Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào chương 3 ths nguyễn thành luân

Các dạng hệ thống cơ bản Theo cấu tạo thiết bị: • Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy Stirred Tank và nuôi cấy hình ống Plug Flow • Hệ thống nuôi cấy lắng ly tâm Segregated Reactor • Nuôi cấ

Chương III

HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ

BÀO VI SINH VẬT

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CNSH & KTMT

BÀI GIẢNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO

GV: Nguyễn Thành Luân

luannt@cntp.edu.vn

Hệ thống nuôi cấy TB VSV

Bể phản ứng sinh học (bioreactor) hay

còn gọi là hệ thống lên men (fermenter

system) là loại thiết bị chủ yếu sử dụng

trong nuôi cấy tế bào VSV

Sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi

các tế bào sống hoặc các thành phần tế

bào in vivo (enzyme)

• Trong phòng thí nghiệm, các tế bào

thường được nuôi cấy trong các bình tam

giác trên máy lắc ổn nhiệt (thermal shaker)

hoặc chế tạo ra các hệ thống khác nhau

dựa trên các dụng cụ hiện có

• Dựa trên đòi hỏi của mô hình/hệ thống

nuôi cấy tế bào VSV: điều kiện môi trường,

tốc độ nuôi cấy & thời gian nuôi cấy

Các dạng hệ thống cơ bản

Theo cấu tạo thiết bị:

• Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (Stirred

Tank) và nuôi cấy hình ống (Plug Flow)

• Hệ thống nuôi cấy lắng ly tâm

(Segregated Reactor)

• Nuôi cấy đồng nhất (homogenous

reactor) và không đồng nhất

(heterogenous reactor)

Phân loại hệ thống nuôi cấy

• Theo mô hình

– Nuôi cấy mẻ (batch culture), mẻ bổ sung cơ

chất (fed-batch culture) & liên tục (continuous

culture)

– Nuôi cấy dạng cột (spin column culture) & nuôi

cấy dạng vòng (loop culture)

– Nuôi cấy cân bằng phản ứng tế bào

– Nuôi cấy mô & nuôi cấy tế bào một lần

– Nuôi cấy bổ trợ TB (Cell support system)

– Bể phản ứng nuôi cấy tế bào (Cell bioreactors)

Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy

Là 1 dạng lên men liên tục trong nuôi cấy tế bào

Đối với hoạt động sản xuất ở quy mô lớn, thì

hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (stirred-tank fermenter, STF) được

sử dụng rộng rãi nhất

để thiết kế cho quá trình nuôi cấy quy mô công

Điều kiện vận hành hệ thống

• Cường độ pha trộn (mixing intensity) có

thể rất khác nhau bằng cách chọn loại

cánh khuấy (impeller) thích hợp và các

tốc độ khuấy khác nhau

• Nó có thể được dùng cho cả hai trường

hợp lên men hiếu khí (aerobic) và yếm

khí (anaerobic) trong một phạm vi rộng

các loại tế bào khác nhau bao gồm vi

sinh vật, động vật và thực vật,…

Ƣu điểm của hệ thống

• Là một trong những hệ thống lên men

quy mô lớn đầu tiên được phát triển trong

công nghiệp dược, bia, rượu…

• Do hệ lên men thùng khuấy thường được

làm bằng thép không rỉ và hoạt động

trong điều kiện ôn hòa nên tuổi thọ của

thiết bị rất lâu

Nhƣợc điểm của hệ thống

• Bộ phận (cánh) khuấy tiêu thụ một lượng lớn công

suất và có thể gây nguy hiểm cho những hệ thống

nuôi cấy tế bào mẫn cảm với lực trượt (shear

force) như tế bào động vật có vú hoặc tế bào thực

vật  khả dụng cho nuôi cấy VSV

• Lực trượt của chất lỏng trong hỗn hợp được tạo ra

bởi gradient tốc độ của các thành phần tốc độ cao

do khi chất lỏng rời khỏi vùng trung tâm, thì tốc độ

của nó ở vị trí trên và dưới cánh khuấy (có khoảng

cách bằng chiều rộng cánh khuấy) sẽ giảm

• Khi tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy trên đường

kính của nó tăng thì cấu hình tốc độ ít có

dạng đặc trưng của parabol mà trở nên tù

hơn và nó tạo ra lực trượt ít hơn do

gradient tốc độ lớn dần lên

 Hạn chế trong việc có thể ứng dụng thành

công hệ thống lên men thùng khuấy trong

nuôi cấy tế bào động vật hoặc tế bào thực

vật

Hệ lên men dòng nút (plug-flow

fermenter, PFF)

• Còn được gọi là hệ lên men mẻ (batch

fermenter) hệ lên men lý tưởng có khả

năng pha trộn tốt sao cho các thành phần

đồng nhất trong một kết cấu ở mọi thời

điểm

• Chất dinh dưỡng (cơ chất) và tế bào đi vào

một đầu của ống hình trụ và tế bào sẽ sinh

trưởng trong khi chúng đi qua ống này

Hệ lên men dòng nút (plug-flow

fermenter, PFF)

• Nuôi cấy theo đường ống dài và thiếu bộ

phận khuấy nên đã ngăn cản sự pha trộn

hoàn toàn của chất lỏng  tế bào thay đổi

dựa trên tính chất của chiều dòng chảy

• Một hệ lên men dòng ống mà không có

những biến thiên hướng tâm thì được gọi

là hệ lên men dòng nút (PFF)

Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture)

• Đơn giản & sử dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine quy mô công nghiệp & các sản phẩm rRNA protein

• Cho phép sinh trưởng

& sản sinh tế bào trong 1 bình chứa kín

HỆ THỐNG NUÔI CẤY MẺ

Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture)

• Hạn chế về môi trường (do cung cấp 1

lần) nên khi không còn cơ chất, TB dừng

phát triển và chết  dễ thoái hóa TB

trong hệ thống

• Nếu muốn tiếp tục nuôi cấy, phải tạo môi

trường phụ bổ sung bằng việc thêm các

tế bào trong môi trường nuôi cấy cũ vào

trong môi trường dinh dưỡng mới ban

đầu (tăng sinh)

Nuôi cấy mẻ (batch culture)

• Tốc độ khởi đầu của phản ứng xúc tác tự

động chậm do nồng độ của cơ chất ban

đầu thấp

• Tốc độ phản ứng tăng lên khi các tế bào

sinh sản và sau đó sẽ đạt đến tốc độ tối

đa

• Khi lượng cơ chất giảm và các sản phẩm

độc được tích lũy, thì tốc độ phản ứng

giảm xuống ở giá trị thấp hơn

Cách lắp đặt hệ thống mẻ trong

quy mô phòng thí nghiệm nhỏ

Nguyên liệu:

• 250 mL Erlenmeyer flask

• Vải mùng /miếng gạt y tế vừa với 1 Pasteur pipette

• Không khí được bơm vào trong môi trường duy trì nồng độ CO2 và O2

• Kéo, bông mỡ (cotton)

• Bước 1: Cắt 2 lớp

của bông mỡ (10 X

10 cm) và đặt vào

giữa miếng vải

mùng đã được

chuẩn bị

• Bước 2: Gấp các

góc của miếng vải

mùng lại thành 1

khối tròn cho cả 4

góc

• Bước 3: Lấy 1 đầu

nhọn của cây kéo và

khoan 1 lỗ nhỏ cho

Pasteur pipette

• Cho Pasteur pipette

đâm xuyên qua lỗ và

cố định trên miệng

của bình Erlenmayer

• Thêm môi trường và

tế bào nuôi cấy vào bình, cho không khí đi vào bình thông qua 1 máy sục khí

• Đặt môi trường nuôi cấy ra ngoài ánh sáng/dưới ánh đèn nếu nuôi cấy VSV tự dưỡng

Các pha tăng trưởng của hệ thống

Các pha Sự tăng trưởng Mật độ tế bào Đặc điểm

1 lag zero Thích nghi cơ học của các tế bào với

sự thay đội diều kiện sống

2 Gia tốc Gia tăng Không đáng kể

3 Pha log

(exponential)

Tăng liên tục Gia tăng mật độ thay đổi môi trường

của tế bào

4 Chậm phát triển TB Giảm sút nhanh Tác dụng của những điều kiện thay

đổi xuất hiện

5 Ổn định zero 1 hay nhiều thành phần dinh dưỡng

(hoặc ánh sáng) bị cạn kiệt đến mức nguy hại cho sự phát triển của tế bào

6 Suy vong Tiêu cực (độc tố) Quãng thời gian của pha ổn định và

sự giảm sút các tỷ lệ tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào cấu tạo của tế bào VSV

Hệ thống nuôi cấy liên tục

(Continuous culture system)

Môi trường nuôi cấy được chứa đựng trong 1 bể chứa lớn

Không khí được thổi vào khu vực rỗng trong bình chứa Áp lực không khí sẽ đẩy môi trường đi qua đường ống kết nối với môi trường chứa tế bào nuôi cấy

Bằng việc đóng mở khóa trên đường ống môi trường,

có thể kiểm soát việc thêm

Hệ thống nuôi cấy liên tục

(Continuous culture system)

Sơ đồ hệ thống nuôi cấy liên tục

Hệ thống nuôi cấy liên tục

(Continuous culture system)

• Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng rộng rãi cho

cả mục đích sản xuất công nghiệp & nghiên cứu (theo

Kubitschek 1970; Tempest 1970; Veldkamp 1976,

1977; Rhee 1980; Munawar và cộng sự, 1989)

• Được nghiên cứu nhiều trong các nghiên cứu VSV

hoặc các phương pháp VSV môi trường như tảo,

nấm, VK kỵ khí gây độc cho môi trường

(ecotoxicology theo Rhee 1980, 1989)

• Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng từ nghiên

cứu của Novik and Szilard (1950) với sự phát triển hệ

thống “chemostat”, và Monod (1950) người đặt tên hệ

thống nuôi cấy là 1 “bactogen”

Lắp đặt hệ thống nuôi cấy liên

tục trong phòng thí nghiệm

• Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong 1 bể chứa khoảng 6-7 lít môi trường

• Thêm vào 500mL sau

đó cứ thêm 100 mL môi trường nuôi cấy mỗi ngày đảm bảo tỷ lệ pha loãng 20% và thể tích đạt được là 6-7 lít trong 2 tuần

Hệ thống nuôi cấy liên tục

(Continuous culture system)

• Fogg and Thake (1987) làm rõ ràng hệ thống nuôi cấy

liên tục “turbidostat” và “chemostat”

• Trong hệ thống “turbidostat”, môi trường dinh dưỡng

chỉ được thêm vào khi số lượng tế bào đạt ngưỡng kỳ

vọng khi được đo lường qua mật độ quang (OD) của

tế bào Tại điểm này, môi trường sẽ bắt đầu thêm vào

và tế bào đạt sẽ được thu nhận Nếu quá số lượng

cho phép, sẽ tiến hành pha loãng và lặp lai từ đầu

• Trong hệ thống chemostat, môi trường được duy trì ở

1 tỷ lệ nhất định kiểm soát hoàn toàn tỷ lệ sinh trưởng

và độ phân bố tế bào

Phân biệt Chemostat vs Turbidostat

Turbidostat vs Chemostat

PP kiểm tra tốc độ sinh

Tỷ lệ sinh trưởng của tế

bào Bằng hoặc gần đạt µ max Từ 0 – gần đạt µ max

Tác dụng của việc gia

tăng nồng độ của các

chất dinh dưỡng trong

bể nuôi cấy

Chỉ gia tăng cơ chất phản ứng khi có sự thay đổi của máy đo cường độ ánh sáng (photometer)

Gia tăng trong điều kiện gia tăng nồng độ cơ chất

Thời gian nuôi cấy Không xác định Không xác định

Các loại đột biến được Biến đổi µ max và các dạng Các biến đổi µpha loãng cao, các đột max tại tỷ lệ

Turbidostat vs Chemostat

• Trong chemostat, tốc độ dòng chảy được

cài đặt ở một giá trị đặc biệt và tốc độ sinh

trưởng của nuôi cấy sẽ điều chỉnh tốc độ

dòng chảy này

• Hoạt động chemostat dễ dàng hơn

turbidostat, do nó có thể được thực hiện

bằng cách đặt máy bơm ở một tốc độ dòng

chảy không đổi

Turbidostat vs Chemostat

• Turbidostat đòi hỏi một thiết bị cảm quang

(optical sensing device) và một bộ điều

chỉnh (controller)

