Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào Escherichia coli được thẩm thấu

Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào Escherichia coli được thẩm thấu GVHD: TS... Chitin và chitosan là chất mang thường được lựa chọn khi cố định enzyme và tế bàot

Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào

Escherichia coli được thẩm thấu

GVHD: TS Huỳnh Ngọc Oanh Học viên: Vũ Hoàng Ý (123106764)

Ngô Thị Diệu Liên (12310736)

GIỚI THIỆU

• Ngày nay, Enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, khó khăn trong việc thu nhận

và tinh sạch, tính nhạy cảm của enzyme với điều kiện sản xuất ,thời gian bán huỷ ngắn, quá trình hồi tính khó khăn và sản phẩm dễ tạp nhiễm với những enzyme tự nhiên là vấn đề cần giải quyết chính trong ngành công nghiệp sử dụng các enzyme nguyên chất Do đó, enzyme thường được sử dụng ở dạng cố định.

• Các thuộc tính của enzyme cố định phụ thuộc vào enzyme và chất mang Chitin và chitosan là chất mang thường được lựa chọn khi cố định enzyme và tế bào(tính ái lực protein, các nhóm chức phản ứng với enzym, ổn định cơ học, dễ xử lý, kinh tế )

GIỚI THIỆU

• Ứng dụng của penicillin G acylase (PGA) trong sản xuất 6-aminopenicillanic acid (6-APA) và

7-aminodeacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA), chất trung gian trong sản xuất kháng sinh β-lactam bán tổng hợp

• Quá trình cố định qua 2 bước:

- Các tế bào E.coli (ATCC 11105) được thẩm thấu bằng

N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide (CTAB) (0.1%, 45 phút, 45rpm)

- Cố định tế bào bằng glutaraldehyde 5% trong dung dịch chitosan 3%

GIỚI THIỆU

• Các tế bào được cố định giúp quá trình chuyển hoá tăng 9%

• Hoạt tính còn 90% sau 20 lần tái sử dụng.

• Mục tiêu nghiên cứu: cố định PGA trong tế bào E.coli được thẩm thấu nhờ liên kết chéo với glutaraldehyde nhằm tối ưu hoá quá trình cố định.

• N-cetyl-N,N,N-trimethyl Bromide (CTAB),

• p-dimethyl amino benzaldehyde (p-DBA)

• Các hoá chất khác

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nuôi cấy tế bào E.coli (ATCC 11105)

• Tế bào E.coli đông khô (được hồi sinh trong môi trường lỏng Muller-Hinton (24 giờ, 37oC)

• Thu hoạch (ly tâm 10000rpm, 4oC, 5 phút) và rửa kỹ bằng đệm phosphate (0.1M, pH 7)

• Tái hoà tan trong đệm phosphat.

• Dịch tế bào được tiêm trong môi trường trung tính đã được tối ưu hoá cho việc sản xuất của PGA.

• Tế bào được phát triển trong bình lắc ở 220 rpm, 24oC, 44 giờ.

• Thu hoạch tế bào (ly tâm 10000rpm, 4oC, 5 phút)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thành phần môi trường trung tính

• Phenylacetic acid (PAA) 0.2%

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Xử lý tế bào với N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide

• 10g tế bào ướt từ giai đoạn trước cho vào dung dịch CTAB với nồng độ từ 0.05-0,25% được chuẩn bị trong đệm phosphate

• Hỗn hợp được khuấy nhẹ nhàng ở nhiệt độ phòng trong 45phút.

• Thu hoạch (ly tâm ở 8000rpm, 4oC, 10 phút)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tạo hạt chitosan

• 10g tế bào thẩm thấu, 10ml dd chitosan 3% cho vào dd acid acetic 3%

• Dùng bơm tiêm tạo hạt trong 2 dung dịch khác nhau:

- Dung dịch NaOH (1M):MeOH

- Dung dịch glutaraldehyde (1-9%)

• Thu hạt và bảo quản trong đệm phosphate sau 1giờ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Khảo nghiệm hoạt động thuỷ phân

• 6-APA được tạo ta từ phản ứng thuỷ phân penicillin G sẽ phản ứng với p-DBA tạo hỗn hợp sinh màu

