Nghiên cứu phương pháp chuẩn đoán nấm bệnh aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin bằng môi trường thạch nước dừa luận văn tốt nghiệp đại học

flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh...46 Bảng 3.7.2 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng A.. flavus sinh độc tố Aflatoxin, góp phần làm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ

- -Phan Thị Phương

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM

BỆNH Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

BẰNG MÔI TRƯỜNG THẠCH NƯỚC CỐT DỪA

(COCONUT AGAR MEDIUM)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

VINH – 07.2011

Lời cam đoan!

Quá trình thực tập tốt nghiệp là khoảng thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức mới mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn Tiếp tục rèn luyện đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa hoc kỹ thuật

Để hoàn thành luân văn này tôi xin cam đoan:

1 Trong quá trình nghiên cứu bản thân luôn nhiệt tình với công việc

2 Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

3 Kết quả nghiên cứu của bản thân có được là nhờ sự giúp đỡ tận tình, chu đáo của thầy giáo hướng dẫn PGS TS Trần Ngọc Lân và cô giáo hướng dẫn KS

Hồ Thị Nhung và các thầy cô giáo trong phòng thí nghiệm

4 Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc

Nghi lộc, tháng 7 năm 2010Tác giả luận văn

Phan Thị Phương

Lời cảm ơn

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô giáo trong khoa Nông Lâm Ngư Trường Đại học Vinh, các nhà khoa học, người dân nơi thu mẫu và bạn bè thân hữu gần xa.

Hoàn thành luận văn này cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Ngọc Lân đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt cả quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn KS Hồ Thị Nhung đã nhiệt tình truyền đạt những

kỹ năng, kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học cho tôi Đặc biệt cô luôn động viên khuyến khích và mang đến cho tôi niền tin, lòng say mê nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công chức khoa Nông Lâm Ngư, tổ bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm, thư viện đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi hoàn thành khóa luận này

Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận sự động viên, hỗ trợ rất lớn về vật chất và tinh thần của gia đình, bạn bè Tôi xin trân trọng biết ơn những sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên đó

Xin chân thành cảm ơn!

Nghi lộc, tháng 7 năm 2011Tác giả luận văn

Phan Thị Phương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

1.1.Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp và độc tố Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm 4

1.2 Sơ lược về các loài Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin 7

1.3 Độc tố Aflatoxin 10

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977) 13

1.3.2 Aflatoxin và tác động của nó đối với sức khỏe con người 13

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành 15

Hình 1.3 Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin của các loài Aspergillus spp 18

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

31

31

31

Hình 2.2 Mầu sắc A flavus trên môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có hoặc không có độc tố Aflatoxin) và trắng (không có Aflatoxin) 31

Hình 2.3 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng nấm A flavus dưới ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin, màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin) 32

Bảng 3.1 Thành phần và mức độ phổ biến của nấm bệnh hại hạt giống ngô 33

Bảng 3.2 Thành phần và mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống 33

Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) một số huyện Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh 37

Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận 41

Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận 41 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc và phụ cận 42 Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận.44 Hình 3.3 Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận 45 Bảng 3.7.1 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng A flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh 46 Bảng 3.7.2 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng A flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An 46 Bảng 3.7.3 Tỷ lệ các chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin tại Nghệ An,

Thanh Hóa và Hà Tĩnh 47 Bảng 3.8 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng A flavus thu thập được từ nông sản thu được từ chợ vùng Nghi Lộc

và phụ cận 49

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ cái viết tắt Nội dung

A candidus Aspergillus candidus

A flavus Aspergillus flavus

A fumigatus Aspergillus fumigatus

A glacus Aspergillus glacus

A nomius Aspergillus nomius

A ochraceus Aspergillus ochraceus

A oryzae Aspergillus oryzae

A paraciticus Aspergillus paraciticus

chromatography

chromatography

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977) 13

Hình 1.3 Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin của các loài Aspergillus spp 18

31

31

31

Hình 2.2 Mầu sắc A flavus trên môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có hoặc không có độc tố Aflatoxin) và trắng (không có Aflatoxin) 31

Hình 2.3 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng nấm A flavus dưới ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin, màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin) 32

Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận 41 Hình 3.3 Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận .45

A flavus thu thập được từ nông sản thu được từ chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận 49

mốc trên các loại hạt này thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium và trong số

chúng sản sinh ra độc tố Theo nghiên cứu, người ta kết luận có 4 độc tố hiện diện trên hạt lạc là: Aflatoxin, Citrinin và Ochratoxin A trong đó Aflatoxin được đặc biệt chú ý

vì tính độc của nó

Aflatoxin là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất hình thành trong

tự nhiên Chúng bao gồm một họ độc tố sinh ra từ nấm Aspergillus flavus và

Aspergillus paraticus Điều kiện thời tiết ở Việt Nam được xem là môi trường lý

tưởng cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nói chung và nấm Aspergillus spp nói riêng Nấm mốc có mặt khắp mọi nơi và thường phát sinh, phát triển trên

các sản phẩm lương thực, thực phẩm…và cả trên hoa quả Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng và giá trị sử dụng còn có rất nhiều loài nấm mốc tiết ra độc tố gây bệnh cho con người gây tổn thương gan, gây

ung thư, gây giảm sức đề kháng cho cơ thể Chính vì tác hại của độc tố này gây

nên với con người nên nhiều nước phát triển trên thế giới như: Mỹ, Nhật Bản, các nước EU, …khi nhập lương thực, thực phẩm như: ngô, lạc, cà phê, chè,…đã đưa ra khung giới hạn về hàm lượng về Aflatoxin phải ở dưới mức cho phép Thực tế thì

đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép Vì vậy, việc nghiên

cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc tố

Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm Nhiều nghiên cứu liên quan đến việc giảm thiểu độc tố Aflatoxin

sinh ra bởi A flavus từ những năm giữa thập niên 1970 của thế kỷ trước Từ đó đến

nay có nhiều công trình nghiên cứu về Aflatoxin và một số myctoxin khác đã được

thực hiện Mặt dù sự hiện diện của A flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với

việc tồn tại Aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm Aflatoxin Do đó việc định tính và định lượng được dư lượng Aflatoxin là cần thiết và quan trọng

Môi trường thạch nước cốt dừa được sử dụng để xác định sự có mặt của

độc tố Aflatoxin sinh ra bởi Aspergillus spp từ những ưu điểm như: (i) rất dễ

chuẩn bị môi trường; (ii) xác định được sự hiện diện của độc tố Aflatoxin nhanh chóng và rõ ràng bằng huỳnh quang; và (iii) sự có mặt của Aflatoxin làm môi trường bị biến màu vàng cam - là cơ sở để định tính nhanh chóng Aflatoxin mà không cần sử dụng đèn tia cực tím

Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy các loài

A flavus sinh độc tố Aflatoxin, góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm trong sản

xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc

tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium)".

1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu

1.2.1 Mục đích nghiên cứu

Xác định thành phần bệnh hại chủ yếu hại trên các loại nông sản lạc, ngô,

đậu tương Nhận xét tỷ lệ mẫu nông sản và mẫu đất trồng ngô, lạc nhiễm A flavus Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A flavus sinh độc tố Aflatoxin

bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM) làm cơ sở đánh giá tình hình nhiễm Aflatoxin trên nông sản và trên đất trồng lạc, ngô

Đánh giá tỷ lệ nhiễm A flavus của mẫu nông sản thu được từ các chợ, kho

bảo quản nông hộ và của các mẫu đất thu được

Chẩn đoán các chủng A flavus phân lập được từ nông sản và từ đất sinh

độc tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp và độc tố

Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm

Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất hàng năm ước tính khoảng 12 – 15 % trên toàn thế giới, trong đó 25% nông sản của toàn thế giới bị nhiễm các độc tố nấm mốc Vì vậy, phòng chống độc tố nấm mốc là vấn đề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và được các nước trên thế giới đặc biệt quan tâm [7]

Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc, gạo, đậu

tương và cà phê cũng được xác định là nhiễm A flavus và độc tố Aflatoxin ở các

mức độ khác nhau và được thể hiện ở bảng 1.1 [2]

Bảng 1.1 Sự có mặt của A flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc

Lạc ở trại, bảo quản

trong các chum, kho

Có nhiều chủng nấm mốc tiết ra độc tố này (nấm A flavus, A parasiticus,

A nomius), nhưng A flavus là loài nấm mốc cung cấp những lượng Aflatoxin lớn

nhất, nguy hiểm nhất Ở khắp các vùng Nam Phi, nơi người ta ăn nhiều lạc có mốc

A flavus, tỷ lệ bệnh nhân bị ung thư gan rất cao A flavus gặp nhiều ở các lương

thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển [17] Tác giả Hiscocks đã nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc – 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin

B1 (độc tố chủ yếu của A flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc

Còn trên lạc khô: 42% số mẫu là rất độc; 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc [5]

Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A flavus được phân lập từ 13-21% trong các mẫu gạo Những nghiên cứu ở Thái Lan cũng cho thấy A flavus có mặt trong nhiều

loại thực phẩm bán trên thị trường Các chủng sinh Aflatoxin cũng có trong đất

trồng trọt A flavus được phân lập từ 15 trong 50 mẫu đất ở Malaysia và 29 trong

106 mẫu đất ở Thái lan, 16 chủng trong số 44 chủng phân lập sản sinh Aflatoxin [2] Các trường hợp nhiễm độc ở người do ăn phải Aflatoxin có trong thực phẩm, đặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao đáng được quan tâm hơn lạc Mặc dù lạc nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một

số nước ăn lạc khá phổ biến như Môdambic, Xênêgan, Xuđăng [2, 5]

Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm

Aflatoxin trên ngô do nấm A flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng

trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến

2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A flavus trong đất và đã xác định rằng mức nhiễm A flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các vụ canh tác trước Mật độ A flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô vụ 2001 so với 251

CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457 CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ

năm 2002 Sự nhiễm A flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0% đến 100%

(trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng Aflatoxin trong ngô dao động từ