• Turbidostat chỉ thực hiện được với các tế

bào có khả năng hấp thụ ánh sáng như

tảo, TB thực vật, VSV quang dưỡng

(photocells)

Batch vs continuous culture

• Trong nuôi cấy liên tục, dinh dưỡng được

cung cấp đến tế bào theo 1 tỷ lệ nhất định

không đổi và theo 1 thể tích nhất định,

lượng tế bào cũng tương đương (Số lượng

TB nuôi cấy đạt được pha ổn định ở cả tế

bào nuôi cấy đi vào và đi ra)  ổn định

• Nuôi cấy mẻ tạo ra sinh khối nhiều & thời

gian sử dụng cơ chất nhanh nhưng dễ bị

thay đổi cơ chất (do VSV sử dụng & biến

đổi theo từng pha)

Batch vs continuous culture

• Nuôi cấy liên tục đáp ứng được nhu cầu

dinh dưỡng của TB nhưng khó thay đổi

cơ chất và VSV (in vivo)  phức tạp

• Nuôi cấy mẻ đòi hỏi việc đáp ứng nhu

cầu sinh trưởng của TB nhưng dễ dàng

chuyển qua cơ chất khác (in vitro)  đơn

giản hơn

Batch vs continuous culture

• Hầu hết các hệ lên men sản xuất là một hệ

thống nuôi cấy liên tục (cánh khuấy) hoạt

động với nồng độ tế bào mà ở đó giá trị của

là tối thiểu do nó đòi hỏi thời gian lưu ngắn

nhất

• Nếu nồng độ cuối cùng của tế bào được

hướng tới ở trong pha tĩnh, thì hệ lên men

mẻ là chọn lựa tốt hơn nuôi cấy cánh khuấy

(liên tục - CSTF), vì thời gian lưu cần thiết

cho nuôi cấy mẻ là ngắn hơn của CSTF

Các hệ thống nuôi cấy khác

Mục đích

• Nhằm để cải thiện hoặc nhược điểm của

hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (tiêu thụ

công suất lớn) hoặc các yêu cầu đặc biệt

của một quá trình nuôi cấy nhất định

– Sục khí tốt hơn,

– Chuyển nhiệt hiệu quả,

– Tách hoặc giữ lại tế bào,

– Bất động tế bào,

– Giảm bớt thiết bị và giá thành của sản phẩm,

– Không được thiết kế cho quy mô lớn

Hệ thống nuôi cấy dạng cột

Các hệ lên men cột: (a) cột bong bóng (bubble column), (b) cột hình nón

(tapered column), (c) cột bong bóng có khay sàng lọc (sieve-tray bubble

column), (d) cột bong bóng có khay sàng lọc với bơm ở bên ngoài, (e) cột

nhồi (packed-bed) với bơm ở bên ngoài

Hệ lên men cột bong bóng

• Hệ lên men đơn giản nhất là hệ lên men

cột bong bóng (còn gọi là hệ lên men

tháp-tower fermenter), thường bao gồm

một bình trụ dài, có bộ phận phun khí ở

dưới đáy

• Tuy nhiên, hệ lên men cột bong bóng

thường bị hạn chế ở trường hợp lên men

hiếu khí và việc tăng các bong bóng

không thể cung cấp một sự pha trộn đầy

đủ cho sự sinh trưởng tối ưu

Hệ lên men chóp và có khay sàng lọc

• Hệ lên men cột hình chóp ngược có thể duy

trì lưu tốc không khí cao trên một đơn vị

diện tích ở phần thấp hơn của hệ lên men

mà ở đó có nồng độ tế bào cao

• Một vài khay sàng lọc có thể được cài đặt

trong cột để tăng hiệu quả tiếp xúc khí-chất

lỏng và phá vỡ sự kết khối của bong bóng

khí (hệ lên men có khay sàng lọc)

