kỹ thuật cố định enzyme urease trên alginate, paraffin và lac

TỔNG QUANHiện nay, enzyme urease u-rê-a được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực quan trọng như: + Nông nghiệp: xúc tác quá trình thủy phân urea u-rê thành NH3, cung cấp đạm cho cây trồng.. Đ

KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN

ALGINATE, PARAFFIN VÀ LAC

MÔN: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO NGÀY BÁO CÁO: T7 11/05/2013 – P.303 B6

HỌC VIÊN THỰC HIỆN:

1/ BÙI THỊ THU THẢO 12310751 2/ NGUYỄN TẤN ĐỨC 12310726

TỔNG QUAN

Hiện nay, enzyme urease (u-rê-a) được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực quan trọng như:

+ Nông nghiệp: xúc tác quá trình thủy phân urea (u-rê) thành NH3, cung cấp đạm cho cây trồng

+ Môi trường: phân tích hàm lượng các kim loại năng trong chất thải rắn

và trong nước

+ Thực phẩm: dùng để phát hiện sự tồn tại của urea trong thịt, cá, nước giải khát, sản phẩm lên men và các sản phẩm từ sữa

+ Cảm biến sinh học: dùng làm điện cực urease để xác định hàm lượng urea trong dòng liên tục

Để tăng hiệu quả sử dụng enzyme urease, người ta đã nghiên cứu cố định enzyme nhằm:

+ tăng tính bền nhiệt

+ tăng phổ hoạt động trong pH rộng hơn

+ tăng thời gian bảo quản

+ tăng khả năng tái sử dụng

TỔNG QUAN

+ Enzyme urease có tên đầy đủ: carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí carbonic

+ Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không

màu, khối lượng phân tử 420 - 540 kDa

+ Urease là enzyme có cấu trúc protein bậc 4, mỗi phân tử có từ 3 – 4 tâm hoạt động Trong tâm hoạt động có sự hiện diện các liên kết –SH và 2 ion Ni2+ với vai trò tạo liên kết giữa enzyme và cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian, đây chính là một cofactor của urease

Một số liên kết cộng hóa trị giữa urease và chất mang:

+ Titanium (IV) chloride + Silica === Urease

+ Chitosan + glutaraldehyde === Urease

+ Sợi tổng hợp: acrylamide + ethylene terephthalate, hoạt hóa bằng

glutaraldehyde === Urease

+ Polymethylglutamate (PMG) === Urease

TỔNG QUAN

Các loại chất mang được dùng để cố định urease:

+ PVC

+ Cellulose

+ Alginate

+ Vỏ các loại hạt (đậu phộng) hình ảnh tương ứng

+ Paraffin wax (sáp)

+ Lac film: một loại nhựa do côn trùng tiết ra trên cây

Sau khi cố định vào chất mang, người ta khảo sát các chỉ tiêu sau để đánh giá hiệu quả cố định:

+ Hiệu suất cố định (tỷ lệ giữa hoạt tính urease tự do trong dung dịch với urease cố định trên chất mang)

+ Khả năng tái sử dụng

+ Độ ổn định hoạt tính trong thời gian bảo quản

+ Mức độ thay đổi của các hệ số phản ứng xúc tác trước và sau cố định + Độ bền của chất mang sau mỗi lần phản ứng

GIỚI THIỆU NGHIÊN CỨU

+ Bài báo: “Cố định enzyme urease trên alginate, paraffin và lac” - Kespi

pithawala và cộng sự, Ấn Độ, 2009

+ Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát sự thay đổi hoạt tính của urease cố

định trên 3 loại chất mang trên, để tìm ra chất mang phù hợp với urease

Enzyme urease thu nhận từ cây đậu jackbean được cố định lên alginate, paraffin và lac với matrix là vải muslin, so sánh với

enzyme tự do.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các loại vật liệu chính:

+ Enzyme urease thu nhận từ cây đậu Jackbean

+ Cơ chất urea mua từ hãng Loba Chem, Ấn Độ

+ Sodium alginate, thuốc thử Nessler, tris buffer (0,2 M) và những hóa chất khác đều đạt chuẩn phân tích

+ Paraffin wax (sáp), nhiệt độ nóng chảy 58-60oC mua của hãng Ranbaxy

+ Lac thu nhận từ nhựa sâu cánh kiến trên cây bồ kết Albizzia lebbeck,

được tinh sạch và trích ly bằng methanol

Cố định urease vào paraffin và lac đều sử dụng thêm vải cotton (muslin cloth) để làm matrix tăng độ bám.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp cố định urease vào hạt gel calcium alginate:

+ Hòa tan 200 mg sodium alginate với 10 mg urease trong 10 ml nước, trộn đều đến khi dung dịch sánh lại