0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb) Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên

trong ngô ở ngoài đồng không tương quan tới sự nhiễm A flavus: 43% đến 59% có khả năng tạo các chủng A flavus phân lập trong đất Aflatoxin Với sự nhiễm cao

nhất ở quần thể đất của ngô gối vụ năm 2001 Kết quả cũng cho thấy 84% A flavus

phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo Aflatoxin [13]

Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 400µg/kg), trong khi 40% nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 133µg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% ở đảo Cebu, Philippin trung bình là 213 µg/kg Hàm lượng Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan tới sự bùng nổ của bệnh gan độc

tố cấp tính ở tây bắc Ấn Độ Theo Goto và cộng sự 80 – 85% số mẫu ngô thu thập

từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái lan đã nhiễm Aflatoxin B1 với lượng 6,30 – 1310 ppb và 0,6 – 767 ppb theo thứ tự Trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết đến 50 µg/kg Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465 µg/kg Các Aflatoxin đã tìm thấy ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có trên 250 µg/kg và 9% số mẫu có trên 1000 µg/kg Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc được kiểm tra năm 1967 – 1969, có Aflatoxin với giá trị 155 µg/kg và giá trị trung bình 500 µg/kg [5, 7]

Ở Inđônêsia các nghiên cứu về độc tố đã được tiến hành trên các cây trồng như lúa, ngô, đậu tương, cây gia vị,cây thuốc Các mẫu lạc thu từ trong kho của

dân, của các nhà phân phối và ở các chợ cho thấy tỷ lệ nhiễm A flavus từ 60 - 80 %

với hàm lượng Aflatoxin từ 40 - 4100µg/kg Các mẫu ngô mới thu hoạch lấy từ các hộ nông dân, các nhà thu mua địa phương và các nhà phân phối tỉnh Lampung

có tìm thấy nấm A flavus xâm nhập và hàm lượng độc tố Aflatoxin từ 5,3 - 291

ppb Ngô và các thức ăn cho gà của các nhà sản xuất và các sản phẩm từ ngô của

các nhà máy cũng như siêu thị có độ ẩm từ 12,5 – 14,5% đều bị A flavus xâm

nhiễm và có chưa độc tố Aflatoxin B1 từ 0 – 100 ppb Trên đậu tương hai loại nấm

thường gặp là A candidus, A flavus có hàm lượng độc tố Aflatoxin trong các mẫu

giao động từ 8 – 34ppb [8]

Ở Việt Nam, Đậu Ngọc Hào và các cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa Kết quả phân

tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã bị nhiễm A

flavus với tần số cao, từ 50 - 80 % Các loài khác như A glacus, A fumigatus và A candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao Loài A ochraceus đã được phát hiện thấy ở

tỷ lệ thấp Các loài thuộc chi Fusarium đã nhiễm với tần suất 15% Kết quả nghiên

cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu ngô trên đã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt đã

bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 10 - 40 ppb, 83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 -

20 ppb, 72% mẫu ngô bột đã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu ngô bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb kg [2]

Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt Nam cho thấy tần số nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng Aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau kg [7]

1.2 Sơ lược về các loài Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin

Họ nấm Aspergillus spp có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoảng 20 loài gây hại cho con người Trong đó A flavus, A.parasiticus, A nomius là ba

loài nấm trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển tiết ra độc tố Aflatoxin cả trên môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy nhân tạo, ba loài nấm này thuộc họ nấm cúc Đây là các loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới [11, 35]

A flavus khi phát triển trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bề

mặt khuẩn lạc có màu váng lục, do bào tử đính màu này được tạo ra rất nhiều Hệ bào tử đính thường có sợi cuống với vỏ cuống xù xì, có hai bộ cuống đính báo tử

và tạo bào tử đính có gai Loại này có thể tạo Aflatoxin và có khả năng gây

bệnh Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong

nước, trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại

này thường rất khó khăn Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương

thực như: Lúa, ngô, sắn Trên một số loại hạt làm thực phẩm như: Lạc, đậu,

vừng, vv… Trên thực phẩm như: Các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị bầm dập như: Thanh long, nhãn,

xoài, vải,…[2, 11, 14]

1.2.1 Điều kiện xâm nhiễm và sinh độc tố của các loài Aspergillus spp.

Khả năng sinh độc tố của các chủng A flavus và A parasiticus rất khác

nhau Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường

Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất Các chủng phân lập từ các hạt khác nhau thường không thấy hoặc rất ít khả năng sinh độc tố Ngay cả trên cùng một cơ

chất, khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng A flavus cũng khác nhau

Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng

với A flavus sinh độc tố Aflatoxin Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện

trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin Sự hình thành Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển khối lượng sợi nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại Thời gian sản sinh cực đại để sản sinh Aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi Lí do của sự giảm lượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc

Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là

từ 25-28oC Nếu nuôi cấy A flavus ở 45oC thì khả năng sản sinh Aflatoxin sẽ bị

ức chế Hàm lượng trong cơ thể đóng vài trò quan trọng trong quá trình hình thành Aflatoxin Ở lạc nhân có lượng nước từ 15-30% Sự hình thành Aflatoxin xuất hiện sau 2 ngày, trên gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24% Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rất nhanh đặc biệt là sau thu hoạch Cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin [11]

1.2.2 Hình thái học nấm A flavus và nấm A paraciticus

Trong tự nhiên, có thể dễ dàng phân biệt được loài nấm này do chúng có

màu sắc dễ nhận Màu vàng lục hay màu xanh lục của đám bào tử khi chín bám trên các mầm của hạt hoặc phát triển trên các kẽ giữa hai phiến của hạt, khi tách

ra có thể nhìn thấy rất rõ Ở các khe giữa hạt lạc hay lớp mầm của hạt ngô bị mốc

có thể quan sát thấy bào tử Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, trên thạch Sabouraud hay Czapek Doc hình thành khuẩn lạc sau 24 giờ, khu vực trung tâm

có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn Sau 48 giờ hình thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chín, màu vàng nhạt đã chuyển sang màu vàng lục Từ 72 – 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh và đạt cực đại ở ngày thứ 6 – 7 khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Khuẩn lạc có kích thước tới 4 – 5 cm, hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5 – 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều loại nấm mốc khác Quan sát đặc điểm vi thể dưới kính hiển vi ở bội số thấp (X16) cũng có thể phân biệt được do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất phong phú Cơ quan sinh sản

có hình hoa cúc Bọng tròn có kích thước từ 25 – 45 µm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì có kích thước từ 400 – 1000 µm; rộng 5 – 15 µm Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có đường kính từ 2 – 4 µm Thể bình có hai lớp, kích thước từ 10 – 15 µm và 3 – 5

µm, đôi khi chỉ có 1 lớp [2, 11]

Hình 1.1 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản

gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi)

Nấm A flavus, A parasiticus thường nhầm lẫn với loài A oryzae trong sử

dụng (chúng có hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, đầu thể bình lưỡng tính hoặc đơn tính, bào tử hình cầu nhỏ Vì vậy, chúng ta cần phải kết hợp cả việc quan sát mầu sắc khuẩn lạc trong quá trình phân lập, nuôi cấy và hình ảnh cuống sinh bào tử khi soi kính hiển vi để tránh nhầm lẫn khi phát hiện

các loại nấm này (A flavus có kích thước cuống sinh bào tử (0,4 – 1mm) trong khi đó A oryzae là (1 – 2 mm) [2, 11].

1.3 Độc tố Aflatoxin

Độc tố nấm còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng,

có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Morrau 1974) Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng (Scheoedes và Ashworth) Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hoá Quá trình trao đổ chất gồm 2 giai đoạn: Trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp.Quá trình trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành chất cần thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào còn trao đổi chất thứ cấp là quá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ, chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào là căn bản giống nhau ở các thế hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài, mỗi chủng nấm mốc Thông thường quá trình này thường xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc Các độc tố nấm mốc được tổng hợp từ nhiều đường chuyển hoá khác nhau, cụ thể như sau:

+Dẫn xuất của đường glucoza

+ Dẫn xuất của các axitamin

+ Dẫn xuất của polyxetoacid

+ Dẫn xuất của terpenteichthecen

+ Các dẫn xuất của mevelonat kết hợp với axitamin

Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loài nấm có thể đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin

có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực

phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium,

Alternaria và Claviceps Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2,

M1, M2), sterimatocystin, axit cyclopianzoic Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin Các độc tố của Penicillium:

Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, và axit cyclopianzoic toxin,

diacetocyscirpenol, fumonisin và moniliformin Các độc tố của Alternaria: axit tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion Các độc tố của Claviceps: Các

alkaloit Ergot Mặc dù độc tính của những loài nấm lớn nhất định đã được biết tới từ lâu, nhưng khả năng gây độc cho con người từ các sản phẩm độc của các nấm mốc chưa được thừa nhận, cho mãi đến năm 1850, khi sự liên quan giữa

việc ăn phải lúa mạch đen nhiễm Claviceps purpurea và các đặc tính lâm sàng

của bệnh Ergot đã được phát hiện Vấn đề này được tiếp tục bằng các báo cáo về các độc tố nấm mốc khác đã ảnh hưởng đến con người như xác định các hội

chứng liên quan đến việc ăn phải bánh mì nhiễm Furarium graminearum, sự nhận biết bệnh do nấm mốc Stachybotris và những nghiên cứu liên quan đến

bệnh giảm bạch cầu độc tố thực phẩm (ATA), và sự ăn phải các hạt lương thực

để qua mùa đông nhiễm Fusarium poae và Fuarium sporotrichioides ở nước Nga

trong chiến tranh thế giới lần thứ hai Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp

mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa thịt Trong số các mycotoxin thì Aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về

mọi phương diện Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen biết là A

flavus và A parasiticus.

