Đa dạng di truyền một số chủng virus gây bệnh tai xanh (prrsv) ở việt nam dựa vào trình tự gen mã hóa protein màng (m)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ THU HẰNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH PRRSV Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN MÀNG M LUẬ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ THU HẰNG

ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH (PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA

PROTEIN MÀNG (M)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ THU HẰNG

ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH (PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA

PROTEIN MÀNG (M)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học

TS Nguyễn Tường Vân

Thái Nguyên - 2013

MỞ ÐẦU

1 Tính cấp thiết của dề tài

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), còn gọi là bệnh “tai xanh” (Blue Ear), là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, lây lan nhanh và nguy cơ tử vong cao [43] Bệnh có một lịch sử dịch tễ học phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện chăn nuôi lợn công nghiệp thông thường Vì vậy đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong công nghiệp nuôi lợn không chỉ trên thế giới mà còn ở Việt Nam

Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” [6] Ở Châu Âu nhiều vùng cũng ghi nhận dịch bệnh này như Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) Năm

1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [45] Từ năm 2006 đến năm 2010, khu vực các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Philippines và Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị các đợt dịch PRRS hoành hành với chủng PRRSV độc lực cao Cho đến nay PRRS đã trở thành dịch bệnh lưu hành ở nhiều châu lục trên thế giới là một trong những bệnh gây tổn thất nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia

PRRS là loại virus có vỏ bọc bên ngoài, có cấu trúc hệ gen là ARN sợi đơn dương, có tính thích ứng nhân lên rất cao đối với các đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang hoạt động ở phổi [32] Trong cơ thể lợn bệnh, sự phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng và chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dich, nếu qua khỏi cũng rất khó lấy lại cân bằng miễn dịch [25]

Bộ gen của PRRSV dài khoảng 15 kb và bao gồm ít nhất tám (ORF) bao gồm ORF1a, 1b, 2,3,4,5,6, và -7 , trong đó ORF 1a và ORF 1b là các gen mã hóa RNA polymerase, GP 2-3-4 là các gen mã hóa protein chức năng, GP5 (hay E) là glycoprotein vỏ ngoài, M là protein màng và N là protein cấu trúc nucleocapsid [40] Do

đa dạng và luôn biến đổi về thông tin di truyền nên việc tìm ra một virus ổn định và có tính đại diện nhằm sản xuất vaccine rất khó khăn

Ở Việt Nam cuối tháng 2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tỉnh Hải Dương và sau đó lan ra các tỉnh miền Trung, miền Nam và đến nay bệnh vẫn diễn biến phức tạp gây thiệt hại vô cùng to lớn về kinh tế cho người chăn nuôi Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hai loại vaccine chống virus PRRS phổ biến bao gồm vaccine bất hoạt và vaccine nhược độc, nhưng giá thành cao, hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virus, đồng thời đòi hỏi nghiêm ngặt trong khâu bảo quản và vận chuyển [22]

Do đó yêu cầu cấp thiết đặt ra đó là phải phân lập được các chủng virus lưu hành tại Việt Nam, phân tích các kháng nguyên quan trọng để tạo cơ sở cho việc sản xuất vaccine Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực

tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đa dạng di truyền của một số dòng virus gây bệnh lợn tai xanh

(PRRSV) ở Việt Nam dựa vào trình tự gen mã hóa cho protein màng (M)”

Trong khuôn khổ của luận văn, đặc điểm di truyền và phân tử của một số chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam trong năm 2010 sẽ được so sánh với các chủng khác của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen mã hóa

cho protein M (ở đây được gọi là gen M) – một trong những protein cấu trúc quan trọng của PRRSV Kết quả

của nghiên cứu này có thể phục vụ cho việc chẩn đoán chủng gây bệnh và phát triển vaccine

3 Ðối tuợng và phạm vi nghiên cứu của dề tài

Các bệnh phẩm dùng trong nghiên cứu là niêm mạc của hầu họng - khí - phế quản chứa virus PRRS thu thập từ lợn mắc bệnh tai xanh ở 5 tỉnh của Việt Nam ( Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền giang)

do trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp

Phạm vi nghiên cứu của đề tài là giải trình tự gen M, phân tích thành phần chuỗi nucleotide và amino acid của gen M, nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phả hệ các chủng thu nhận được với các chủng của Việt Nam và thế giới dã đăng ký trong Ngân hàng gen và phát hiện các chủng mới ở Việt Nam

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 54 trang, trong đó phần Mở đầu 2 trang; Tổng quan tài liệu 18 trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 9 trang; Kết quả và bàn luận 15 trang; Kết luận và kiến nghị 1 trang; Tài liệu tham khảo 7 trang; Phụ lục 1 trang