+ Tạo gel bằng cách nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2% w/v), khuấy nhẹ nhàng hạt gel trong 20 phút, sau đó loại bỏ dung dịch, rửa gel bằng buffer

Phương pháp cố định urease vào màng sáp paraffin:

+ Làm nóng chảy 4 g paraffin wax ở bể ổn nhiệt 65oC, hòa tan 1 g bột enzyme vào hỗn hợp trên, khuấy đều ở tốc độ thấp

+ Vải muslin được rửa sạch bằng nước cất, phơi khô dưới nắng mặt trời, cắt nhỏ thành từ miếng 1 cm2 rồi cho vào dịch sáp paraffin để hấp phụ enzyme vào mạng lưới cotton bên trong

+ Sau 3 đến 5 giây ta dùng kẹp gắp những miếng vải này ra, lắc nhẹ

nhàng để dịch sáp bên ngoài rơi xuống, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng + Như vậy enzyme đã được cố định vào vải với sự kết dính bởi sáp

paraffin

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Lac là gì:

+ Lac là một loại nhựa sinh học được tạo ra bởi những con sâu cánh kiến cái

không di chuyển có tên khoa học Laccifier lacca nhằm bảo vệ chúng khỏi tác

động của điều kiện bất lợi của môi trường xung quanh

+ Con sâu cánh kiến này sống ở nhiều loại cây, trong đó có cây bồ kết

+ Rệp son cánh kiến là một côn trùng rất nhỏ, dài vào khoảng 0,6-0,7mm, rộng 0,3 đến 0,35 mm hình trông giống thuyền nhỏ, trên đầu có 2 râu, miệng có vòi nhỏ để hút nhựa Con cái mới sản xuất ra nhựa cánh kiến (lac), con đực cũng tạo nhựa nhưng tổ nhỏ và mỏng Tổ nhựa của con đực hơi hình thoi, còn tổ nhựa của con cái hình tròn

Thành phần lac:

+ Nhựa 4%: Gồm nhựa mềm tan trong ether (25%) và nhựa cứng không tan trong ether (75%) Nhựa là hỗn hợp các poliester dẫn chất của các acid béo

có nhóm OH và các acid hữu cơ

- Chất màu (2-3%): Gồm các chất đỏ tan trong nước là phức hợp của nhiều loại acid laccaic, chất màu vàng không tan trong nước, erytrolaccin (1, 2, 5,

7 tetrahydroxy-4-methylantraquinon)

- Sáp (6,6%): Trong đó phần tan trong cồn nóng chiếm 80% và phần tan

trong benzen chiếm 20% Các muối, đường (glucose, arabinose, fructose)

- Tạp chất: Xác sâu kiến, đất, cát

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp thu nhận lac:

+ Lac được lấy từ những cành cây bị sâu cánh kiến bám vào, tạo tổ Cắt nhuyễn các cành cây này, nung lên rồi lọc qua vải lấy dịch Hỗn hợp sau đó được hòa tan trong methanol, giữ trong 2 ngày

+ Ly tâm dịch này ở tốc độ cao trong 20 phút để loại cặn Ta lấy phần dịch trong cho vào chén sứ rồi cho bay hơi methanol trong 2 ngày Phần cặn còn lại chính là tinh thể lac được dùng cho thí nghiệm

Phương pháp cố định urease vào lac:

+ Cân 2 g lac hòa tan trong 5 ml methanol Bổ sung 1 g bột urease vào hỗn hợp rồi khuấy đều Cắt vải muslin như ở phần cố định với paraffin, cho vào hỗn hợp để hấp phụ dịch enzyme

+ Để biết lượng enzyme hấp phụ được trong vải muslin tẩm lac này là bao nhiêu thì ta sẽ rửa sạch enzyme trong này ra, đo dịch thu được bằng

phương pháp Lowry với thuốc thử BSA để xác định hàm lượng protein được cố định

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp đo hoạt tính urease tự do:

+ Để đo hoạt tính urease thì ta sẽ đo lượng ammonia tạo thành ở điều kiện

ủ enzyme này với cơ chất trong một khoảng thời gian nhất định Dùng

thuốc thử Nessler để phản ứng màu, đo OD

+ Một đơn vị hoạt tính urease được định nghĩa là 1 mol ammonia tạo thành

trong 1 phút từ 0,1 M urea ở điều kiện tiêu chuẩn

Phương pháp đo hoạt tính urease cố định:

+ Gel alginate: ta cân khoảng 17 hạt cho vào 1 ml dung dịch phosphate

buufer 0,2 M ở pH 7, hỗn hợp này sẽ phản ứng với 1ml dung dịch urea 3%

trong 15 phút Sau đó lấy hạt gel ra, làm lạnh dung dịch rồi cho H2SO4

vào để dừng phản ứng Lúc này đo ammonia trong dung dịch theo phương

pháp như trên

+ Màng paraffin wax và màng lac cũng được làm tương tự như với gel

alginate, nhưng cho phản ứng trong 30 phút Quy trình được lặp lại tương

tự như trên

Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính ổn định của số liệu.

