Ebook trichobakin và immunotoxin tái tổ hợp phần 2 phan văn chi, trần bích nhi

Chương VI THAY ĐỔI TRÌNH TỰ AMINO ACID VÀ ÁI LỰC CỦA TRICHOBAKIN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT ĐỐI VỚI CM-SEPHAROSE Chương V đã được giới thiệu với các kết quả thiết kế tạo một số dạng pro

Chương VI

THAY ĐỔI TRÌNH TỰ AMINO ACID VÀ ÁI LỰC CỦA TRICHOBAKIN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT ĐỐI VỚI CM-SEPHAROSE

Chương V đã được giới thiệu với các kết quả thiết kế tạo một số dạng protein lai tái tổ hợp trên cơ sở trình tự gen mã hóa cho Trichobakin (TBK) gồm hai dạng chính: (i) biến đổi về trình tự amino acid ở đầu amino (đầu N) tạo các protein lai PBL-2 (ATF-TBK), PBL-3 (GnRH-TBK), PBL-5 (TGF-TBK) và (ii) biến đổi tại đầu carboxyl (đầu C) trong trường hợp PBL-4 (mini-TBK) Các dẫn

xuất của TBK này đã được biểu hiện ở E coli và đã được xác định,

tinh chế Chương VI tiếp theo sẽ trình bày một số kết quả nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc bậc một của TBK và các dẫn xuất đối với một số đặc tính hóa lý như khối lượng phân tử, pI và ái lực của các protein tái tổ hợp đối với CM-Sepharose

6.1 Mức độ biểu hiện của TBK và các dẫn xuất

Để biểu hiện protein, các vector biểu hiện tái tổ hợp sau khi được thiết kế (pQV, pGnRH-TBK, puPA-TBK và pMTBK), được biến

nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) và nuôi cấy trong môi

trường LB lỏng có cảm ứng bằng IPTG Các mẫu tế bào được thu tại các thời điểm 0, 1, 2, 3 giờ sau khi cảm ứng Dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào được phân tích bằng SDS-PAGE Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, trong dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG, có xuất hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử phù hợp với kết quả tính toán lý thuyết đối với từng trường hợp cụ thể Để có thể khẳng định mức độ biểu hiện trên, phản ứng Western blot đã được tiến hành, kiểm tra với tất cả các mẫu biểu hiện với kháng thể kháng TBK Các clone biểu hiện đều

cho kết quả dương tính, điều đó cho thấy đã thu được các protein tái

tổ hợp mong muốn (Phan Van Chi et al, 2001a; Lê Thị Bích Thảo et

al, 2002; Đặng Thành Nam et al, 2003; Lê Thị Bích Thảo et al,

2003, 2007)

Tế bào E coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu hiện pQV,

pGnRH-TBK, puPA-TBK và pMTBK đã được chứng minh là có khả năng biểu hiện protein ổn định, tiếp tục được sử dụng làm đối tượng trong nghiên cứu này Để có thể thu được các protein tái tổ hợp ở dạng tan, đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch, nhằm phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc xác định điều kiện biểu hiện thích hợp là hết sức cần thiết Trong phạm vi nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biểu hiện của những protein tái tổ hợp ở dạng tan Sự biểu hiện của

cả 4 loại protein nói trên được tiến hành khảo sát ở 22, 30 và 37oC

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trong các bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút ở 37oC, cho đến khi A600nm đạt 0.4-0.6 thì tiến hành cảm ứng bằng IPTG (nồng độ cuối cùng là 0.4 mM) Sinh khối tế bào ở các thời điểm khác nhau 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm (16 giờ) được thu lại bằng ly tâm và được xử lý như đã mô

tả ở phần phương pháp để tách riêng các phần cặn và nổi Protein tổng số thu được ở phần nổi và cặn được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12.5% Từ kết quả thu được cho thấy, ở tất cả các điều kiện đã khảo sát, các protein đều được biểu hiện khá ổn định Không thấy có sự khác biệt cả về động học biểu hiện cũng như về độ tan của chúng, ngay cả ở các điều kiện thay đổi nhiệt độ và tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn

6.2 Ái lực của Trichobakin và các dẫn xuất đối với Sepharose

CM-Để phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu tiếp theo, quá trình biểu hiện các protein tái tổ hợp nói trên được tiến hành ở 22oC qua đêm (16 giờ) Sau khi biểu hiện, sinh khối tế bào của TBK và các dẫn xuất được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme

100 μg/ml Huyễn dịch tế bào được ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech) và quy trình tinh chế được tiến hành như đã

Hình 6.1 Sắc ký đồ tinh chế các protein tái tổ hợp bằng hệ thống FPLC (Pharmacia-Biotech) trên cơ sở cột trao đổi ion CM- Sepharose (Đặng Thành Nam et al, 2003) Phần dịch nổi của các tế bào

sau siêu âm và ly tâm được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose 16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech) Các tạp chất được rửa bằng đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 cho đến khi A 280nm trở lại đường nền Protein tái tổ hợp được thôi ra khỏi cột bằng gradient nồng độ 0.0-0.4 M NaCl trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 với tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ

(XK-và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml A Tách hỗn hợp mini-TBK (I) (XK-và PBL-3(II); B Tinh chế mini-TBK; C: Tinh chế PBL-3

mô tả ở Chương V Protein đích hầu như được giữ trên cột, còn các

protein khác và tạp chất bị rửa trôi khỏi cột bằng đệm 50 mM

Tris-HCl có pH 7.0 cho đến khi A280nm trở lại đường nền Protein tái tổ

hợp được thôi ra khỏi cột bằng gradient nồng độ 0.0-0.4M NaCl

trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 với tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ

và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml

Bằng kết quả thực nghiệm cho thấy mỗi loại protein tái tổ hợp có

độ bám dính và giải phóng ra khỏi cột trao đổi ion bằng một

gradient nồng độ NaCl khác nhau và được tổng kết trong Bảng 6.1

Trên Hình 6.1 là ví dụ điển hình của quá trình tinh chế không chỉ

hỗn hợp PBL-3 với mini-TBK, mà còn cả các trường hợp PBL-3 và

mini-TBK riêng biệt Kết quả cho thấy, hai loại protein này được

thôi ra khỏi cột CM-Sepharose bằng các nồng độ NaCl khác nhau

Điều đó chứng tỏ có sự tương quan và khác biệt rõ ràng giữa hai giá

trị pI của chúng với ái lực đối với CM-Sepharose Tuy nhiên, trong

các trường hợp PBL-2 lại không thể thấy có sự tương ứng trên Với

giá trị pI là 9.01 protein này lại có các chỉ số về ái lực với

CM-Sepharose tương đương như của TBK và mini-TBK (0.16 M NaCl)

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, khi thay đổi trình tự bậc

1 bằng cách thêm hoặc bớt một số amino acid ở đầu amino hoặc

carboxyl dẫn đến sự thay đổi một số đặc tính lý hóa của các protein,

kể cả pI nhưng đã không làm thay đổi khả năng biểu hiện của

Trichobakin bằng hệ pET ở E coli Tuy nhiên, những số liệu về

tinh chế protein cho thấy, ái lực của một số dạng protein tái tổ hợp

đối với CM-Sepharose không hoàn toàn tương ứng với giá trị pI

Trong những trường hợp này, rất có thể, những biến đổi về thành

phần amino acid đã làm biến đổi cấu trúc không gian của các

Chương VII

NHẬN DẠNG, XÁC ĐỊNH TBK TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT TRÊN HỆ KHỐI PHỔ MALDI- TOF MS VÀ MS/MS

Bên cạnh việc xác định các protein lai tái tổ hợp nhận được bằng phương pháp Western – blotting sử dụng kháng thể kháng TBK, để

có thể đưa ra những bằng chứng có tính khoa học xác thực hơn, trong chương này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu nhận dạng, khẳng định những biến đổi về trình tự của TBK và các dẫn xuất bằng phương pháp khối phổ liên tục MALDI-TOF MS/MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) trên

hệ thống QSTAR XL (MDS Sciex, Toronto, Canada)

Các protein lai tái tổ hợp TBK, PBL-2, PBL-3, PBL-4 và PBL-5 dạng tinh chế được dùng để xác định, nhận dạng Các phân đoạn được sử dụng trong phân tích đã được xác định có độ tinh sạch cao

(95% - 99%) và có nồng độ khoảng 0.8 mg/ml đến 1.0 mg/ml

7.1 Nhận dạng và xác định TBK

Theo nguyên lý của MALDI, dưới tác dụng của chùm xung laser, các phân tử matrix (α-cyano-4-hydrocycinamic acid, HCCA) hay 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinamic acid (sinapinic acid-SA) nhanh chóng phân li ra các proton Những proton này sẽ làm thăng hoa và ion hóa các phân tử protein/peptide đã kết tinh trong matrix Do khối lượng của các protein đều thấp và nằm trong khoảng có khả năng xác định (700 Da - 35000 Da), chiến lược phân tích, xác định TBK và các dẫn xuất được xác định như sau

a b

Hình 7.1 Nhận dạng và xác định TBK bằng phương pháp khối phổ

MALDI-TOF MS và MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003)

a: Giá trị m/z của Trichobakin tái tổ hợp tinh sạch được xác định là 27328,60 amu; b: Phổ TOF-MS của Trichobakin sau khi thủy phân bằng

trypsin Peptide có kích thước 2168,22 amu được chọn để xác định

MS/MS; c: Phổ MS/MS và trình tự các amino acid của peptide 2168,22

amu cho thấy đây chính là peptide thứ hai từ đầu C của Trichobakin sau

khi bị thủy phân bằng trypsin; d: Kết quả tìm và so sánh với dữ liệu NCBI

bằng chương trình Mascot Trichobakin đứng đầu bảng với điểm số (score) cao nhất (128) trong danh sách các protein tìm được

Đầu tiên, phổ của protein tinh sạch, nguyên dạng được ghi ở phần TOF của thiết bị Với TBK, phổ MALDI-TOF MS cho phép xác định protein này có giá trị m/z là 27328.60 amu (Hình 7.1a) Nếu tính rằng giá trị m/z có thể được thể hiện theo công thức m/z = (MW + nH+)/n, trong đó m/z là tỷ lệ giữa khối lượng và điện tích,

MW là phân tử lượng của protein, n là điện tích trên các ion và H là khối lượng của proton (1.008 Da), thì khối lượng phân tử của TBK

sẽ là tương đương với kết quả lý thuyết tính theo trình tự của protein (monoisotopic mass: 27313,24 Da) Tiếp theo, protein được thủy phân bằng trypsin để xác định phổ của hỗn hợp các peptide theo các điểm cắt hạn chế đặc hiệu tại đầu C của lysine (K) và arginine (R) Kết quả thu được trên Hình 7.1b cho thấy, hầu hết các peptide sau khi thủy phân đều được ghi rõ nét và phù hợp với kết quả phân tích lý thuyết các điểm cắt theo trình tự của TBK Khi sử dụng toàn bộ phổ của hỗn hợp peptide thu được để tìm kiếm trên cơ

sở dữ liệu của NCBI, kết quả cho thấy protein tìm được có số điểm cao nhất (128) là TBK Để khẳng định thêm về kết quả tìm kiếm này, peptide có giá trị m/z 2169.22 amu được lựa chọn để phân tích phổ MS/MS và trình tự các amino acid Kết quả ghi phổ MS/MS của peptide 2169.22 cũng được thể hiện rõ nét và rất đặc trưng trên Hình 7.1c Sử dụng chương trình tìm kiếm Mascot đã khẳng định peptide phân tích chính là peptide thứ hai từ đầu C của TBK sau khi

bị thủy phân bằng trypsin, gồm 21 amino acid: VTITNVDAGVVTSNIALLPNR Đây cũng là peptide chứa điểm khác biệt về trình tự amino acid (P) so với các RIPs nhóm 1 khác Kết quả tìm kiếm Mascot (Hình 7.1d) khi sử dụng phổ

MS để tìm kiếm theo chương trình MASCOT sẽ thu được các kết quả tương tự như đối với TBK Tuy nhiên, nếu chọn peptide có giá

trị m/z 1788,15 amu (Hình 7.2b) để xác định MS/MS thì kết quả sẽ cho biết đây chính là mảnh được cắt ra (thủy phân bằng trypsin) từ đoạn peptide được chọn để thiết kế protein lai tái tổ hợp Đây cũng chính là peptide thứ hai từ đầu N của protein nếu đánh dấu theo thứ

tự phân cắt của trypsin Mảnh peptide này có trình tự được xác định hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích theo Mascot: Y F S N I H

W C N D V S F R

Hình 7.2 Nhận dạng và xác định PBL-2 bằng phương pháp khối phổ

MALDI-TOF MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003)

a Giá trị m/z của PBL-2 tái tổ hợp tinh sạch được xác định là 29691,22 amu; b Phổ TOF-MS của PBL-2 sau khi thủy phân bằng trypsin Peptide

có giá trị m/z 1788,15 amu được chọn để xác định MS/MS và trình tự các amino acid của peptide 1788.15 cho thấy đây chính là peptide đầu N của PBL-2 sau khi bị thủy phân bằng trypsin

Bằng phương pháp đo phổ MALDI-TOF MS trên hệ QSTAR XL (MDS Sciex, Toronto, Canada) đã xác định được các protein tái tổ hợp TBK, PBL-2 và PBL-3 với các giá trị m/z tương ứng là 27328.60 amu; 29889.44 amu và 29691.22 amu Số liệu trên hầu như trùng lặp với các số liệu lý thuyết thu được qua chương trình xác định khối lượng peptide (http://us.expasy.org/ tools/peptidea-mass.html)

Để nhận dạng và xác định TBK và các dẫn xuất đã tiến hành ghi

và sử dụng ảnh phổ TOF-MS của các hỗn hợp peptide sau khi thủy

phân bằng trypsin hoặc phổ MS/MS của peptide thứ hai từ đầu C (peptide 2168,22) để so sánh với cơ sở dữ liệu của NCBI qua

chương trình MATRIX SCIENCE MASCOTTM V1.8 Các dẫn xuất của TBK sau khi thủy phân bằng trypsin có thể phân biệt rõ ràng với TBK bằng phổ MS/MS của các peptide đã thay đổi trình tự amino acid đầu N như đã thiết kế: Peptide 1531.70 của PBL-2, peptide 1788.15 của PBL-3

7.3 Nhận dạng và xác định PBL-3

Chiến lược nhận dạng và xác định các protein PBL-3 được tiến hành tương tự như đối với TBK Hình 7.3a cho thấy phổ TOF-MS của PBL-3 tinh sạch và nguyên dạng với giá trị m/z là 29889.44 amu Hình 7.3b là phổ TOF-MS của hỗn hợp các peptide sau khi thủy phân bằng trypsin Mặc dù có sự khác biệt về cường độ (tính theo trục tung), trên hình có thể thấy những peptide giống nhau (theo trục

Hình 7.3 Nhận dạng và xác định PBL-3 bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003)

a Giá trị m/z của PBL-3 tái tổ hợp tinh sạch được xác định là 29889,44 amu; b Phổ TOF-MS của PBL-3 sau khi thủy phân bằng trypsin Peptide

có giá trị m/z 1531,70 được chọn để xác định MS/MS và trình tự các amino acid của peptide 1531.70 cho thấy đây chính là peptide đầu N của PBL-3 sau khi bị thủy phân bằng trypsin

hoành), có cùng nguồn gốc từ TBK Sự khác biệt của protein này so với các dẫn xuất khác được xác định chính bằng peptide có m/z là 1531.70 amu Đây chính là một mảnh của peptide có nguồn gốc từ hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) người, đã được sử dụng

để thiết kế một loại protein lai như đã công bố (Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi, 2003a; 2003b)

a Giá trị m/z của mini-TBK đo được là 26532.27 b Trong hỗn hợp các

peptide thu được sau thủy phân bằng trypsin có peptide 1800.02 là khác

biệt (do mất đi 7 amino acid) so với peptide đầu C của TBK (2 168.22)

7.5 Nhận dạng và xác định PBL-5

Hỗn hợp peptide thủy phân với trypsin được phân tách qua cột sắc

ký ngược pha C18 trên hệ thống sắc ký lỏng nano HPLC (LC Packings, Dionex, USA), các peptide sau đó được thu và nhận dạng trực tiếp trên hệ thống khối phổ QSTAR® XL MS/MS (hãng AppliedBiosystems) với nguồn ion hóa ESI (ElectroSpray Ionization) Phổ LC-MS/MS các mảnh peptide sau đó được so sánh trên Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBInr (non-redundant database) qua sử dụng phần mềm Mascot v 1.8 (Matrix Science, UK) Kết

quả trên cho thấy đã tạo được được tổ hợp gen tgf-tbk có kích thước

906 bp dựa trên cơ sở gen mã hóa cho TGF α có nguồn gốc từ người và gen mã hóa cho Trichobakin bằng kỹ thuật PCR Tổ hợp gen này đã được đưa vào vector biểu hiện pET 21a(+) và được biểu

hiện trong chủng E coli BL21(DE3) Kết quả điện di SDS-PAGE,

Western blotting và sắc ký lỏng kết nối khối phổ cho thấy, protein tái tổ hợp được biểu hiện ổn định và có trọng lượng phân tử 33 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết của protein lai TGF-TBK Hình 7.5

là kết quả nhận dạng TGF-TBK qua các mảnh peptide: (A) KVTLPYSGNYER từ TBK và (B) FLVQEDKPACVCHSGYVGAR từ TGF

Hình 7.5 Kết quả phân tích khối phổ nhận dạng TGF-TBK tái tổ hợp sau khi thủy phân bằng trypsin (Lê Thị Bích Thảo et al, 2007)

tế bào vi khuẩn E coli chủng BL21(DE3)plysS theo qui trình gồm

các bước chính sau: (i) Chuẩn bị chủng; (ii) Lên men và biểu hiện protein; (iii) Thu tế bào và tinh chế protein; (iv) Kiểm tra chất lượng protein đã tinh sạch; (v) Đông khô và bảo quản protein tái tổ hợp

Sơ đồ qui trình lên men, tinh chế và bảo quản các protein tái tổ hợp được trình bày trong Hình 8.1

Hình 8.1 Sơ đồ qui trình lên men, tinh chế và bảo quản các độc tố miễn dịch tái tổ hợp ở qui mô 4 lit

8.1 Chuẩn bị chủng

Plasmid tái tổ hợp chứa gen lai mã hóa cho TBK và các dẫn xuất được tiến hành biến nạp vào chủng vi khuẩn BL21(DE3)plysS và cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc có bổ sung Ampicillin (nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml) và ủ ở 37°C qua đêm Nhặt một khuẩn lạc nuôi cấy trong 1.5 ml môi trường LB lỏng có

bổ sung Ampicillin và nuôi cấy lắc ở 37°C, 200 rpm qua đêm rồi cấy chuyển ra bình tam giác chứa 50 ml LB lỏng + Amp, nuôi qua đêm để sử dụng làm dịch giống gốc

Chuẩn bị bình lên men 4 lit (Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học): vô trùng và chuẩn bị môi trường LB lỏng có

bổ sung Ampicillin với nồng độ cuối cùng là 100μg/ml

8.2 Lên men

Quá trình lên men các protein tái tổ hợp được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học, được tiến hành như trình bày dưới đây

Vào thời điểm lên men, cho 50 ml dịch giống gốc vào bình lên men đã chứa 4 lit môi trường LB lỏng đã bổ sung Ampicillin (với nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml) Nhiệt độ lên men sử dụng trong khoảng 22-30°C, tùy theo từng loại dẫn xuất Bình lên men được lắc với tốc độ 200 vòng/phút Theo dõi kiểm tra OD600nm của dịch lên men Sau khoảng 2.5 - 3.5 giờ kể từ lúc bắt đầu nuôi cấy, khi OD600nm của dịch lên men đạt khoảng 0.5-0.7, bổ sung dung dịch IPTG vào dịch lên men sao cho nồng độ cuối cùng là 0.4 mM/ml rồi tiếp tục quá trình lên men Sau 14-17 giờ dừng quá trình lên men

Đo OD600nm tại thời điểm dừng lên men (thường đạt khoảng 3.3) Giữ dịch nuôi cấy ở 4°C

2.6-8.3 Thu tế bào và tinh chế protein

8.3.1 Thu tế bào và chuẩn bị dịch chiết protein

Việc thu nhận các tế bào E coli được tiến hành trên máy li tâm lớn

với dung tích ống li tâm từ 0.5-1 lit dịch nuôi cấy (Phòng Công nghệ lên men) ở 4°C, 6000 rpm, 20 phút Phần dịch nổi chứa môi

trường không sử dụng Các tế bào được rửa loại môi trường bằng nước cất rồi tiến hành li tâm loại bỏ dịch rửa Thu và hòa các tế bào trong đệm phá tế bào chứa 50mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 100 μg/ml Lysozyme Các tế bào được phá màng bằng siêu âm trong điều kiện lạnh 4°C trong khoảng 10 phút theo chu trình 20 giây siêu âm, ngừng 10 giây đến khi các tế bào trở thành dịch đồng nhất Dịch chiết tế bào được li tâm ở 12000 vòng/phút ở 4°C trong thời gian 20-30 phút Thu dịch trong, bảo quản ở -20°C để tinh chế protein Tổng số dịch protein thu được cho một mẻ 4 lit nuôi cấy vào khoảng 180-200 ml

8.3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp

Quá trình tinh chế được tiến hành theo phương pháp đã mô tả trong Chương V đối với từng loại protein lai nhưng ở qui mô lớn hơn, sử dụng cột sắc kí lớn với kích thước 1.6 x 50 cm Dịch chiết tế bào được nạp vào cột lớn chứa CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC Các protein khác không bám cột được rửa bằng đệm A (50

mM Tris-HCl, pH 7.0) với tốc độ 2.5 ml/phút đến khi OD280nm của dịch rửa đạt đường nền (xấp xỉ bằng 0) Các protein tái tổ hợp bám trên cột được thôi ra bằng đệm Tris-HCl với gradient NaCl từ 0-0.4M Dịch thôi protein được thu nhận và kiểm tra các thông số, đo thể tích (khoảng 75-100 ml) và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch

8.4 Kiểm tra chất lượng, độ tinh sạch của protein tái tổ hợp

Dịch thôi protein được kiểm tra các thông số sau:

(i) Đo thể tích: khoảng 75-100 ml

(ii) Đo OD280nm để kiểm tra nồng độ protein, thường chỉnh để có OD280 ~ 1.0 tương đương với nồng độ 1mg protein/1ml

(iii) Tính toán hiệu suất của mẻ lên men: thường đạt 35-40 mg protein tái tổ hợp sạch trên 1 lit dịch nuôi cấy

(iv) Kiểm tra độ sạch bằng điện di SDS-PAGE: quan sát băng protein sau khi tinh sạch sau khi nhuộm gel bằng Commassie Brilliant Blue Các phân đoạn protein tinh sạch thường chỉ có dạng một băng đậm có khối lượng phân tử tương đương với khối lượng tính toán của protein lai tái tổ hợp, không lẫn các băng phụ khác

