

R.R’ + H-OH  RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp thành 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào)

và Exoamylase (enzyme ngoại bào)

Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzymekhử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α–dextrin6-glucosidase ); khử gián tiếp là Transglucosylase( hay oligo-1,6-glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase.Các enzyme này thủy phân các liên kết bêntrong của chuỗi Polysaccharide

Exoamylase gồm có β-enzyme và γ-enzyme Đây là những enzyme thủy phântinh bột từ đầu không khử của chuỗi Polysaccharide

=> Cơ chế tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:

Tinh bột:

Là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu ở trong các loại củ như khoailang, khoai tây , khoai mì … trong các loại hạt ngũ cốc , các loại hạt và có côngthức tổng quát là () Các loại tinh bột đều C6H12O12)n Tinh bột từ mọi nguồn khácnhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940có 20-30% amylase

và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ nănglượng quan trọng

 Amylase có trọng lượng phân tử từ 50000 đến 160000 Da , đượccấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glusoside tạo thành một mạch nhánh dài không phân nhánh

 Amylopectin có khối lượng phân tử từ 400000 đến hang chục triệu Da,được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kếtα-1,4-glusoside và α-1,6-glusoside tạo thành mạch có nhiều nhánh, tinhbột không tan trong nước lạnh nhưng khi đun nóng đến 60o-85oC thìtinh bột sẽ bị hồ hóa gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzymeamylase, tinh bột sẽ bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt

Sự thủy phân tinh bột do amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa vàđường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sãn phẩm trung gian làdextrin, và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sãn phẩm là maltose vàglucose.

 Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọngcho cơ thể con người Rau và quả củng là nguồn cung cấp tinh bột, mộtphân tinh bột này đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose Cabohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, cung cấp đường

và tinh bột

Glycogen :

Là một loại Cabohydrate dự trữ, ở động vật được dự trữ trong cơ thể vàchuyển hóa từ từ để sử dụng Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết vớinhau bởi lien kết α-1,4-glusoside ở các vị trí phân nhánh và α-1,6-glusoside Glycogen có nhiều mạch hơn tinh bột, phân tử khối khoảng 2000000 đến 3000000

Da Glycogen dể tan trong nước, nếu chúng ta ăn thức ăn có quá nhiều thì cơ thểchúng ta sẽ dự trữ dưới dạng chất béo chủ yếu ở trong gan

1.2.2: Đặc tính của enzyme α-amylase

Enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khácnhau, mỗi loại enzyme α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng.Enzyme α-amylase là một protein giàu tyrosine, ryptophan, acid glutamic vàaspartic Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng aminoacid cấu thành nên phân tử enzyme:

 α-amylase có ít methionine và có khoảng 7 đến 10 gốc cysteine

 Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc khoảng 45000 đến 50000 Da

 α-amylase dể tan trong nước, dung dịch muối loãng và rượu loãng

 Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globoline

 Điểm đẵng điện của α-amylase nằm trong khoảng pH= 4,5-5,7