Hệ lên men cột nhồi

• Để tăng cường sự pha trộn mà không có

các phần chuyển động bên trong

• Dịch lên men (môi trường) có thể được

bơm ra ngoài và quay vòng (tuần hoàn)

bằng cách dùng một bơm chất lỏng ở bên

ngoài

Hệ thống nuôi cấy dạng vòng

Hệ thống nuôi cấy dạng vòng

• Hệ lên men vòng là hệ lên men thùng (tank

fermenter) hoặc cột (column fermenter) có

vòng lưu thông chất lỏng,

• Nó có thể là một ống thông gió ở giữa

hoặc là một cái vòng ở bên ngoài

• Tùy thuộc vào sự lưu thông chất lỏng

được tạo ra như thế nào, được phân loại

thành ba kiểu: lực đẩy không khí (air-lift),

vòng khuấy (stirred loop) và vòi phun (jet

loop)

Hệ lên men áp lực chu kỳ ICI

• Thuộc Imperial Chemical Industries Ltd.,

England

• Là một hệ lên men dùng lực đẩy không

khí với một vòng bên ngoài (outer loop)

được phát triển cho lên men hiếu khí đòi

hỏi có sự chuyển nhiệt

• Môi trường và không khí được đưa vào

trong các phần cao hơn và thấp hơn

Vai trò của việc bơm không khí

• Cung cấp oxygen cần thiết cho sự sinh

trưởng của tế bào

• Tạo ra sự lưu thông tự nhiên của chất

lỏng trong hệ lên men thông qua một cái

vòng Bộ phận trao đổi nhiệt để làm lạnh

môi trường lỏng được cài đặt vào trong

cái vòng đó

• Hệ lên men này đã được chứng minh là

tạo ra một tốc độ hấp thụ oxygen cao trên

một đơn vị thể tích

Ƣu & nhƣợc điểm của hệ

thống nuôi cấy cơ bản

Fed-batch culture

Fed-batch culture

 Hệ thống nuôi cấy mẻ bổ sung cơ chất

là quá trình công nghệ hóa hệ thống nuôi cấy mẻ bằng việc bổ sung cơ chất dinh dưỡng để kiểm soát sinh trưởng VSV

 Sử dụng trong bể phản ứng sinh học nhằm thu nhận lượng tế bào với mật độ cao

 Hầu hết dung dịch bổ sung (feed solution) là đậm đặc nhằm hạn chế việc pha loãng nhiều lần trong bể phản ứng sinh học

 Kiểm soát việc thêm các cơ chất trực tiếp ảnh hưởng đến tỷ lệ sinh trưởng của VSV và hạn chế việc trao đổi cơ chất tràn lan

 VD: Bổ sung acetate cho nuôi cấy

Escherichia coli, lactic acid cho Lactobacillus, ethanol cho

Hệ thống nuôi cấy dạng túi

(Bag system)

Hệ thống nuôi cấy chai xoay

(Roller bottle system)

Các dạng bể phản ứng sinh học

• Cánh khuấy đơn giản (Simple Stirred

Tank Bioreactor)

• Airlift Bioreactor (Vận chuyển khí)

• Membrane Stirred Tank Bioreactor (cánh

khuấy màng lọc)

• Spin Filter Stirred Tank Bioreactor (cánh

khuấy cột lọc)

• Vibromixer (máy trộn bằng gây chấn

động)

• Fluidized Bed Bioreactor (Thảm lỏng)

Các dạng bể phản ứng sinh học

• Hollow fiber bioreactor

• Multiple membrane plate bioreactor

KẾT THÚC CHƯƠNG III

Tài liệu tham khảo

• Asenjo JA and Merchuk JC 1995 Bioreactor System Design

Marcel Dekker, Inc New York, USA

• Atkinson B and Mavituna F 1991 Biochemical Engineering and

Biotechnology Handbook 2nd ed Stockton Press, New York,

USA

• Flickinger MC and Drew SW 1999 Encyclopedia of Bioprocess

Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation John

Wiley & Sons, New York, USA

• Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA

• Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic

Concepts 2nd ed Prentice Hall, Inc NJ, USA

• Vogel HC and Todaro CL 1997 Fermentation and Biochemical

Engineering Handbook (Principles, Process Design, and