8.5 Đông khô và bảo quản protein tái tổ hợp

Dịch protein tinh chế sau khi đã kiểm tra các thông số kỹ thuật, được chia nhỏ vào các lọ penicillin sạch vô trùng, mỗi lọ 1ml, dán nhãn đề tên protein tái tổ hợp, hàm lượng, ngày đông khô Các lọ được giữ ở -70°C qua đêm Ngay sáng hôm sau các lọ penicillin chứa protein tái tổ hợp được đem đông khô ở nhiệt độ thấp trên máy đông khô Virtix (Phòng Thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học) Quá trình đông khô được tiến hành cho đến khi bay hơi hết phần nước (khoảng 16-20 giờ) Các protein tái

tổ hợp sau khi đông khô có dạng bột trắng Các lọ penicillin được lấy ra khỏi máy đông khô, đậy nắp cao su và bên ngoài phủ nút thiếc Từng mẻ được cất trong hộp nhựa và giữ ở -20°C cho đến khi

sử dụng

nuôi cấy in vitro Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ

Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học dưới sự giúp đỡ của PGS.TS Đỗ Khắc Hiếu Các protein lai tái tổ hợp được thử khả năng giết chết các tế bào ung thư thuộc ba dòng đã lựa chọn là (i) dòng tế bào ung thư họng miệng KB (Human Epidermoid Carcinoma of the mouth), (ii) ung thư cơ vân RD-26 (Human Rabdomyo Sarcoma) và (iii) ung thư tủy xương SP 2/0-Ag14 (Myeloma Sarcoma) Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp

đã được mô tả trong Chương III Sau đây là một số kết quả đã nhận được (Nguyễn Bích Nhi et al, 2003)

9.1 Tác động của các dẫn xuất PBL-2, PBL-3 lên dòng tế bào ung thư họng miệng KB (Human Epidermoid Carcinoma

of the mouth)

Các tế bào ung thư sau khi được đánh thức và nuôi ổn định trong môi trường thích hợp được chia vào các giếng trong microplate với lượng ban đầu ở tất cả các giếng như nhau (khoảng 3 x 104 tế bào/giếng) Các giếng đối chứng được bổ sung một lượng dung dịch sinh lý bằng với lượng dịch protein tái tổ hợp bổ sung theo các nồng

độ khác nhau Với dòng tế bào KB, protein thử nghiệm được bổ sung vào các giếng với 6 nồng độ cuối cùng khác nhau từ 5-30 μg/ml Các Microplate được ủ trong tủ ấm 37°C với 5% CO2 Sau

48 giờ thí nghiệm, các tế bào được thu nhận, rửa bằng đệm chứa EDTA Số lượng các tế bào sống sót ở các giếng thí nghiệm và đối chứng đã được đếm (Bảng 9.1) Kết quả trong Bảng 9.1 cho thấy PBL-2 và PBL-3 đều có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư KB với các mức độ khác nhau thể hiện ở lượng tế bào sau thí nghiệm bị chết và giảm dần ở các giếng thí nghiệm so với đối chứng với nồng độ protein bổ sung tăng dần từ 5 đến 30 μg/ml PBL-2 với giá trị ID50 là 8.65 μg/ml có tác dụng mạnh hơn PBL-3 (11.24 μg/ml), TBK (10.6 μg/ml) là phân tử gốc (Nguyễn Thúy Hà

et al, 2003) và RIP tự nhiên được tách từ rễ cây Hồng qua (10.94 μg/ml) (Hoàng Quốc Trường et al, 2003) Điều đó cũng còn cho thấy dạng biến đổi PBL-2 là ATF-TBK của phân tử TBK đã cải thiện hoạt tính kháng tế bào ung thư của TBK thông qua giá trị ID50 giảm khoảng 20% so với TBK với P < 0.01 Bên cạnh đó, dạng biến đổi GnRH-TBK (PBL-3) chưa thấy biểu lộ khả năng này Như vậy

có thể thấy TBK và các dẫn xuất có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư dòng KB với ID50 khá thấp từ 9.6 đến 11.2μg/ml, trong đó PBL-2 có tác dụng giết chết các tế bào này mạnh hơn cả

Bảng 9.1 Tác động của PBL-2 và PBL-3 lên sự phát triển của các tế bào ung thư họng miệng KB (Human Epidermoid Carcinoma of the mouth) (Nguyễn Bích Nhi et al, 2003)

% tế bào đếm được Nồng độ protein

9.2 Tác động của PBL-2 và PBL-3 lên dòng tế bào ung thư cơ vân RD-26 (Human Rabdomyo Sarcoma)

Tương tự như đối với dòng tế bào KB, PBL-2 và PBL-3 đã được thử tác dụng đối với sự sinh trưởng của các tế bào ung thư cơ vân dòng RD-26 với các nồng độ từ 2.5 đến 20 μg/ml Với liều

30 μg/ml các protein bổ sung, các tế bào thử nghiệm bị co tròn, chết, không phát triển, số lượng tế bào thấp hơn lượng tế bào ban đầu trước thí nghiệm chứng tỏ ở liều này, sự phát triển của

tế bào RD-26 bị ức chế hoàn toàn Kết quả thử nghiệm được trình bày trong Bảng 9.2

Bảng 9.2 Tác động của PBL-2 và PBL-3 lên sự phát triển của các tế bào ung thư cơ (Human Rabdomyo Sarcoma) dòng RD-26 (Nguyễn

Bích Nhi et al, 2003)

% tế bào đếm được Nồng độ protein

mạnh hơn tác dụng đối với các tế bào KB, với giá trị ID50 là 6.67 μg/ml (PBL-2) và 7.98 μg/ml (PBL-3) Như vậy có thể thấy PBL-2 vẫn có tác dụng mạnh hơn TBK (ID50 giảm gần 10% so với TBK với P < 0.01) và PBL-3 PBL-3 có hiệu lực thấp nhất trong những mẫu đã thử nghiệm (với ID50 tăng xấp xỉ 10% so với TBK với P < 0.01)

9.3 Tác động của PBL-2 và PBL-3 lên các tế bào ung thư tủy xương (Myeloma Sarcoma) dòng SP 2/0-Ag14

Kết quả thử nghiệm tác động của PBL-2 và PBL-3 lên sự phát triển của các tế bào ung thư tủy xương dòng SP2/0-Ag14 cho thấy dòng tế bào này bị ức chế mạnh nhất so với 2 dòng tế bào

KB và RD-26 (Bảng 9.3 và Hình 9.1)

Bảng 9.3 Tác động của PBL-2 và PBL-3 lên sự phát triển của các tế bào ung thư tủy xương (Human Myeloma Sarcoma) dòng SP 2/0- Ag14 (Nguyễn Bích Nhi et al, 2003)

% tế bào đếm được Nồng độ protein

Các nồng độ thử nghiệm đối với dòng tế bào này chỉ từ 1.5 đến

10 μg/ml Tại nồng độ 15 và 30 μg/ml sự phát triển của các tế bào bị ức chế hoàn toàn Điều đó cho thấy đối với các dòng tế

bào ung thư nuôi cấy in vitro khác nhau, các protein có sự tác

động khác nhau Giá trị ID50 nhận được đối với dòng

SP2/0-Ag14 là 2.1 μg/ml (PBL-2) và 2.78 μg/ml (PBL-3) Một lần nữa PBL-2 lại khẳng định khả năng kháng tế bào ung thư đã được cải thiện với ID50 giảm khoảng 20% so với TBK với P < 0.01, còn tác dụng của PBL-3 gần như TBK

Hình 9.1 ID50 của TBK và các dẫn xuất lên các dòng tế bào ung

thư người nuôi cấy in vitro (Nguyễn Bích Nhi et al, 2003)