1.3.1 Tính chất hoá lý của Aflatoxin

Các Aflatoxin gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản

phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A flavus và A parasiticus, được đặt tên là

B1, B2, G1, G2 Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật Bốn chất được phân biệt trên cơ sỏ màu phát quang của chúng B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây) Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá được gọi là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng

độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, Aflatoxin G1 có màu huỳnh quang xanh lá cây Aflatoxin G1 có chứa hai vòng lacton, Aflatoxin B1có chứa 1 vòng lacton Sau đó, hai Aflatoxin B1, G2 cũng được phát hiện Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống Aflatoxin B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử

Năm 1966, Dutton và Heathcote đã phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy có hai dẫn xuất hydroxi-2 của Aflatoxin B2 và Aflatoxin G2 là Aflatoxin B2a và Aflatoxin G2a

Allcroft và Carnaaghan đã nhận thấy trong sữa và thịt bò cũng có dẫn xuất của Aflatoxin B1và B2, được đặt tên là Aflatoxin M1và M2 Cả hai chất này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm được hợp chất như vậy

Aflatoxin Công thức Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy

268-269286-289244-246229-231299293

1.3.2 Aflatoxin và tác động của nó đối với sức khỏe con người

Theo Tổ chức Nông lương Thế giới FAO, khoảng 25% cung cấp ngũ cốc thế giới có chứa một lượng lớn mycotoxin Tại nhiều nơi ở châu Á, tỷ lệ nhiễm mycotoxin cao hơn do các nhân tố khí hậu và phương thức thu hoạch, bảo quản hạn chế Theo các tài liệu khoa học, có 6 loại Aflatoxin, trong đó độc nhất là Aflatoxin B1 (AFB1) Sự nguy hiểm của AFB 1 ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liều lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam (với lượng chỉ

đủ đính trên đầu 1 móng tay) cũng đã đủ làm hỏng gan Độc chất này lại bền vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100 độ C ở nồi bình thường hoặc nhiệt độ cao hơn ở nồi áp suất hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc thì Aflatoxin

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977)

vẫn không bị phân hủy Cái nguy hiểm nữa là với điều kiện nóng ẩm như nước ta thì nấm mốc hiện diện gần như khắp nới, trên hạt bắp, hạt lạc, cám gạo, khô dầu… Một điều tra của Trung tâm y tế dự phòng thành phố Hồ Chí Minh thấy hàm lượng Aflatoxin trong lạc cao gấp 263 lần ngưỡng cho phép Khảo sát của Viện nghiên cứu Dầu thực vật cũng cho kết quả cứ 11 mẫu thử thì có 5 mẫu nhiễm Aflatoxin với hàm lượng từ 20 – 112 mg/kg (gấp 2 đến 11 lần ngưỡng cho phép) Mối nguy hiểm khác, khi các nguyên liệu thức ăn gia súc như bắp, khô dầu đậu nành bị nhiễm mốc thì người sử dụng thường vò, sảy và thổi cho bay mốc, cứ tưởng như thế thì sẽ sử dụng được nhưng trên thực tế thì chỉ bay các sợi nấm còn độc tố Afatoxin do nấm tiết ra vẫn còn nguyên trong nguyên liệu đó [20].

Hiện nay có khoảng 300 Aflatoxin với trên 100 loài nấm mốc tương ứng

đã được phát hiện, trong đó chiếm số đông là Penicillium sau đó đến Aspergillus [1].

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành

A fumigatus Aflatoxin , fumigacillin, gliotoxin

A oryzae Oryzacilli, acid koji

A versicolor Versicolorin A, B, C; aversin, sterogmatocystin

(Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004.)

Aflatoxin là một độc tố nấm mốc đáng sợ nhất Có nhiều chủng nấm mốc

tiết ra độc tố này, nhưng A flavus là loài nấm mốc cung cấp những lượng Aflatoxin

lớn nhất, nguy hiểm nhất Sau này các nhà hóa sinh học đã xác định thêm không phải chỉ có một mà nhiều Aflatoxin có công thức hóa học khá gần gũi nhau có 4 loại Aflatoxin đã được xác định là B1, B2, G1, G2 (Phân biệt ký tự "B" và "G" theo màu huỳnh quang xanh da trời và xanh lá cây khi chiếu tia cực tím lên bản tách các vết sắc ký lớp mỏng Aflatoxin)

Ðộc tố Aflatoxin rất bền với nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt

độ rất cao, các bào tử của mốc bị tiêu diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá hủy hoàn toàn Người ta đã nghiên cứu thấy rang lạc ở 15000C trong 30 phút thì tỷ suất Aflatoxin B1 giảm trung bình 80% và Aflatoxin B2 giảm 60% Như vậy lạc mốc dù được rang ở nhiệt độ cao, ăn vào vẫn nguy hiểm

Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn gây tử vong cho hàng loạt người và gia súc mà nguyên nhân chính là do độc tố của một số chủng

vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số

người ăn phải ngũ cốc bị mốc [21].

Đến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to gan, sau xét

nghiệm và phân tích đã xác định tác nhân gây chết là độc tố Aflatoxin do nấm A

flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên thức ăn [38, 40].

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc

tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư Người ta đã biết Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua đường miệng nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau Năm 1961, ở Anh người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan Robinson nghiên cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, ông đã tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những

bà mẹ có con bị xơ gan Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá chặt chẽ với nhau [5]

Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 – 60% số mẫu đó có Aflatoxin Đồng thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30 – 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin

Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể tiếp nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc Theo Baxter

và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc với bụi lạc hay các sản phẩm nông

nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ nguy hiểm chưa được xác nhận [2].

