Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào chương 2 ths nguyễn thành luân

Chương II CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CƠ BẢN Bài giảng Môn học CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Khoa CNSH & KTMT Nội dung cơ bản • Xác định sự sinh trưởng tế bào VSV • Các phươn

Chương II CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI

CẤY TẾ BÀO CƠ BẢN

Bài giảng Môn học

CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO

Khoa CNSH & KTMT

Nội dung cơ bản

• Xác định sự sinh trưởng tế bào VSV

• Các phương pháp nuôi cấy tế bào VSV

• Các thiết bị nuôi cấy cơ bản VSV

Mục đích xác định sinh

trưởng của tế bào

“Mọi sự sinh trưởng đều có thể được định

nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần

hóa học Tăng đơn thuần khối lượng không

thể phản ánh đầy đủ sự sinh trưởng, do tế

bào có thể chỉ tăng hàm lượng các sản phẩm

dự trữ của chúng như là glycogen,

poly-β-2

Mục đích xác định quá trình

sinh trưởng/nuôi cấy tế bào

• Khảo sát quá trình sinh trưởng kết hợp với

sự nhân đôi sinh khối cùng với các đặc tính

xác định khác của sinh vật/ quần thể như:

protein, DNA, RNA và nước nội bào

• Mặt khác, quá trình nuôi cấy nhằm cân bằng

& duy trì một thành phần hóa học không đổi

• Môi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau đó

tế bào thích nghi thì nó sẽ ở trong trạng thái

sinh trưởng tối ưu

• Chọn lọc và xác định số lượng tế bào, sinh

khối tế bào hoặc hoạt tính tế bào

Phương pháp đếm trực tiếp

• Haemocytometer:

Buồng đếm tế bào máu dùng cho những tế bào

có đường kính ≥ 3 μm

• Petroff-Hausser counting chamber:

Buồng đếm Petroff-Hausser được dùng chủ yếu cho vi khuẩn

và phân tích mẫu tinh

trùng

Phương pháp đếm khuẩn lạc

• Các tế bào phát triển là tế bào có thể phân

chia và tạo ra khuẩn lạc Phương pháp này

cho phép đếm các tế bào phát triển trên đĩa

nuôi cấy

• Phương pháp đếm trên đĩa petri:

– Phương pháp đĩa trải/hộp trải (spread plate)

– Phương pháp đĩa rót/hộp đổ (pour plate)

PP hộp trải (Spreading plate)

Sinh khối sinh vật được

phát triển trong môi

trường canh (lỏng) và

sử dụng một thể tích

nhỏ hơn 100 - 200 μL

được trải khắp bề mặt

agar

Phương pháp hộp trải

• Kỹ thuật hộp trải (Sự phân

tán tế bào dựa trên kỹ thuật

của Drigalsky) là 1 phương

pháp hoàn thiện hơn với

các ứng dụng rộng rãi trong

thực tập VSV trong các

phòng TN

• Rất nhiều kỹ thuật sử dụng

để xác định số lượng VK

trong 1 mẫu nghiên cứu

Phương pháp hộp đổ

(Pouring plate)

• Mẫu vật được trộn với

agar nóng chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC)

và được rót trên đĩa vô trùng

4

Dựa trên PP pha loãng nồng độ của R.Koch, các khuẩn

lạc được cố định trên đĩa petri sạch chưa có môi trường,

sau đó đổ môi trường có chứa agar đun nóng và làm

lạnh ở khoảng 45-55 độ C

So sánh các phương pháp

Streaking plate (PP Cấy ria)

Ƣu điểm

• Có khả năng phân lập hàng triệu TB trên bề

mặt

• Những nhóm TB đơn lẻ phát triển dính vào

nhau với những tế bào khác

• Các khuẩn lạc phân lập riêng biệt

• Không lẫn lộn vào các khuẩn lạc khác

• Tạo dòng những nhóm tế bào VK đơn trong

môi trường vô trùng

Ƣu điểm

• Chỉ cần các thiết bị tối thiểu

• Các kết quả thu được nhanh

• Có thể quan sát các đặc điểm hình thái

của cơ thể

6

Nhược điểm

• Thường rất khó phân biệt các tế bào chết

và tế bào sống

• Không thích hợp cho các dịch huyền phù có

mật độ thấp

• Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó

quan sát dưới kính hiển vi và có thể không

thấy khi đếm

• Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và

nhầm lẫn trong quá trình đếm

• Không thích hợp đối với các tế bào xếp

thành cụm như là mycelium (thể sợi nấm)