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới

1.1.2 Tình hình bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam

1.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.2.1 Triệu chứng lâm sàng

1.2.2 Bệnh tích

1.3 Nguyên nhân gây bệnh và phân loại

1.4 Giới thiệu về virus PRRS

1.4.1 Hình thái và cấu trúc của virus PRRS

1.4.2 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng

1.5 Các con đường lây nhiễm

1.5.1 Sự lây truyền dọc

1.5.2 Sự lây truyền ngang

1.6 Đa dạng di truyền của virus PRRS

1.7 Giới thiệu về gen M

1.7.1 Chức năng

1.7.2 Cấu trúc gen M của virus PRRSV

1.7.3 Vai trò trong tạo đáp ứng miễn dịch

1.8 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu tìm hiểu gen M

1.8.1.Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen M

1.8.2 Triển vọng sử dụng gen M tái tổ hợp trong sản xuất vaccine

CHƯƠNG 2 ÐỐI TUỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Ðối tuợng

Gen M của 5 chủng virus cúm PRRS gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam đại diện ở một số địa phương được thu nhận từ năm 2010 Các mẫu bệnh phẩm gồm 5 chủng được thu nhận tại Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ

An, Bạc Liêu, Tiền giang

2.2 Nội dung

1 Tiến hành tách chiết được RNA tổng số của virus

2 Thiết kế mồi để thực hiện phản ứng PCR để thu nhận gen mã hóa cho protein màng (M)

3 Giải trình tự gen và tiến hành phân tích số liệu, so sánh sự tương đồng giữa các nucleotide và amino acid để đánh giá sự đa dạng di truyền chủng PRRS của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen mã hóa cho protein M

2.3 Vật liệu

- Mẫu bệnh phẩm do trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp

- Chủng E coli DH5α, các vector nhân dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ

sinh học cung cấp

- Cặp mồi F-M, R-M để nhân dòng gen mã hóa protein màng M của virus PRRS do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.4 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng duợc cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới:Qiagen,Invitrogen, Fermentas

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng nhân dòng

Các cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân dòng gen mã hóa protein màng M của virus PRRS được thiết kế dựa trên phân tích trình tự của tất cả các chủng PRRSV có trong Ngân hàng gen

2.5.2.Tách chiết RNA tổng số của virus

Sử dụng bộ kit Trizol Regents (của hãng Invitrogen ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

2.5.3.Tổng hợp cDNA và phản ứng PCR

RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA) thứ nhất cDNA từ phản ứng phiên

mã ngược được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen M với cặp mồi đặc hiệu M-F và M-R Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và tinh sạch theo kit thôi gel theo quy trình GeneJET™Gel Extraction Kit (Fermantas)

2.5.4.Phương pháp tách dòng gen

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gắn vào trong vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả

biến E coli DH5-α

2.5.5 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc Để chắc chắn vector đã được biến nạp vào trong tế bào vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành chọn ra các khuẩn lạc trắng để kiểm tra bằng phản ứng PCR, sử dụng trực tiếp các tế bào vi khuẩn làm khuôn mẫu (hay còn gọi là colony-PCR)

2.5.6 Tách chiết plasmid

Quy trình tách plasmid được thực hiện theo kit tinh sạch plasmid ”Plasmid Extraction Kit” của hãng

QIAGEN

2.3.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp

Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp enzym giới hạn Trên vector pBT có hai điểm cắt của enzym BamHI ở hai đầu điểm gắn gen do đó BamHI được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen trong vector nhân dòng

2.6 Phương pháp xác định trình tự và xử lý số liệu

Sử dụng chương trình Neighbor Joining và Alignment trên phần mềm Mega 3.1 [37], chương trình Multiple Sequence Aligment trên phần mềm DNAMAN 4.1.5 (Lynnon BioSoft) để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide, amino acid và các đặc điểm sinh học, sinh học phân tử và xây dựng mối quan hệ phả hệ xác định nguồn gốc chủng loài

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Phân lập gen M

3.1 Phân lập gen M

Năm mẫu bệnh phẩm PRRS thu thập ở Quảng Ninh, Bạc Liêu, Nghệ An, Tiền Giang, Hưng Yên nuôi cấy trên tế bào thận khỉ Marc145 được sử dụng để tách chiết ARN tổng số Sau đó tiến hành tách chiết ARN tổng số bằng cách sử dụng bộ kit Trizol Regents và tổng hợp cDNA, sau đó gen M được nhân lên bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi F-M, R-M