Độc tính với các Aflatoxin , người ta đã thấy có một loạt những triệu chứng gắn liền với sự nhiễm độc cấp tính và những sự biến đổi liên quan đến các

sự nhiễm độc mãn tính Loại sau này có bản chất di truyền và tương ứng với ba kiểu: Gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến Hậu quả của việc nhiễm

Aflatoxin phụ thuộc rất nhiều vào tuổi, giới tính, loài, trạng thái dinh dưỡng, mức và tần số tiếp xúc [3].

1.4 Các biện pháp chẩn đoán nấm A flavus sinh độc tố Aflatoxin

Các phương pháp phân tích để xác định các độc tố nấm mốc trong thực phẩm đã được phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960 Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác nhau nên cần những phương pháp kiểm tra đặc trưng riêng Chính vì vậy đã xuất hiện nhiều phương pháp xác định như: Phương pháp truyền thống, phương pháp vật lý hóa học, phương pháp hóa sinh học, các phương pháp dựa trên cơ sở sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GS) với dectector thích hợp như dectector huỳnh quang (FLD), dectector bắt điện tử UV , dectector ion (FID), dectector bắt điện tử (ECD)

Hình 1.3 Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin của

các loài Aspergillus spp.

(Nguồn Hamed K Abbas và cộng sự, 2004)

1.4.1 Phương pháp sử dung môi trường CAM (Coconut Agar Medium)

Khuẩn lạc trên PDA sau 4-7 ngày

Đánh giá sự thay đổi màu sắc môi trường

Cho khuẩn lạc vào bản đánh giá sắc ký lớp mỏng (TLC), quan sát dưới đèn UV bước sóng 365 nm.

Chiết xuất khuẩn lạc, phân tích bằng ELISA, sắc ký lỏng cao áp hiệu suất cao (HPLC) hoặc các phương pháp phân tích khác

Chuyển khuẩn lạc nấm mốc từ môi trường

Màu vàng trên môi trường giúp xác định được 94% chủng không sinh độc và 71-74% chủng sinh độc tố Aflatoxin

Huỳnh quang màu xanh giúp xác định được chính xác 80% chủng không sinh độc tố Aflatoxin, 87% chủng sinh độc tố ở mức thấp và 98% chủng sinh độc tố ở mức cao

Đánh gía huỳnh quang dưới đèn

UV bước sóng 365 nm

TLC giúp đánh giá chính xác 92% chủng không sinh độc

và 100% chủng sinh độc tố Aflatoxin ởmức cao.

Để phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin dựa vào đặc

điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang để lại trên môi trường đã công bố

từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước

Theo Hamed K Abbas và cộng sự (2004), màu vàng đến màu vàng cam

trên môi trường nuôi cấy được sinh ra bới các chủng A flavus sinh độc tố

Aflatoxin được phát hiện lần đầu tiên bởi Wiseman và cộng sự (1967), bởi vì chúng gây ra sự sai khác trong các lần định lượng Aflatoxin bằng phương pháp

hấp phụ Sự xuất hiện sắc tố màu vàng bởi A flavus cũng đã được báo cáo của

Arseculeratne et al (1969), đã quan sát thấy rằng sắc tố vàng xuất hiện bắng đầu

vào ngày thứ hai của những khuẩn lạc A flavus được nuôi cấy trên môi trường

thạch dừa [15] Lin và Dianese (1976) đã đưa ra ý kiến đầu tiên về sự kết hợp đánh giá sự thay đổi màu sắc trên môi trường với màu huỳnh quang để xác định

chủng A flavus có sinh độc hay không Sắc tố màu vàng được quan sát sớm hơn

so với màu xanh huỳnh quang và người ta không quan sát thấy sự xuất hiện của sắc tố vàng ở những khuẩn lạc không sản xuất Aflatoxin Sắc tố màu vàng được tiết vào môi trường và dễ dàng quan sát ở mặt dưới của môi trường thạch chẳng hạn như môi trường thạch đường khoai tây Lin và Dianese (1976) báo cáo rằng mức độ sắc tố màu vàng tỷ lệ thuận với huỳnh quang màu xanh ở tất cả các thử nghiệm của họ [18] Tuy nhiên, Davis et al (1987) kết luận rằng việc sản xuất sắc tố màu vàng không phải là một yếu tố dự báo đáng tin cậy của số lượng Aflatoxin trong tất cả các loại môi trường nuôi cấy

Theo Lin và Dianese (1976), môi trường thạch chứa nước cốt dừa với pH được điều chỉnh ở mức 6.9 được phát triển để xác định độc tố Aflatoxin sinh ra

bởi Aspergillus spp Trên môi trường này, nếu Aflatoxin được tạo ra, môi trường

sẽ có huỳnh quanh màu xanh da trời hoặc xanh lá cây dưới ánh sáng của tia cực tím Huỳnh quang xuất hiện do Aflatoxin được sinh ra nhiều sau 32 giờ chuyển sang môi trường thạch nước cốt dừa Màu vàng cam trên môi trường thạch nước cốt dừa là một cơ sở để kết hợp với màu của huỳnh quang để đánh giá khả năng

sinh độc tố Aflatoxin của Aspergillus spp Sự biến đổi màu sắc trên môi trường

thạch nước cốt dừa không thể sử dụng để định tính Aflatoxin sinh ra mà không cần kết hợp với việc sử dụng ánh sáng của đèn cực tím Môi trường thạch nước cốt dừa rất dễ dàng để chuẩn bị và định tính được độc tố Aflatoxin nhanh chóng, đơn giản với trang thiết bị rất đơn giản [18].

1.4.2 Phương pháp vật lý hóa học

Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp sắc ký để

phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng

(TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền

* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định, định lượng Aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 (Coomes et al, 1964, 1965) Thủ tục phân tích sử dụng các bản được tráng bởi Silica gel Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan Aflatoxin

Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform [2,7, 19] được đánh giá là có khả năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy, được đưa vào chiếu bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm Các vết mẫu phân tích

có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có độ dài Rt được so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuẩn Nhược điểm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20 – 30% [2, 25]

*Sắc ký lớp mỏng hiệu suât cao (High performance thin layer chromatography –

HPTLC)

Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng

một cách tự động; cải thiện sự đồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát

Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất

* Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography –

1.4.3 Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods)

Phương pháp hoá sinh miễn dịch mang tính đặc hiệu cao, dựa trên nguyên

lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin đánh dấu phóng xạ và Aflatoxin gắn men (Pestka, 1980, 1981) Do

sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau để xác định Aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng [2]

* Phương pháp ELISA (enzyme – linked immunoabsorbant assay)

Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp, ELISA trực tiếp sử dụng Aflatoxin có gắn men, ELISA gián tiếp – Aflatoxin có gắn prôtêin và một kháng thể thứ hai Cả hai phương pháp này đều sử dụng men peroxidaza và men photphataza kiềm để gắn

Phương pháp ELISA trực tiếp: dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ (microtites) Dung dịch tách từ mẫu hay Aflatoxin mẫu được ủ cùng nhau hay tách thành hai bước, sau đó được rửa bằng dung dịch thích hợp Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh trực tiếp bằng mắt

thường với các đĩa chuẩn Phương pháp này chiếm nhiều thời gian và sai số lớn trong cùng mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách [2]

Phương pháp ELISA gián tiếp: Aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ (microtiter) Mẫu tách hay Aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp theo là kháng thể thứ cấp (anti Aflatoxin antibody) Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm kháng thể IgG (anti rabit IgG) gắn với photphataza kiềm (ALP) và phản ứng màu xảy ra với P-nitrophenyl photphat

Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với đường độc chuẩn Standard Curve Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thể thứ cấp nên sai số cao và chiếm nhiều thời gian [2]

1.4.4 Phương pháp PCR dùng chẩn đoán nấm sinh độc tố Aflatoxin

Để tiện lợi hoá việc phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố

Aflatoxin , gần đây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu áp dụng rộng rãi [24] Ngoài tính tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp này còn có ưu

điểm là phát hiện nhanh, nhạy, chính xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố

Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu

hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp

Aflatoxin [12, 16] Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin , trong đó có 4 gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm

Chất đầu tiên tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin có nguồn gốc từ một polyketide, ngưng tụ các chất acetate để tạo thành axit norsoloric, tiếp

đó là sự biến đổi norsolorinic axit (NOR)→ averantin (AVN)→ averufanin → averufin (AVF) → hydroxyversicolorone → versiconal hemiacetal acetate → versicolorin B → versicolorin A (VA)→ sterigmatocystin (ST) → O –

methylsterigmatocystin (OMST) → Aflatoxin B1 Trong mắt xích cuối của con đường sinh tổng hợp enzym O – methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) có liên quan tới sự sản sinh Aflatoxin Gần đây, chỉ mới một vài enzym trong con đường sinh tổng hợp này được phân lập [19,24] Cụ

thể, ba gen cấu trúc trong con đường sinh tổng hợp Aflatoxin của nấm A

paraciticus có liên quan đến sự biến đổi của NOR và VA (nor-1 và ver-1),

enzym O – methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST)

(omt -1) ; và một gen điều hoà của nấm A flavus (afl-2) đã được nhân dòng Các

gen này được chọn làm gen đích cho phản ứng PCR Gen afl -2 được biết đến như một như một enzym bảo tồn hoạt động của các enzym khác trong con đường sinh tổng hợp Aflatoxin Trong một số nghiên cứu cũng đưa ra, gen apa-2 của

chủng nấm A parasiticus trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin , có mức độ tương đồng về ADN rất lớn với gen afl-2 của nấm A flavus [20, 21].

1.5 Tình hình sản xuất lạc, ngô ở tỉnh Nghệ An

Cây lạc (Arachis hypogaea L) là cây trồng cổ truyền, được trồng ở hơn

100 nước trên thế giới, với diện tích khoảng gần 22 triệu ha Sản lượng lạc vỏ gần 30 triệu tấn, trong đó sản lượng lạc ở các nước đang phát triển gấp 10 lần các nước phát triển Ở Việt Nam lạc là sản phẩm quan trong để xuất khẩu và sản xuất dầu ăn mà hiện nay nước ta còn phải hập khẩu Trong số 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về sản lượng nhưng năng suất thì còn thấp Nhìn chung so với diện tích của cả nước, Nghệ An là tỉnh đứng thứ hai về diện tích trồng lạc (30.000ha) sau Tây Ninh Hiện nay, Nghệ An sản xuất 3 lạc vụ/năm

Vụ lạc xuân (vụ chính) có diện tích trên 20000 ha, sản phẩm chủ yếu phục vụ cho xuất khẩu; vụ thu đông chủ yếu để cung cấp giống cho vụ chính và một phần làm hàng hoá cho các tỉnh bạn (năm 2006, diện tích 1914ha, năng suất 11.65tạ/ha), vụ lạc hè đã có từ rất lâu, diện tích hàng năm trên dưới 2000 ha, sản phẩm chủ yếu phục vụ tiêu dùng, chế biến và một phần được dùng để làm giống (hè thu 2007, diện tích 1821ha, năng suất 14.05tạ/ha)

Cây ngô (Zea mays L) là cây lương thực quan trong trong nền kinh tế toàn

cầu Trên thế giới cây ngô đứng thứ 3 về diện tích, thứ 2 về sản lượng và đứng thứ nhất về năng suất Nghệ An đứng thứ 5 so với cả nước về diện tích trồng ngô (54.400ha) với sản lượng 34,7tạ/ha.( Tổng cục thống kê năm 2009)

Trong những năm gần đây, cây lạc ngô được trồng phân bố trên khắp 19 huyện trong tỉnh mà tập trung chủ yếu ở các huyện như: Diễn Châu, Nghi Lộc, Nam Đàn, Thanh Chương, Quỳnh Lưu…Mặt khác, năng suất lạc giữa các huyện chênh lệch lớn, ngay trong các xã cũng có sự khác nhau rất lớn

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loại nấm hại trên nông sản, đất trồng lạc ngô; độc tố Aflatoxin được

sinh ra bởi các chủng A flavus.

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

• Đề tài được tiến hành tại:

+ Địa điểm thu thập mẫu nông sản: Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Yên Thành, Anh Sơn và một số chợ đầu mối ở Nghi Lộc, Vinh

+ Địa điểm thu mẫu đất: Nghệ An (Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Quỳnh Lưu), Thanh Hóa (Tĩnh Gia, Nông Cống), Hà Tĩnh (Nghi Xuân, Thạch Hà)

+ Phòng thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư trường Đại học Vinh

• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12 năm 2010 đến tháng 7 năm 2011

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu

• Mẫu hạt giống thu thập tại Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Yên Thành, Anh Sơn và một số chợ đầu mối ở Nghi Lộc, Vinh

• Mẫu đất thu thập trên đồng ruộng ở một số huyện ở Nghệ An, Thanh Hóa,

Hà Tĩnh

• Các chủng A flavus được phân lập từ nông sản và đất.

• Môi trường nuôi cấy: CAM, PDA, v.v

• Dụng cụ thí nghiệm: gồm các trang thiết bị đơn giản phục vụ cho nghiên cứu: kính hiển vi, kính lúp điện, tủ sấy, buồng cấy, đèn UV bước sóng λ =

365 nm, nồi hấp, đèn cồn, đĩa petri, bếp từ, cân điện tử, bình tam giác,v.v

2.2 Nội dung nghiên cứu

• Xác định thành phần nấm gây hại nông sản lạc và ngô thu thập tại Nghi

Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Yên Thành, Anh Sơn và một

số chợ đầu mối ở Nghi Lộc, Vinh

• Xác định thành phần nấm hại đất trồng lạc, ngô một số huyện ở Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh

• Đánh giá tỷ lệ nhiễm A flavus trên nông sản thu từ các chợ đầu mối Nghi

Lộc và Vinh

• Đánh giá tỷ lệ nhiễm A flavus trên nông sản thu được từ kho bảo quản

nông hộ thu thập tại Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Yên Thành, Anh Sơn

• Đánh giá tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc, ngô vùng Nghệ An,

Thanh Hóa, Hà Tĩnh

• Đánh giá tỷ lệ các chủng A.flavus phân lập được từ mẫu nông sản thu

được sinh độc tố Aflatoxin

• Đánh giá tỷ lệ các chủng A.flavus phân lập được từ mẫu đất thu được sinh

độc tố Aflatoxin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

2.3.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất

• Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, tư trang cần thiết: Dao nhọn; túi bóng; giấy, bút; máy ảnh; phiếu thu thập

• Bước 2: Xác định địa điểm thu mẫu: Thu mẫu đất ở 3 xã của huyện Nghi Lộc (Nghi Phong, Nghi Ân, Nghi Trường), thu trên 10 ruộng cố định (Nghi Phong 4 ruộng, Nghi Ân 3 ruộng, Nghi Trường 3 ruộng), mỗi ruộng có diện tích khoảng 500m2

• Bước 3: Phương pháp lấy mẫu: Dùng dao nhọn đào mẫu đất xung quanh các gốc cây ở độ sâu khoảng 5- 10 cm Thu mẫu đất định kỳ 7 ngày một lần theo phương pháp 5 điểm chéo góc Tức là mỗi ruộng lấy 5 điểm chéo góc trộn lẫn với nhau làm 1 mẫu (10 ruộng thành 10 mẫu), lấy khoảng 200- 300g đất / mẫu