• Đo màu bằng phương pháp đo quang

• 1 đơn vị hoạt động thuỷ phân (U) là lượng enzyme sinh ra 1µm 6-APA trong 1 phút khi bổ sung dung dịch pennicillin G 2%, pH 7.8

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đặc điểm hình thái hạt

• Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)

• Các hạt đông được khô và phủ một lớp vàng trên bề mặt

Hạt cố định bằng NaOH:MeOH Hạt cố định bằng glutaraldehyde

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tính ổn định hoạt động

• Tính ổn định hoạt động của enzyme cố định và các tế bào được xử lý với CTAB được phân tích bằng cách

đo lường hoạt động trong những mẻ và những điều kiện lên men khác nhau

KẾT QUẢ

Ảnh hưởng của nồng độ CTAB lên thẩm thấu tế bào

Biểu đồ 1: ảnh hưởng của CTAB lên hoạt tính tế bào E.coli

KẾT QUẢ

Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên cố định tế bào.

Biểu đồ 2: ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên tế bào cố định

Lớn hơn, không đồng đều - Đồng đều và trải đều bề mặt

• Kích thước lỗ đồng đều giúp gia tăng quá trình vận chuyển của cơ chất và sản phẩm Kết quả là hoạt động thủy phân penicillin xảy ra nhanh hơn, quá trình chuyển đổi tốt hơn.

KẾT QUẢ

Hoạt động thuỷ phân của những dạng tế bào khác nhau

A Tế bào tự do B Tế bào được xử lý với CTAB

C Tb cố định bằng NaOH:MeOH D Tb cố định bằng glutaldehyde

BÀN LUẬN

• Nồng độ tối ưu của CTAB để thẩm thấu tế bào là 0.1%

Ở nồng độ này, hoạt tính tối ưu: 134U/g tế bào Cao hơn 32g so với tế tự do Điều này có thể do sự hạn chế khuếch tán giảm gây nên do thành tế bào Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu trước đó.

•Glutaraldedyde ảnh hưởng đến sự tối ưu hoá cố định Nồng độ glutaraldehyde tối ưu cho cố định PGA lên chitosan là 5%, hoạt tính là 56U/g, giảm 90g/u so với tế bào tự do Sự giảm có thể do phản ứng không đặc hiệu của glutaraldehyde với các nhóm chức của enzyme, làm thay đổi hình thái và vị trí kết nối của enzyme

BÀN LUẬN

• Tế bào thẩm thấu với CTAB làm tăng chuyển hoá hơn 9% so với tế tự do Điều này có thể do sự hạn chế khuếch tán giảm bởi thành tế bào Độ xốp của hạt, trọng lượng phân tử của cơ chất cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.

• Hoạt động tối ưu của chất xúc tác không cố định và cố định với glutaraldehyde tương ứng là 14 U/g

và 44 U/g Có thể cho thấy ảnh hưởng của glutaraldehyde trong quá trình cố định.

BÀN LUẬN

• Xu hướng của dòng chuyển hoá: hoạt tính của tế bào cố định bằng glutaraldehyde tuyến tính hơn so với những tế bào khác Điều này giúp ta có thể dự đoán thời điểm kết thúc của phản ứng chính xác hơn.

• Hoat tính của tế bào cố định được xử lý với CTAB bên trong các hạt polyacrylamide cao hơn khoảng 30% so với tế bào không được xử lý Có thể các tế bào thẩm thấu có hạn chế khuếch tán thấp hơn

KẾT LUẬN

• Các tác giả đã thành công quá trình thẩm thấu tế bào E coli bằng CTAB, cố định trong chitosan bằng tác nhân liên kết glutaraldehyde, tối ưu hoá nồng độ của CTAB và glutaraldehyde, tối ưu hoá các dạng quy trình xử lý hạt.

• Kết quả cho ta thấy phương pháp này có tiềm năng được ứng dụng trong công nghiệp.

• Ngoài ra, việc áp dụng phương pháp lên men liên tục có thể loại bỏ sự ức chế sản phẩm, làm tăng hoạt tính của chất xúc tác sinh học và tỉ lệ phản ứng.

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN