Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá... 4, Ống thạch nghiêng có thể đĩa petri chứa bào tử nấm sợi, t

Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (tt)

5 Một số phương pháp phổ biến

sử dụng trong bảo quản các nhóm

vi sinh vật cụ thể:

5.2 Bảo quản vi tảo:

Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô Các phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn Một số

điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo

là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương pháp đông khô

5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi:

a Phương pháp cấy truyền:

Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá

trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:

- Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 OC)

- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 OC trong 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm Nhiệt độ bảo quản là 15-20 OC

- Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành

từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm2 và cho vào lọ nước đã thanh trùng Bảo quản tại nhiệt độ phòng

b Bảo quản nấm sợi có bào

tử trong silicagel:

Chuẩn bị:

1, Lọ đựng silicagel (10-15ml)

có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170 OC trong 3 giờ

2, Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °C trong 3 giờ

3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút)

4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày)

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy

khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào

tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ

một vài ống thạch bào tử khác nhau)

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp

3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt

(nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC trong 1 tuần Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4OC

Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:

Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp

c Bảo quản nấm sợi có bào

tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):

Chuẩn bị:

1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC trong 3 giờ

2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút)

3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày)

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy

khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm

sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào

tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau)

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường

và nhiệt độ thích hợp Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc

3, Giữ ở -80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt

độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt

độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm

4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry

5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC

Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:

- Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên

- Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C trong 3 giờ Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt

độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt

độ -55oC

Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:

1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn

và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt

2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất

vô trùng làm tan đều mẫu đông khô Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ:

3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao

quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp

4, Cách đánh giá:

Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc

Trung bình: 10-50 khuẩn lạc

Kém: < 10 khuẩn lạc

Không mọc

Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên Tuy nhiên,

có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa

bề mặt môi trường trong đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào

tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi

d Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:

Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên

và được thực hiện như sau:

Chuẩn bị:

1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC trong 3 giờ

2, Môi trường L-drying chuẩn

có thành phần như sau:

Đệm phosphat: 0.1M :

100 ml

Monosodium glutamat: 3 g

Adonitol: 1.5 g

(Khử trùng ở 115oC/20 phút)

3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày)

Cách tiến hành:

1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì

có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau)

2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường

và nhiệt độ thích hợp Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc

3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho

phép) Khi độ chân không đạt

45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ

4, Hàn kín ampoule mẫu:

Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu Hết đợt lại khoá các van của các

ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên

Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:

- Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô

- Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học

- Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các

mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần

Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC

e Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 o C và nitơ lỏng (-196 o C):

Vietsciences- Dương Văn Hợp,

Nguyễn Lân Dũng