Chọn lọc và nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (2)

Tỷ lệ mẫu sống ở các công thức khử trùng mẫu 16 Bảng 03 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi Bảng 05 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến giai đoạn tạo chồi của 6 dòng Keo tai tượng

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

………*………

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI

CẤP BỘ NĂM 2009 TÊN ĐỀ TÀI:

CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG 6 DÒNG KEO TAI TƯỢNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS PHẠM ĐỨC HUY

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BAP: 6-Benzylaminopurine

NAA: 1-Naphtalene acetic acid

IBA: 3-Indolbutiric acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Thứ thự bảng Trang

Bảng 02 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả của

giai đoạn đưa mẫu vào in vitro

16

Biểu đồ 01 Tỷ lệ mẫu sống ở các công thức khử trùng mẫu 16

Bảng 03 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi

Bảng 05 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến giai đoạn tạo chồi của 6

dòng Keo tai tượng

20

Biểu đồ 02 Tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi ở các độ tuổi khác nhau 21

Bảng 06 Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của giai

đoạn đưa mẫu vào in vitro

21

Bảng 07 Phân tích phương sai về mùa cắt mẫu 22

Bảng 08 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi

hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

23

Bảng 09 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân

chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

25

Bảng 10 Ảnh hưởng phối hợp của BAP, NAA và kinetin đến hệ

số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

27

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 4 1.3.2 Nội dung nghiên cứu 4

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 5

2.1.1 Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội 7

2.1.2 Xử lý cây mẹ tạo chồi 7

2.1.4 Thử nghiệm tuổi mẫu và mùa lấy mẫu 8

2.1.5 Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy 8

2.1.6 Thử nghiệm môi trường cơ bản 9

2.1.7 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hiệu quả quá trình tạo chồi 9

2.1.8 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến nhân nhanh chồi 10

2.1.9 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và kinetin đến hiệu quả

2.1.10 Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy 11

2.1.11 Thu thập và xử lý số liệu 11

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 13

2.3.1 Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội 14

2.3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 15

2.3.3 Thử nghiệm lựa chọn môi trường cơ bản cho nhân nhanh chồi 17

2.3.4 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào

2.3.5 Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào in vitro 20

2.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu 22

2.3.7 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu 24

2.3.8 Ảnh hưởng phối hợp của BAP, NAA và Kinetin đến hệ số

PHẦN PHỤ BIỂU

TÓM TẮT

Đề tài “Chọn lọc và thử nghiệm nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào” dự kiến thực hiện trong 2 năm 2009 và 2010 Năm 2009 đề tài thực hiện một số nội dung thuộc 2 lĩnh vực:

Thứ nhất là tiến hành chọn cây trội, xác định màu sắc gỗ của cây trội và

tiến hành xử lý tạo chồi phục vụ nuôi cấy mô tế bào Đề tài đã chọn được 6 cây

mẹ ưu trội nhất từ 20 cây trội của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chọn trước đây Đã xác định được màu sắc lõi gỗ của 6 cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống bằng phương pháp khoan tăng trưởng

Thứ hai là thử nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đưa mẫu

vào in vitro và giai đoạn nhân nhanh chồi Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (cấy

mẫu từ tự nhiên vào ống nghiệm) đã xác định được khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian 16 phút cho tỷ lệ sống cao nhất bình quân đạt 15,6% Thời gian cắt mẫu vào mùa hè có tỷ lệ mẫu sống cao hơn hẳn khi cắt mẫu vào mùa thu Môi trường cơ bản thích hợp nhất là môi trường MS Giai đoạn nhân nhanh chồi đã xác định được môi trường cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất đối với từng dòng là:

- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6 Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%

- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6 Hệ số nhân chồi của các dòng lần là: 1,5 lần; 1,6 lần; 1,6 lần và 1,4 lần Tỷ lệ chồi hữu hiệu là 24,8%; 22,7%; 22,0% và 22,4%

- Dòng 14: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 0,9mg/l BAP + 0,6mg/l NAA, pH=6 Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,7 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 26,7%

I TỔNG QUAN

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài

- Căn cứ quyết định số 6363/QĐ-BCT, ngày 02/12/2008 của Bộ Công thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ năm

2009 với Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

- Căn cứ hợp đồng số 085.09.RD/HĐ-KHCN ngày 04/03/2009 của Bộ Công thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ năm 2009 với Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

- Căn cứ quyết định số 14/VNC-QĐ.KHTH ngày 05 tháng 03 năm 2009 của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ năm 2009

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1.2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Keo tai tượng (Acacia mangium Wild) đã và ngày càng được trồng rộng

rãi ở hầu hết các vùng sinh thái của nước ta và là loài cây ưu tiên trồng rừng ở cả

