phát hiện và xác định lebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPCKHANG CARBAPENEM

Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

VŨ DIỆU THU

PHAT HIỆN VA XAC ĐỊNH

Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC

KHANG CARBAPENEM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011

Tôi xin dành những lời cám ơn chân thành nhất gửi đến tất cả những người đã luôn bên cạnh tôi, giúp tôi có được thành công ngày hôm nay.

Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích và kinh nghiệm quý báu Thầy luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Cũng những lời tri ân này, xin gửi tới các thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - những người đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững chắc để tôi tự tin bước vào con đường nghiên cứu

Tôi có được may mắn vì đề này nằm trong luận án tiến sĩ của Th.S Trần Nhật Phương nên tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Anh Cám ơn Anh đã cung cấp cho tôi các chủng để tiến hành thí nghiệm cũng như đã theo sát từng bước đi của tôi, cho tôi những góp ý rất chân thành, giúp đề tài này đuợc hoàn thiện trong thời gian sớm nhất

Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè ở công ty Nam Khoa đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo một môi trường làm việc thân thiện giúp tôi có động lực làm việc tốt hơn

Cảm ơn rất nhiều những người bạn đã luôn sát cánh, dõi theo tôi, những người

đã cùng tôi chia sẻ buồn vui trong những năm tháng đi học, những người mà nếu thiếu

họ chắc tôi khó lòng hoàn thành luận văn này một cách trọn vẹn

Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, con biết ơn bố mẹ đã dành cho con cả cuộc đời này Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con những lúc khó khăn nhất, giúp con

có thêm động lực, niềm tin vào những gì mình làm, giúp con nên người trưởng thành như ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2011

Vũ Diệu Thu

DANH MUC CHÜ VIET TAT

DANH MỤC BANG

ASTS Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance

CLSI Clinical and Laboratory Standards Insitute

dNTP deoxyribonucleotide triphosphate

ESBL Expanded Spectrum Beta-lactamase

FDA Food and Drug Administration

ICARE Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology

MC agar Mac Conkey agar

MIC Minium Inhibitory Concentration

NCBI National Center for Borotechnology Information

ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside

PBP penicillin-binding protein

PCR Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.11 Kết quả tra cứu trình tự tương đồng với chủng K pneumoniae ATCC ®

1705 dùng trong thí nghiệm bằng công cụ BLAST của NCBI 75

Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trong trình tự gen blaKPC bằng phần mềm

Primer premier 5.0 77

MỤC LỤC

PHỤ LỤC

Phu lục 1: Kết quả định danh bằng IDS 14 ® GNR

Phu lục 2: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA

Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ của 21 chủng thí nghiệm

Phu lục 4: Kết quả giải trình tự gen blaKPC của các chủng thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cuộc chiến tranh giữa con người và vi khuẩn, kháng sinh là những trợ thủ đắc lực cho con người Thuốc kháng sinh không ngừng được cải biến về chất lượng và phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu quả điều trị Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều cơ chế khác nhau, đáng chú ý là cơ chế sản xuất men ESBL (extended spectrum beta-lactamase) có khả năng thủy phân các thế hệ kháng sinh cephalosporin và hầu hết các loại beta-lactam Đối với các trường hợp này, kháng sinh carbapenem được xem là phương án cuối cùng Vũ khí carbapenem hiện nay đang có nguy cơ trở nên vô hiệu do sự xuất hiện của các vi khuẩn có khả năng tiết men carbapenemase,

đáng lo ngại nhất là men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) phát hiện chủ yếu ở Klebsiella pneumoniae.

Klebsiella pneumoniae được biết đến là tác nhân phổ biến các trường hợp viêm phổi bệnh viện và nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm khác Chủng này có khả năng tích lũy và lan truyền tính kháng rất cao Gần đây, vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem đã và đang bùng phát trên một số quốc gia trên thế giới và gây ra những đợt

dịch lớn điển hình như ở New York[17, 18, 20, 69], Isarel [46] Đây thực sự là thách thức đối các nhà điều trị và gánh nặng cho cộng đồng bởi vì việc trị liệu rất hạn chế, những vi khuẩn mang gen này được xem là “bất trị” Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên plasmid nên khả năng lan truyền tính kháng rất nhanh và còn có thể cộng hợp với các họ gen kháng khác trên plamid làm cho những chủng mang gen này có tính kháng mạnh hơn Tổ chức Y tế thế giới đã lên tiếng cảnh báo về sự lây lan của các vi

khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để các nước có biện pháp kiểm soát sự lây nhiễm và tránh lạm dụng, sử dụng

thuốc kháng sinh sai mục đích Tuy nhiên, ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về mô hình lan truyền của siêu vi khuẩn này

Đề tài “Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem” được thực hiện nhằm phát hiện được một số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC ở một số bệnh viện ở Việt Nam Qua đó giúp cho các nhà

lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn sự lây lan cũng như có cái nhìn thận trọng hơn về sự lan truyền của đối tượng này

Nội dung thực hiện đề tài bao gồm các phần:

+ Định danh lại các chủng nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu được từ một số bệnh viện tại Việt

Nam

+ Xác định kiểu hình tiết ESBL và carbapenemase

+ Phát hiện gen blaKPC bằng phương pháp PCR.

+ Xác định kiểu gen blaKPC trên các chủng Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp giải trình tự.

1 TỒNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

1.1.1 Đặc điêm phân loại

Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (18531938)

đã phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae và

Streptococcus pneumoniae Klebsiella được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức

thế kỉ 19, Edwin Klebs (1834-1913) [24]

Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài:

Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella

terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica và

Klebsiella variicola Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ là Klebsiella

pneumoniae, Klebsiella ozaenae và Klebsiella rhinoscleromatis Sự phân chia này dựa

theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựa vào khoảng cách

di truyền [24] Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng

nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh

viện nghiêm trọng trong những năm gần đây [52]

Đặc điểm phân loại của Klebsiella pneumoniae:

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố

Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ

polysacharide đặc trưng Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của

tế bào chủ [52]

Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuấn lạc K pneumoniae [76]

K

pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose K pneumoniae

có quan hệ gần nhất với Klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhau nhờ phản ứng

indole, K pneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả melezitose và

3-hydroxybutyrate [52] Một số phản ứng sinh hóa của các loài trong chi Klebsiella

được thống kê trong bảng 1.1

Vi khuấn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các

sản phấm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao Một số

loài trong chi Klebsilla còn được phân lập từ bề mặt rễ của một số loài thực

vật với vai trò cố định nitơ Klebsiella spp có phổ kí chủ động vật rộng, bao

gồm cả côn trùng và nhiều nhóm động vật khác Ở người có thể tìm thấy

chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương vô trùng

[24, 52] Nguồn phân lập phổ biến của các loài trong chi Klebsiella được mô tả

trong bảng 1.2

Ghi chú: (-) thử nghiệm âm tính; (+) thử nghiệm dương tính; (+/-) trên 70% là dương tính.

(OXI) thử nghiệm oxidase; (GLU) khả năng lên men glucose; (LAC) khả năng lên men lactose; (GAS) khả năng sinh hơi; (H2S) khả năng sinh H2S; (PAD) thử nghiệm phenylalanine deaminase, (URE) thử nghiệm urease; (IND) thử nghiệm indol; (MOB) tính di động; (CIT) khả năng biến dưỡng citrat; (VP) thử nghiệm Voges - Proskauer; (MR) thử nghiệm methyl red; (LDC) thử nghiệm decarboxylase; (MLO) khả năng biến dưỡng malonate; (ONPG) thử nghiệm ONPG

GLU LAC GAS H2S

Trang

1.1.3 Các nhân tố gây bệnh

Các thành viên trong chi Klebsiella đều biểu hiện 2 loại kháng nguyên bề mặt: kháng

Klebsiella pneumoniae

Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người như viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết

nhiều nhiễm trùng khác nhau

Klebsiella ozanae

Là tác nhân gây viêm mũi teo và nhiễm trùng mủ ở màng nhầy của mũi Ngoài ra vi khuẩn này còn có thể phân lập được từ các nhiễm trùng: máu, nước tiểu, mô mềm

Klebsiella ornithinolytica

Phân lập được từ nước và thực vật Ở người, vi khuẩn này thường được phân lập ở đường hô hấp trên, nước tiểu, dịch não tùy và máu

hầu, xoang mũi

Klebsiella terrigena

Nguồn phân lập chính là đất và nước, có thể phân lập được từ phân người khỏe mạnh, đường hô hấp nhưng không gây bệnh cho người

Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O Cả hai kháng nguyên này là cơ sở cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào quá trình phát sinh bệnh Dựa vào tính biến động trong cấu trúc của những kháng nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau Độc tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau [52].

Cũng như các loài khác trong họ vi khuẩn đường ruột, Klebsiella bám dính lên bề mặt

tế bào chủ nhờ hệ thống lông pili được cấu tạo bởi những đơn vị protein hình cầu có khối lượng phân tử khoảng 15-26kDa Những lông pili này có khả năng đông tụ hồng cầu của nhiều loài động vật khác nhau [52]

Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngoài việc thoát khỏi sự thực bào do hoạt động của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải còn phải tìm cách thoát khỏi ảnh hưởng của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh Hoạt tính diệt khuẩn chủ yếu qua trung gian các protein bổ thể Bổ thể được hoạt hóa khi có hay không có kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn tới hoạt hóa protein C3, hình thành opsonin C3b và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9 Protein này tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được bơm vào trong, thay đổi ấp suất thẩm thấu bên trong tế bào vi khuẩn Cho tới nay, cơ chế giúp

vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ Đối với Klebsiella, giả thuyết được đưa ra là do lớp

vỏ polysaccharide bao bọc và che lớp lipopolysaccharide nằm ở dưới hoặc do chuỗi bên của kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể [52]

Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủ sắt Đây là nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc tác các phản ứng oxi hóa khử trong quá trình truyền điện tử Tuy nhiên, do nguồn sắt tự do trong tế bào chủ rất thấp nên nhiều vi khuẩn đảm bảo đủ lượng sắt cho tăng trưởng bằng cách tiết ra những chất kìm

phân tử lượng nhỏ, có ái lực cao với sắt được gọi là các siderophore Ở Klebsiella người ta

nhận thấy đã có sự sản xuất hai loại siderophore là enterobactin và aerobactin [24, 52]

1.1.4 Đặc điếm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh

Klebsiella là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng

ngoài phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản, Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện

do Klebsiella tăng cao chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng

thuốc [24, 52]

Tính đề kháng kháng sinh của các thành viên trong gia đình Klebsiella rất cao Tất cả

đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất beta- lactamase đặc hiệu cho penicillin Thông thường, các enzyme beta-lactamase vốn có này còn nhạy cảm với các chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic, tuy nhiên từ năm 1982 tại Đức đã xuất hiện

K

ESBL (extended spectrum betalactamase) Các enzyme này được truyền qua trung gian plasmid nên có tính chất lây lan trên diện rộng, tính nhạy cảm giảm hẳn với các thuốc ức chế beta- lactamase, và nguy hiểm hơn lại có tính đa kháng thông qua trung gian plasmid với các

họ kháng sinh khác như với aminoglycoside Đối với các chủng tiết ESBL, việc lựa chọn kháng sinh điều trị rất khó khăn do chúng kháng được với nhiều loại kháng sinh Carbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem) được coi là kháng sinh có tác dụng nhất Tuy nhiên,

“siêu vi khuẩn” K pneumoniae có khả năng kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau

đang bùng phát và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng [52]

1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem

1.2.1 Carbapenem

Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh beta-lactam, có phổ kháng khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của beta-lactam như penicillin, các thế hệ cephalosporin Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một hợp chất tự nhiên do

Streptomyces cattlaya tiết ra [15, 60].

Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vòng beta-lactam hình vuông nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ nguyên tố lưu huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi Cấu trúc đặc biệt của carbapenem tạo ra 3 đặc tính giúp carbapenem có phổ tác dụng rộng: (1) những phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử dụng những lỗ hổng rất nhỏ của màng ngoài vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin-binding protein); (2) cấu trúc của carbapenem làm cho kháng sinh này khó bị beta-lactamase của nhiều loại vi khuẩn cắt đứt vòng beta-lactam; (3) carbapenem có ái lực với nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn

Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem

Penicilline [75]

Carbapenem [74]

Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem gồm có: imipenem, meropenem, ertapenem,

Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam [2]

Cloxacillin, dicloxacillin, methincillin,

nafcillin, oxacillinAmidinopenicilli

Cephem

(chích)

Cephalosporin I Cefazolin, cephalothin, cephapirin,

cephradineCephalosporin II Cefamandole, cefocicid, ceftaroline, cefuroxime (sodium)Cephalosporin III Cefoperazone, cefotaxime, ceftazidime, ceftizoxime, ceftiaxone

doripenem, panipenem/ betamipron, biapenem Trong đó imipenem, meropenem, ertapenem

là các loại thông dụng, doripenem cũng đã được FDA chấp nhận sử dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm trùng ổ bụng và nhiễm trùng tiểu nặng [28] Carbapenem thường được sử dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn Gram âm sản xuất beta-lactamase phổ rộng (ESBL) [20, 22, 39, 60, 71], điển hình trong một số trường hợp như viêm màng não mủ, viêm xoang do nhiễm khuẩn bệnh viện, viêm phổi do nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm trùng không rõ nguồn gốc

1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem

Tính kháng với carbapenem chủ yếu do 3 cơ chế:

- Sản xuất vượt mức một loại beta-lactamase không phải carbapenemase như AmpC cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài do mất hoặc thay thế

kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh Cơ chế này được nhận thấy ở Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogens, Proteus rettgeri, Citrobacter freundii, Escherichia coli, K pneumoniae [71, 72] Ở K pneumoniae, kênh porin màng OmpK35và OmpK36 giữ vai trò

quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng góp vào tính kháng carbapenem [36]

- Sản xuất carbapenemase có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt tính thủy phân cầu

amide của vòng beta-lactam Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở K pneumoniae [71, 72] Với

vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), K pneumoniae đã gây ra nhiều đợt

dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm trọng

- Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối với carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn [71,

72] Cơ chế kháng carbapenem này trên K pneumoniae ít được nghiên cứu.