Từ các kết quả thử nghiệm tác dụng ức chế sự phát triển các tế bào

ung thư nuôi cấy in vitro của TBK và các dẫn xuất, chúng tôi có

một số kết luận sơ bộ như sau:

• Các dẫn xuất PBL-2 và PBL-3 từ TBK đều có khả năng ức chế

sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy in vitro

đã thử nghiệm theo thứ tự mạnh dần: ung thư biểu bì họng miệng KB (Epidermal Carcinoma of the mouth) < ung thư cơ vân RD-26 (Rhabdomyo Sarcoma) < ung thư tủy xương SP 2/0-Ag14 (Myeloma Sarcoma)

• ID50 của dẫn xuất PBL-3 lên các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm đều xấp xỉ TBK

• ID50 của dẫn xuất PBL-2 lên các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm giảm khoảng 10-20% so với TBK với P < 0.01 Điều đó chứng tỏ dẫn xuất này có tác dụng cải thiện một phần tính chất

kháng các tế bào ung thư người nuôi cấy in vitro so với phân tử gốc là TBK

Chương X

KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ

NGHIỆM Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG DÒNG SWISS

Để có thể khẳng định hoạt tính kháng ung thư của TBK và các dẫn

xuất, bên cạnh việc thử nghiệm in vitro trên các tế bào ung thư

người nuôi cấy, tác dụng của các chất này đã được thử trên mô hình chuột nhắt trắng gây u báng thực nghiệm bằng các tế bào ung thư

Sarcoma 180 (S-180) in vivo Thử nghiệm được tiến hành tại Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với sự cộng tác của PGS.TS Trần Công Yên, PGS.TS Nguyễn Thị Quỳ và các cộng sự Mục đích của thử nghiệm là xem xét TBK

và các dẫn xuất (PBL-2, PBL-3 và PBL-4) có thực sự giết chết các

tế bào ung thư trên mô hình động vật thực nghiệm hay không và chất nào trong các dẫn xuất có tác dụng mạnh nhất đối với các tế bào ung thư S-180 Các thông số chính được theo dõi trong quá trình thí nghiệm là: (i) khả năng sống sót của chuột thí nghiệm gây

u báng S-180 có xử lí với các protein tái tổ hợp; (ii) các chỉ tiêu ung thư học định lượng (khối lượng trung bình của u, mật độ tế bào ung thư, tỷ số phát triển u, tỉ số ức chế sự phát triển của u, tỉ lệ tế bào ung thư chết ); (iii) thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm so với đối chứng Các kết quả nhận được bước đầu cho thấy tác động dương tính đáng chú ý của các protein thử nghiệm Sau đây chúng tôi xin giới thiệu những kết quả chính (Nguyễn Bích Nhi et al, 2004) của quá trình thử nghiệm

10.1 Liều thử nghiệm trên chuột nhắt trắng

Dựa vào các kết quả thử nghiệm tác dụng của TBK và các dẫn xuất

trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro (Chương IX), hai chất

là TBK (chất gốc) và PBL-3 là một dẫn xuất đã được lựa chọn để thử nghiệm dò liều protein tái tổ hợp thích hợp cho việc điều trị kháng u báng ở chuột nhắt trắng 3 liều được sử dụng để thử nghiệm

là 20, 40 và 80 μg protein tái tổ hợp (tương ứng với 1, 2 và 4 mg protein/kg thể trọng) trên chuột nhắt trắng có trọng lượng trung bình

20 g/con Các lô chuột đều được truyền khoảng 1 triệu tế bào ung thư S-180

Thí nghiệm dò liều được tiến hành với 8 lô, mỗi lô 10 con chuột nhắt trắng đực, dòng Swiss (do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương,

Hà Nội cung cấp) với mô hình được bố trí như sau:

(i) Lô 1: đối chứng sinh học, được truyền 0.2 ml dung dịch sinh lý/con

(ii) Lô 2: đối chứng bệnh, được truyền 0.2 ml dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con

(iii) Lô 3, 4, 5: điều trị, được truyền 0.2 ml dung dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con và sau 24 giờ được tiêm 0.2 ml dung dịch chứa lần lượt mỗi lô là 80, 40 và 20μg/con TBK tái tổ hợp

(iv) Lô 6, 7, 8: điều trị, được truyền 0.2 ml dung dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con và sau 24 giờ 0.2 ml dung dịch chứa lần lượt mỗi lô là 80, 40, 20μg/con PBL-3 tái tổ hợp

Chuột nhắt thí nghiệm được nuôi bằng thức ăn tổng hợp được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội và theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe (vận động, ăn uống, bài tiết ) và khả năng sống sót so với đối chứng để chọn liều thích hợp

Quan sát và theo dõi các lô chuột thí nghiệm cho thấy:

(i) Lô 1 (đối chứng sinh học): chuột phát triển bình thường

(ii) Lô 2 (đối chứng bệnh): mỗi con chuột được tiêm 1 triệu tế bào ung thư và không được điều trị Sau khi tiêm, u báng phát triển, bụng chuột to ra và bắt đầu chết dần từ ngày 17 và chết 100% sau

23 ngày truyền báng Thời gian sống trung bình là 19.9 ngày (iii) Lô 3 (điều trị bằng TBK với liều 80μg/con): 80% chuột trong lô chết ngay trong những ngày đầu sau khi truyền báng, thời gian sống trung bình là 12.6 ngày Kết quả này cho thấy, đây là liều quá cao, gây độc cho chuột, không thể sử dụng để thí nghiệm

(iv) Lô 4 (điều trị bằng TBK với liều 40μg/con): chuột sau khi được tiêm thuốc điều trị có sức khỏe tốt hơn, nhanh nhẹn, bụng không to, ăn nhiều, lông mượt hơn so với đối chứng Tại thời điểm lô đối chứng bệnh chết 100% (23 ngày sau khi truyền tế bào ung thư) thì lô này vẫn còn sống 100% Theo dõi tiếp cho thấy thời gian sống trung bình của lô này là 50.9 ngày Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (90 ngày) lô này vẫn còn 20% số chuột sống sót Chúng tôi nhận thấy đây là liều có thể sử dụng hiệu quả trong việc điều trị cho chuột mang u báng S-180 (v) Lô 5 (điều trị bằng TBK với liều 20μg/con): tương tự như lô 4, chuột sau khi được tiêm thuốc điều trị có sức khỏe tốt hơn, nhanh nhẹn, lông mượt hơn so với đối chứng Tại thời điểm lô đối chứng bệnh chết 100% thì lô này vẫn còn 60% số chuột sống Thời gian sống trung bình của chuột trong lô là 43.9 ngày

và sau 90 ngày thí nghiệm cũng vẫn còn 20% số chuột sống sót (Hình 10.1) Kết quả này cho thấy 20μg/con là liều có thể sử dụng trong điều trị đối với chuột mang u báng S180 nhưng tác dụng không hiệu quả bằng liều 40μg/con

Từ những theo dõi trên, có thể nhận thấy TBK có hiệu quả tốt đối với chuột thí nghiệm mang u báng S-180 và liều 40μg TBK/con được chọn để sử dụng trong thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm dò liều sử dụng PBL-3 điều trị cũng cho kết quả tương tự

