Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (lates calcarifer) nuôi lồng biển tại nha trang – khánh hòa

-Đề tài “Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm Lates calcarifer nuôi lồng biển tại Nha Trang - Khánh Hòa” được thực hiện với mục tiêu “xác định được tác nhân gây bệnh lở loét v

VIÊN ĐẠI PHÚC

TÌM HIỂU TÁC NHÂN GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN

CÁ CHẼM (Lates calcarifer) NUÔI LỒNG BIỂN

TẠI NHA TRANG - KHÁNH HÒA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Ts LÊ THỊ THÚY ÁI Ths NGUYỄN THỊ THANH THÙY

Thành phố Hồ Chí Minh — Năm 2011

Để hoàn thành luận văn này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắcnhất tới:

Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, KhoaSinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Vi sinh vật đã tạo mọi điều kiện tốtnhất để tôi hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp của mình

Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh học đã tận tình giảng dạy, trang bị cho tôi nhữngkiến thức quý báu trong những năm học vừa qua

Cô Lê Thị Thúy Ái và Chị Nguyễn Thị Thanh Thùy là những giáo viên hướngdẫn đã luôn ân cần chỉ dạy và tận tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, Giám đốc Trung tâmQuốc gia Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vựcmiền Trung đã tạo điều kiện và thời gian để tôi có thể tham gia và hoàn thành khóahọc

Các anh chị và các bạn đồng nghiệp ở Trung tâm Quốc gia Quan trắc cảnh báomôi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung, Dự án NUFU, Tổphân tích và kiểm nghiệm thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3 đã tận tìnhgiúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Gia đình, người thân, bạn bè đã luôn dõi theo, động viên và giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình học tập

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Viên Đại Phúc

MỞ ĐẦU

Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) hay còn gọi là cá vược, là một loài cá

có giá trị kinh tế quan trọng ở vùng Nhiệt đới và Cận nhiệt đới thuộc châu Á - TháiBình Dương Với đặc tính dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, sau một năm thảnuôi từ cá giống cỡ 4 - 5cm, cá có thể đạt trọng lượng từ 1,5 - 3kg Hơn nữa, thịt cáchẽm thơm ngon, giá thành khá cao nên loài này đã được nuôi phổ biến ở nhiều nướctrên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Philippin, Indonesia, Australia

Ở nước ta, sau khi trường Đại học Nha Trang sản xuất nhân tạo thành cônggiống cá chẽm (năm 2006) và chuyển giao công nghệ sản xuất giống cho các tỉnh thìnghề nuôi cá chẽm đã phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh ven biển, đến nay cá chẽm trởthành đối tượng nuôi xóa đói giảm nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang bịsuy thoái

Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân và chết (tỷ lệ mắc bệnh khoảng 30 - 40% cá thểtrong đàn), bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôilớn (2 - 3kg) Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định và cáchphòng trị bệnh vẫn chưa có giải pháp hiệu quả Xuất phát từ tình hình đó, việc tìm ratác nhân gây bệnh để đưa ra cơ sở cho việc phòng và trị bệnh lở loét trên cá chẽm làvấn đề khá cần thiết và cấp bách hiện nay

-Đề tài “Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer)

nuôi lồng biển tại Nha Trang - Khánh Hòa” được thực hiện với mục tiêu “xác định

được tác nhân gây bệnh lở loét và đề xuất được biện pháp phòng trị bệnh cá hiệu quả”.Các nội dung nghiên cứu gồm:

- Phân tích tác nhân vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm trên cá chẽm (Lates

calcarifer) biểu hiện lở loét.

- Phân tích sự biến đổi mô học tại vết loét, gan và thận của cá bệnh

- Thử nghiệm cảm nhiễm tác nhân gây bệnh có tần số bắt gặp cao để làm cơ sở xác định đúng tác nhân gây bệnh lở loét

- Đề xuất biện pháp phòng trị bệnh lở loét ở cá chẽm.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu nghiên cứu

dịch bệnh trên cá chẽm nuôi ở nước ta

Ý nghĩa thực tiễn : Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở để phòng

và trị bệnh trên cá chẽm, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm ở nước ta

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Tên gọi và hệ thống phân loại[1]

Tên khoa học: Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Tên tiếng Anh: Sea bass, barramundi

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược

Loài: Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)

1.1.2 Hình thái, đặc điêm nhận dạng và cỡ

Cá chẽm có thân dài, cuống đuôi khuyết sâu, đầu nhọn, nhìn bên lõm phía lưng(hình dạng lưng lõm) và lồi ở phía trước vây lưng Miệng rộng, hơi so le, hàm trên kéodài tới tận mắt, răng dạng lông nhung, không có răng nanh Vây lưng có 7 - 9 gai và 10-

11 tia mềm Vây hậu môn tròn, có 3 gai, 7 - 8 tia mềm, vây đuôi tròn, vảy dạng lượcrộng (xù xì hay nhẵn)[22] Chiều dài tối đa 200cm, nặng tối đa 60kg[1]

Màu sắc: Giai đoạn cá giống có màu nâu ô-liu ở phía trên và màu bạc hoặc nâuvàng ở phần bên và phần bụng, giai đoạn trưởng thành cá có màu xanh lục hay vàngnhạt ở phần trên và màu trắng bạc ở phần bụng[22]

1.1.4 Đặc điểm môi trường sống

Cá chẽm sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện môi trường nhiệt độ: 15

-280C, độ mặn: 2 - 35 0oo, độ sâu: 5 - 20m Chúng thường sống tập trung ở vùng nướcven bờ, cửa sông, rừng ngập mặn và phân bố cho tới độ sâu 40m[1]

1.2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới

Do giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài

phân bố rộng, dễ nuôi đã làm cho cá chẽm trở thành một trong những đối tượng đượclựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi trồng thủy sản Kỹ thuật nuôi cáchẽm được phát triển lần đầu tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từnhững năm đầu của thập niên 1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khuvực như Trung Quốc, Ân Độ, Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan,Việt Nam và Australia, và gần đây ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh vàIsrael[38].

Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần lớn cá chẽm đượcnuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển[39] Năm 2004, sản lượng cáchẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn[50] và năm 2006 tăng lên27.522 tấn[51]

-Biểu đồ 1.1 Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia (cột) và giá trị (đường) ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006 (Nguồn

Mike Rimmer (2008))[50]

Thái Lan: Là nước dẫn đầu về sản lượng nuôi cá chẽm trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương Năm 2004, giá trị sản lượng cá chẽm của Thái Lan là 65,08 triệuUSD, năm 2005 là 68,52 triệu USD với giá bán khá ổn định, trung bình mỗi kg cáthương phẩm dao động trong khoảng 2,50 - 2,60 USD[51] Theo FAO (2006) (trích dẫnbởi Halwart, 2007), sản lượng cá chẽm nước mặn và lợ của Thái Lan tăng hằng năm, từ

-3.884 tấn (năm 1995) và tăng lên 14.550 tấn (năm 2004)[39].

Malaysia: Cá chẽm là loài được nuôi truyền thống, đến năm 2007 vẫn là loàinuôi dẫn đầu trong nghề nuôi cá lồng ở Malaysia Theo thống kê của FAO (2006) (tríchdẫn bởi Halwart, 2007), sản lượng cá chẽm của Malaysia là 4.003,73 tấn (năm 2002),4.210,93 tấn (năm 2003), và 4.000,54 tấn (năm 2004)[39]

Indonesia: Là quốc gia có sản lượng cá có vảy (ííníísh) biển lớn nhất trong khuvực Đông Nam Á Trong đó cá chẽm cũng là một trong những loài nuôi chính của nướcnày với sản lượng năm 2004 vào khoảng 2.900 tấn[39]

Singapore: Dự tính đến năm 2012 sản lượng cá chẽm là 3.000 tấn và đến năm

2020 sản lượng sẽ tăng lên 20.000 tấn[74]

Hàn Quốc: Tổng sản lượng cá nuôi của Hàn Quốc năm 2003 khoảng 72.393 tấn,trong đó cá chẽm khoảng 2.778 tấn[39]

Australia: Cá chẽm được nuôi ở hầu hết các bang của Australia (ngoại trừ bangTasmania)[39],[73], nhưng sản lượng cá chẽm tập trung chủ yếu ở Queensland (phần lớn lànuôi nước ngọt), Northern Territory (nuôi lồng biển và nuôi ao nước lợ) và NamAustralia (nuôi nước ngọt)[35] Cá chẽm được nuôi công nghiệp bắt đầu từ những năm

1980, hiện nay có khoảng 100 trang trại được cấp phép nuôi[73] Theo dữ liệu của FAOnăm 2004 (trích dẫn bởi Halwart M., 2007), sản lượng cá chẽm khoảng 1.600 tấn, giátrị đạt 9,9 triệu USD Theo báo cáo của O’Sullivan và ctv (2005) (trích dẫn bởi HalwartM., 2007), niên vụ 2003/2004 sản lượng cá chẽm khoảng 2.800 tấn, đạt giá trị 17,6triệu USD[39] Niên vụ 2008/2009 sản lượng cá chẽm cả nước ước khoảng 6.000 tấn và

sẽ tăng lên 7.000 tấn trong niên vụ 2009/2010[73]

Biểu đồ 1.2 Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở Australia từ năm 1986 đến năm 2004 (nguồn FAO, 2006 được trích dẫn bởi Halwart

M, 2007)[39]

1.2.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam

Ở nước ta, cá biển được nuôi chủ yếu ở 3 vùng là vùng biển phía Bắc, vùngNam Trung Bộ và vùng phía Nam Năm 2001, sản lượng cá nuôi biển cả nước khoảng2.600 tấn, năm 2002 sản lượng tăng lên 5.000 tấn, ước tính năm 2010 sẽ đạt 20.000 tấn

Các loài nuôi chính là các loài cá mú (Epinephelus), cá giò (Rachycentron canadum),

cá chẽm (Lates calcarifer), cá vược mõm nhọn (Psammoperca waigensis), cá hồng đỏ

(Lutjanus erythropterus), cá tráp đen (Rhabdosargus sarba) và cá đù đỏ (Sciaenops

ocellatus) [39 \ Cá chẽm được xem như là vật nuôi xóa đói giảm nghèo và là đối tượng

nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ởnước ta Hiện nay chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi

cá chẽm ở nước ta, nhưng qua tìm hiểu thông tin từ các báo cho thấy cá chẽm đã nuôithành công ở một số nơi như ở Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa)[77],[78],[79], Hương Trà(Thừa Thiên Huế)[80], Hà Tĩnh[81], Đồng Nai, Bình Định[82], Cà Mau[76]

Cá biển được nuôi lồng thành công đầu tiên ở Nhật Bản từ những năm 1950 và ở Đông

Nam Á từ những năm 1970 Hiện nay đã có rất nhiều loài cá đã đượcnuôi thành công Tuy nhiên, các loại bệnh và sự nghiêm trọng của bệnh đã ảnh hưởngđến các loài cá nuôi Cá nuôi lồng sẽ trở nên dễ mắc bệnh khi mà các thông số môi

trường như nhiệt độ, độ mặn, nồng độ oxy hòa tan và các chất lơ lửng thay đổi nhiềuhoặc đột ngột Chỉ cần một điều kiện thích hợp cho bệnh cũng có thể tạo điều kiện chobệnh phát triển, quá trình dẫn tới bệnh ở môi trường nước xảy ra rất nhanh Việc xácđịnh sớm sự thay đổi hoạt động và dấu hiệu của bệnh ở cá nuôi là rất quan trọng đểchẩn đoán bệnh[69].

1.3.1 Bệnh do vi khuẩn

Bệnh vibriosis: Vibriosis là bệnh gây nên bởi các vi khuẩn thuộc giống Vibrio,

gây bệnh trên rất nhiều loài cá biển và cửa sông, chúng thường xuất hiện khi môitrường nước xấu, cá bị sốc và thiếu dinh dưỡng[38] Khi nhiễm Vibrio, thường màu cơ

thể cá trở nên tối, lờ đờ, chán ăn, có các vết loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng[36], bơibất thường, mắt đục, bụng có màu đỏ Bên trong, có thể thấy các vùng hoại tử và xuấthuyết ở thận, gan và lách[38]

Nghiên cứu của Renaul T và ctv (1994) cho thấy Vibrio damsela là nguyên

nhân gây chết hàng loạt ở cá chẽm con nuôi ở Tahiti (nằm ở khu vực Thái Bình Dương,thuộc Pháp), dấu hiệu chính của bệnh là cá lờ đờ, xuất huyết ở gốc đuôi và lở loét lanrộng ra[60]

Bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu xuất huyết: Gây ra bởi Aeromonas hydrophila,

Aeromonas sorbia, Aeromonas caviae, Aeromonas spp., pseudomonas sp Các vi khuẩn

này thường nhiễm ở cá chẽm nuôi nước ngọt, làm cho cá bị xuất huyết đỏ ở da, lờ đờ,

cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt Bệnh thường xuất hiện khi môi trườngxấu, da bị tổn thương[36] Theo Kumaran S (2009), Pseudomonas sp KUMS3 là tác

nhân gây nên bệnh mòn vây ở cá chẽm nuôi ở Ân Độ, làm cá xuất huyết ở gốc vây,miệng và mất sắc tố da[43]

Bệnh vi khuẩn ở da: Do Aeromonas sorbia, Aeromonas hydorphila, Vibrio

harveyi, Vibrio alginolyticus gây nên, làm cá bị lở loét không đều, mất vảy Bệnh

thường xảy ra khi môi trường xấu, da bị tổn thương[36]

Bệnh streptococcusis: Streptococcusis là bệnh rất nghiêm trọng, tác nhân chính

là Streptococcus iniae Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn

và kết quả là làm cho cá chết với tỷ lệ cao Bệnh này được ghi nhận là tác nhân gây

bệnh trên cá chẽm nuôi lồng biển ở Northern Territory (Australia) năm 2005 Trongtrường hợp cấp tính, cá có thể gần chết hoặc chết với một vài dấu hiệu bên ngoài vàtrong các nội tạng Trong trường hợp ít trầm trọng hơn thì cá bị nhiễm bệnh có thể bơinhấp nhô gần mặt nước, có thể bị mù và không đáp ứng với sự kích thích bên ngoài,xuất huyết có thể thấy ở da và đặc biệt ở chân vây Cầu mắt bị lồi và xuất huyết bêntrong mắt, mang bị xung huyết Bên trong, sự xuất huyết nhiều có thể thấy ở bề mặt củacác nội quan lớn, thường thì cơ xương có màu đỏ hồng[38] Các báo cáo của Alicia E và

ctv (2005), Bromage E.S và ctv (1999) cũng cho thấy Streptococcus iniae là tác nhân

chính gây bệnh trên cá chẽm ở Australia với liều gây chết LD50 là 2,5 x 105 CFU/gtrong 2 ngày và 3,2 x 104 CFU/g trong 10

ngày[25],[32]

Bệnh columnaris: Nguyên nhân gây bệnh là Flavobacterium columnare;

Flavobacterium johnsoniae và Flavobacterium sp ở cá chẽm nước ngọt và Tenacibaculum marinimum ở cá chẽm nước mặn, khi nhiễm bệnh, cá xuất hiện các đám

nhợt nhạt trên bề mặt lưng, phần sau vây lưng và cuống đuôi, cá lờ đờ Phần lớn bệnhxảy ra khi cá mới đẻ, trong giai đoạn muộn của cá ấu niên có sự ăn mòn da xung quanhmiệng Bệnh thường xảy ra do bị sốc môi trường, vệ sinh kém, da bị tổn thương[36]

Bệnh vi khuẩn mang: Các vi khuẩn khác nhau gây ra như Flavobacterium spp.,

Cytophaga spp Khi bị bệnh, cá thường bơi nổi trên bề mặt, mang hoạt động đóng mở

nhanh và có nhiều dịch nhầy, có các mảng trắng trên mang Kiểm tra mang đang còntươi ở dưới kính hiển vi cho thấy một số lượng lớn vi khuẩn có hình que dài ở biểu môcủa mang Bệnh phần lớn xảy ra ở giai đoạn cá nhỏ[36],[38]

Bệnh vi khuẩn viêm màng bụng: Các vi khuẩn gây bệnh là các vi khuẩn Gram

(-) và Gram (+) khác nhau trong đó có Vibrio harveyi, Aeromonas hydrophila Các dấu

hiệu bệnh chính là cơ thể cá có màu đen, cá lờ đờ, bụng sưng phồng, có dịch keo vàmùi khó chịu ở bụng, bệnh hay gặp trên cá nuôi ở hệ thống tuần hoàn[36]

Bệnh hoại tử viêm ruột và mưng mủ: Hội chứng hoại tử viêm ruột mưng mủ,thường gọi là “sưng”, xuất hiện một cách định kỳ ở các trại nuôi cá chẽm Hội chứngnày ảnh hưởng đến cá cỡ nhỏ tới các cá thể thành thục, gặp cả ở cá chẽm nuôi nước

ngọt và nước mặn Người ta đã phân lập được Vibrio harveyi và Photobacterium

damselae subspecies damselae trên cá bị bệnh này Cá bị bệnh thường bụng phình, hôn

mê và chết Điểm đặc trưng của bệnh là mùi của cá sắp chết hoặc mới chết giống vớimùi cá đã chết 1 ngày, khoang bụng bị sưng phồng bởi một lượng lớn dịch phân hủy.Trường hợp bệnh ở giai đoạn sớm có sự xuất hiện của tơ huyết bện lại với nhau, nối các

cơ quan nội tạng và mô Ở trường hợp muộn hơn, ở các nội quan bên trong bị hoại tử

và hóa lỏng[38]

Bệnh epitheliocystis: Là bệnh gây ra bởi sự xâm nhiễm vào mang của

Chlamydial, cá ấu niên bị nhiễm nặng ở mang có thể chết với tỷ lệ cao Cá bị nhiễm

bệnh có thể không thấy dấu hiệu rõ ràng, mang có thể trở nên đỏ và cá bơi gần với mặtnước, tỷ lệ chết có thể cao Ở dưới kính hiển vi có thể thấy một số lượng lớn các nangnằm trong biểu mô[38]

1.3.2 Bệnh do ký sinh trùng

Theo báo cáo của FAO và Glenn Schipp (2007), trên cá chẽm có các bệnh kýsinh trùng sau[36],[38]:

Bệnh cryptocaryonosis: Nguyên nhân gây bệnh là Cryptocaryon irritans Đây là

động vật đơn bào, có lông, sống ký sinh và không có vật chủ chuyên biệt Là nguyênnhân gây ra rất nhiều bệnh trên cá nuôi biển, đặc biệt ở vùng Nhiệt đới[38] Cá bị nhiễmbệnh thường cọ vào đáy hoặc thành của lồng nuôi, cá biếng ăn và trở nên lờ đờ Nếusau đó không chữa trị kịp thời thì mắt cá trở nên đục và có các đốm trắng cũng nhưnhững chỗ lở loét nhỏ có thể xuất hiện trên vảy Sự tiến triển của bệnh sẽ nhanh, cá cóthể chết trong vòng 2 đến 3 ngày[38]

Bệnh trypanosomosis: Là bệnh gây ra bởi Trypanosoma sp Dấu hiệu bệnh là

cá bị hôn mê, mất tập trung, mù mắt và chết Mắt cũng có thể bị lồi và bị xuất huyếtbên trong, đồng thời xuất hiện vùng lở loét xuất huyết và vùng ăn mòn trên da Bêntrong, thận căng to và tình trạng thiếu máu xảy ra, kết quả làm cho cá chết với tỷ lệ cao

Khi kiểm tra bằng kính hiển vi thấy rất nhiều Trypanosoma sp trong máu và mô[38]

Bệnh oodiniosis: Gây ra bởi Oodinium sp., ký sinh trùng này nhiễm vào mang

và da ở cá nước mặn làm cho cá chết ở mức thấp Khi bị nhiễm Oodinium sp., cá hay cọ

vào thành hoặc đáy lồng nuôi Nếu bị nhiễm nhiều, cá chết với sự sung huyết và dịchnhầy ở mang[36].

Bệnh trichodiniasis: Do nhóm Trichodina spp gây nên Cá bị bệnh này có các

dấu hiệu bệnh như cá bơi ở bề mặt, nắp mang đóng mở nhanh, dịch nhầy ở mang tiết ranhiều Bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ môi trường nước thấp, chất hữu cơ lơ lửngnhiều và nuôi cá với mật độ dày[36]

Bệnh chilodonelliasis: Gây ra bởi Chilodonella spp và Chilodonella

hexasticha Khi nhiễm ký sinh trùng này, cá thường bơi trên bề mặt, nắp mang đóng mở

nhanh và mở rộng Môi trường nước xấu và cá bị ốm yếu là điều kiện thuận lợi để kýsinh trùng này xâm nhập và gây bệnh[36]

Bệnh Ichthyobodosis (costiasis): Ichthyobodo necator là nguyên nhân chính gây

bệnh Cá bị bệnh thường cọ lên thành lồng, xuất hiện các vết sẫm màu trên da, tróc vảy,bơi trên bề mặt, nắp mang mở to và hoạt động đóng mở nhanh[36]

Bệnh piscinoodiniasis: Nguyên nhân gây bệnh là Piscinoodiniasis sp., bệnh

thường gặp ở cá chẽm nuôi nước ngọt Bệnh xảy ra ở cá nhỏ thì có các vết mờ hoặcmàu xanh bạc trên da, ở cá lớn hơn thì có các mảng nổi lên trên bề mặt da và có các vết

lở loét, nắp mang hoạt động mạnh, mang tiết nhiều dịch và có màu xanh đen[36]

Bệnh Amyloodiniasis: Nguyên nhân chính là do Amyloodinium ocellatum.

Thường gặp ở cá chẽm nuôi biển, xuất hiện các vết mờ hoặc mất màu trên da ở cá nhỏ

Cá lớn hơn thường có các vết lở loét, nắp mang đóng mở nhanh, dịch tiết từ mangnhiều, mang có màu xanh đen Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ thấp và nhiệt độgiảm đột ngột[36]

Bệnh mụn đỏ: Gây ra bởi Epistylis sp Bệnh này xảy ra ở cá chẽm nước ngọt,

gây nên lở loét trên da và làm cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá gây bệnh[36]

Bệnh sán lá mang: Tác nhân chính gây bệnh là Diplectanum sp., Dactylogyrus

sp Cá bị bệnh thường đóng mở nắp mang nhanh, biếng ăn, có các vùng trắng trênmang[36]

Bệnh sán lá da: Gây ra bởi Neobenedinia melleni, Gyrodactylus spp Dấu hiệu

chính của bệnh là mắt mờ, xuất hiện các mảng trắng trên da, lở loét trên da Bệnhthường xảy ra ở điều kiện độ mặn cao và nhiệt độ nước thấp[36].

Bệnh myxosporidiosis: Nguyên nhân gây bệnh là Henneguya sp., Kudoa sp.,

bệnh này không thường xuyên xảy ra Kiểm tra mô học thấy có bào tử của chúng ở tơ

mang (Henneguya sp.) và trong não (Kudoa sp.)[36]

Bệnh microspridiosis: Nguyên nhân là do Peistophora sp Khi nhiễm bệnh,

thường có các khối u nổi lên trên da, có các u mềm màu trắng ở cơ[36]

Theo báo cáo của Ruckert S và ctv (2008), khi nghiên cứu ký sinh trùng ký sinhtrên cá chẽm nuôi tại vịnh Lampung, Indonesia đã ghi nhận được 19 loài ký sinh trùngtrên cá chẽm nuôi lồng và tất cả cá đều nhiễm từ 2 đến 10 loài ký sinh trùng Trong đó,nhóm protozoan (1 loài), myxozoans (1 loài), digeneans (3 loài), monogenean (5 loài),cestodes (3 loài), nematodes (5 loài) và acanthocephalans (1 loài)[62] Theo Rajkumar

M và ctv (2005), khi nuôi cá chẽm trong phòng thí nghiệm được 14 ngày, nhóm nghiên

cứu đã phát hiện thấy Cymothoa indica xuất hiện ở vùng mang và trước lưng, tạo thành

các vết tổn thương có màu đỏ, xuất huyết mà không có hiện tượng tiết nhớt nhiều Tỷ lệ

cá chết sau 3 tuần nuôi là 16,54% Ký sinh trùng này đã được truyền vào theo conđường thức ăn của cá và gây bệnh[59] Báo cáo của Saugata Basu và Durga P Haldar(2003) cho thấy, cá chẽm nuôi ở vùng Đông Bengal, Ân Độ phát hiện thấy có nhiễm

loài ký sinh trùng Myxobolus calcariferum sp n ở mang cá, gây bệnh và làm chết cá[63].1.3.3 Bệnh do nấm

Bệnh chấm đỏ: Bệnh chấm đỏ hay hội chứng lở loét (EUS) đã được báo cáo trênrất nhiều loài cá, trong đó có cá chẽm Tuy nhiên bệnh chỉ xảy ra ở cá nuôi nước ngọt,

chưa thấy có báo cáo trên cá nuôi biển Nguyên nhân gây bệnh là nấm Aphanomyces

invadens Dấu hiệu của bệnh là có các vết lở loét sâu màu đỏ hoặc xuất huyết trên da,

hiện tượng lở loét có thể lan đến mắt Khi bị bệnh, cá trở nên hôn mê và dễ trở thànhcon mồi cho những loài khác[38]

Bệnh nấm da: Do nấm Saprolegnia spp., Achlya spp gây ra Bệnh thường làm

cho cá nổi cục và phát triển thành dạng như múi bông trên da và vây Bệnh thường xảy

ra khi nhiệt độ thấp và cá bị tổn thương ở da[36].

Bệnh branchiomycosis: Do nấm Branchiomyces sp và Achlya spp gây ra Biểu

hiện của bệnh là cá bơi nổi trên mặt nước, nắp mang đóng mở liên tục, có các vết đỏ vàtrắng (xuất hiện lốm đốm) ở mang Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ nước thấp, chấthữu cơ tập trung trong nước nuôi nhiều[36]

1.3.4 Bệnh do virus

Bệnh virus ở cá biển nuôi lồng đã được báo cáo ở Đông Á từ những năm 1980

và các nước Đông Nam Á từ những năm 1990[69] Ở cá chẽm, đã phát hiện được 2 virusgây bệnh chính là:

Bệnh virus gây hoại tử thần kinh VNN (Viral Nervous Necrosis):

Tác nhân gây bệnh là nhóm Nodavirus cá Bệnh VNN trên cá chẽm lần đầu tiên

được báo cáo từ những năm 1980 ở Australia khi gây bệnh trên cá chẽm ấu niên Ngàynay, VNN là nguyên nhân gây chết ở cá hương và cá ấu niên ở các trại giống cáchẽm[38] Đặc điểm của bệnh là virus làm thoái hóa các nơron thần kinh và sinh khôngbào trong hệ thần kinh trung ương và võng mạc Vì vậy, khi bị nhiễm virus, cá ở trạngthái mất cân bằng, cơ không kiểm soát được và loạn chức năng thị giác[36] Hiện nay,bệnh này đã được báo cáo ở hơn 30 loài cá biển trên thế giới Bệnh thường xảy ra ở giaiđoạn cá hương từ 15 đến 24 ngày tuổi, còn có thể xuất hiện cho tới khi cá được 7 tuầntuổi[38] Khi mắc bệnh, cá bị nhạt hoặc sẫm màu, bơi xoắn ốc, choáng, có sự phồng vàcác không bào lớn ở não và dây sống[36]

Theo báo cáo của Azad IS và ctv (2005), ở Ản Độ, VNN gây bệnh ở các trạigiống cá chẽm ở giai đoạn cá hương làm cá chết từ 60 - 90% Khi bị bệnh, cá hương cómàu đen, khi kiểm tra không thấy có dấu hiệu bị nhiễm vi khuẩn hay ký sinh trùng Dựavào các lát cắt mô ở não và tủy sống người ta đã thấy rất rõ các vùng bị hoại tử, qua

kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR, người ta đã phát hiện được Nodavirus [2S \ Một nghiên

cứu khác ở Chennai và Nagapattinam thuộc Tamilnadu, Ản Độ cũng cho thấy, VNN lànguyên nhân gây chết hàng loạt cá hương ở các trại giống với các dấu hiệu như cábiếng ăn, da có màu tái nhợt, mất trạng thái cân bằng, bơi xoắn hay bơi vòng trước khi

Bệnh lymphocytis: Do Iridovirus gây nên Bệnh làm cho cá xuất hiện các mụn

cóc trên da, vây, thông thường chỉ gây chết nếu xâm nhiễm nhiều và kết hợp với điềukiện môi trường xấu[36], giai đoạn cá ấu niên thường dễ mắc bệnh hơn cá trưởngthành[69]

1.4 Các nghiên cứu về bệnh cá biển ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào cụ thể về bệnh lở loét trên cáchẽm Tuy nhiên, trên cá biển nói chung thì cũng đã có khá nhiều các công trình nghiêncứu như:

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2008), cá biển nuôi tại Khánh Hòa có 10 bệnh thườnggặp trên cá biển nuôi là[5]:

+ Bệnh vibriosis: Gây bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú, cá hồng, cá chẽm thờigian xuất hiện bệnh chính là mùa khô

+ Bệnh mòn vây và đuôi: Nguyên nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn Gram (-), có

đặc điểm gần giống với Flexibacter maritimus, bệnh xuất hiện quanh năm và gây chết

rải rác tới hàng loạt cá nuôi lồng, đặc biệt là giai đoạn cá con Các loài cá hay gặp là cá

mú, cá hồng, cá chẽm

+ Bệnh sán lá da (bệnh mè cá): Nguyên nhân gây bệnh thường là sán lá đơn chủ(monogenea) dạng hạt mè trên bề mặt cơ thể Bệnh làm cho cá có thể đục mắt, ngứangáy, giai đoạn cuối nổi lờ đờ trên mặt nước, nếu bị nhiễm nặng, cá có thể bị chết.Bệnh thường xuất hiện vào thời gian giao mùa giữa mùa mưa và mùa khô, các loài cáthường bị bệnh là cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò

+ Bệnh sán lá mang (bệnh sưng mang, hay bệnh mủ mang): Làm cá hoạt độngyếu, bỏ ăn, khi bơi nắp mang thường phồng lên, mang tiết nhiều dịch nhầy (mủ mang).Trường hợp bị bệnh nặng có thể gây chết cá từ rải rác đến hàng loạt Nguyên nhân gây

bệnh là các loài sán lá đơn chủ ký sinh khác nhau như loài Pseudorhabdosynochus spp.,

Diplectanum spp và Haliotrema spp Các loài cá thường gặp là cá mú, cá hồng, cá

chẽm

+ Bệnh rận cá: Làm cá kém ăn, chậm lớn, khi cảm nhiễm với mức độ cao gâychết cá rải rác Nguyên nhân gây bệnh là một số loài giáp xác bậc thấp thuộc giống

Caligus spp., Parapetalus sp và Lepeophtheirus sp Cá nuôi hay gặp là cá mú, cá giò,

cá chẽm

+ Bệnh hoại tử thần kinh (bệnh bơi xoắn): Khi nhiễm bệnh này, cá thường cócác dấu hiệu như: màu sắc cá đen sậm, bơi lội không định hướng, bơi xoắn ốc, đuôicong và liệt cứng, bụng chướng to do bong bóng cá căng phồng, ruột không có thức ănnhưng thấy có chứa chất dịch màu xanh lá cây Nguyên nhân gây bệnh là virus gây hoại

tử thần kinh VNN Các loài cá hay nhiễm bệnh là cá mú, cá chẽm, cá giò

+ Bệnh đỉa cá: Làm cá gầy yếu, suy kiệt sức khỏe, chết rải rác do mất máu hoặc

do nhiễm khuẩn cơ hội Nguyên nhân gây bệnh là ký sinh trùng thuộc họ đỉa Hirunidae.

Các loài cá thường bị bệnh là cá mú, cá chẽm và cá hồng

+ Bệnh đốm trắng ở thận: Thường gặp ở cá giò nuôi lồng ở Vạn Ninh, KhánhHòa Với các biểu hiện bệnh như cá kém ăn, chậm lớn Ở thận, gan, tụy xuất hiện cácđốm trắng dạng hạt Trên cá bị bệnh này, người ta đã phân lập được vi khuẩn

Photobacterium damselae.

+ Bệnh lymphocystic (bệnh u sần): Cá bị bệnh này thường xuất hiện các u nhỏ

có màu trắng hay hồng trên vây, lưng, đầu Bệnh này chỉ gây chết rải rác nhưng ảnhhưởng tới sinh trưởng và giá trị thương phẩm của cá nuôi Các loài cá thường gặp là cágiò và cá chẽm

+ Hội chứng dị dạng ở cá biển: Cá có hình dạng không bình thường, cột sống bịưỡn cong và bụng cá hóp lại như bị đói lâu ngày và không lâu sau thì cá sẽ chết Bệnhnày hay gặp trên cá mú

Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), khi nghiên cứu về bệnh lở loét trên cá

mú cho thấy hai loài vi khuẩn là Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus là tác

nhân chính gây nên bệnh lở loét ở cá mú nuôi tại Khánh Hòa Trên các mẫu bệnh còn

phân lập được 7 loài ký sinh trùng là Pseudorhabdosynochus epinepheli, Benedenia sp.,

Caligus sp., Trichodina sp., Apiosoma sp., Ampiphrya sp., Zeylanicobdella sp., và nấm

thuộc giống Aspergillus Tuy nhiên theo tác giả thì các loài ký sinh trùng và nấm chỉ làtác nhân cơ hội hoặc là tác nhân mở đường cho vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh cho

cá[20] Võ Thế Dũng và ctv (2005) nghiên cứu về thành phần loài ký sinh trùng trên cá

mú (Epinephelus spp.) tự nhiên, nuôi ao, nuôi lồng tại Khánh Hòa, đã phát hiện thấy có

22 loài ký sinh trùng thuộc 7 giống, 12 họ, 11 bộ, 9 lớp, 8 ngành Trong đó, Trichodinachiếm tỷ lệ cao nhất (74,2%), các loài monogenea ký sinh ở mang và da với tỷ lệ cảmnhiễm 31,9%[67] Nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2007) về sán lá đơn chủ

(monogenean) trên cá mú (Epinephelus sp.) và cá chỉ vàng (Lutjanus argentimaculatus)

nuôi tại Khánh Hòa cho thấy, cá bị nhiễm monogenea thường bơi lờ đờ, ăn kém, tiếtnhiều dịch nhờn từ chỗ da và mang bị tổn thương Nếu nhiễm monogenea ở da vớicường độ cao sẽ gây nên lở loét trên da ở giai đoạn cuối của bệnh Nếu cường độ cảmnhiễm của ký sinh trùng ở mang cao, thì nắp mang bị căng ra, tiết rất nhiều dịch nhầy,

da cá bị sậm đen và có thể làm cá chết rải rác[34]

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu được thu chọn lọc tại thời điểm cá mắc bệnh lở loét, mẫu thu phải là cá cònsống và được vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp có sục khí Khi thu mẫu,ghi thông tin về ngày tháng, tình trạng của cá

Mẫu cá đem về phòng thí nghiệm, trước hết cần đo chiều dài, cân trọng lượng,quan sát bằng mắt thường về các biểu hiện bệnh lý bên ngoài

Nhớt ở thân, vết loét, vây, phiến mang được lấy bằng dao đã vô trùng để kiểmtra ký sinh trùng Tơ mang, vây, mẫu cơ ở vết loét được thu để phân lập nấm

Sát trùng toàn bộ cơ thể cá bằng cồn 700, sau đó giải phẩu quan sát các biểu hiệncủa nội quan bên trong như gan, thận, lách, dạ dày, bóng bơi, xoang bụng Thu mẫubệnh phẩm gan, thận, lách vào các ống nghiệm vô trùng để phân lập vi khuẩn và nấm

Thu mẫu cơ ở vết loét để phân lập vi khuẩn, nấm và kiểm tra ký sinh trùng.Thu mẫu gan, thận, cơ ở vết loét tất cả được cố định bằng dung dịch Bouin để

kiểm tra mô học bằng phương pháp cắt mô.

pH: Sử dụng máy đo pH; Độ mặn: Sử dụng khúc xạ kế; Nhiệt độ nước: Sử dụngnhiệt kế thủy ngân có chia độ từ 0 - 1000C

Độ kiềm: Xác định bằng phương pháp chuẩn độ axít

Oxy hòa tan trong nước (Dissolved Oxygen - DO): Xác định bằng phương phápWinkler

Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand - COD): Xác bằng phươngpháp KMnO4 trong môi trường kiềm

Nhu cầu oxy sinh hóa (Biochemical Oxygen Demand - BOD5): Xác định bằngphương pháp nuôi cấy và pha loãng

Amoni (NH4+-N): Xác định theo phương pháp Salicylate, đo quang trên máyDR2010 ở bước sóng 655nm

Nitrite (NO2--N): Thực hiện với thuốc thử axit sunphanilic và a-napthylamin, đoquang trên máy DR2010 ở bước sóng 507nm

Nitrate (NO3--N): Dùng cột khử cadimi để chuyển nitrate về nitrite, sau đó xácđịnh nitrite bằng thuốc thử sunphanilic và a-napthylamin, đo quang trên máy DR2010 ởbước sóng 507nm

Sulfide (S2-): Sử dụng phương pháp đo quang với thuốc thử Phenylendiamin tạo phức màu xanh và đo trên máy DR2010 ở bước sóng 665nm.Phosphat (PO43--P): Thực hiện bằng thuốc thử molipdate và đo quang trên máyDR2010 ở bước sóng 680nm

+ Môi trường nuôi cấy cần thiết:

- Môi trường định lượng vi khuẩn hiếu khí tổng số: TSA (Tryptone Soya Agar) +2%NaCl

- Môi trường định lượng Vibrio tổng số: TCBS (Thiosulfat Citrat Bile salts

- Hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau vào trong các đĩa petri đãchứa môi trường thạch TCBS và TSA (2%NaCl), dùng que trang thủy tinh trángđều cho đến khi mặt thạch khô, lật úp đĩa petri, nuôi cấy ở 29 - 310C từ 24 - 72giờ lấy ra đọc kết quả.

- Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả Sự phân bố củacác khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì sốkhuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôicấy

- Cách tính kết quả: Chọn những đĩa không quá 300 khuẩn lạc ở 3 nồng độ phaloãng liên tiếp, tính số khuẩn lạc vi khuẩn cho 1ml bằng cách tính trung bìnhcộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức:

N=—^—

(n1 + 0,1.n2 + ).d

Trong đó, C là số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn; n1, n2, là số đĩa ở

3 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn, d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãngthứ nhất

Tham khảo các công trình của Đỗ Thị Hòa (2005)[3], Austin B và ctv (2007)[29],

và Nicky B Buller (2004)[54]

+ Môi trường nuôi cấy và hóa chất cần thiết:

- Môi trường tổng hợp: TSA +2% NaCl.

- Môi trường nuôi cấy chọn lọc cho vi khuan Vibrio: TCBS

- Môi trường nuôi cấy chọn lọc cho vi khuẩn Pseudomonas: CA (Cetrimid Agar)+ 2% NaCl

- Môi trường nuôi cấy tăng sinh (nếu cần thiết): TSB (Tryptone Soya Broth)

- Nước muối vô trùng 2% NaCl dùng để rửa và pha loãng mẫu

- Bộ test kit API 20E của hãng Biomerieux với các phản ứng sinh hóa: ONPG nitrophenyl-D-galactopyranosid), ADH (arginine hidrolase), LDC (lysinedecarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), CIT (sử dụng citrate làmnguồn carbon duy nhất), H2S (sinh H2S), URE (thử nghiệm urease), TDA (thửnghiệm tryptophan deaminase), IND (khả năng sinh Indol), VP (Voges-Proskauer), GEL (thử nghiệm gelatinase), GLU (lên men glucose), MAN (lênmen manose), INO (lên men inositol), SOR (lên men sorbitol), RHA (lên menrhamnose), SAC (lên men sucrose), MEL (lên men melibiose), AMY (lên menamygladin), ARA (lên men arabinose), NO2 (khử nitrate), McC (phát triển trongmôi trường MacConkey), OX (oxidase), MOB (khả năng di động), O/F (khảnăng oxi hóa - lên men) Ngoài ra còn thực hiện thêm các phản ứng catalase, thửkhả năng phát triển trong các nồng độ muối khác nhau, vibriostat (0/129) + Phương pháp thực hiện:

(o-vết loét và các nội quan (tim, gan, thận, lách ) được chú trọng phân tích tínhnhiễm khuẩn Các mẫu này được đồng nhất và dùng làm nguồn phát hiện vi khuẩn gâybệnh trên các môi trường chọn lọc (TSBS, CA), không chọn lọc (TSA), hay tăng sinhtrong môi trường TSB Dựa vào đặc tính khuẩn lạc ưu thế trên các môi trường chọn lọc

và kết quả thử nghiệm sinh hóa làm tiêu chí định danh nhanh vi khuẩn Quy trìnhnghiên cứu vi khuẩn gây bệnh trên cá được tóm tắt qua sơ đồ hình 2.1:

- Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn được tính theo công thức:

Số cá có xuất hiện loài vi khuẩn cần tínhTổng số cá kiểm tra

x100 (%)

+ Các trang thiết bị cần thiết: kính lúp, kính hiển vi soi nối, kính hiển vi quanghọc

+ Phương pháp thực hiện:

Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm, trước tiên được quan sát bằng mắtthường hoặc kính lúp để phát hiện các ký sinh trùng lớn ngoại ký sinh Sau đó thu cácmẫu nhớt ở da, vây, mang, hốc mũi, vết loét lên lam kính sạch, quan sát tươi dướikính hiển vi soi nối và kính hiển vi quang học để phát hiện ký sinh trùng, kết hợp vớicác tài liệu để định danh ký sinh trùng

+ Cách tính tần số bắt gặp:

Số cá bị nhiễm ký sinh trùngTần số bắt gặp = -— -7 -7 - X100 (%)

Tống số cá kiểm tra

+ Đánh giá cường độ cảm nhiễm (CĐCN):

- Đối với những ký sinh trùng nhỏ như ký sinh trùng đơn bào, CĐCN được tínhtheo công thức:

Tống số ký sinh trùng trên các thị trường kính kiểm tra

CĐCN = - (Trùng/thị trường kính)

Tống số thị trường kính kiểm tra

CĐCN = Tống ký sinh trùng trên các lam kính hay lá mang kiểm tra

Tổng lam kính hay lá mang kiểm tra

(Trùng/lam kínhhoặc lá mang)

2.7 Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm

+ Môi trường nuôi cấy: Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm là Sabouraud agar (SA)

bổ sung 100mg chloramphenicol và 20g NaCl/ 1 lít môi trường

+ Phương pháp thực hiện:

Các mẫu vây, mang, vết loét được thu vào các ống nghiệm vô trùng và được rửasạch nhiều lần bằng nước muối 2% NaCl vô trùng, dùng đũa thủy tinh tán đều mẫu Mẫuđược nuôi cấy trên môi trường SA ở 29 - 310C/3 - 5 ngày Hình thái đại thể và hiển vi được

sử dụng định danh sơ bộ nấm gây bệnh

Tham khảo công trình của Đỗ Thị Hòa (2005)[3]

+ Các hóa chất và dụng cụ cần thiết: Dung dịch Bouin, cồn (ở các nồng độ 50, 70,

80, 95, 100%), xylene, hematocylin, eosin, parafin, keo bomcanda, bộ xử lý mẫu và máy cắtlát mẫu, kính hiển vi quang học

+ Phương pháp thực hiện:

- Cố định mẫu: Mẫu gan, cơ, thận được thu và ngay lập tức được cố định trong dungdịch cố định mẫu cá Bouin từ 12 - 36 giờ, sau đó chuyển qua sang cồn 700 để bảoquản

- Hút nước mẫu và đúc parafin: Mẫu đã cố định được rút nước bằng cách ngâm quacồn ở các nồng độ từ thấp đến cao (95%, 100%) Sau đó mẫu được làm trong bằngxylene Tiếp theo, ngâm mẫu trong parafin nóng chảy (58 - 600C), sau 4 giờ đổparafin ra khuôn và để lên dàn lạnh, sau ít phút lấy khối parafin ra

- Cắt lát mẫu: Dùng máy cắt mô chuyên dụng microtome, cắt lát mô có độ dày từ 5-7 |im

để khô ở nhiệt độ 46 - 60 C (1 - 4 giờ) Khử parafin bằng xylene, rồi nhuộm tiêu bảnbằng Hematocylin và Eosin Gắn lamen lên tiêu bản bằng keo bomcanada.

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10x40 lần

2.9 Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn lên cá khỏe

- Thí nghiệm được bố trí thành 5 lô với 4 lô tiêm vi khuẩn và 1 lô tiêm nước muối sinh

lý (0,85% NaCl) làm đối chứng

- Cá thí nghiệm: Chọn cá chẽm khỏe, ăn tốt, có chiều dài và khối lượng thân trungbình lần lượt là 18,5 (± 1,34)cm và 76,7 ( ± 22,9)g (thí nghiệm lần 1); 20,6 (±1,52)cm và 106,8 (± 20,2)g (thí nghiệm lần 2), cá mua từ các lồng nuôi thương phẩm

và được nuôi thuần dưỡng trong bể composit 2000 lít, có hệ thống nước chảy ra vàoliên tục trong 2 tuần trước khi bố trí ngẫu nhiên vào trong các lô thí nghiệm

- Vi khuẩn thí nghiệm: Là chủng có tần số bắt gặp cao nhất là V alginolyticus

(CH3G-TCBSVN), bố trí thành 4 lô tiêm là 1x103 1x104, 1x105, 1x106 CFU/g khối lượngthân cá

- Điều kiện nuôi thí nghiệm:

Mật độ: 6 con/bể composit 200 lít Độ mặn 30 - 32%0 Nhiệt độ nước 27 - 280CSục khí liên tục

Cho ăn thức ăn công nghiệp, khẩu phần ăn 2% khối lượng thân/ ngày, cho ăn ngày 2 lần vào buổi sáng và chiều

- Thí nghiệm cảm nhiễm: Mỗi con cá ở các lô thí nghiệm được tiêm dưới da 0,2 mldung dịch chứa vi khuẩn (lô đối chứng được tiêm 0,2 ml dung dịch nước muối sinh

lý (0,85% NaCl) vô trùng)

bệnh, quan sát các biểu hiện bệnh bên ngoài, giải phẫu để kiểm tra sự biến đổi cácnội quan bên trong và thu mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu vi khuẩn.

- Tính LD50 (Liều gây chết 50% cá thể sau khi thí nghiệm): LD50 được xác định theocông thức của Reed và Muench (1938)

LD50 = Nồng độ gây chết lớn hơn 50% thấp nhất trừ cho số nội suy (p.d)

pd = L % - 5% (L là tỷ lệ chết trên 50% thấp nhất; H là tỷ lệ chết dưới 50% L% - H%cao nhất.)

Thí nghiệm được tóm tắt qua sơ đồ hình 2.2 sau:

2.10 Phương pháp thử nghiệm độ nhạy kháng sinh (kháng sinh đồ)

+ Môi trường và vật liệu cần thiết:

- Môi trường TSA + 2% NaCl, nước muối 2% NaCl vô trùng

- Đĩa giấy kháng sinh các loại: nalidixic acid, gentamycin, ampicillin, ciprofloxacin, cephalexin, tetracyclin,erythromycin, streptomycin, nofloxacin, kanamycin

+ Phương pháp tiến hành:

- Vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy kháng sinh được lấy từ các khuẩn lạc đã được làm thuần và nuôi cấy trên môi trường

- Hút dung dịch huyền phù vi khuẩn này cấy lên đĩa lồng chứa TSA (2% NaCl) đã chuẩn bị sẵn, dùng que trang thủy tinhtrang đều dung dịch vi khuẩn lên mặt thạch TSA, đặt vào tủ ấm sấy khô trong 15 phút.

- Đặt các đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch sao cho các đĩa giấy cách nhau từ 1,5 - 2cm

- Lật ngược đĩa lồng, ủ ở 29 - 310C/24 giờ

- Đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy kháng sinh Dựa vào độ nhạy chuẩn của từng loại kháng sinh để sosánh với độ nhạy thực nghiệm đạt được

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

mẫu cá bệnh

Nhân tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cá.Nếu môi trường thay đổi theo hướng bất lợi sẽ làm cho cá bị yếu đi và trở thành yếu tốtrực tiếp gây bệnh hoặc tạo cơ hội cho tác nhân gây bệnh khác phát huy hiệu quả gâybệnh trên cá Việc phân tích các thông số môi trường nước ở thời điểm cá bị bệnh làrất quan trọng và là cơ sở để xác định tác nhân gây bệnh chính cho cá

3.1.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý nước tại vùng nuôi

Cùng với việc thu mẫu cá bệnh, mẫu nước vùng nuôi cá cũng được thu và đem

về phòng thí nghiệm để phân tích các chỉ tiêu hóa lý cần thiết Kết quả phân tích chothấy, các yếu tố như nhiệt độ nước, pH, độ mặn, độ kiềm, oxy hòa tan (DO), nhu cầuoxy hóa học (COD), nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), amonia (NH4+-N), nitrate (NO3--N),nitrite (NO2--N) đều nằm trong giới hạn cho phép đối với nước nuôi trồng thủy sản.Chỉ riêng có nồng độ Sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn nhưngkhông nhiều Cụ thể, đối với sulfide (S2-) đo ở các đợt 2 (0,007 mg/l) và 4 (0,006mg/l) vượt quá giới hạn cho phép là 0,005mg/l, phosphate (PO43-- P) trong các đợt đoluôn ở mức bằng hoặc cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép, nhưng cao hơn khôngnhiều, cao nhất là đợt phân tích mẫu thứ 5 (0,020 mg/l)

Theo Sena S De Silva (1998), đối với môi trường nuôi cá chẽm, giới hạn chophép đối với H2S là <0,3 mg/l, điều kiện tối ưu để cá phát triển tốt là 0 mg/l; nhiệt độtối ưu: 26 - 320C (giới hạn >150C); độ mặn: 0 - 35%o; pH tối ưu từ 7,5 - 8,5 (giới hạn

>4); amonia (NH4+-N) tối ưu là 0 mg/l (giới hạn <0,46 mg/l); oxy hòa tan (DO) tối ưu

từ 4 - 9 mg/l (giới hạn >1 mg/l)[64] Cũng theo một tài liệu khác là “sinh học và kỹthuật nuôi cá chẽm” của Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ (1994) thì vị trí chọn vùngnuôi thích hợp cho cá chẽm là ở môi trường nước có: pH từ 7,5 - 8,5; oxy hòa tan nằmtrong khoảng 4 - 9 mg/l; độ mặn 10 - 30%; nhiệt độ từ 26 - 320C;

Như vậy, trong các yếu tố môi trường nước đã phân tích thì đa số đều nằmtrong giới hạn cho phép để nuôi cá chẽm Riêng chỉ có chỉ tiêu sulfide (S2-) vàphosphate (PO43--P) có vượt giới hạn không đáng kể so với các tiêu chuẩn hiện hànhđối với môi trường nước nuôi trồng thủy sản nói chung, nhưng vẫn nằm trong giới hạncho phép so với các tài liệu chuyên môn về nuôi cá chẽm Từ kết quả này đề tài nhậnthấy, các yếu tố môi trường nước cơ bản đã phân tích đều không ảnh hưởng xấu đến

cá, nguyên nhân gây bệnh lở loét cho cá có thể đến từ một tác nhân hữu sinh khác

Kết quả cụ thể các chỉ tiêu hóa lý nước nuôi thu tại thời điểm cá chẽm bị bệnh

lở loét được thể hiện qua bảng 3.1 sau