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm RT- PCR nhân đoạn gen M (1 : 10-QuNi ; 2 : 10-BaLi ; 3 :10-NgAn ; 4 :10-TiGi ;5 : 10-HuY)

Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% chỉ thấy một vạch duy nhất, có kích thước khoảng hơn 600 bp tương đương với kích thước của gen M theo lý thuyết Như vậy, bước đầu có thể sơ bộ kết luận: đã nhân được gen M và cặp mồi dùng để nhân gen M từ khuôn cDNA sợi đơn là rất đặc hiệu

Sản phẩm PCR được thôi gel và dòng hóa vào vector pBT tạo thành vector tái tổ hợp pBT-M Vector tái

tổ hợp pBT-M được nhân bản trong E.coli

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm clony – PCR từ E.coli để kiểm tra các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp

pBT-M (1-3 :10-QuNi ; 4-6 : 10-BaLi ; 7-9 :10-NgAn ; 10-13 :10-TiGi ;14-16 : 10-HuY)

Hình ảnh 3.2 là ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ E.coli để kiểm tra 16 dòng khuẩn lạc trắng.Kết quả

có 15 giếng ( Giếng số 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ) xuất hiện băng có kích thước khoảng hơn

600bp

600bp

600bp tương đương với kích thước gen M theo lý thuyết Như vậy ta có thể kết luận rằng có 15 dòng mang vector tái tổ hợp pBT- M

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn BamHI (1 : 10-QuNi ; 2 : 10-BaLi ; 3 :10-NgAn ; 4 :10-TiGi ;5 : 10-HuY)

Tiến hành tách plasmid và cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và điện di cho thấy sản phẩm cắt của 5 plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI có 2 phân đoạn kích thước khoảng 2700bp tương ứng với kích thước vector pBT và 620 bp tương ứng với kích thước của gen M Điều này khẳng định gen M đã được dòng hóa thành

công vào vector nhân dòng pBT

Các plasmid tái tổ hợp 10NgAn, 10TiGi, 10BaLi, 10HuY, pBT-M-10QiNi được đọc trình tự để phân tích sự đa dạng di truyền của gen M

3.2 Phân tích quan hệ di truyền giữa các dòng virus PRRS

Khi có được trình tự nucleotid chuỗi gen M, chúng tôi tiến hành so sánh chuỗi trình tự nucleotid vừa giải duợc với chuỗi trình tự nucleotid của các chủng virut PRRS trong Ngân hàng dữ liệu gen

3.2.1 Phân tích quan hệ di truyền giữa các dòng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự DNA gen M

Hình 3.4 Phân tích chủng loại dựa vào

đa hình trình tự DNA của gen M của 5 mẫu virus và của 38 chủng tham khảo Chú thích : 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu ( Hình 2.1);*) 07 QN 2007: chủng virus

có độc tính cao ở Quảng Nam [30] ;

**) JXA1: chủng virus có độc tính cao

ở Trung Quốc [55] 2001-2012 sau tên các chủng virus: năm thu mẫu (Bảng 1) EU genotype: chủng châu Âu; NA genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2: nhóm phụ 1 và 2 của chủng virus Bắc

Mỹ

600bp 2700bp

38 trình tự gen M gồm 5 trình tự trong nghiên cứu này và 33 trình tự đã công bố chia thành 2 nhóm lớn trên cây phát sinh chủng loại: nhánh 1 (type 1) gồm các đại diện của châu Âu; nhánh 2 gồm các đại diện của Trung Quốc, Việt Nam, Hoa Kỳ,Hàn Quốc, Thái Lan… (type 2) Sự sai khác giữa 2 type này với độ tin cậy tuyệt đối (giá trị bootstrap 100%) Các dòng virus PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Tiền Giang, Bạc Liêu, Nghệ An đều thuộc type 2 Type 2 được chia thành 2 nhóm phụ riêng biệt là : Nhóm phụ 1- Subgroup 1 (Sg1) và Nhóm phụ 2- Subgroup 2 (Sg2)

Subgroup 1 (Sg1): Bao gồm 4 dòng PRRS-M đã phân lập trong nghiên cứu này QuNi, HuY,

10-TiGi và 10-BaLi cùng nhánh với các chủng virus có độc tính cao (High Pathogenic PRRSV : HP-PRRSV) như JXA1 ở Trung Quốc và 07QN ở Quảng Nam, Việt Nam, và các chủng đã công bố ở Trung Quốc, Lào… từ các năm 2001-2012

Subgroup 2 (Sg2) : gồm chủng 10-NgAn và các chủng PRRSV gốc VR-2332 và chủng vaccine

RespPRRS MLV

3.2.2 Phân tích quan hệ di truyền giữa các dòng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự amino acid gen M

Hình 3.5 Phân tích chủng loại dựa vào đa hình trình tự amino acid của gen M của 5 mẫu virus và của 38 chủng

tham khảo

Chú thích: 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu (Hình 2.1) *) 07 QN 2007: chủng virus có độc tính cao ở Quảng Nam [30],

**) JXA1: chủng virus có độc tính cao ở Trung Quốc [55].2001-2012 sau tên các chủng virus: năm thu mẫu

(Bảng 2.1) EU genotype: chủng châu âu; NA genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2: nhóm phụ 1 và 2 của chủng

virus Bắc Mỹ

Kết quả phân tích bằng MEGA 3.1 cho thấy 38 trình tự amino acid ( 5 trình tự trong nghiên cứu này và

33 trình tự của các chủng mẫu tham khảo chia thành 2 nhánh chính của 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ Độ sai khác tin cậy về di truyền giữa 2 nhóm này là 100% Cả 5 chủng nghiên cứu đều thuộc type 2 (Bắc Mỹ) giá trị bootstrap 91-99%

- Nhóm 1 (Type 1): Gồm các đại diện của Châu Âu (type 1) như HKEU 16, BJEU06, Lelystad, 01CB1, SD01-08 và Euro PRRSV là đại diện của các nước Trung Quốc, Hà Lan, Thái Lan và Hoa Kỳ

- Nhóm 2 ( Type2): Các chủng PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Tiền Giang, Bạc Liêu đều thuộc nhánh này Type 2 được chia thành 2 Subgroup riêng biệt là Subgroup 1 (Sg1) và và Subgroup 2 (Sg2) (giá trị bootstrap 91-99%)

Subgroup 1 (Sg1): Bao gồm 4 chủng trong nghiên cứu này (10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi và 10-BaLi) và 25

chủng tham khảo Trong đó có một số chủng có độc lực cao như chủng 07 phân lập ở Quảng Nam- Việt Nam

2007, chủng JXA1 là chủng virus có độc tính cao ở Trung Quốc [55]

Subgroup 2(Sg2): Bao gồm các chủng như VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ, RespPRRS Repro: chủng vaccine

Chủng 10-NgAn có quan hệ gần gũi với các chủng này tuy nhiên vẫn có sự sai khác đáng kể Cần có thêm những nghiên cứu thêm về chủng này để có nhứng kết luận chính xác về chủng này

Như vậy, trong số 5 dòng PRRSV-M đã phân lập được, các dòng Quảng Ninh , Bạc Liêu, Hưng Yên, Tiền Giang có độ tương đồng DNA và axit amin cao và có quan hệ di truyền gần gũi với nhau Chủng 10 –NgAn lại có sự khác biệt trong quan hệ di truyền với các dòng trong cùng nghiên cứu

Theo Feng và đồng tác giả (2008) [30], chủng Quảng Nam (2007) và các chủng Trung Quốc (2006) có quan hệ di truyền gần gũi với nhau Sự vận chuyển thịt lợn sống giữa hai nước cũng như giữa các tỉnh trong nước có thể là nguyên nhân dẫn đến sự bùng phát của các chủng virus PRRS có độ tương đồng cao [33].Kết quả phân tích do đoàn chuyên gia của tổ chức Nông lương thế giới (FAO) cho thấy 99% các chủng đang lưu hành tại

Việt Nam tương đồng với các chủng virus đang lưu hành tại Trung Quốc [29]

Các chủng PRRSV có đa dạng di truyền cao do tốc độ tiến hóa nhanh [17] Do đó trong thời gian ngắn nhiều chủng mới xuất hiện với độc tính cao và gây ra những vụ dịch nghiêm trọng [30] Các chủng PRRSV mới xuất hiện của Type2 có lẽ bắt nguồn từ chủng gốc với đại diện là VR2332 do áp lực chọn lọc [23] Độc tính khác nhau cộng thêm đa dạng di truyền cao của các chủng PRRSV đã hạn chế hiệu quả phòng trị bệnh bằng vaccine [31] Các chủng phân tử xuất hiện ở các thời điểm khác nhau đều có cấu trúc phân tử khác nhau thể hiện ở một

số gen hoặc toàn bộ hệ gen [26], [27]

3.3 Phân tích mức tương đồng về trình tự DNA và amino acid

Kết quả phân tích bằng Mega 3.1 cho thấy 5 chủng virus PRRS được phân lập chia thành chia thành 2 nhánh chính của 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ Độ sai khác tin cậy về di truyền giữa 2 nhóm này là 100% Cả 5