Ở K pneumoniae, vấn đề hệ thống bơm đấy kháng sinh ra ngoài AcrAB có

liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [36], tuy nhiên đã

có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống này có làm cho vật

chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng kháng chéo với

chloramphenicol, quinolone [14]

1.2.3 Carbapenemase

Carbapenemase là enzyme thuộc họ P-lactamase bất hoạt được tất cả các loại

P-lactam như penicillin, cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện

nay là carbapenem [53]

Dựa vào cơ chế thủy giải tại vị trí hoạt hóa, carbapenemase được phân làm 2nhóm:

TEM và SHV Các hoạt chất nhóm broad

spectrum trên cộng với oxyimino-cephalosporins (cefotaxime, cefpodoxime, ceftazidime, và cef triaxone) và monobactam (aztreonam)

++++

A

Khác (BES-1, GES/IBC, PER-1, 2, SFO-1, TLA-1, VEB-1, 2)

AmpC ACC-1, ACT-1,

CFE-1, CMY, DHA-1, 2, FOX, LAT, MIR-1, MOX-

1, 2

Hoạt chất nhóm expanded-

cephamycins (cefotetan, cefoxitin, và thuốc khác)

0

C

Carbape-

nemase

IMP, VIM, GIM-1,

và SPM-1

Hoạt chất nhóm expanded- spectrum cộng với cephamycins và carbapenems (ertapenem, imipenem, và meropenem)

Lớpphântử

Broad-spectrum

TEM-1, 2, SHV-1

Benzylpenicillin (penicillin G),amino-penicillins (amoxicillin

carboxypenicillins (carbenicillin và ticarcillin), ureidopenicillin (piperacillin), cephalosporins phổ hẹp (cefazolin, cephalothin, cefamandole, cefuroxime, và các thuốc khác)

OXA

Các hoạt chất nhóm broad- spectrum trên cộng thêm cloxacillin, methicillin, và oxacillin

- Non-metallo-carbapenemase: có serin tại trung tâm hoạt động của enzyme, hoạt tính

bị ức chế bởi clavulanic

không bị ảnh hưởng bởi clavulanic

Dựa vào chức năng thủy giải, beta-lactamase được phân làm 4 nhóm từ nhóm

1 đến 4 Trong đó, nhóm 2 được chia làm nhiều nhóm phụ dựa trên sự chuyên biệt cơ

chất và các chất ức chế Carbapenemase chủ yếu thuộc nhóm 3 và nhóm phụ 2f [53]

Dựa vào đặc tính phân tử, carbapenemase được chia làm 3 lớp

- Lớp A: thuộc nhóm non-metallo-beta-lactamase, gồm các loại sau:

+ Nguồn gốc NST: Serratia marcescens enzyme (SME)

■ Not metalloenzyme carbapenemases (NMC)

■ Imipenem-hydrolyzing ß-lactamases (IMI)

+ Nguồn gốc plasmid:

■ Klebsiella pneumoniae carabapenemases (KPC)

■ Guiana Extended-Spectrum (GES)

- Lớp B: thuộc nhóm metallo-beta-lactamases, bao gồm IMP, GIM, SIM, SPM, và

VIM carbapenemases, được ghi nhận ở Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumanii và một số vi khuẩn đường ruột Mới đây là NDM-1, một carbapenemase

nằm trên plasmid, phát hiện ở K pneumoniae và E coli, phân lập từ mẫu bệnh phẩm

của bệnh nhân người Thụy Điển nhập viện tại New Delhi, Ân Độ

- Lớp D: bao gồm oxacilinase, chủ yếu tìm thấy ở Acinetobacter baumanii.

1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)

1.3.1 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)

Trước đây các men carbapenemase được cho là chuyên biệt cho loài, do gen

mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể với các đặc tính rõ ràng Tuy nhiên, với việc phát hiện

các carbapenemase do gen mã hóa nằm trên plasmid, điển hình là KPC (Klebsiella

pneumoniae Carbapenemase), đã làm thay đối cách nhìn nhận về mô hình lan truyền

của tác nhân kháng thuốc này Sự gia tăng nhanh chóng các chủng mang gen blaKPC

trong thời gian gần đây càng cho thấy tầm quan trọng của việc tìm hiểu đặc tính của

các men này trong nghiên cứu lâm sàng học

KPC là một carbapenemase đầu tiên được tìm thấy ở K pneumoniae, thuộc

lớp A, nhóm 2f, bị ức chế bởi clavulanic Kết quả của việc sản xuất enzyme này là vi

khuẩn có khả năng đề kháng với tất cả penicillin, cephalosporin (cefepime,

ceftriaxone), carbapenems (meropenem, ertapenem), và aztreonam Vi khuẩn đường

ruột tiết men KPC hầu hết còn kháng được các lớp kháng sinh khác như

fluoroquinolone, aminoglycoside [16, 34, 38, 46, 62]

KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung hợp hay

không dung hợp Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon Tn44001, vị trí

của gen blaKPC ở K pneumoniae và một số loài khác được mô tả trong hình 1.3

Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen kháng khác nằm trên plasmid như

fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi khuẩn Hơn nữa,

plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng di truyền ngang giữa các loài lân

cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao [22, 53, 58]

Có 3 loại isoenzyme của KPC đã được xác định rõ ràng Trình tự gen

blaKPC-2 sai biệt 1 nu so với blaKPC-1 dẫn đến sự biến đổi serine thành glycine ở vị trí 175

Trình tự gen blaKPC-3 khác biệt một nu so với blaKPC-2 dẫn đến sự thay thế

tyrosine thành histidine tại vị trí 272 [31] Sự khác nhau này giúp ta phân biệt 3 biến

thể gen blaKPC này dựa trên sản phẩm gen sau khi cắt bởi 2 loại enzyme cắt giới hạn

BstNI và RsaI như hình 1.4 Tuy là men KPC-3 có hiệu quả thủy giải cao hơn KPC-1

và KPC-2 nhưng tầm quan trọng lâm sàng vẫn chưa rõ ràng KPC-3 được nhận thấy

có ở K pneumoniae [37, 56, 69], Enterobacter cloacae [19], Hiện nay đã phát hiện

các biến thể khác của KPC ( từ 2-11) [21]

c]ai San phàm POR ban đâu

11 I San phàm PCR đã đươc cãt bơi Bst'N i vá Rsal1.3.2 Phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem

Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn mang gen blaKPC thông qua việc phát

hiện carbarpenemase đã được sử dụng bao gồm:

- Sử dụng môi trường chọn lọc CHROMagar KPC có bổ sung tác nhân ức chế vi

khuẩn Gram âm và dương nhạy carbapenem [57]

- Phương pháp đĩa khuyếch tán kháng sinh dựa trên sự xác định đường kính vòng vô

khuẩn quanh đĩa carbapenem [67]

Hình 1.4 Sự khác biệt giữa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 [30]

- Phương pháp vi pha loãng dựa trên sự xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC

của các kháng sinh carbapenem Cùng với phương pháp đĩa khuyếch tán kháng sinh,

đây được coi là phương pháp đánh giá tiêu chuẩn trong các phòng thí nghiệm, được

biện luận theo tiêu chuẩn của CLSI [67]

- Sử dụng que thử E-test được cấu tạo bằng nitrocellulose tẩm kháng sinh carbapenem

theo dãy nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Khi đặt que E-test trên

môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh từ que khuyếch tán ra môi trường theo

gradient nồng độ và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vùng vô khuẩn có

hình elip Một số hệ thống tự động như MicroScan WalkAway (Dade MicroScan,

Inc), BD Phoenix (BDDS), Sensititre AutoReader (Westlake, Mỹ), VITEK Legacy

(bioMérieux) và VITEK 2 (bioMérieux) giúp xác định MIC carbapenem cũng đã

được nghiên cứu sử dụng [63, 64]

- Thử nghiệm Hodge cải biên: là thử nghiệm có độ nhạy cao giúp khẳng định kiểu hình

tiết carbapenemase Thử nghiệm này dựa trên nguyên tắc những chủng có khả năng

tiết carbapenemase có khả năng tăng cường sự tăng trưởng của chủng E.coli ATCC ®

25922 nhạy carbapenem ở trong vùng vô khuẩn đĩa carbapenem [67]

- Phương pháp dựa trên APB (3-aminophenylboronic acid): APB là một dẫn xuất của

boronic có khả năng ức chế enzyme carbapenemase lớp A Phương pháp này dựa sự

mở rộng đường kính vòng vô khuẩn từ đĩa carbapenem tới vùng giao tiếp với đĩa

chứa chất ức chế carbapenemase APB đối với những chủng tiết carbapenemase lớp A

[49]

- Phương pháp PCR hay realtime-PCR dựa trên sự khuếch đại vùng gen blaKPC bằng

cặp mồi chuyên biệt [30, 59] Phương pháp này có độ nhạy và độ chuyên biệt cao

nhưng cũng có trường hợp kết quả dương tính giả do sự ngoại

nhiễm hay âm tính giả do trình tự mồi không đặc hiệu, các thành phần phản ứng không

tối ưu

- Phương pháp giải trình tự: phương pháp này bổ sung cho phương pháp

khuếch đại PCR nhằm xác định chính xác kiểu gen blaKPC [25]

Nhìn chung, việc phát hiện vi khuẩn mang gen blaKPC kháng carbapenem rất

khó khăn vì giá trị MIC carbapenem có thể rất cao nhưng vẫn nằm trong khoảng xác

định là trung gian được xác định theo CLSI Những nghiên cứu trước đây cho thấy có

tình trạng “kháng giả” đối với imipenem do có sự phân hủy của thuốc Một vài

nghiên cứu gần đây còn nảy sinh vấn đề cả “kháng giả” và “nhạy giả” với imipenem

và meropenem trong các loài vi khuẩn đường ruột Vì vậy, phát hiện carbapenemase

không chỉ là thách thức đối với các hệ thống tự động mà với ngay cả những phương

pháp kiểm soát tiêu chuẩn Sai sót trong việc phát hiện sẽ dẫn tới những hậu quả

nghiêm trọng [25, 27, 36, 40, 42, 64]

Ertapenem là carbapenem hiệu quả thấp nhất đối với KPC và được sử dụng

trong các phương pháp thử nghiệm tính nhạy kháng sinh và hệ thống tự động cho

thấy khá nhạy để phát hiện KPC Tuy nhiên, vấn đề về độ chuyên biệt khi dùng

ertapenem để phát hiện KPC được đặt ra do Enterobacteriaceae tiết ESBL và mang

đột biến kênh porin cũng kháng ertapenem [40]

Điều trị nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn sản xuất KPC là rất khó khăn và rất ít

thuốc kháng sinh có hiệu quả Polymyxin và tigecycline là 2 kháng sinh được chỉ

định điều trị cho vi khuẩn Gram âm sản xuất KPC Polymyxin B kết hợp với

rifampicin cho thấy hiệu quả trên tất cả các chủng, kể cả các chủng kháng polymyxin

B Tuy nhiên hiệu quả lâm sàng của việc kết hợp này cũng như hiệu quả trên các

chủng kháng polymyxin B cần phải được làm rõ [20] Hơn nữa, mặc dù polymyxin B

là loại polymyxin hiệu quả nhất nhưng có độc tính cao và đã bị rút ra khỏi danh sách

kháng sinh sử dụng trên người nên được thay thế bằng kháng sinh tương tự, cùng họ

là colistin nhưng vẫn chưa có sự đồng thuận về hiệu quả [11, 35]

Do khó khăn trong việc điều trị, tỉ lệ tử vong do nhiễm trực khuẩn Gram âm tiết KPC rất cao (khoảng 40%) [43]

1.3.3 Tình hình dịch tễ học

Năm 1996, K pneumoniae sản xuất KPC lần đầu tiên được phân lập từ mẫu bệnh

phẩm lâm sàng ở bệnh viện tại Bắc Carolina, Mỹ KPC ít được phát hiện những năm sau đó Cho tới năm 2001, họ vi khuẩn Enterobacteriaceae sản xuất KPC bùng phát

tại bệnh viện ở New York và New Jersey [72] Vi khuẩn sản xuất KPC tiếp tục lan

truyền theo thời gian và mới đây báo cáo cho biết có 27 bang ở Mỹ và nhiều quốc

gia khác trên thế giới như Trung Quốc [61, 68, 73], Colombia [12], Brazil [42, 50, 51], Pháp [44], và Israel [37] Tình hình dịch tễ vi khuẩn sản xuất KPC tiếp tục leo thang

Mặc dù hầu hết KPC được phát hiện trong các chủng Klebsiella nhưng cũng được

thấy ở các vi khuẩn đường ruột khác như Klebsiella oxytoca [54, 71], Escherichia coli

[46], Salmonella spp [41], và Citrobacter freundii [54], Serratica spp [73] Một số

nghiên cứu còn nghi nhận sự có mặt của gen KPC ở những vật chủ không thuộc họ

vi khuẩn đường ruột như Pseudomonas aeruginosa phát hiện ở Colombia năm 2006

[12], Acinetobacter baumannii phát hiện ở Puerto Rico năm 2010 [55] Tệ hại hơn, ở

Hy Lạp đã ghi nhận một trường hợp nhiễm khuẩn K pneumoniae mang đồng thời 2

loại carbapenemase KPC-1 và VIM-1 [26] Sự phân bố gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý được thống kê trong bảng 1.6, hình 1.4 Nếu không có biện pháp phát

hiện nhanh để kiểm soát quá trình lây lan, sự bùng phát trên qui mô toàn cầu của

các chủng vi khuẩn mang gen blaKPC, đặc biệt là K pneumoniae mang gen blaKPC

có nguy cơ trở thành hiện thực

2001-2003 New York, Mỹ

2002-2003 New York, Mỹ K pneumoniae 29 [17]

2003-2004 New York, Mỹ K pneumoniae 95 [20]

2004 New York Mỹ K pneumoniae 59 [18]

[66]

2006 Medellin, Pseudomonas aeruginosa 3 [65]

Collombia Citrobacter freundii 1 [65]

2003 New York Enterobacter cloacae 1 [19]

Trang

Viuiíi phân bô rai rác Vunti tlieh

Vunti phân hô rai rác co Paeinìomona.s spp manu KPC Vunu dich co Pseiídomcmas spp

mont» KPC

1.4 Một số nghiên cứu đã thực hiện 1.4.1

Trên thế giới

Trên thế giới, đặc biệt ở những vùng dịch tễ đặc hữu, rất nhiều nghiên cứu được

thực hiện nhằm phát hiện các “siêu vi khuẩn” kháng carbapenem cũng như tìm hiểu

cơ chế kháng của các chủng này, trong đó cơ chế tiết men KPC rất được quan tâm

trong thập kỉ gần đây Một số nghiên cứu điển hình như:

Gln

Trang

Epidemiology) điều tra tính kháng của 448 chủng Enterobacteriaceae và Pseudomonas aeruginosa với kháng sinh imipenem [63].

- Năm 1999, Martinez-Martinez và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của beta- lactamase và porin

ở K pneumoniae kháng carbapenem và cephalosporin [39].

- Năm 2007, cấu trúc tinh thể của gen blaKPC-2 được đưa ra bởi Ke, W và cộng sự [33]

- Năm 2008, Thierry Naas và cộng sự đã xác định cấu trúc gen blaKPC từ các chủng K pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa thu được từ các bệnh viện ở Mỹ, Colombia, Hy Lạp

[45]

- Năm 2006, Fred C Tenover và nhóm nghiên cứu của mình đã tiến hành đánh giá nhanh các phương pháp thử tính nhạy kháng sinh tự động và không tự động phát hiện tính kháng

carbapenem thông qua phát hiện KPC ở các chủng K pneumoniae [64].

- Năm 2008, Hindiyeh và cộng sự đã tối ưu hóa qui trình realtime-PCR để phát hiện nhanh chóng gen blaKPC [30]

- Samra và cộng sự kết luận môi trường CHROMagar KPC có khả năng chọn lọc những vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (2008) [57]

- Năm 2009, Vered Schechner và cộng sự đánh giá phương pháp PCR giúp phát hiện các thành viên tiết men KPC trong họ vi khuẩn đường ruột [59]

- Năm 2009, Pasteran và cộng sự đề nghị thử nghiệm tính nhạy dựa vào APB aminophenylboronic acid) để phát hiện carbapenemase lớp A ở các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [49]

(3 Ngoài ra, những nghiên cứu sự xuất hiện của gen blaKPC và các biến thế mới của

nó được thực hiện trên nhiều quốc gia, điển hình như New York [17, 18, 38, 69], Isarel [37],

1.4.2 Trong nước

Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tình hình đề kháng kháng sinh

Trang

chủng gây nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn Gram âm hoặc đánh giá mức độ kháng thuốc của các chủng này qua việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC bằng E-test, xác định tỷ lệ

ESBL đối với Klebsiella mà chưa xác định đến mức phân tử dẫn đến tính kháng của các

chủng này

Các dữ liệu đã công bố cho thấy tình hình đề kháng carbapenem ở K pneumoniae tại

một số bệnh viện có sự gia tăng theo thời gian Theo nghiên cứu từ chương trình giám sát tính

kháng thuốc ASTS tại Hội nghị tổng kết tháng 1 năm 2005 thì tỷ lệ đề kháng chung của K pneumoniae đối với carbapenem (imipenem) là 0,1% Cũng trong năm này, ở Bệnh viện

Thống Nhất, tỷ lệ đề kháng của vi khuẩn này với imipenem lên đến 1,5% [9]

Một nghiên cứu tương tự trong năm 2005 tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 cho thấy K pneumoniae là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện đứng hàng thứ 2 sau E.coli và được quan

tâm nghiên cứu nhiều do đặc tính kháng kháng sinh của chúng và khả năng đề kháng chéo rất cao trong trường hợp sử dụng nhiều loại kháng sinh Đặc tính này có được là do vi khuẩn có men ESBL kháng được với các cephalosporin thế hệ thứ 3, 4 với tỷ lệ từ 50 - 70% Điểm đáng chú ý là tỷ lệ kháng imipenem của các chủng trong nghiên cứu này lên đến 10% [6]

Nhóm nghiên cứu tại tại Bệnh viện Nhiệt Đới cho thấy từ năm 2000 đến năm 2006 trong khi các chủng vi khuẩn phân lập từ nhiễm trùng ngoài cộng đồng còn nhạy cảm với một

số kháng sinh thông dụng thì các chủng phân lập tại bệnh viện đã có một tỉ lệ kháng thuốc

khá cao, chủ yếu bao gồm Pseudomonas, Klebsiella và Acinetobacter Đáng lo ngại là tỉ lệ

kháng với imipenem đang gia tăng nhanh đáng kể và trở thành thách thức lớn trong việc lựa chọn kháng sinh điều trị nhiễm trùng bệnh viện [5]

Tại Bệnh Viện Trưng Vương, Bác sĩ Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2010 cho thấy các kháng sinh mạnh là imipenem/cilastatin và

meropenem có tỷ lệ kháng bởi K pneumoniae lần lượt là 5,6% và 4,3% [7].

Trong những nghiên cứu tương tự ở một số bệnh viện khác, tỷ lệ K pneumoniae

kháng với carbapenem là rất thấp hoặc chưa phát hiện đựơc chủng kháng Trong nghiên cứu

Trang

pneumoniae kháng đa kháng sinh ở mức cao hơn nhưng kháng rất thấp với imipenem với tỷ

lệ là 0,7% [1] Còn tại Bệnh viện Trung ương Huế chưa phát hiện thấy chủng này kháng với carbapenem [8]

Các nghiên cứu này cho kết quả phù hợp với nghiên cứu đa trung tâm do Bác sĩ Phạm

Hùng Vân và nhóm MIDAS thực hiện trên 16 bệnh viện tại Việt Nam cho thấy K pneumoniae một khi đã tiết đựơc ESBL thì không chỉ đề kháng với penicillin, cephalosporin

thế hệ 1, 2, 3, 4, monobactam mà còn có tỷ lệ kháng cao đối với aminoglycoside và fluoroquinolone Phân tích cho thấy vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae vẫn còn nhạy cảm

cao với imipenem và meropenem Có 2,5% Enterobacter sp kháng được imipenem nhưng vẫn còn nhạy hoàn toàn với meropenem Đối với K pneumoniae, 3,2% kháng imipenem và

1,2% kháng meropenem Kết quả còn cho thấy MIC90 (nồng độ ức chế tối thiểu ức chế 90%

các chủng vi khuẩn thử nghiệm) của imipenem và meropenem trên K pneumoniae là 1,5 |!

g/ml và 0,25 |ig/ml Mặc dù tỷ lệ kháng đựơc carbapenem ghi nhận là thấp nhưng cần phải đựơc lưu tâm làm rõ vì nếu cơ chế của đề kháng là do vi khuẩn tiết được men carbapenemase thì nguy cơ lan truyền tính kháng thuốc sẽ rất cao vì gen mã hóa cho tính đề kháng có thể nằm trên plasmid và có thể lan truyền được [11]

Như vậy nguy cơ để Enterobacteriaceae trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc là hiện

thực, nhất là khi K pneumoniae tiết men KPC phố biến và lan rộng Chính vì vậy sự

giám sát các vi khuẩn sở hữu các khả năng này là điều nhất thiết phải đặt ra cho các phòng thí nghiệm lâm sàng hiện nay [11]

Trang

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. aaAnh (2008), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại Bệnh Viện Nhi Đồng 2 năm 2007", tạp chí Y

Học Thành Phố Hồ Chí Minh, tập 12(phụ bản số 4), trang 183 - 191 .

2. aaDiệp (2009).

3. aaNga (2008), "bv thong nhat".

4. AaNguyễnTháiBình, "Nhiễm trùng cơ hội do Enterobacteriaceae", Tài liệu giảng dạy Đại học Y

dược thành phố Hồ Chí Minh.

5. AaNguyễnThanhBảo.

6. AaPhạmHùngVân.

7. aaPhú (20089), "bệnh viện hoàn mỹ".

8. aaThi, "benh vien nhi trung uong".

9. aathịnh, hồi súc cấp cứu trung uong.

10. aaTuấnBảo, "benh vien trung uong Hue".

11. aatuyếncươnghương (2005), "benh vien thong nhat".

12. Akpaka, P.E., et al (2009), "Emergence of KPC Producing Pseudomonas aeruginosa in Trinidad & Tobago", Journal of clinical

microbiology, JCM 00362-09v1.

13. Ambretti, S., et al (2010), "A carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolate harboring KPC-1 from Italy", New

Microbiologica, 33(3), 281-282.

14. Bialek, S., et al (2010), "Membrane Efflux and Influx Modulate both Multidrug Resistance and Virulence of Klebsiella pneumoniae in a

Caenorhabditis elegans Model", Antimicrobial agents and chemotherapy, 54(10), 4373.

15. Birnbaum, J., et al (1985), "Carbapenems, a new class of beta-lactam antibiotics: Discovery and development of imipenem/cilastatin", The

American journal of medicine, 78(6), 3-21.

16. Bradford, P.A., et al (2004), "Emergence of carbapenem-resistant Klebsiella species possessing the class A carbapenem- hydrolyzing KPC-2 and

inhibitor-resistant TEM-30 -lactamases in New York City", Clinical infectious diseases, 39(1), 55.

17. Bratu, S., et al (2005), "Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in New York City: a new threat to our antibiotic

armamentarium", Archives of internal medicine, 165(12), 1430.

18. Bratu, S., et al (2005), "Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, New York: epidemiology and recommendations for

detection", Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(7), 3018.

19. Bratu, S., D Landman, M Alam, E Tolentino, and J Quale (2005), "Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in Enterobacter spp from

Brooklyn, New York", Antimicrob Agents Chemother, 49, 776-778.

20. Bratu, S., P Tolaney, U Karumudi, J Quale, M Mooty, S Nichani, and D and Landman (2005), "Carbapenemase- producing Klebsiella pneumoniae

in Brooklyn, N.Y.: molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents", J Antimicrob Chemother,

56, 128-132.

21. Chen, L., et al (2011), "Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection and Classification of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Gene (blaKPC)

Variants", Journal of clinical microbiology, 49(2), 579.

22. Cole, J.M., et al (2009), "Development and evaluation of a real-time PCR assay for detection of Klebsiella pneumoniae carbapenemase genes",

Journal of clinical microbiology, 47(2), 322.

23. Cuzon, G., et al (2008), "Plasmid-Mediated Carbapenem-Hydrolyzing {beta}-Lactamase KPC-2 in Klebsiella pneumoniae Isolate from Greece",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 52(2), 796.

24. Dworkin, M., The genus Klebsiella in The Prokaryotes: Symbiotic associations,

biotechnology, applied microbiology 2006, Springer Verlag, 159-196.

25. Endimiani, A., et al (2009), "Characterization of blaKPC-containing Klebsiella pneumoniae isolates detected in different institutions in the Eastern

USA", Journal of antimicrobial chemotherapy, 63(3), 427.

26. Giakkoupi, P., et al (2009), "Emerging Klebsiella pneumoniae isolates coproducing KPC-2 and VIM-1 carbapenemases",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(9), 4048.

27. Goldfarb, D., et al (2009), "Detection of plasmid mediated KPC-producing Klebsiella pneumoniae in Ottawa, Canada: evidence of intra-hospital

transmission", Journal of clinical microbiology, JCM 00098-09v1.

28. Greer, N.D (2008), "Doripenem (Doribax): the newest addition to the carbapenems", Proceedings (Baylor University.

Medical Center), 21(3), 337.

29. Grobner, S., et al (2009), "Emergence of carbapenem-non-susceptible extended-spectrum {beta}-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates

at the university hospital of Tubingen, Germany", Journal of medical microbiology, 58(7), 912.

30. Hindiyeh, M., et al (2008), "Rapid detection of blaKPC carbapenemase genes by real-time PCR", Journal of clinical

microbiology, 46(9), 2879.

31. Hossain, A., M J Ferraro, R M Pino, R B Dew III, E S Moland, T J Lockhart, K S Thomson, R V Goering, and N D Hanson (2004),

"Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 in an Enterobacter sp.", Antimicrob Agents

Chemother, 48, 4438^-440.

32. Jacoby George A., L.S.M.-P (2005), "Mechanisms of disease: The New beta-Lactamases", N Engl J Med, 352(4), 380-91.

33. Ke, W., et al (2007), "Crystal structure of KPC-2: insights into carbapenemase activity in class A -lactamases",

Biochemistry, 46(19), 5732-5740.

34. Kitchel, B., et al (2009), "Molecular epidemiology of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates in the United States: clonal expansion of

multilocus sequence type 258", Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(8), 3365.