9 vùng sinh thái trên toàn quốc Đối với vùng Trung tâm Bắc Bộ hiện nay thì đây

là loài cây được trồng phổ biến và có diện tích rừng trồng lớn nhất trong số các loài cây trồng rừng kinh tế

Năm 1996 Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chuyển hóa 10,6 ha rừng trồng khảo nghiệm từ nguồn hạt nhập nội xuất xứ Carlwell tại Hàm Yên – Tuyên Quang thành rừng giống Hiện nay, rừng giống chuyển hóa này đã cho hiệu quả rõ rệt, rừng trồng

từ nguồn hạt của rừng giống sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao hơn rõ rệt so với rừng trồng đại trà ở Vùng Trung tâm Bắc Bộ Tuy nhiên, sản lượng hạt của rừng giống còn thấp, nguồn hạt giống không đủ cung cấp cho trồng rừng của Tổng công ty giấy nói riêng cũng như trồng rừng trong khu vực Một số cây sinh trưởng và phát triển tốt, có thể tích thân cây lớn lại không ra hoa kết quả Đồng thời sử dụng hạt giống từ của cây trội còn có những hạn chế do thu phấn mang lại Nhân giống vô tính những cây trội này đảm bảo giữ được những đặc tính ưu trội của chúng và dễ dàng lưu giữ nguồn gen quý

Cũng như các loài cây khác, nhân giống vô tính cây Keo tai tượng vừa nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc, tăng sự đồng đều của rừng trồng từ đó tăng năng suất và chất lượng rừng Do vậy, nuôi cấy mô tế bào các dòng Keo tai tượng ưu trội của rừng giống Hàm Yên vừa đáp ứng được các mục đích nêu trên vừa đáp ứng bảo tồn và phát triển nguồn gen quý khi rừng giống không còn thu hái hạt

Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để tạo ra số lượng lớn cây con chất lượng cao phục vụ trồng rừng khảo nghiệm và trồng rừng kinh tế Về lâu dài là nâng cao năng suất, chất lượng rừng và phát triển nguồn gen quý được chọn lọc thì thử nghiệm nhân giống cây Keo tai tượng và tiến tới hoàn thiện công nghệ nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là cần thiết

Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy là một trong những đơn vị đi đầu về nuôi cấy mô tế bào các loài cây lâm nghiệp, nhiều loài cây đã được nuôi cấy ở quy mô công nghiệp, đội ngũ cán bộ có nhiều kinh nghiệm, cơ sở vật chất tương đối đầy đủ Đây là những yếu tố quan trọng để đề tài đạt được tốt nhất các mục tiêu đề ra

1.2.2 Mục tiêu của đề tài

™ Mục tiêu lâu dài

Chọn lọc và nhân nhanh cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Tạo được cây con Keo tai tượng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho trồng rừng khảo nghiệm Góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng Keo tai tượng

™ Mục tiêu năm 2009:

1 Tuyển chọn được 6 cây mẹ ưu trội cung cấp vật liệu nhân giống

2 Xác định tuổi mẫu, mùa cắt mẫu cho hệ số nhân chồi cao và thời gian khử trùng mẫu thích hợp cho tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao

3 Tìm môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân chồi đối với 6 cây trội đã chọn

4 Tạo được bình giống gốc từ cây trội đã chọn lọc

1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

™ Cây mẹ lấy mẫu:

Cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống là 6 cây ưu trội nhất được chọn lọc

từ 20 cây trội tại rừng giống Hàm Yên - Tuyên Quang (20 cây trội này đã được

Sở NN&PTNT Tuyên Quang công nhận là cây trội cung cấp vật liệu nhân giống)

™ Mẫu nuôi cấy:

Mẫu nuôi cấy là chồi được tạo ra từ cây dài 4-7cm chứa nách lá thứ 3-6 Mẫu nuôi cấy là những chồi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh

1.3.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1 Chọn lọc cây trội Keo tai tượng theo mục tiêu nâng cao năng suất rừng trồng Xác định màu sắc gỗ của cây trội đã chọn

2 Xử lý cho cây mẹ nảy chồi

3 Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau và tìm thời gian khử trùng thích hợp

4 Thử nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố: tuổi mẫu và mùa lấy mẫu cho tỷ lệ mẫu nảy chồi cao

5 Nuôi cấy mẫu trong 3 loại môi trường và xác định môi trường cơ bản thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi

6 Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng phối hợp của chúng đến quá trình nhân nhanh chồi

7 Thu thập, xử lý số liệu và viết báo cáo

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu

địa thiếu nitơ vì hệ rễ có nốt sần cố định đạm do đó chúng còn được trồng làm cây cải tạo đất [2]

Trong các chương trình cải tạo giống cây lâm nghiệp thì giai đoạn nhân giống nhằm tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng di truyền đồng đều từ đó nâng cao năng suất và chất lượng rừng là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, đối với cây Keo tai tượng thì các nghiên cứu mới tập trung vào giai đoạn chọn tạo giống

và xây dựng vườn giống, rừng giống hữu tính Việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ

thuật nhân giống in vitro còn hạn chế và cho đến nay chưa có những báo cáo về nhân giống in vitro đối với loài cây này

Cùng loài với cây Keo tai tượng là cây Keo lai đã được tiến hành nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm tại nhiều nơi ở nước ta Hiện nay một số đơn vị đã sản xuất cây con Keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Mặc dù vậy,

những báo cáo về nhân giống in vitro đối với cây Keo tai tượng và Keo lai ở

nước ta còn ít Nếu có thì cũng chưa thể hiện được các các biện pháp kỹ thuật cụ thể đối với loài, chưa đưa ra những môi trường hóa học cụ thể Ví dụ, như báo cáo về “Kỹ thuật nhân giống keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh” của Đoàn Thị Mai và cộng sự [3] mới chỉ đưa ra những thông tin chung, chưa cụ thể về các biện pháp kỹ thuật cho từng giai đoạn

1.4.2 Ngoài nước

Cùng với một số loài cây thân gỗ khác như Bạch đàn, Thông, Dương vv, nhân giống cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới và thu được những thành công đáng kể,

nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này đã được công bố như:

Tác giả Darus H Ahmad thuộc Viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia

(Forest Research Institute) đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai tượng (Acacia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5 mg/l

BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao >0.5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA ở nồng

độ 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [7]

Với công bố của Marie-Claude Bon [8] về nghiên cứu nhân giống invitro cây Keo tai tượng với vật liệu nhân giống là hạt Tác giả đã thử nghiệm 7 công

thức về nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đối với môi trường nhân nhanh chồi Trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy ngày/đêm là 28/22 ± 20C thì môi trường nhân chồi tốt nhất là môi trường MS + 4,4µM BA + 2,7 µM NAA, pH =5,6-5,8 Sau 8 tuần nuôi cấy thu được chiều cao trung bình của chồi là 10,5mm

Năm 2004, Olivier Monteuuis [11] đã công bố kỹ thuật nhân giống in vitro

cây Keo tai tượng với cây mẹ là những cây trội tuổi 7 Ở đây mẫu được khử trùng bằng cồn 70% trong vòng 5 phút sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong

3 phút Môi trường nhân chồi là môi trường MS có bổ sung 50mg/l Myo-inositol + 200 mg/l casein hydrolyzate + 2mg/l glysin + 2,2 µM BA + 0,1µM NAA + 30g/l sucarose; pH từ 5,6-5,8

V.J.Hartney và cộng sự đã tạo cây con Keo tai tượng thành công bằng

nuôi cấy in vitro Ở đây vật liệu nuôi cấy là hạt giống xuất xứ Cardwell,

Queensland, đây cũng là xuất xứ của những cây trội trong đề tài Hạt được gieo trong ống nghiệm cho nảy chồi phục vụ các nghiên cứu tiếp theo Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% sucrose + 0.8% agar + 1µM BAP + 1 µM NAA Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (±40) Giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypochlorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút

Cùng với cây Keo tai tượng, cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) cũng

đã được W.Nitiwattanachai nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thành công từ chồi của cây trội Ở đây tác giả sử dụng môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) + 10 µM BAP + 0.5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ

là môi trường White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA [12]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nhân giống in vitro cây Keo tai tượng

thường sử dụng tổ hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng là BAP và NAA với ph từ 5,6-5,8 Tuy nhiên các các nghiên cứu khác nhau lại sử dụng nồng độ khác nhau, điều này cho thấy vật liệu nghiên cứu khác nhau đòi hỏi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng cũng khác nhau Vật liệu là hạt gieo trong ống nghiệm thì nồng

độ các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nhân chồi thấp hơn với vật liệu từ chồi cắt từ cây mẹ Cây mẹ có tuổi càng cao đòi hỏi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng càng cao

II THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội đã chọn

Kế thừa 20 cây trội được chọn lọc từ 10,5 ha rừng giống tại Hàm Yên - Tuyên Quang, đây là 20 cây trội đã được Sở NN&PTNT Tuyên Quang công nhận là cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống phục vụ trồng rừng Đề tài tiến hành chọn 6 cây ưu trội nhất làm cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống

Cùng với việc nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng Hiện nay, khi trồng rừng cây Keo tai tượng thì màu sắc gỗ cũng là tiêu chí ngày càng được người trồng rừng quan tâm Cây Keo tai tượng được trồng ở nước ta thì gỗ có 2 màu chính là gỗ màu đen và màu vàng Thông thường gỗ màu đen có tỷ trọng cao hơn và sức chịu đựng về cơ lý tốt hơn gỗ màu vàng nên cây có gỗ màu đen được quan tâm trồng gỗ xẻ và gỗ xây dựng Tuy nhiên trong công nghiệp giấy và bột giấy thì gỗ màu đen lại không được ưa chuộng bằng gỗ màu vàng do chi phí tẩy trắng cao hơn

Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, đề tài tiến hành xác định màu sắc của gỗ bằng phương pháp khoan tăng trưởng Sử dụng khoang tăng trưởng khoan qua ½ lõi gỗ ở độ cao 1m trên thân cây sau rút phần lõi ra và dùng giấy giáp đánh bỏ phần nhựa cây và xác định mõi sắc của lõi gỗ

2.1.2 Xử lý cây mẹ tạo chồi

Cây trội được xử lý tạo chồi từ khoảng độ cao cách mặt đất từ 4-6m Với những cây có cành trong khoảng chiều cao này, cưa cành ở sát thân cây Với cây không có cành ở chiều cao này, tạo chồi bằng phương pháp ken cây (bóc toàn bộ lớp vỏ ½ chu vi thân cây với chiều dài 4-5cm) Sau khi chặt cành hoặc ken cây, dùng bông thấm đều trên bề mặt vết cắt bằng dung dịch BAP 1%

2.1.3 Tiêu chuẩn mẫu cấy

Mẫu được cắt vào buổi sáng (8h-9h) vào những ngày nắng ráo và trước ngày cắt từ 2-3 ngày cũng nắng, không mưa nhằm hạn chế tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn Mẫu nuôi cấy (explants) được lấy ở những chồi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá

(cuống lá được cắt sát với chồi) Mẫu cấy có chiều dài từ 4-7 cm, chứa 2-3 nách

lá từ lá thứ 3 đến lá thứ 6

2.1.4 Thử nghiệm tuổi mẫu và mùa lấy mẫu

• Tuổi mẫu:

Mẫu được cắt từ chồi ở 5 độ tuổi khác nhau như sau:

Công thức 1: mẫu cấy 4 tuần tuổi

Công thức 2: mẫu cấy 6 tuần tuổi

Công thức 3: mẫu cấy 8 tuần tuổi

Công thức 4: mẫu cấy 10 tuần tuổi

Công thức 5: mẫu cấy 12 tuần tuổi

• Mùa cắt mẫu:

Mấu sau khi cắt khỏi cây mẹ đòi hỏi phải có sức sống tốt, tỷ lệ hóa gỗ vừa phải không quá già cũng không quá non Do vậy mùa cắt mẫu cũng là yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình tạo chồi Đề tài tiến hành thử nghiệm lấy mẫu ở các thời điểm vào 2 thời điểm trong năm

Công thức 7: Lấy mẫu vào vụ hè (tháng 5 đến tháng 7)

Công thức 8: Lấy mẫu vào mùa thu (tháng 8-10)

2.1.5 Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy

Do mẫu sống nên không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già…vv Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn

Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước Sau đó rửa mẫu bằng nước 3

Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng Khử trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng Cuối cùng khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau và cuối cùng rửa lại bằng nước cất vô trùng

Các khoảng thời gian khử trùng mẫu cấy bằng HgCl20,1%

2.1.6 Thử nghiệm môi trường cơ bản

Mẫu đã khử trùng được cấy vào ống nghiệm chứa 3 loại môi trường sau có

bổ sung sucrose 30g/l + 5g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA Ở đây, đề tài tiến hành bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA nhằm nâng cao hệ số nhân chồi tạo vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm sau, vì chưa tìm ra nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Đồng thời đây cũng là nồng độ được một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng và cho hiệu quả nhân chồi tương đối tốt [6]

Công thức 14: Môi trường MS

Công thức 15: Môi trường MS cải tiến

Công thức 16: Môi trường WPM

Môi trường tốt nhất được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.1.7 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi

Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nhân giống Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng mạnh mẽ và quan trọng nhất trong giai đoạn nhân nhanh chồi đó là các chất thuộc nhóm cytokinin, hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy mô đều có sử dụng các chất thuộc nhóm này

Cytokinin thường được sử dụng là BAP

Bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như sau vào môi trường cơ bản cho hệ số nhân chồi tốt nhất đã chọn được

2.1.8 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến nhân nhanh chồi

Trong môi trường nhân giống in vitro, tỷ lệ cân đối giữa cytokinin /auxin

có ảnh hưởng đến chất lượng của chồi và hệ số nhân chồi [1] Để tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự tương tác với BAP và cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhan chồi Đề tài tiến hành bổ sung NAA vào môi trường tốt nhất ở thí nghiệm về ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi với như sau:

và BAP còn có tác dụng làm giảm quá trình lão hoá của chồi Thông thường khi

đã có mặt của BAP trong môi trường thì kinetin được bổ sung với hàm lượng từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l [1]

Từ môi trường cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất ở thí nghiệm mục 13.3.7 Kinetin được bổ sung với các nồng độ thay đổi như sau:

2.1.10 Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy

- Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (±30)

- Độ ẩm trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 55% (±5%)

- Cường độ chiếu sáng từ 1000-3000 lux (mỗi thời điểm khác nhau sử dụng cường độ chiếu sáng khác nhau)

- Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày

- pH môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng =6,0

• Với các thí nghiệm về khử trùng mẫu cấy, tuổi mẫu và mùa lấy mẫu thì mẫu được cấy trong ống nghiệm Đánh giá qua số mẫu sống và nảy chồi Mỗi công thức thí nghiệm cấy 60 mẫu (mỗi mẫu cấy vào 1 ống nghiệm)

• Các thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn môi trường cơ bản, môi trường nhân chồi mẫu được cấy trong bình tam giác 500ml Mỗi công thức theo dõi 10 cấy 10, mỗi bình 10 chồi

• Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại Đánh giá kết quả sau

8 tuần nuôi cấy

∑ Chồi hữu hiệu

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = - x 100

∑ Chồi tạo thành Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus Ghi tình trạng phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố Khi giá trị

Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa phương sai tổng thể bằng nhau và ngược lại

Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, đề tài tiến hành kiểm tra sự sai khác giữa các công thức bằng tiêu chuẩn LSD Các công thức sai khác có ý nghĩa được đánh dấu (*), còn lại là sai khác không có ý nghĩa

- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)

Giả thuyết Ho: Sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh là không có ý nghĩa (chỉ

tiêu so sánh đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)

Giả thuyết H 1: Sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh là có ý nghĩa về mặt thống

kê (chỉ tiêu so sánh có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)

+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận

H0 (Sai khác không có ý nghĩa)

+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H1 (Sai khác có ý về mặt thống kê)

- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan

Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả nghiên cứu Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia thành các nhóm khác nhau Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong cùng một nhóm sự sai khác không có ý nghĩa

Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm

ở giữa 2 cấp Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân tố kiểm tra không lớn)

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

- Panh, kéo nuôi cấy mô

- Thước đo chiều cao, thước đo đường kính, địa bàn

- Khoan tăng trưởng

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác

2.3 Kết quả thực nghiệm và thảo luận

2.3.1 Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội

Từ 20 cây trội đã được chọn tại rừng giống Hàm Yên - Tuyên Quang (kết quả chọn cây trội thuộc đề tài cấp Tổng công ty giấy Việt Nam về “Xây dựng rừng giống, vườn giống Keo tai tượng và Bạch đàn” Đề tài tiến hành chọn 6 cây trội có số điểm cao nhất làm cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống Các đặc điểm

về sinh trưởng, hình thái thân cây của 20 cây trội và 6 cây trội được chọn lọc làm cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống được thể hiện ở bảng 01 (đặc điểm chi tiết của 6 cây trội xem phụ biểu 02) 6 cây trội được lựa chọn là cây trội số 1, 2, 3,

11, 13 và cây trội số 14

Khi đã chọn được 6 cây trội, đề tài tiến hành khoan tăng trưởng và xác định màu sắc gỗ Kết quả cho thấy trong 6 cây thì 2 cây có lõi gỗ màu đen là các cây trội số 3 và cây trội số 6 Còn lại là có lõi gỗ màu vàng bao gồm các cây số

1, cây số 2 , cây số 13 và cây số 14 (xem phụ biểu 01 về hình ảnh thực hiện đề tài) Từ 6 cây trội đã chọn lọc được đề tài tiến hành ken tạo chồi cung cấp vật liệu nuôi cấy cho các giai đoạn tiếp theo

Ảnh 1: Xác định màu sắc lõi gỗ Ảnh 02: Màu sắc lõi gỗ của

Bảng 01 Sinh trưởng của 20 cây trội chọn lọc

Số hiệu

cây trội Hvn (m) Hdc (m) D1.3 (cm) Dt (m) thẳng Độ

H×nh d¹ng t¸n

2.3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ mẫu sống

Hiện nay, HgCl2 được sử dụng khá phổ biến để khử trùng mẫu trong nhân

giống in vitro các loài thực vật Do đó đề tài cũng sử dụng HgCl2 0,1% để tiến hành khử trùng mẫu cấy và thử nghiệm các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra thời gian khử trùng thích hợp Đối với các loài Bạch đàn khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% thời gian khử trùng thường là 11 phút Vì kích thước mẫu của cây Keo tai tượng lớn hơn rất nhiều so với kích thước mẫu của Bạch đàn (khoảng 3-4 lần) nên đề tài sử dụng 5 công thức thời gian khử trùng mẫu là 10, 12, 14,16 và

18 phút Sau 8 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 02 và biểu đồ 01

Bảng 02 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả của giai đoạn

đưa mẫu vào in vitro

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

Dòng

Thời gian khử trùng (phút)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

5,0 10,0 15,0 20,0

Bảng 02 cho thấy: tỷ lệ mẫu sống của cả 6 dòng đều đạt cao nhất ở thời gian khử trùng 16 phút Tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 18,3% ở dòng số 14 và thấp nhất là 13,3% ở dòng số 3 Điều này cho thấy chồi của dòng số 14 có sức sống tốt nhất và cho hiệu quả tạo chồi tốt nhất trong số các dòng nghiên cứu Tuy nhiên sự khác nhau này là không đáng kể

Bảng 02 và biểu đồ 01 cũng cho thấy giai đoạn cấy mẫu in vitro cây Keo

tai tượng cho tỷ lệ mẫu sống tương đối thấp, tỷ lệ mẫu sống trung bình ở các dòng với thời gian khử trùng 16 phút đạt 15,6% Tỷ lệ mẫu sống tăng dần theo các khoảng thời gian 10 phút, 12 phút, 14 phút, cao nhất ở 16 phút và giảm mạnh

ở khi khử trùng với thời gian 18 phút Kết quả phân tích phương sai cho thấy, 5 công thức thí nghiệm về khử trùng mẫu có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê với

độ tin cậy 95% (phụ biểu 4.1)

So với một số kết quả trên thế giới, ở đây tỷ lệ sống của mẫu cấy thấp hơn đáng kể [9, 12] HgCl2 là chất khử trùng bề mặt và độc tính cao đối với mô nuôi cấy trong khi đó mẫu cấy có kích thước tương đối lớn (1-2mm) nên khi khử trùng với thời gian ngắn thì tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao Ngược lại, nếu kéo dài thời gian khử trùng mẫu sẽ bị chết khô nhiều

Do vậy để nâng cao tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi của giai đoạn này cần thử nghiệm phối hợp với một số chất khử trùng khác như Calci hypochlorit, Natri hypochlorit hoặc một số chất kháng sinh khác

2.3.3 Thử nghiệm và lựa chọn môi trường cơ bản cho nhân nhanh chồi

Để một nghiên cứu về nhân giống in vitro thành công thì một trong những

giai đoạn quan trọng trước hết là xác định được môi trường cơ bản thích hợp Ở đây đề tài tiến hành nuôi cấy trên 3 môi trường là MS, MS cải tiến và môi trường WPM bổ sung sucrose 30g/l + 5g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA thường được sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ, trong đó môi trường MS đã được một số tác giả trên thế giới sử dụng nuôi cấy mô cây Keo tai tượng [ 7]

Kết quả nghiên cứu cho thấy 6 dòng đều có phản ứng tương tự nhau đối với 3 loại môi trương nuôi cấy, với cả 6 dòng thì môi trường MS đều cho hệ số nhân chồi cao nhất Kết quả được trình bảy ở bảng 03 (thành phần 3 loại môi trường xem phụ biểu 03)

Bảng 03 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi của 6 dòng

Dòng trường Môi Hệ số nhân chồi (lần) Dòng trường Môi Hệ số nhân chồi (lần)

6 là 1,04 lần, dòng 13 là 0,99 lần và 1,12% với dòng 14) Sau đó là môi trường

MS cải tiến và tiếp đến là môi trường WPM

Môi trường khoáng MS là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cấy các loài thực vật nói chung và thích hợp cho nhiều loài khác nhau Môi trường này không những được sử dụng trong nuôi cấy chồi mà còn được sử dùng trong nuôi cấy tế bào lát mỏng, tế bào đơn, nuôi cấy phôi…vv [6] Kết quả này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về nuôi cấy Keo tai tượng trên thế giới Để kiểm tra xem sự khác biệt về hệ số nhân chồi thu được, đề tài tiến hành phân tích phương sai một nhân tố kết quả thu được như sau:

Kết quả ở bảng phân tích phương sai (phụ biểu 4.2) cho thấy giá trị Sig của

F < 0.05 rất nhiều Do đó, hệ số nhân chồi ở các môi trường nuôi cấy đã có sự sai

Để xác định môi trường cho hệ số nhân chồi nhân chồi cao nhất, đề tài tiến hành phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan, kết quả được thể hiện ở bảng 04 Từ bảng 04 cho thấy với 6 dòng Keo tai tượng nghiên cứu thì môi trường MS là môi trường cơ bản thích hợp nhất và có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê so với 2

môi trường còn lại Đề tài chọn môi trường MS có bổ sung 30g/l sucrose + 4,5 g/l agar, pH=6 cho các thử nghiệm tiếp theo

Bảng 04: Phân nhóm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi

Phân nhóm hệ số nhân chồi Môi trường Số lần lặp

Ảnh 03: Từ trái qua phải: Mẫu cấy ở các môi

trường cơ bản WPM, MS và MS cải tiến

Ảnh 04: Mẫu cấy ở môi trường MS

2.3.4 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào in vitro

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào gồm 3 giai đoạn là:

giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (đưa mẫu từ ngoài tự nhiên vào ống nghiệm); giai đoạn nhân nhanh chồi và giai đoạn ra rễ Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro có ảnh

hưởng quan trọng đến thời gian của toàn bộ quá trình nuôi cấy Đặc biệt đối với các nghiên cứu thử nghiệm khi đưa mẫu vào đạt được hiệu quả tốt mới tạo được vật liệu khởi đầu đủ lớn phục vụ cho các thử nghiệm tiếp theo

Trong giai đoạn đưa mẫu vào in vitro thì tuổi mẫu cấy là nhân tố quan

trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình này Tuổi mẫu thích hợp quyết định đến tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi Trong giâm hom cây Keo tai tượng người ta thường lấy hom có độ tuổi từ 4 đến 6 tuần, vì vậy ở đây đề tài tiến hành thử nghiệm 5 công thức về tuổi mẫu Mẫu được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 16 phút và cấy vào môi trường MS Đánh giá tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy Kết quả về ảnh hưởng của tuổi mẫu đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi được thể hiện ở bảng 05

Kết quả bảng 05 cho thấy cấy mẫu in vitro ở 6 tuần tuổi cho tỷ mẫu sống

và nảy chồi tốt nhất trong các công thức thí nghiệm Với mẫu ở 6 tuần tuổi, tỷ lệ mẫu sống biến động từ 13,9% (dòng số 2) đến 21,7% (dòng số 14) Sự khác biệt

về tỷ lệ mẫu sống ở các độ tuổi khác nhau được thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 02

Bảng 05 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến giai đoạn tạo chồi của 6 dòng Keo tai tượng

Tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi (%)

Biểu đồ 02: Tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi ở các độ tuổi khác nhau

rõ rệt (phụ biểu 4.3) Như vậy, cấy mẫu in vitro ở 6 tuần tuổi là tốt nhất trong các

công thức thí nghiệm

2.3.5 Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào

in vitro

Thời vụ lấy mẫu (thời điểm lấy mẫu trong năm) có ý nghĩa quan trọng ảnh

hưởng đến giai đoạn đưa mẫu vào in vitro Thông thường đối với các nghiên cứu

nuôi cấy mô, mẫu được lấy vào mùa sinh trưởng của cây trồng Ở miền Bắc thường là mùa xuân hoặc mùa hạ khi đó chồi có sức sinh trưởng tốt nhất Tuy nhiên trong một số trường hợp không thể lấy mẫu vào mùa sinh trưởng để có được tỷ lệ mẫu sống cao nhất Đề tài thử nghiệm lấy mẫu cấy vào 2 mùa, tỷ lệ sống của mẫu cấy thu được ở bảng 06

Bảng 06 Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của giai đoạn đưa mẫu

Bảng 06 cho thấy với cả 6 dòng thì cắt mẫu vào vụ hè đều cho tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi tốt hơn rõ rệt so với lấy mẫu vào vụ thu Tỷ lệ mẫu sống thay đổi từ 16,1% (dòng 1) đến 26,1% (dòng 14) khi lấy mẫu vào vụ hè Trong khi đó lấy mẫu vào vụ thu tỷ lệ này là 11,7% (dòng 1) và 18,3% (dòng 14)

Kết quả phân tích thống kê ở bảng 07 cho thấy giá trị Sig của F nhỏ hơn 0,05 rất nhiều Như vậy, tỷ lệ sống và nảy chồi của mẫu cấy giữa 2 mùa đã có sự sai khác nhau rõ rệt về mặt thống kê

Bảng 07 Phân tích phương sai về mùa cắt mẫu

Hầu hết các công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro đã chỉ ra rằng chất

điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng, quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống Cụ thể nó quyết định đến hệ số nhân chồi, tốc độ nhân nhanh chồi

và tỷ lệ chồi hữu hiệu [1] Đề tài sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng trong nhóm auxin có NAA , nhóm cytokinin là BAP và kinetin

Trong đó BAP là một cytokinin có tác dụng kích thích tạo chồi mạnh và được sử dụng rộng rãi trong các môi trường tạo chồi và nhân chồi BAP gần như

là một chất không thể thay thế trong quá trình nuôi cấy in vitro các loài thực vật

Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng được tổng hợp ở bảng 08

Bảng 08 cho thấy, nồng độ BAP có ảnh hưởng mạnh mẽ và tích cực đến quá trình phát sinh chồi và sinh trưởng chiều cao của chồi nuôi cấy Ở tất cả các dòng, khi tăng nồng độ từ 0,6 mg/l đến 0,9 mg/l khả năng đẻ nhánh của chồi tăng lên rõ rệt Trừ dòng 1 và dòng 14 thì các dòng còn lại đều đạt được hệ số

thì hệ số nhân chồi cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/l BAP (hệ số nhân chồi đạt 1,4 lần)

Bảng 08: Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

Dòng

Nồng độ

BAP (mg/l)

Hệ số nhân chồi (lần)

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) Dòng

Nồng độ BAP (mg/l)

Hệ số nhân chồi (lần)

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%)

0,6 1,0 14,9 0,6 1,1 11,0 0,9 1,2 16,2 0,9 1,2 12,1 1,2 1,3 18,9 1,2 1,3 19,0

1,5 1,3 14,6 1,5 1,3 8,0 Dòng 2

1,8 1,1 11,7

Dòng

13

1,8 1,2 4,7 0,6 1,2 10,1 0,6 1,2 14,0 0,9 1,2 12,5 0,9 1,3 20,7 1,2 1,3 19,5 1,2 1,2 16,4 1,5 1,3 13,4 1,5 1,3 10,9 Dòng 3

1,8 1,1 10,9

Dòng

14

1,8 1,1 9,9

Tuy nhiên tỷ lệ chồi hữu hiệu là 13,9% và thấp hơn ở nồng độ 1,2mg/l (tỷ

lệ chồi hữu hiệu đạt 18,9%) Với dòng số 14 thì hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất khi nồng độ BAP là 0,9 mg/l Với các nồng độ BAP cao hơn thì

hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu đều giảm Ở nồng độ 1,8mg/l xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh và mướt Những chồi này cho hiệu quả rất thấp ở những lần tiếp theo

So với các dòng khác thì dòng 14 cần hàm lượng BAP ngoại thấp hơn và dòng này cũng cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất trong các dòng Có thể hàm lượng BAP nội sinh của cây mẹ cao hơn các dòng khác nên mẫu cấy cần hàm lượng BAP ngoại sinh thấp hơn Qua quan sát thực tế cây mẹ

cũng cho thấy khi xử lý tạo chồi thì cây này cũng cho số lượng chồi nhiều nhất Như vậy đây là dòng có khả năng tái sinh trồi mạnh nhất và đó cũng là bản chất

di truyền của cây mẹ

Nhằm xác định những khác biệt trên có thực sự khác nhau về mặt thống kê toán học hay không, đề tài tiến hành phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu các dòng nghiên cứu Phụ biểu 4.4 cho thấy, hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ở môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng độ BAP có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê

2.3.7 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

Trong đời sống thực vật, tỉ lệ auxin/cytokinin có vai trò quan trọng trong

sự biệt hóa cơ quan và quyết định sự sinh trưởng, phát triển của cây Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tổ hợp giữa auxin và cytokinin hầu hết đều cho

hiệu quả tốt hơn sự tác động riêng rẽ của cytokinin trong nuôi cấy in vitro

NAA là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thường có tác dụng mạnh hơn

so với IAA ở đa số các loài thực vật (IAA là chất điều hoà sinh trưởng tự nhiên) NAA có tác dụng kích thích tế bào phát triển theo chiều ngang Nhiều nghiên cứu đã sử dụng NAA kết hợp với cytokinin trong giai đoạn nhân chồi Thông thường NAA được sử dụng với nồng độ từ 0,5 đến 3,0 mg/l cho nhân chồi

Để tìm ra môi trường nhân nhanh chồi thích hợp, đề tài bổ sung NAA với các nồng độ thay đổi vào môi trường MS + 30g/l đường sucrose + 4.5g/l agar và BAP với các nồng độ tốt nhất đã tìm ra ở thí nghiệm về ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả giai đoạn nhân nhanh chồi (mục 2.3.6) Kết quả được tổng hợp ở bảng

09

Bảng 09 cho thấy, khi bổ sung NAA với nồng độ 0,3 mg/l đến 1,5mg/l thì

hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu được cải thiện rõ rệt Với các dòng số 2, 3,11 và dòng 13 thì hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu tăng dần theo nồng độ NAA từ 0,3 đến 0,9 mg/l Khi tăng hàm lượng NAA cao hơn nữa ở các mức 1,2