(vi) Lô 6 (điều trị bằng PBL-3 với liều 80μg/con): đây cũng là liều cao đối với chuột, tuy nhiên do đã được biến đổi về phân tử nên PBL-3 tỏ ra không độc bằng TBK Có 10% số chuột chết sau 2 ngày, tuy nhiên vào thời điểm 23 ngày khi lô đối chứng bệnh chết hết, lô này vẫn còn lại 60% số chuột sống và vẫn còn 10%

số chuột sống sau hơn 90 ngày theo dõi

(vii) Lô 7 (điều trị bằng PBL-3 với liều 40μg/con): tại thời điểm lô đối chứng bệnh chết hết (23 ngày) lô này còn 60% số chuột sống Thời gian sống trung bình của chuột trong lô là 44.3 ngày

so với đối chứng bệnh là 19.9 ngày Tại thời điểm kết thúc theo dõi (90 ngày) lô này vẫn còn 20% số chuột sống sót Như vậy

có thể nhận thấy liều này có tác dụng trong điều trị u báng

S-180 ở chuột, tăng thời gian sống cho chuột thí nghiệm so với đối chứng bệnh

(viii) Lô 8 (điều trị bằng PBL-3 với liều 20μg/con): đến thời điểm

lô đối chứng bệnh chết 100% thì lô này cũng chết 50% số chuột Sau đó chết rải rác và còn 10% sau hơn 90 ngày theo dõi

So với liều 40μg/con thì liều này cũng có tác dụng nhưng hiệu quả thấp hơn một chút

Như vậy các kết quả thử nghiệm dò liều cho thấy PBL-3 cũng có tác dụng đối với u báng S-180 ở chuột nhưng hiệu quả chưa bằng TBK với cùng liều protein tái tổ hợp sử dụng trong điều trị Liều 40μg PBL-3/con cũng được lựa chọn để sử dụng trong các thử nghiệm tiếp theo

Liều 40μg/con cũng được dùng để thử với các dẫn xuất PBL-2

và PBL-4 trên chuột nhắt trắng mang u báng S-180 thực nghiệm

10.2 Thử nghiệm tác dụng của TBK và các dẫn xuất trên chuột nhắt trắng mang u báng S-180

Thử nghiệm được tiến hành trong hai đợt Đợt 1 thử tác dụng của TBK và PBL-2 Đợt 2 thử tác dụng của PBL-3 và PBL-4 với cùng liều protein tái tổ hợp ở tất cả các chất và tất cả các lô điều trị là 40μg/con Quá trình tạo u báng và truyền thuốc được tiến hành như trong thí nghiệm dò liều Ở thí nghiệm này số chuột thí nghiệm ở mỗi lô tăng lên gấp đôi là 20 con, còn lô đối chứng sinh học và đối chứng bệnh là 10 con Mỗi chất được thử nghiệm hai lô với cùng liều protein tái tổ hợp, trong đó một lô sẽ được mổ để phân tích các chỉ tiêu ung thư học định lượng sau 15 ngày truyền báng, còn lô kia được nuôi tiếp tục đến 60 ngày để theo dõi thời gian sống thêm Mỗi đợt đều bố trí 5 lô thí nghiệm: (1) Đối chứng bệnh; (2) Điều trị bằng chất 1 và mổ chuột sau 15 ngày truyền báng; (3) Điều trị bằng chất 1 và nuôi tiếp theo dõi đến 60 ngày sau truyền báng; (4) Điều trị bằng chất 2 và mổ chuột sau 15 ngày truyền báng và (5) Điều trị bằng chất 2 và nuôi tiếp theo dõi đến 60 ngày sau truyền báng

10.2.1 Ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất lên sự phát triển của

u báng S-180 và các tế bào ung thư ở chuột thí nghiệm

Sau 15 ngày truyền báng các lô chuột thí nghiệm được mổ và phân tích các chỉ tiêu ung thư học định lượng Các kết quả được thể hiện trong Bảng 10.1

Bảng 10.1 Ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất với liều 40 μg /con lên các chỉ tiêu ung thư học định lượng ở chuột mang u S-180 (Nguyễn Bích Nhi et al, 2004)

chứng bệnh

Không đáng

kể

Không đáng

Từ các kết quả nhận được trong Bảng 10.1, có thể nhận thấy tất

cả các protein tái tổ hợp đã thử nghiệm đều có tác động ức chế rõ rệt sự phát triển của u báng S-180 ở chuột nhắt trắng thí nghiệm U báng ở các lô chuột điều trị hầu như không phát triển, khối lượng trung bình của u tính theo ml dịch báng xấp xỉ bằng 0 ml, trong khi

ở lô chuột đối chứng bệnh là 5.77 ± 1.14 ml (đợt thí nghiệm I) và 4.73 ± 1.03 ml (đợt thí nghiệm II) Do đó khi quan sát hình thái (Hình 10.4) có thể nhận thấy chuột đối chứng bệnh mang u báng khá to trong khi chuột điều trị bằng TBK và các dẫn xuất sự phát

triển của u không thấy rõ và mức độ chậm hơn so với lô đối chứng bệnh Mật độ của tế bào ung thư cũng giảm đáng kể, chỉ còn 1.6 x

106 (lô điều trị bằng TBK), 2.92 x 106 tế bào (lô điều trị bằng 3) và 4.84 x 106 tế bào (lô điều trị bằng PBL-2) so với lô đối chứng bệnh (trung bình hai đợt) là 216.02 x 106 tế bào Tỉ số ức chế sự phát triển của u ở tất cả các lô điều trị đều đạt trên 99% so với lô đối chứng bệnh là 0% Ngược lại, tỉ số phát triển u ở tất cả các lô điều trị đều chỉ có dưới 0.2% trong khi lô đối chứng bệnh là 100% Phân tích tỉ lệ tế bào ung thư bị chết cũng cho thấy ở các lô điều trị tỉ lệ này tăng lên nhiều lần so với lô đối chứng bệnh Trong đợt thí nghiệm I, tỉ lệ tế bào ung thư bị chết ở lô đối chứng bệnh là 2.7% trong khi ở lô điều trị bằng TBK là 10% và PBL-3 là 14% Trong đợt thí nghiệm II, tỉ lệ tế bào ung thư bị chết ở lô đối chứng bệnh là 0.3%, trong khi ở lô điều trị bằng PBL-2 là 5.5% và PBL-4 là 6.77% Các số liệu này đã góp thêm bằng chứng khẳng định tác dụng giết chết các tế bào ung thư rất đặc hiệu của TBK và các dẫn xuất

PBL-Kích thước của tế bào ung thư ở lô đối chứng bệnh và các lô điều trị cũng có sự khác biệt đáng kể Ở các lô điều trị đường kính của các tế bào ung thư đều nhỏ hơn so với đối chứng, điều này cũng được khẳng định khi quan sát hình ảnh các tế bào ung thư dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (Hình 10.1) và dưới kính hiển vi điện tử (Hình 10.2) với độ phóng đại 10 000 lần Chỉ số phân bào ung thư (MI%) đã giảm mạnh ở các lô điều trị chỉ còn 17.3% (lô điều trị bằng TBK) và 12.5% (lô điều trị bằng PBL-3) so với đối chứng bệnh là 33% Kết quả này cho thấy dưới ảnh hưởng của các protein tái tổ hợp điều trị, các tế bào ung thư đã bị ức chế sự phát triển đáng kể thông qua chỉ số phân bào ung thư giảm hẳn

Quan sát dưới kính hiển vi thường (Hình 10.1) thấy các tế bào đối chứng ung thư (Hình 10.1-A) có dạng tròn, trông rõ tế bào chất bắt màu đậm và nhân bắt màu hồng, tỉ lệ nhân/tế bào chất khá lớn, đây là những tế bào u báng điển hình

A

Hình 10.1 Các tế bào ung thư S-180 dưới tác động của TBK và các

dẫn xuất được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus – BH2 với độ phóng đại 1000 lần (Nguyễn Bích Nhi et al, 2004) A Đối chứng bệnh; B Điều trị bằng TBK; C Điều trị bằng PBL-3; D Điều trị bằng PBL-2; E Điều trị bằng PBL-4

Dưới ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất (Hình 10.2-B, -C, -D, -E) các tế bào bị teo, co lại, chết khô, không trông rõ nhân và tế bào chất, mật độ tế bào giảm mạnh so với đối chứng ung thư, kích thước

tế bào giảm đi nhiều và teo đặc lại Các tế bào ung thư bị chết và dịch báng hầu như không hình thành

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 10 000 lần (Hình 10.2) thấy hình ảnh các tế bào đối chứng ung thư S-180 (Hình 10.2A) có tế bào chất và nhân là một khối nguyên vẹn Trong tế bào chất chứa những giọt lipid, các bào quan cũng rõ ràng Trong nhân trông thấy rõ hạch nhân và các chất nhiễm sắc nằm trên hạch nhân Các tế bào ung thư dưới ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất với đại diện là PBL-4 (Hình 10.2B) có kích thước nhỏ hơn, nhân thay đổi hình thái có dạng cong hạt đậu hoặc teo nhỏ, dính cụm, khả năng bắt màu với thuốc nhuộm kém, nhân bị phân đoạn và teo không thấy rõ hạch nhân Màng tế bào bị tổn thương nặng, tế bào chất tích lũy nhiều lipid hơn Nhân tế bào bị trần ra và teo đặc, chứng tỏ các tế bào đã và đang bị chết

Như vậy qua quan sát các tế bào ung thư dưới kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử có thể rút ra nhận xét là TBK và các dẫn xuất protein tái tổ hợp đều có cùng một kiểu tác động lên tế bào ung thư S-180 và gây chết tế bào không theo kiểu làm phân rã tế bào (necrosis) mà có khả năng theo con đường apoptosis So với các

số liệu đã công bố do nhóm Ung thư thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tiến hành thử nghiệm trong nhiều năm (Trần Công Yên et al, 2001), bên cạnh Cysplatin là phức chất tổng hợp, TBK và các dẫn xuất là những chất tiêu diệt tế bào ung thư hiệu quả trong tổng số 50 chế phẩm có nguồn gốc động thực vật và các hóa chất tổng hợp đã được thử nghiệm Dưới tác dụng của các protein tái tổ hợp này với liều đã được lựa chọn để thử nghiệm (40 μg/con) các lô chuột điều trị không bị ảnh hưởng độc hại đến sức khỏe so với lô đối chứng sinh học (nuôi bình thường, không xử lí truyền tế bào ung thư cũng như protein tái tổ hợp, chỉ bị truyền một thể tích dung dịch sinh lí bằng thể tích tế bào ung thư và protein tái tổ hợp) Chuột vẫn nhanh nhẹn, việc ăn uống tỏ ra bình thường, tuy nhiên mức độ tăng trọng thấp hơn so với lô đối chứng sinh học do chúng phải chịu đựng hai đợt truyền (i) tế bào ung thư và (ii) protein tái tổ hợp đều độc hại đối với cơ thể

A B

Hình 10.2 Hình ảnh tế bào ung thư quan sát dưới kính hiển vi điện

tử với độ phóng đại 10 000 lần (Nguyễn Bích Nhi et al, 2004).

A, B: Đối chứng bệnh; C, D: Điều trị bằng mini-TBK

10.2.2 Ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất lên thời gian sống

thêm ở chuột ung thư

Để có thể đánh giá tác động thực sự của các protein tái tổ hợp lên sự phát triển của các tế bào ung thư, bên cạnh các chỉ tiêu ung thư học định lượng vừa được giới thiệu ở trên, thí nghiệm theo dõi thời gian sống thêm của các lô chuột điều trị so với lô đối chứng bệnh đã được tiến hành Ở thí nghiệm này, ngoài việc đánh giá khả năng tác động của các chất đến sự kéo dài thời gian sống của chuột thí nghiệm còn có thể lựa chọn được chất nào có hiệu quả tốt nhất trong việc kháng u báng S-180 trên chuột nhắt

Các lô điều trị và theo dõi thời gian sống thêm (20 con/lô) sau khi được truyền tế bào S-180 và điều trị bằng TBK và các dẫn xuất (PBL-2, PBL-3 và PBL-4) với cùng liều 40 μg/con đã được nuôi trường diễn và theo dõi đến ngày thứ 90 (đối với TBK và PBL-3 trong thí nghiệm đợt I) và do thời gian không cho phép chỉ đến ngày

thứ 60 (đối với PBL-2 và PBL-4 trong thí nghiệm đợt II) sau khi truyền báng Kết quả theo dõi tỉ lệ sống sót của các lô chuột thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 10.2 và Hình 10.3

Bảng 10.2 Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột mang u báng S-180 được điều trị bằng TBK và các dẫn xuất (Nguyễn Bích Nhi

Trong thí nghiệm đợt I, lô đối chứng bệnh có thời gian sống trung bình là 19.9 ngày trong khi lô điều trị bằng TBK có thời gian sống trung bình là 54.65 ngày và lô điều trị bằng PBL-3 có thời gian sống trung bình 33.9 ngày (Bảng 10.2) Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (90 ngày) cả hai lô điều trị bằng TBK và PBL-3 đều vẫn còn 2 con sống sót Như vậy có thể nhận thấy so với PBL-3 thì TBK có tác dụng kéo dài thời gian sống trung bình của chuột mang u báng S-

180 hơn hẳn Điều đó cho thấy dẫn xuất PBL-3 (GnRH-TBK) cũng

có tác dụng kháng ung thư nhưng yếu hơn so với chất gốc là TBK Trong thí nghiệm đợt II chỉ theo dõi thí nghiệm đến ngày thứ

60 sau khi truyền báng, lô đối chứng bệnh có thời gian sống trung bình là 16.7 ngày, trong khi lô điều trị bằng PBL-2 là 41.9 ngày và lô điều trị bằng PBL-4 là 47.15 ngày Như vậy có thể thấy cả hai loại dẫn xuất này đều có tác dụng kéo dài đáng

kể thời gian sống của chuột được gây u báng thực nghiệm bằng S-180 so với lô đối chứng không được điều trị, trong đó PBL-4

có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột ung thư nhiều hơn

so với PBL-2 Tại thời điểm kết thúc theo dõi (60 ngày), lô điều trị bằng PBL-2 vẫn còn 9 con (tương ứng với 45% số chuột trong lô) và lô điều trị bằng PBL-4 vẫn còn 12 con (60%) đang sống Nếu có điều kiện theo dõi tiếp tục thì thời gian sống thật

sự có khả năng kéo dài thêm nữa Có thể nhận thấy TBK và các dẫn xuất tuy có khả năng giết chết đặc hiệu các tế bào ung thư đến trên 99%, nhưng vẫn chưa đạt tới tỉ lệ tuyệt đối 100% Do vậy, các tế bào ung thư còn sống sót, cho dù là rất ít vẫn có cơ hội phát triển và gây chết động vật Điều này hướng tới mô hình thử nghiệm thêm lần điều trị với liều lượng thích hợp để có thể tấn công giết chết toàn bộ các tế bào ung thư Bên cạnh đó, các kết quả nhận được còn cho thấy TBK và các dẫn xuất khá độc hại đối với chuột thí nghiệm vì 24 giờ sau khi truyền các tế bào ung thư, các lô điều trị được tiêm truyền protein tái tổ hợp Một

số chuột ở lô điều trị đã bị chết trước khi chuột ở lô đối chứng bệnh bị chết có khả năng do cơ thể chúng phải chịu liên tiếp hai đợt truyền Các con chuột ở lô điều trị đã vượt qua được thời gian đầu có khả năng kéo dài thời gian sống hơn hẳn so với lô đối chứng bệnh Như vậy cần có những nghiên cứu tiếp tục để tìm thời điểm truyền thuốc thích hợp cho chuột thí nghiệm để có thể tối ưu các điều kiện điều trị trên chuột

Thời gian sống của chuột

Hình 10.3 So sánh thời gian sống của các lô chuột thí nghiệm

(Nguyễn Bích Nhi et al, 2004)

Nếu chỉ tính thí nghiệm kéo dài đến 60 ngày, so sánh cả 4 chất thí nghiệm có thể nhận xét như sau:

Đến ngày thứ 60, lô điều trị bằng TBK vẫn còn 6/20 con chuột còn sống (tương ứng với 30% số chuột thí nghiệm) Tương tự, lô điều trị bằng PBL-2 là 9/20 (45%), PBL-3 là 4/20 (20%) và PBL-4 là 12/20 (60%) Như vậy so với TBK là chất gốc có khả năng kéo dài đáng kể thời gian sống của chuột điều trị thì trong 3 dẫn xuất đã thử nghiệm chỉ có PBL-3 có tác dụng yếu hơn chất gốc còn hai dẫn xuất PBL-2 và PBL-4 đều có tác dụng tích cực, cải thiện thời gian sống thêm của chuột so với TBK Kết luận này cũng góp phần khẳng định tác dụng tích cực của độc tố miễn dịch PBL-2 (ATF-TBK) không chỉ cải thiện

hoạt tính ức chế các tế bào ung thư nuôi cấy ở mức độ in vitro

mà còn cả ở mô hình thử nghiệm trên động vật in vivo Bên cạnh

đó dẫn xuất PBL-4 (mini-TBK) là phân tử TBK được biến đổi rút gọn bớt 7 amino acid ở đầu C cũng đã chứng minh tính ưu việt hơn so với toàn bộ phân tử TBK

Hình 10.4 Mô hình u báng S-180 ở chuột nhắt trắng và thử nghiệm tác động của các độc tố miễn dịch tái tổ hợp (Nguyễn Bích Nhi et al,

2004) 1: Đối chứng bệnh (chuột với u báng S-180); 2: điều trị bằng 2; 3: Điều trị bằng mini-TBK; 4: điều trị bằng TBK

PBL-Như vậy, các kết quả thử nghiệm tác dụng của TBK và các dẫn

xuất (PBL-2, PBL-3 và PBL-4) lên chuột nhắt trắng dòng Swiss mang u báng S-180 thực nghiệm đã cho thấy:

(i) TBK và các dẫn xuất với liều tiêm 40μg/con đều có tác dụng ức chế đặc hiệu (trên 99%) sự phát triển của báng S-180 trên chuột thực nghiệm tại thời điểm 15 ngày sau khi truyền tế bào ung thư (1 triệu tế bào/con) Khối lượng trung bình của u báng tại thời điểm mổ thí nghiệm hầu như không đáng kể so với chuột đối chứng bệnh

(ii) Ở mức độ hiển vi với độ phóng đại 1000 lần và hiển vi điện tử với độ phóng đại 10 000 lần có thể quan sát thấy tế bào ung thư S-180 dưới ảnh hưởng của TBK và các dẫn xuất có hình dạng nhỏ đi, bị teo lại, nhân trần ra… gợi ý chúng có khả năng bị giết chết không theo con đường necrosis mà là apoptosis

(iii) TBK và các dẫn xuất có khả năng kéo dài đáng kể thời gian sống thêm của chuột mang u báng S-180 theo thứ tự PBL-4 > PBL-2 > TBK > PBL-3 Sau 60 ngày truyền báng tỉ lệ sống sót của chuột điều trị tương ứng là 60, 45, 30 và 20% Như vậy

trong 3 dẫn xuất của TBK thì PBL-2 và PBL-4 có tác dụng tích cực cải thiện hoạt tính kháng ung thư của TBK, còn PBL-3 là dẫn xuất kém hiệu quả hơn so với TBK.

THAY CHO LỜI KẾT

Immunotoxin được tạo ra trên cơ sở Trichobakin - một loại protein bất hoạt ribosome type 1 và các peptide hướng đích như đã được giới thiệu trong cuốn sách là những phân tử protein tái tổ hợp mới, đang được tiếp tục thử nghiệm khả năng tiêu diệt chọn lọc các

tế bào ung thư không chỉ trên các mô hình tế bào nuôi cấy và động vật thực nghiệm, mà còn trên các thử nghiệm lâm sàng Những nghiên cứu tiếp theo sẽ được phát triển theo hướng kết hợp các đặc tính của immunotoxin với khả năng nhận biết, thâm nhập tế bào, giảm độc và tính gây miễn dịch đối với cơ thể

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Abuharbeid S, Apel J, Sander M, Fiedler B, Langer M, Zuzarte ML, Czubayko F, Aigner A (2004) Cytotoxicity of the novel anti-cancer drug rViscumin depends on HER-2 levels in

SKOV-3 cells Biochem Biophys Res Commun 321 (2):

403-412

2 Akhtar S, Maghfoor I Rituximab plus CHOP for diffuse

large-B-cell lymphoma (2002) N Engl J Med 346: 1830-1831

3 Alexander Levitzki (2003) EGF receptor as a therapeutic

target Lung Cancer 41: S9-S14

4 Alexander RL, Ramage J, Kucera GL, Caligiuri MA, Frankel

AE (2001) High affinity interleukin-3 receptor expression on blasts from patients with acute myelogenous leukemia correlates with cytotoxicity of a diphtheria toxin/IL-3 fusion

protein Leuk Res 25: 875-881

5 Alexander RL, Kucera GL, Klein B, Frankel AE (2000) In vitro

interleukin-3 binding to leukemia cells predicts cytotoxicity of a

diphtheria toxin/IL-3 fusion protein Bioconjug Chem 11:

564-568

6 Allured VS, Collier RJ, Carroll SF, McKay DB (1986) Structure

of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0 Angstrom resolution Proc Natl Acad Sci USA 83: 1320-1324

7 Amlot PL, Stone MJ, Cunningham D, Fay J, Newman J, Collins R, May R, McCarthy M, Richardson J, Ghetie V, Ramilo O, Thorpe PE, Uhr JW, Vitetta ES (1993) A phase I study of an anti-CD22-deglycosylated Ricin A chain immunotoxin in the treatment of B-cell lymphomas resistant

to conventional therapy Blood 82: 2624-2633

8 Andreasen PA, Kjeller L, Christensen L and Dufy MJ (1997) The urokinase-type plasminogen activator system in cancer

metastasis: a review Int J Cancer 72: 1- 22

9 Anderson Y, Juell S, Fodstad O (2004) Downregulation of the antiapoptotic MCL-1 protein and apoptosis in MA-11 breast cancer cells induced by an anti-epidermal growth factor

receptor-Pseudomonas exotoxin a immunotoxin Int J

Cancer 112(3): 475-483

10 Aron GM and Irvin JD (1980) Inhition of herpes simplex virus

multiplication by a pokeweed antiviral protein Antimicrob

single-chain antibody-toxin targeted to ErbB2/HER2 Breast

Cancer Res Treat 82: 155-164

13 Azemar M, Schmidt M, Arlt F (2000) Recombinant antibody toxins specific for ErbB2 and EGF receptor inhibit the in vitro growth of human head and neck cancer cells and cause rapid

tumor regression in vivo Int J Cancer 86: 269-275

14 Bacha P, Williams DP, Waters C, Williams JM, Murphy JR, Strom TB (1988) Interleukin 2 receptor-targeted cytotoxicity: interleukin 2 receptor-mediated action of a diphtheria toxin-

related interleukin 2 fusion protein J Exp Med 167: 612-622

15 Baluna R, Coleman E, Jones C, Ghetie V, Vitetta ES

(2000) The effect of a monoclonal antibody coupled to Ricin

A chain-derived peptides on endothelial cells in vitro: insights

into toxin-mediated vascular damage Exp Cell Res 258:

417-424

16 Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES (1999) Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and

initiating vascular leak syndrome Proc Natl Acad Sci USA 96:

3957-3962