35. Kwa, A.L., V.H Tam, and M.E Falagas (2008), "Polymyxins: a review of the current status including recent developments",

_ Ann Acad Med Singapore, 37, 870-83

36. Landman, D., S Bratu, and J Quale (2009), "Contribution of OmpK36 to carbapenem susceptibility in KPC-producing Klebsiella pneumoniae",

Journal of medical microbiology, 58(10), 1303.

37. Leavitt, A., et al (2007), "Emergence of KPC-2 and KPC-3 in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in an Israeli hospital",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 51(8), 3026.

38. Lomaestro, B.M., et al (2006), "The spread of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K pneumoniae to upstate New York",

Clinical infectious diseases, 43(3), e26.

39. Martinez-Martinez, L., et al (1999), "Roles of beta-lactamases and porins in activities of carbapenems and cephalosporins against Klebsiella

pneumoniae", Antimicrobial agents and chemotherapy, 43(7), 1669.

40. McGettigan, S.E., K Andreaecchio, and P.H Edelstein (2009), "Specificity of ertapenem susceptibility screening for the detection of Klebsiella

pneumoniae carbapenemases (KPC)", Journal of clinical microbiology, JCM 02143-08v1.

41. Miriagou, V., et al (2003), "Imipenem resistance in a Salmonella clinical strain due to plasmid-mediated class A carbapenemase KPC-2",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 47(4), 1297.

42. Monteiro, J., et al (2009), "First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil", Antimicrobial agents

and chemotherapy, 53(1), 333.

43. Munoz-Price, L.S., et al (2010), "Successful Eradication of a Monoclonal Strain of Klebsiella pneumoniae during a K pneumoniae

Carbapenemase-Producing K pneumoniae Outbreak in a Surgical Intensive Care Unit in Miami, Florida",

Infection Control and Hospital Epidemiology, 31(10), 1074-1077.

44. Naas, T., et al (2005), "Plasmid-Mediated Carbapenem-Hydrolyzing {beta}-Lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae Isolate from France",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(10), 4423.

45. Naas, T., et al (2008), "Genetic Structures at the Origin of Acquisition of the {beta}-Lactamase blaKPC Gene",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 52(4), 1257.

46. Navon-Venezia, S., I Chmelnitsky, A Leavitt,M J Schwaber, D Schwartz, and a.Y Carmeli (2006), "Plasmid-mediated imipenem-hydrolyzing

enzyme KPC-2 among multiple carbapenem-resistant Escherichia coli clones in Israel", Antimicrob Agents

Chemother, 50, 3098-3101.

47. Nordmann, P., G Cuzon, and T Naas (2009), "The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria",

The Lancet infectious diseases, 9(4), 228-236.

48. Palepou, M., et al (2005), "Novel class A carbapenemase, KPC-4, in an Enterobacter isolate from Scotland, abstr 1134_01_20 Prog Abstr 15th Eur",

Cong Clin Microbiol Infect Dis., Copenhagen, Denmark.

49. Pasteran, F., et al (2009), "Sensitive screening tests for suspected class A carbapenemase production in Enterobacteriaceae",

Journal of clinical microbiology, JCM 00130-09v1.

50. Pavez, M , E M Mamizuka, and N Lincopan (2009), "Early dissemination of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(6), 2702.

51. Peirano, G., et al (2009), "Carbapenem-hydrolysing -lactamase KPC-2 in Klebsiella pneumoniae isolated in Rio de Janeiro, Brazil", Journal

of antimicrobial chemotherapy, 63(2), 265.

52. Podschun, R and U Ullmann (1998), "Klebsiella spp as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors",

Clinical microbiology reviews, 11(4), 589.

53. Queenan, A.M and K Bush (2007), "Carbapenemases: the Versatile {beta}-Lactamases", Clinical microbiology reviews,

20(3), 440.

54. Rasheed, J.K., et al (2008), "Detection of the Klebsiella pneumoniae carbapenemase type 2 carbapenem-hydrolyzing enzyme in clinical isolates of

Citrobacter freundii and K oxytoca carrying a common plasmid", Journal of clinical microbiology, 46(6), 2066.

55. Robledo, I.E., et al (2010), "Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico", Antimicrobial agents and

chemotherapy, 54(3), 1354.

56. Samra, Z., et al (2007), "Outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae producing KPC-3 in a tertiary medical centre in Israel",

International journal of antimicrobial agents, 30(6), 525-529.

57. Samra, Z., et al (2008), "Evaluation of CHROMagar KPC for Rapid Detection of Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae", Journal of

clinical microbiology, JCM 00249-08v1.

58. Samuelsen, 0., et al (2009), "Emergence of clonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type 258 producing plasmid-mediated KPC

carbapenemase in Norway and Sweden", Journal of antimicrobial chemotherapy, 63(4), 654.

59. Schechner, V., et al (2009), "Evaluation of PCR-based testing for surveillance of KPC-producing carbapenem-resistant members of the

Enterobacteriaceae family", Journal of clinical microbiology, 47(10), 3261.

60. Schwaber, M.J., et al (2008), "Predictors of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae acquisition among hospitalized adults and effect of

acquisition on mortality", Antimicrobial agents and chemotherapy, 52(3), 1028.

61. Shen, P., et al (2009), "Novel Genetic Environment of the Carbapenem-Hydrolyzing {beta}-Lactamase KPC-2 among Enterobacteriaceae in China",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(10), 4333.

62. Smith Moland, E., et al (2003), "Plasmid-mediated, carbapenem-hydrolysing -lactamase, KPC-2, in Klebsiella pneumoniae isolates", Journal

of antimicrobial chemotherapy, 51(3), 711.

63. Steward, C.D., et al (2003), "Antimicrobial susceptibility testing of carbapenems: multicenter validity testing and accuracy levels of five antimicrobial

test methods for detecting resistance in Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa isolates", Journal of clinical

microbiology, 41(1), 351.

64. Tenover, F.C., et al (2006), "Carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae not detected by automated susceptibility testing", Emerg

Infect Dis, 12(8), 1209-13.

65. Villegas, M.V., K Lolans, A Correa, J N Kattan, J A Lopez, J P Quinn, and a.t.C.N.R.S Group (2007), "First identification of

Pseudomonas aeruginosa isolates producing a KPC-type carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase", Antimicrob

Agents Chemother, 51, 1553-1555.

66. Villegas, M.V., K Lolans, O M del Rosario, C J Suarez, A Correa, A M and a.J.P.Q Queenan (2006), "First detection of

metallo-beta-lactamaseVIM-2 in Pseudomonas aeruginosa isolates from Colombia", Antimicrob Agents

Chemother, 50, 226-229.

67. Wayne (2011), CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Performance

standards for antimicrobial susceptibility testing.Twenty-First informational

supplement, M100-S21, Vol 31, Clinical and Laboratory Standards Institute.

68. Wei, Z.Q., et al (2006), "Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumoniae isolate from China", Antimicrobial agents and

chemotherapy, AAC 01053-06v1.

69. Woodford, N., et al (2004), "Outbreak of Klebsiella pneumoniae producing a new carbapenem-hydrolyzing class A {beta}- lactamase, KPC-3, in a

New York Medical Center", Antimicrobial agents and chemotherapy, 48(12), 4793.

70. Woodford, N., et al (2008), "Arrival of Klebsiella pneumoniae producing KPC carbapenemase in the United Kingdom",

Journal of antimicrobial chemotherapy, 62(6), 1261.

71. Yigit, H., et al (2003), "Carbapenem-Resistant Strain of Klebsiella oxytoca Harboring Carbapenem-Hydrolyzing {beta}- Lactamase KPC-2",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 47(12), 3881.

72. Yigit, H., et al (2001), "Novel carbapenem-hydrolyzing {beta}-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae",

Antimicrobial agents and chemotherapy, 45(4), 1151.

73. Zhang, R., et al (2007), "Plasmid-mediated carbapenem-hydrolysing -lactamase KPC-2 in carbapenem-resistant Serratia marcescens isolates from

Hangzhou, China", Journal of antimicrobial chemotherapy, 59(3), 574.

74. zzhttp://en.wikipedia.org/wiki/File:Carbapenems_structure.svg.

75. zzhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Penicillin-core.png.

zzhttp://www.sciencephoto.com./media/11034/view.

2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Các chủng thí nghiệm

- Đối tượng nghiên cứu: 21 chủng vi khuẩn nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae kháng

carbapenem thu bệnh viện được từ một số bệnh viện tại Việt Nam

- Các chủng chuẩn dùng trong thử nghiệm Hodge cải biên: Escherichia coli ATCC ®

25922 (vi khuẩn nhạy carbapenem), K pneumoniae ATCC ® 1705 (carbapenemase

dương tính), K pneumoniae ATCC ® 1706 (carbapenemase âm tính).

- Máy PCR (MyCycler, Bio-rad, Mỹ)

- Máy đọc gel (GelDoz XR, Bio-Rad, Mỹ)

- Máy phân tích nồng độ DNA tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Aligent

Technologies, Mỹ)

- Máy giải trình tự tự động ABI 3130XL genetic Analyzer (Applied Biosystem,

Mỹ)

- Máy sấy khô (Nam Khoa, Việt Nam)

- Micropipet, đầu tuyp, eppendorf, que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy vô

trùng, tăm bông vô trùng, khay nhựa 12 giếng

- Đĩa thạch MC, MHA (Nam Khoa, Việt Nam)

- Đĩa kháng sinh imipenem (10 (Tg), meropenem (10 (Tg), ceftazidime (30

(Tg), cefotaxime (30 (Tg), cefepime (10 (Tg), amoxillin/clavulanate (30/20

(Tg), Ceftazidime/clavulanate (30/10 (Tg) (Nam Khoa, Việt Nam)

- Bộ hóa chất NKMIC.MDA giúp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC bao

gồm: kháng sinh đông khô meropenem, ertapenem, doripenem (Nam Khoa,

Việt Nam), môi trường lỏng Muller Hinton (Nam Khoa, Việt Nam)

- Bộ hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Biorad, Mỹ) bao gồm PCR buffer,

MgCl2, dNTPs, Tag DNA polymerase, nước cất

- Bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits (QUIAGEN, Mỹ) dùng cho tinh

sạch DNA

- Hóa chất dùng cho điện di gồm: Agarose (Bio-Rad, Mỹ), TBE 10X (Bio-Rad,

Mỹ), loading buffer (Bio-Rad, Mỹ), ethidium bromide (Bio-Rad, Mỹ), thang

chuẩn DNA từ 100 bp đến 900 bp (Bio-Rad, Mỹ)

- Bộ hóa chất dùng cho điện di DNA chip bao gồm: Gel-dye, marker, ladder

(Aligent Technologies, Mỹ)

- Bộ hóa chất dùng cho quá trình giải trình tự (BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit, ABI, Mỹ) bao gồm Big Dye, Big Dye buffer, nuclease free

water, sodium acetate 3 M, ethanol 100%, ethanol 70%

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp nhuộm Gram

Muc đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước

định danh tiếp theo

Nguyên tắc: khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu Crystal Violet và một chất gắn

màu Iodine như Lugol nếu ta tẩy màu bằng ethanol 95%, vi khuẩn Gram dương có lớp

peptidolycan dày ăn màu tím của Crystal Violet, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tẩy

mất màu tím Khi nhuộm lại với safranin 0,5%, nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím

còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu đỏ

Tiến hành

- Phết nhuộm được cố định trên lame

- Phủ Crystal Violet lên phết nhuộm trong 1 phút Rửa nước và nghiêng kính để

cho ráo

- Phủ Lugol lên phết nhuộm trong 1 phút Rửa nước và nghiêng kính cho ráo

- Phủ ethanol 95% lên phết nhuộm, để 30 giây Rửa bằng nước và nghiêng kính

cho ráo

- Nhuộm lại với dung dịch Safranin trong 30 giây Rửa nước và thấm khô vết

nhuộm

- Quan sát ở vật kính dầu

Đoc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ màu tím của Crystal Violet, vi khuẩn

Gram âm giữ màu đỏ của Safranin

2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa

Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên môi trường MacConkey

agar (MC) Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh IDS

14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam) dùng cho định danh các trực khuẩn Gram âm dễ

mọc

2.2.2.1 Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn

Gram âm

• Thử nghiệm khả năng lên men

Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản

phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2, Trong tất cả các

trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi

màu của chỉ thị pH trong môi trường

• Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat

thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với

sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất

có màu hồng.

• Thử nghiệm ONPG

Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất

cả 2 loại men lactose permease và P-galactosidase Một số vi khuẩn được xem là

nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được P-galactosidase Hoạt tính của

enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là

o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG) Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi P-galactosidase

sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng

• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường

Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có

khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất Sự phân giải của muối

ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi

trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong

môi trường

• Thử nghiệm Urease

Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành

CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường

thử nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ

• Phenylalanine deaminase (PAD)

Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia

có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành

một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho

ra màu xanh lá cây

• Thử nghiệm bile esculine

Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên

kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của

muối mật Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo

thành hợp chất màu đen hay nâu đen

• Thử nghiệm khả năng sinh indol

Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy

vi sinh vật trong môi trường canh trypton Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành

Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác

cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ

• Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer)

Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính

trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Chất này bị oxid hóa trong

môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho

một phức chất màu hồng đỏ

• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là

nguồn carbon duy nhất trong môi trường Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sử

dụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng Nếu không sử dụng được

malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt khuẩn Các vi sinh vật có khả năng

biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy

nhất Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3

làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH

• Thử nghiệm KIA

Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate,

khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1%

và glucose 0.1% Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy

ra:

+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng

trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid Điều này có thể giải thích do vi

sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng

tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi

trường có pH kiềm Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose

được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường Nếu trong