Phương pháp xác định tế bào

bằng máy đếm

• Ưu điểm

– Tránh sự đơn điệu khi đếm trực tiếp bằng kính

hiển vi

– Kỹ thuật này cho phép không chỉ đếm được số

lượng tế bào, mà còn đo cả kích thước tế bào

• Nhược điểm:

– Không thể phân biệt giữa tế bào và các phần tử

bẩn khác

– khó sử dụng với các cơ thể dạng chuỗi

– Không đem lại kết quả tốt với các cơ thể dạng hệ

sợi (ví dụ như nấm)

Máy đếm & chụp hình khuẩn lạc

(Colony counter)

Phương pháp xác định sinh khối

tế bào

• Các phương pháp trực tiếp

– Trọng lượng khô của tế bào

– Độ đục của dịch huyền phù tế bào

• Các phương pháp gián tiếp

– Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng

– Tạo thành các sản phẩm

– Các thành phần tế bào

– Giải phóng nhiệt

– Độ nhớt

Nguồn Carbon + nguồn Nitrogen + Phosphate + O2→ Sinh khối tế bào

+ CO2+ H2O + Sản phẩm + Nhiệt

Các phương pháp bất động tế bào

Phương pháp gắn bề mặt

(Microcarriers)

8

Microcarriers

• Vi thể mang (microcarrier) được xem là hỗn

hợp hỗ trợ cho sự phát triển các tế bào đính

trong bể phản ứng sinh học (bioreactor)

• Là các hạt hình cầu có kích thước

125-250µm và độ đậm đặc của chúng nhằm để

duy trì trong các môi trường khuấy canh lỏng

nhẹ

• Gia tăng mật độ các tế bào đính protein hay

tăng sinh các TB virus trong mô hình sản xuất

công nghiệp (CNSH protein) hay vaccine

• Phương pháp nuôi cấy tế bào vi thể mang được thực

hiện trong 1 bình xoay (spinner flask), mặc dù các

loại thùng/bình khác như bể phản ứng sinh học (bể vi

trọng lực hay bể dịch đệm) cũng có thể dùng cho

nuôi cấy vi thể mang

• Ưu điểm: trong công nghiệp sản xuất vaccine

– Dễ dàng so sánh, đo đạc số liệu

– Điều khiển các điều kiện phát triển TB trong bể phản ứng

sinh học phức tạp, điều khiển bằng máy tính

– Sự biến đổi tổng số TB trong khu vực tầng và thể tích ủ đòi

hỏi bắt buộc cho 1 quy trình vận hành sản xuất

– Biến đổi mạnh mẽ số lượng TB trong quy mô phòng TN kỹ

thuật

• Các loại Vi thể mang (microcarrier) trên thị

trường

– Vi thể mang dextran (Cytodex, GE Healthcare)

– Vi thể mang collagen (Cultispher, Percell)

– Vi thể mang polystyrene (SoloHill Engineering)

 Khác nhau ở tính xốp, trọng lực đặc hiệu, cấu hình

tối ưu, sự hiện diện của các thành phần động vật &

hóa chất bề mặt…

Phương pháp tạo thể xốp (Porous Glass)

Thể xốp thủy tinh chứa khoảng 96% silica

Các màng dạng sợi rỗng tạo thành một cấu trúc hình ống thường được sắp hàng như là các

bó sợi song song bên trong một buồng hình trụ

Các tế bào được giữ lại trên thành của các sợi rỗng trong khi môi trường dinh dưỡng được thông khí luân chuyển quanh các sợi

Loại màng này có thể cung cấp thêm sự bảo vệ chống nhiễm bẩn môi trường

Các thể xốp thủy tinh thương mại trên thị trường VYCOR-Glass (PVG) &

Controlled Pore Glass (CPG)

Phương pháp tạo thể xốp

• Thủy tinh xốp (Porous glasses) có thể thu

nhận được qua việc tách chiết acid của thể

thủy tinh Borosilica gel kiềm tách pha

• Sản xuất 1 thể thủy tinh xốp với 1 kích cỡ xốp

kích cỡ khoảng 0.4-1000nm trong độ phân bố

xốp

• Có thể tạo ra các loại nấm mốc khác nhau,

các phân mảnh TB khác nhau, các màng tế

bào siêu mỏng, các tuýp và nhẫn

• Trong CNSH, thủy tinh xốp có lợi thế trong

việc tinh sạch DNA và cố định enzyme hoặc

VSV

• Rất phù hợp cho sự tổng hợp các

oligonucleotide

• Các nucleotide khởi đầu được tập hợp ở phía

trong bề mặt Chiều dài của chuỗi

oligonucleotide được quyết định bởi kích cỡ

10

Phương pháp bao vi thể

(Ethylcellulose)

Ethyl cellulose

• Ethyl cellulose có nguồn gốc từ cellulose

chứa nhiều nhóm glucose bị chuyển hóa

nhóm hydroxyl thành nhóm ethyl ether Số

lượng ethyl ether tùy thuộc vào nhà sản xuất

• Sản xuất chủ yếu dạng màng bao mỏng

• Sử dụng như là chất gia vị thức ăn như chất

bổ trợ chuyển đổi

Ưu & nhược điểm

• Ưu điểm của kỹ thuật bao vi thể

– là tạo một diện tích bề mặt lớn cho sự tiếp xúc của

cơ chất và tế bào

– Màng bán thấm chỉ cho đi qua một cách chọn lọc

những thành phần có trọng lượng phân tử thấp

• Nhược điểm chính của hệ thống màng là

– Giá thành cao,

– Sự tắc nghẽn của màng đã làm trở ngại cho việc

chuyển khối

– Khó khăn trong việc thông khí

Phương pháp bao vi thể

(Emulsion)

Phương pháp bao vi thể

(Emulsion)

• Phương pháp tạo thể nhủ (Emulsion) được

sử dụng ở cả 2 pha là: phân tán & liên tục ở

dạng lỏng

• Ví dụ: ứng dụng PP này có thể thấy include

nước trộn dầu giấm, sữa, mayonnaise, và 1

số loại thể lưu cần loại bỏ cho các công việc

hàn kim loại (vàng, bạc…) cũng như ứng

dụng các chất keo (colloid) trong phim chụp

ảnh

Phương pháp tự kết khối

• Các tế bào tự kết khối hoặc kết thành cụm

như len cũng có thể được xem như là các tế

bào được bất động

– Do kích thước lớn của chúng

– Ưu điểm tương tự như sự bất động bằng các

phương pháp khác

– Ví dụ: nấm mốc sẽ tạo ra các tiểu thể tự nhiên, thì

các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men lại cần đến sự

kết cụm

12

Phương pháp nuôi cấy theo

điều kiện chọn lọc

• Hóa học: thành phần hóa học, cơ

chất,…

• Vật lý: pH, nhiệt độ, …

• Sinh học: các tác nhân sinh học như

VK tương tác, virus, enzyme,…

Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí & kỵ khí

Nuôi cấy hiếu khí: có O2 và đa số là tự

động hóa các thiết bị nuôi cấy

Nguyên lí hoạt động:

Dựa trên khả năng sống, sinh sản của vi sinh vật trong những điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, khí oxi cung cấp, về

pH môi trường, về tốc độ khuấy

Tất cả các yếu tố này đều được điều khiển PID, trên cơ

sở đó có thể điều khiển môi trường sống của vi sinh vật thích hợp

Hệ thống nuôi cấy vi sinh tự động (Bioengineering, Thụy Sĩ)

Nuôi cấy kỵ khí

Thiết bị nuôi cấy kỵ khí : tạo điều kiện môi

trường không có O 2

Tài liệu tham khảo

• Review of Medical Microbiology /E Jawetz, J

Melnick, E A Adelberg/ Lange Medical Publication,

Los Altos, California, 2002 – P.46-87

• Medical Microbiology and Immunology:

Examination and Board Rewiew /W Levinson, E

Jawetz.– 2003.– P.14-16

• Handbook on Microbiology Laboratory diagnosis of

Infectious Disease/ Ed by Yu.S Krivoshein, 1989,

P 29-74

• Essentials of Medical Microbiology / W.A Volk at

al., – Lippincott-Raven, Philadelphia-New-York

KẾT THÚC CHƯƠNG II

THANK YOU!