2(2KIHgI2) + NH3 + 3KOH  (NH2)Hg-O-HgI + 7KI + 2H2O

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp khảo sát cách thức bảo quản:

+ Enzyme cố định được giữ ở nhiệt độ phòng Hoạt tính theo dõi trong 1 tháng, so sánh với hoạt tính enzyme cố định ở thời điểm mới tạo thành để xác định hiệu suất hoạt tính xem còn lại bao nhiêu

+ Riêng enzyme cố định trên màng paraffin được khảo sát thêm 3 nghiệm thức là: bảo quản trong buffer, trong nước cất và ở điều kiện khô

+ Enzyme được cố định trong alginate được bảo quản trong dung dịch

CaCl2 do hạt gel ướt sẽ bền hơn hạt gel khô

Phương pháp khảo sát nhiệt độ phản ứng thích hợp:

+ Enzyme tự do và enzyme cố định được ngâm trong phosphate buffer 0,2

M pH 7, và ủ ở nhiệt độ 30 đến 80oC trong 30 phút để xác định hoạt tính

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp xác định các thông số động học:

+ Để xác định các thông số động học, nồng độ cơ chất được thay đổi và giá trị pH tối ưu của enzyme tự do và enzyme cố định được xác định dựa vào sự thay đổi các giá trị pH của dung dịch đệm

+ Hoạt tính tương đối của enzyme ở từng mức pH khác nhau được xác định bằng phản ứng với thuốc thử Nessler như trên Tốc độ phản ứng được đo bằng mmole ammonia sản xuất ra trên một phút trên một mg enzyme

+ Giá trị Kmax và Vmax xác định dựa trên giản đồ Lineweaver-Burke

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

1

2 3

4 5

6

Hoạt tính enzyme thay đổi theo thời gian bảo quản

1: Màng paraffin khô 2: Màng paraffin trong buffer 3: Màng paraffin trong nước cất 4: Enzyme tự do

5: Ca-alginate 6: Lac film

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

2

3

theo số lần tái sử dụng

1: Ca-alginate 2: Màng paraffin khô 3: Lac film

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

2

3 1

Hoạt tính enzyme ở nhiệt độ khác nhau

1: Enzyme tự do 2: Ca-alginate 3: Lac film

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

Hoạt tính enzyme ở pH khác nhau:

1: Enzyme tự do 2: Ca-alginate 3: Paraffin wax 4: Lac film

1 2 3

4

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

1 2 3 4

Tương quan giữa tốc độ giải phóng NH3 và nồng độ cơ chất:

1: Paraffin wax 2: Enzyme tự do 3: Ca-alginate 4: Lac film

KẾT LUẬN

+ Enzyme cố định thể hiện hoạt tính tốt hơn enzyme tự do

+ Sau nhiều lần tái sử dụng, hạt gel alginate chuyển sang màu nâu và dễ bị phân hủy, do đó thời gian bảo quản kém hơn cố định trên paraffin và lac

+ Màng paraffin dạng khô cố định enzyme bảo quản tốt hơn dạng ướt, màng trở nên dẻo hơn và protein ít bị rửa trôi

+ Màng lac có đặc tính cơ học dai hơn màng paraffin, do đó sẽ bền hơn

trong các điều kiện phản ứng

+ Tốc độ phản ứng Kmax với cơ chất ở alginate và lac tỏ ra thấp hơn so với paraffin, trong khi đó paraffin thì thấp hơn so với enzyme tự do Nguyên

nhân là khi cố định trên alginate ta dùng CaCl2 và trên lac ta dùng methanol đã ức chế trong tâm hoạt động của urease Trong khi đó cố định trên paraffin thì trung tâm hoạt động giảm khả năng gắn với cơ chất

Qua đề tài này, ta rút ra được những điều sau:

+ Khảo sát hiệu quả cố định của enzyme và cơ chất cần theo các bước như trên, đi từ cơ chất đến lựa chọn phương pháp cố định

+ Sau khi khảo sát sẽ đánh giá hiệu quả hoạt tính cố định

+ Ghi nhận các giá trị thu được để làm tiền đề cho các thí nghiệm tiếp theo liên quan đến enzyme đó

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN