Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà muscadomestica trong vi khuẩn escherichia coli

Để khắc phục những tồn tại của thuốc diệt ruồi hóa học và các phương pháp diệt ruồi truyền thống, chúng ta cần tạo ra những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng tiêu diệt hiệu quả mầm bệnh,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

LUẬN VĂN CAO HỌC

Mã số chuyên ngành: 60420103

Đề tài:

Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca

domestica trong vi khuẩn Escherichia coli

Học viên: Đặng Văn Tiến

Lớp: CHST _ K15

Hướng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính

Hà Nội, 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis 3

1.1.2 Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam 4

1.1.3 Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt 5

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái 6

1.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 7

1.1.4 Đặc điểm phân loại 7

1.1.5 Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis .11

1.1.6 Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng .15

2 17

1.3 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 18

1.3.1 Phân loại khoa học của ruồi nhà (Musca domestica) .19

1.3.2 Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica) 19

1.3.3 Ảnh hưởng của ruồi đối với sức khỏe cộng đồng .21

1.3.4 Một số phương pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay .22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Sinh phẩm .24

2.1.2 Hóa chất và thiết bị .24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.1 Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn

dịch 27

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học .27

2.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn .29

2.2.4 Phương pháp tinh sạch plasmid của E coli .30

2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A .30

2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose .30

2.2.7 Phương pháp tách dòng gen cry2 .31

2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng .32

2.2.9 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % 32

2.2.10 Phương pháp biểu hiện gen 34

2.2.11 Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện 34

2.2.12 Xác định khả năng hoà tan của protein 35

2.2.13 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin 35

CHƯƠNG 3: ẢO LUẬN 37

Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37

3.2 Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis 38

Musca domestica của các chủng Bt phân lập được 40

3.4 Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR 42

đọc trình tự gen cry2A 43

2A .43

2A .45

3.6 Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E coli BL21 (DE3) 48

3.6.1.Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry2A 48

3.6.2 Gắn đoạn gen cry2A vào vector biểu hiện pET22b(+) 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3.6.3 Tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen cry2A 50

3.6.3.2 Kiểm tra sự tồn tại của cry2A trong plasmid tái tổ hợp 50

3.6.4 Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong E coli BL21 54

3.7 Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 61

62

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

9 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

17 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A

Bảng 3.1: Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bt

Bảng 3.2: Kết quả phân loại dưới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng

phương pháp huyết thanh

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore)

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc chung của một protein tinh thể độc tố Cry

Hình 1.5 Ruồi nhà (Con ruồi đực - Bên trái; Con ruồi cái - bên phải)

Hình 1.6 Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)

Hình 1.7 Trứng của ruồi nhà (Musca domestica)

Hình 3.1 Hình dạng bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt

Hình 3.2 Hình ảnh ngưng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dưới kính hiển vi quang học

Hình 3.3 Ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các

chủng Bt phân lập

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pCR2.1- cry2A vào vi khuẩn E.coli DH5α Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide từ các dòng khuẩn lạc pCR2.1 - cry2A - LNT7.12 và pCR2.1 - cry2A - MSS8.4 trên agarose 1%

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cry2A

Hình 3.8 So sánh trình tự gen của 2 chủng MSS8.4 và LNT7.12 với AJ488143.1

Hình 3.9 sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen cry2A

Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt mở vòng vector pET22b(+)

Hình 3.11 Điện di sản phẩm cắt đoạn gen cry2A từ vector tái tổ hợp pCR2.1 –

cry2A

Hình 3.12 Khuẩn lạc của E coli DH5α trên môi trường LBA

Hình 3.13 Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E coli DH5a trên gel 1 % agarose Hình 3.16 Trình tự acid amin của protein Cry2A trên lý thuyết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.17 Khuẩn lạc của vi khuẩn E coli chủng BL21 trên môi

Hình 3.18 Điện di sự biểu hiện protein rCry2A trên gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.19 Điện di protein tái tổ hợp Cry2A theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide

Hình 3.20 Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp Cry2A theo nồng độ IPTG

Hình 3.21 Điện di mẫu protein Cry2A theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide

Hình 3.22 Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide

MỞ ĐẦU

Ruồi nhà (Musca domestica) sống rất gần gũi với loài người trên toàn thế

giới Khoảng 90 % ruồi hiện diện xung quanh con người Chúng thường được tì

vật sinh sống, nơi có nhiều thực phẩm và chất thải Sự có mặt của chúng là dấu hiệu của điều kiện mất vệ sinh vì chúng mang theo nhiều chất bẩn và mầm bệnh Ruồi không chỉ gây khó chịu cho con người làm việc và nghỉ ngơi mà còn là vật trung gian lây truyền rất nhiều bệnh cho người, động vật và cây trồng

virus, vi khuẩn, trứng giun sán từ người bệnh sang người lành và từ môi trường vào

cơ thể con người Ruồi truyền khoảng 100 bệnh nhưng chủ yếu là các bệnh nguy

hiểm như: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae, lỵ,

tả, thương hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus)

Ngày nay, có nhiều phương pháp diệt ruồi nhà khác nhau mà con người áp dụng Biện pháp diệt ruồi nhà được sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi Tuy nhiên, những loại thuốc diệt ruồi hiện nay thường có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh Để khắc phục những tồn tại của thuốc diệt ruồi hóa học và các phương pháp diệt ruồi truyền thống, chúng ta cần tạo ra những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng tiêu diệt hiệu quả mầm bệnh, lại vừa thân thiện với con người, với môi trường

Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất, gram dương được phát hiện và biết

đến từ năm 1901 Chúng có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con người

và môi trường sinh thái và sinh vật có ích Chế phẩm Bt được sử dụng lần đầu tiên

vào năm 1930 để kiểm soát loài sâu đục thân Angasta kuehnella ở Châu Âu

Bt

ứng dụng vào đời sống

Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ruồi nhà của các chủng Bt phân lập ở Việt Nam

là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ruồi Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt

ấu trùng ruồi nhà Musca domestica trong vi khuẩn Escherichia coli”

Mục tiêu của đề tài:

1 Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt ruồi nhà (Musca domestica)

2 Tách dòng và đọc trình tự được Gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất,

lá có hoạt tính diệt ruồi nhà

3 Biểu hiện được protein Cry2 diệt ấu trùng ruồi

Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nhiệm sau:

1 Phân loại các chủng Bt bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch

2 Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà

3 Khuếch đại gen mã hóa protein độc tố diệt ấu trùng ruồi nhà sử dụng cặp mồi đặc hiệu

4 Tách dòng gen cry2A mã hóa tinh thể protein diệt ruồi nhà

5 Đọc trình tự gen cry2A và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen Quốc

tế

6 Biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E.coli BL21 (DE3)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis

Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được coi là

vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng

Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis được bắt nguồn

ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20 Từ năm 1870 khi Loius Pasteur phát

hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata nghiên cứu về

bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi

khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto Đến mười

năm sau (1911), loài vi khuẩn này được nhà khoa học người Đức là E Berliner

phân lập được từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải, Anagasta kuhniella và ông đã

có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào

tử này Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis do phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức

Năm 1927, Mattes và cộng sự đã phân lập lại Bt từ Anagasta kuhniella Chế

phẩm Bt được sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm soát loài côn trùng hại

có tên là Angasta kuhniella, một loài sâu đục thân ở Châu Âu Chế phẩm thương

mại đầu tiên, được sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein Năm 1956, Angus đã chứng minh được hoạt tính diệt sâu là do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử

Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thương mại của Bt đã được sản

xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức Sau đó, Howard Dulmage và

Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập được bộ sưu

tầm đầu tiên về các chủng Bt

Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới

cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh Năm

1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn được sử dụng

cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis subsp isralensis diệt được cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh

Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên được tách dòng và đọc trình tự Từ đó một lượng lớn gen đã được tách dòng và nghiên cứu đặc tính của chúng

Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dưới loài Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu Tenebrio molitar Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tương tự

Bt subsp morrisoni đặt tên là Bt subsp sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gen

độc tố của chúng

Năm 1985, gen cry của Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu

Năm 1987, công ty Mycogen đã sản xuất chế phẩm dạng con nhộng Cellcap

Trong những năm 1987 - 1992, người ta tiếp tục nghiên cứu và phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera

Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất, từ

đó một chương trình mới về ứng dụng Bt vào cây trồng - thực vật chuyển gen

(Genetically Modified Organisms - GMOs) [5]

1.1.2 Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam

Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bt và phải kể đến một chặng

đường dài mà các nhà khoa học của Việt Nam nghiên cứu về thuốc trừ sâu sinh học

Bt Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bt các nhà khoa

học Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đưa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh

tế cho ngành nông, lâm nghiệp [4]

Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ thực vật

năm 1971 Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phương pháp lên men trên máy lắc và có

chế phẩm diệt sâu rất tốt [1]

Năm 1973 - 1976, Bt được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc với giá thể là

agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc Các chế phẩm này đã được sử dụng cho vùng trồng rau ở ngoại thành

Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt đẹp [2]

Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo

phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5 m3

phân lập tại Việt Nam và nghiên cứu về các gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng cũng ứng dụng các protein này trong sản xuất chế phẩm sinh học [17, 18, 19, 20]

1.1.3 Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt

1.1.3.1 Vị trí phân loại

Bacillus thuringiensis được xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi khuẩn

khả năng diệt côn trùng Kích thước tế bào khoảng 0,8 1,4µm x 2,5 - 10µm [8]

-Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thước 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm, quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào Một đặc điểm

quan trọng là trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp

protein tinh thể Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích thước và số lượng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng Khi ở trong tế bào sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và bào tử đều thoát ra ngoài

Trong môi trường lỏng Bt có khả năng chuyển động, khả năng này có được là

nhờ các lông roi (flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thước lớn hơn 0,9 µm [54]

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore)

B thuringiensis được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ biến của Bt trong

môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [16]

1.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa

Bt không lên men sinh axit trong môi trường có chứa đường arrabinoza,

xylose, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường có chứa đường glucose Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Không có khả năng khử amin của phenilalamin, không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45oC Nhiệt

độ tối ưu là 28 - 30o

C Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH = 7 Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và

dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [5]

1.1.4 Đặc điểm phân loại

Có rất nhiều phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau [5]:

- Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và

Angus, 1958) Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không phân biệt được

các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử B cereus, B thuringiensis,

B mycoides, B anthacis Mới đây mới phát hiện thêm loài B weihenstephanensis và

B pseudomycoides [5, 8, 14]

- Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H

- Phân loại theo ngoại hình enzyme lipase

- Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau

- Phân loại theo nguồn bệnh

- Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho

Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính

diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp…Phương pháp phân loại theo typ huyết thanh H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao

: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo ra cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm

có thể quan sát bằng mắt thường Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được

Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82

thứ huyết thanh khác nhau của Bt [6, 15] (Bảng 1.1) Đây là phương pháp phân loại

được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế

Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [6, 47]

1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958

2 finitimus FIN Heimpel & Angus 1958

3a, 3c alesti ALE Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus 1958 3a, 3b, 3c kurstaki KUR de Barjac & Lemille 1970

3a, 3d sumiyoshiensis SUM Ohba & Aizawa 1989

3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba & Aizawa 1989

4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958

4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi & de Barjac 1963

5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi 1962

5a, 5c canadensis CAN de Barjac & Bonnefoi 1972

6 entomocidus ENT Heimpel & Angus 1958

7 aizawai AIZ Bonnefoi & de Barjac 1963

8a, 8b morrisoni MOR Bonnefoi & de Barjac 1963

8a, 8c ostriniae OST Ren et al 1975

8b, 8d nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon 1984

9 tolworthi TOL Norris 1964 ; de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10b darmstadiensis DAR Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10c londrina LON Arantes et al (Không công bố)

11a, 11b toumanoffi TOU Krieg 1969

11a, 11c kyushuensis KYU Ohba & Aizawa 1979

12 thompsoni THO de Barjac & Thompson 1970

13 pakistani PAK de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik & Viviani 1977

14 israelensis ISR de Barjac 1978

15 dakota DAK De Lucca, Simonson & Larson 1979

16 indiana IND De Lucca, Simonson & Larson 1979

17 tohokuensis TOH Ohba, Aizawa & Shimizu 1981

18a, 18b kumamotoensis KUM Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

18a, 18c yosoo YOS Lee, H H et al 1995

19 tochigiensis TOC Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei 1979

20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al (Không công bố)

21 colmeri COL De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh Code Người đầu tiên nghiên cứu

22 shandongiensis SHA Wang Ying et al 1986

23 japonensis JAP Ohba & Aizawa 1986

24a, 24b neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al 1988

24a, 24c novosibirsk NOV Burtseva, Kalmikova et al 1995

25 coreanensis COR Lee H H et al 1994

26 silo SIL de Barjac and Lecadet (Không công bố)

27 mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không công bố) 28a, 28b monterrey MON Rodriguez-Padilla et al (Không công bố)

28a, 28c jegathesan JEG Seleena, Lee, H L & Lecadet 1995

29 amagiensis AMA Ohba (Không công bố)

30 medellin MED Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac 1992

31 togucshini TOG Hodirev (Không công bố)

32 cameroun CAM Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al 1994

33 leesis LEE Lee H H et al 1994

34 konkukian KON Lee H H et al 1994

35 seoulensis SEO Lee H H et al 1995

36 malaysiensis MAL Ho (Không công bố)

37 andaluciensis AND Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996

38 oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al 1995

39 brasiliensis BRA Rabinovitch et al 1995

40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al 1996

41 sooncheon SOO Lee H H et al 1995

42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al (in press)

43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al (in press)

44 higo HIG Ohba et al 1995

45 roskildiensis ROS Hinrinschen, Hansen and Daamgaard (Không công bố)

46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (Không công bố)

47 wratislaviensis WRA Lonc et al 1997

48 balearica BAL Caballero et al (Không công bố)

49 muju MUJ Seung Hwan Park et al (Không công bố )

50 navarrensis NAV Caballero et al (Không công bố)

51 xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (Không công bố)

52 kim KIM Kim et al (Không công bố)

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh Code Người đầu tiên nghiên cứu

53 asturiensis AST Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996

54 poloniensis POL Damgaard et al (Không công bố)

55 palmanyolensis PAL Santiago-Alvarez et al (Không công bố )

56 rongseni RON Li Rong Sen (in press)

57 pirenaica PIR Caballero et al (Không công bố)

58 argentinensis ARG Campos-Dias et al (Không công bố)

59 iberica IBE Caballero et al (Không công bố)

60 pingluonsis PIN Li Rong Sen (in press)

61 sylvestriensis SYL Damgaard (Không công bố)

62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen (in press)

63 bolivia BOL Ferrộ-Manzanero et al (Không công bố)

64 azorensis AZO Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

65 pulsiensis PUL Khalique F and Khalique A (Không công bố)

66 graciosensis GRA Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

67 vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

68 thailandensis THA Chanpaisaeng et al (Không công bố)

69 pahangi PAH Seleena and Lee H L (Không công bố)

1.1.5 Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7

triệu bp Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gen tự nhiên cho một

số chủng Bacillus thuringiensis [26] Thể nhân (Nuclear Body) ở vi khuẩn là dạng

nhân nguyên thủy, chưa có màng nhân nên không có hình dạng nhất định và được

gọi là vùng nhân Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Bt Hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST,

các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [45] Trong một thời gian dài người ta cho rằng các protein tinh thể được mã hóa chung trên các

plasmid lớn Khi sử dụng kỹ thuật lai ADN với các mẫu dò cho gen cry đã nhận

thấy chúng xuất hiện cả trên NST [23, 39]

1.1.5.1 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng

Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các

loài phụ Bt khác nhau Một số nghiên cứu mối tương quan về sự có mặt của

plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid lớn có hệ số copy thấp Theo điều tra của Carlton và Gonzalez thì plasmid có mặt trong hầu hết các chủng

Bacillus thuringiensis, số lượng plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các chủng

nghiên cứu Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen

tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào Bt Ví dụ các plasmid trong Bt aizawai và kurstaki HD-1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng nằm ở nhiều vị trí khác nhau

trong tế bào [6, 34]

1.1.5.2 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis

Trước đây, khóa phân loại protein độc tố được Hoft và Whiteley đề nghị năm

1989 dựa trên tính tương đồng giữa các trình tự acid amin Dựa trên khóa phân loại này, năm 1998, Crickmore và cộng sự đã đề xuất một khóa phân loại mới hoàn thiện hơn Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số protein và thay đổi cách viết tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [29]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Bt có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt (Cytolysin) và Vip (Vegetative

Insecticidal Protein) Dựa vào tính tương đồng của trình tự acid amin của các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau, cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ được quy ước như sau: họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1, 2, 3 ), ký tự viết hoa (A, B ), ký tự viết thường (a, b ), số đếm (1, 2, 3 ), ví dụ như độc tố Cry12Aa1 Tỷ lệ acid amin tương đồng để phân chia các lớp độc tố như sau: lớp 1 (Cry1, Cry2 ) có độ tương đồng dưới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ

78%-95%, lớp 4 dưới 99% [25, 29, 42 ] Ngoài 3 họ độc tố trên Bt còn sinh ra một

số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase [30]

1.1.5.2.1 Độc tố Cry

Độc tố Cry (dạng chủ yếu là tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry khác

nhau Đây là họ độc tố quan trọng nhất, được phát hiện và nghiên cứu chi tiết nhất Tính đến năm 2005, đã phát hiện được 310 độc tố Cry khác nhau (thuộc 47 nhóm

từ Cry1- Cry47) [24, 37, 46]

*/ Cấu trúc chung của độc tố Cry:

Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên cứu tinh thể bằng tia X với nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau đó được

mở rộng cho các độc tố khác Các protein tinh thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng (Domain) (Hình 1.3) Thứ tự các vùng được tính từ đầu N đến đầu C của chuỗi polipeptid [24, 37, 46]

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc chung của một protein tinh thể độc tố Cry

Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn α đối song song (α- antiparallel) trong đó chuỗi số 5 được bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này mang đầu N [46] Vùng 2 có chứa 3 tấm β đối song song tạo thành một dạng hình học topo điển

hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này được gọi là cuộn lăng kính β (β-prism fold)

Vùng 2 được xem là quyết định tính đặc hiệu liên quan đến việc gắn độc tố vào màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp

- Nhóm Cry2: gồm hơn 20 độc tố thuộc nhóm Cry2A Các protein nhóm này

có khối lượng 70kDa, có độc tính với cả hai loài bộ cánh vảy và bộ hai cánh Riêng Cry2B và Cry2C tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng cánh vẩy [50]

- Nhóm Cry3: gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A - Cry3C có khối lượng 73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng [50]

- Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A - Cry4B tích lũy cả hai loại tinh thể có khối lượng khoảng 70kDa và 130kDa Nhóm này có hoạt tính với các loài thuộc bộ hai cánh Những protein này cùng với protein 27kDa do nhóm cyt1A tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn [50]

- Nhóm gen Cry5: Mã hóa cho protein có khối lượng 81kDa, gây độc với côn trùng bộ cánh vảy và cánh cứng [32]

Nhóm cry8: Nhóm gen cry8 mã hóa cho các protein có hoạt lực đối với côn trùng thuộc bộ cánh cứng Những nghiên cứu về gen cry8 vẫn còn rất mới mẻ và

chưa được đầy đủ Cho đến hiện tại, đã xác định được nhóm gen này gồm 39 gen

thuộc các dưới loài Bt khác nhau Gen cry8Aa1, cry8Ba1 được tách dòng từ Bacillus thuringiensis var kumamotoensis Gen cry8Ea1, cry8Fa1, cry8Ha1 được tách dòng từ Bt185 Gen cry8Da được tách dòng từ Bacillus thuringiensis var galleriae Gần đây, một số gen cry8 mới được xác định: gen cry8Ia1 (Yan et al , 2008), cry8Ea2 (Liu et al , 2007)… Hầu hết các gen cry8 có khối lượng phân tử là

130 kDa [51, 52, 53]

1.1.5.2.2 Độc tố Cyt

Độc tố Cyt (độc tố phân hủy tế bào) cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng của trình tự acid amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry hầu như không đáng kể Độc tố Cyt đầu tiên được Waalwijk phát hiện là Cyt1Aa1 vào năm 1985 Hiện nay người ta đã phát hiện được 22 độc tố Cyt thuộc 2 nhóm, các độc tố này có trọng lượng 25-30 kDa Độc tố này có thể làm tăng khả năng diệt côn trùng của độc tố Cry [8, 9]

1.1.5.2.3 Độc tố Vip

Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry được tạo ra ở một

số chủng Bt trong pha sinh trưởng sinh dưỡng của tế bào, các protein này gọi chung

là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) do gen vip mã hóa tổng hợp Các độc tố

Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào [12] Độc tố Vip được phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch và cộng

sự

Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa được tổng hợp trong suốt pha sinh dưỡng

nhưng nó không được tiết ra ngoài Gen mã hóa protein Vip3A xuất hiện trong cả

các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus Protein này có hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy như: Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea Khi côn trùng mẫn cảm ăn phải

độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải các tế bào biểu mô ruột giữa Các đặc tính vật lý của Vip3A biểu lộ tính độc như protein Cry [42, 43]

1.1.6 Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng

Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau Khả năng diệt côn trùng của các loài Bt chỉ thể hiện khi tinh thể độc được côn trùng tiêu hóa

Cơ chế hoạt động của protein Cry của Bt liên quan đến sự hòa tan của tinh thể

trong ruột giữa côn trùng, quá trình phân giải protein của tiền độc tố nhờ protease ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion (Hình 1.4) Tinh thể bao gồm các tiền độc tố,

để tiền độc tố trở nên hoạt động thì côn trùng mẫn cảm phải ăn chúng Với hầu hết côn trùng cánh vảy, tiền độc tố được hòa tan trong môi trường kiềm của ruột giữa côn trùng [27] Sự khác nhau trong phạm vi hòa tan đôi khi giải thích sự khác nhau

về cấp độ gây độc trong số các protein Cry Sau khi hòa tan nhiều tiền độc tố phải được xử lí bởi protease ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động Protease chính của ruột giữa côn trùng cánh vảy giống trypsin hoặc chymotrypsin

Hình 1.4 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng

(a) Tinh thể độc bị hòa tan bởi dịch ruột; (b) Protease ruột cắt từ đầu C của protein độc tố; (c) Tạo ra độc tố được hoạt hóa với hoạt động của vùng 2 và 3; (d) Vùng I sắp xếp

2 chuỗi xoắn cho phép gắn vào màng; (e) Hình thành lỗ rò [37]

Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng là sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ rò (kênh ion) Sự gắn kết của độc tố với thụ thể của tế bào ruột côn trùng là quá trình phức tạp Đó là sự gắn kết của độc

tố với thụ thể (phân tử cảm thụ) nằm trên màng vi thể của tế bào ruột côn trùng Sự gắn này là một quá trình hai giai đoạn, thuận nghịch và không thuận nghịch, các bước sau này có thể dẫn tới sự gắn chặt giữa độc tố vào thụ thể, sự gắn độc tố vào màng ruột hoặc cả hai

Chức năng hình thành kênh ion: Cấu trúc của độc tố bao gồm vùng I với bộ bó

7 chuỗi xoắn alpha Vùng này có chức năng bám vào màng ruột côn trùng và hình

57, 58] Ba gen cry2 đã được công bố là: cry2A, cry2B, cry2C [31, 32, 33, 56] Winder và Whiteley (1989) tách dòng hai gen liên quan đến cry2A và cry2B, từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-1 Cả hai gen mã hóa protein chứa

633 acid amin với khối lượng phân tử khoảng 71 kDa Mặc dù hai protein Cry tương đồng tới 87% acid amin, nhưng chúng khác nhau trong phổ diệt côn trùng

Cry2A là độc hại đối với loài cánh vảy (M sexta) và hai cánh (A aegypti), trong

khi đó Cry2B và Cry2C là độc hại đối với loài cánh vảy Một gen khác trong lớp này được tách dòng và đọc trình tự bởi Wu và cộng sự (1991)

Các gen cry2A và cry2C xuất hiện như vùng gen thứ ba của một operon ba gen (Orf1, Orf2 và cry2A) [56] Tuy nhiên sự hình thành protein Cry2A đòi hỏi phải có gen thứ hai (Orf2), trong khi hai Orf phía đầu của gen cry2C không có vai trò trong hình thành protein Cry2C [33] Mặt khác, gen cry2B là rất khó xác định

Để có được biểu hiện mạnh hơn của một gen cry2B từ Bt kurstaki HD-1, Dankocsik

và cộng sự (1990) đã hợp nhất gen này tại vùng điều hòa của một gen cry3A Kết quả là các độc tố Cry2B có độc tính cao với bộ cánh màng bao gồm Lymantria dispar, Heliothis virescens, Trichoplusia ni

Người ta tìm thấy protein Cry2B có độc tính cao đối với Lymantria dispar, Heliothis virescens và Trichoplusia ni, nhưng không độc hại đối với muỗi Aedes aegypti [29, 30, 55] Độc tố Cry2A chống lại hoạt động của côn trùng, bên cạnh

việc sử dụng nó như là một loại thuốc trừ sâu sinh học ở dạng thuốc xịt của bào tử tinh thể hỗn hợp, nó đã được sử dụng trong cây chuyển gen để làm cho cây trồng

kháng với các loại sâu bệnh Kể từ khi cry - loại chất độc được sử dụng rộng rãi

trong các cây chuyển gen đã có những nghiên cứu cho rằng côn trùng đã phát triển sức đề kháng chống lại một số các chất độc này Akhurst và cộng sự (2003) đã đưa

ra kết quả nghiên cứu về sức đề kháng của sâu bệnh trên cây bông đối với cry1Ac của Bt Pakistan Maqbool và cộng sự (1998) đã tạo ra lúa biến đổi gen, cho thấy gen cry2A là hiệu quả đối với sâu hại cây lúa tại khu vực Ấn Độ - sâu đục thân màu

vàng và sâu cuốn lá lúa Sau đó, Zaidi (2005) đã tạo biến đổi gen cây thuốc lá,

Nicotiana tabacum với cry2A để bảo vệ nó chống lại Heliothis virescens Tuy nhiên, thông tin về gen cry2 vẫn còn hạn chế và không bao gồm các khu vực địa lý khác

biệt Do đó, cần phải tìm kiếm nhiều hơn nữa các chủng mới và có phạm vi tác dụng mạnh hơn, đặc biệt là các mẫu trên thế giới chưa có Việt Nam là một trong những khu vực cần được khám phá các chủng mới với phạm vi rộng lớn hơn [36]

1.3 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm

Ruồi là loài động vật chân khớp ký sinh, thuộc lớp Côn trùng (Insecta), bộ Hai cánh (Diptera) Ruồi chỉ có 2 cánh, trong khi phần lớn các loài côn trùng khác có 4

cánh Ở ruồi, đôi cánh sau đã thoái hóa thành đôi chùy (halter), đó là những bộ phận giữ thăng bằng Ruồi có râu ngắn, đôi mắt phức hợp to, bàn chân có 5 đốt, có vuốt dùng để bám vào tường… C rung nhanh khi ruồi bay và đảm bảo cho sự vững chắc của ruồi Hơn nữa, những bộ phận giữ thăng bằng còn giúp ruồi hạ cánh

Ruồi có 2 nhóm chính là ruồi hút máu và ruồi liếm thức ăn, trong đó chú ý

đến ruồi nhà Musca domestica và Musca vicina thuộc nhóm liếm hút thức ăn

Hình 1.5 Ruồi nhà (Con ruồi đực - Bên trái; Con ruồi cái - bên phải)

1.3.1 Phân loại khoa học của ruồi nhà (Musca domestica)

Họ ruồi nhà phân bố khắp thế giới, với gần 4.000 loài đã được mô tả thuộc hơn 100 chi [48]

Giới (regnum): Animalia

số bệnh giun sán, đơn bào ký sinh

1.3.2 Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)

Vòng đời của ruồi nhà là chu kỳ biến thái hoàn toàn với 4 giai đọan: Trứng -

Ấu trùng (còn gọi là d ) - Nhộng - Trưởng thành (có cánh)

Hình 1.6 Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)

Con trưởng thành dài 6 – 8 mm với chiều dài cánh 13 - 15 mm, ngực màu xám có 4 sọc sẫm

suốt bên hông, ở giữa đốt bụng có dãy đen hơi mở rộng để phủ đốt bụng cuối Khi đậu nghỉ cánh trải ra, có 4 gân cánh rõ ràng uốn cong hướng về phía trên ở ngọn [58]

Ruồi nhà thông thường sau 48 giờ thành con trưởng thành, con cái bắt đầu đẻ trứng Trong suốt cuộc đời con cái từ 1 - 3 tháng nó có khả năng sinh sản 4 - 5 lứa, mỗi lứa từ 100 - 150 trứng Trứng hình trụ tròn trắng như ngọc trai, dài 1 mm, được

đẻ ở những nơi có chất thối rữa nhưng ẩm như rác nhà, lá cỏ ủ thành phân [58]

Hình 1.7 Trứng của ruồi nhà (Musca domestica)

Trứng nở trong khoảng từ 8 - 48 giờ sau khi đẻ, đây là giai đoạn ấu trùng hay còn gọi là mềm, trắng, không chân, chúng tránh ánh sáng và tìm kiếm nhiệt độ tối ưu là từ 45o

- 50oC Sau 3 lần lột xác chúng sẽ là con ấu trùng thành thục dài 10 - 12 mm Ở nhiệt độ cao hơn, sự phát triển của ấu trùng hoàn thành trong ít ngày, nhưng trong mùa đông tiến trình này có thể mất hơn nhiều tháng

Khi thành thục, ấu trùng rời khỏi nơi đẻ để tìm những nơi chung quanh mát hơn, thí dụ như đất Ở đây chúng phát triển thành những chú nhộng màu vàng, màu nâu hoặc màu đen dài 6 mm Tuỳ theo điều kiện, con trưởng thành sẽ nở sau 3 ngày cho đến 4 tuần

Với nhiệt độ cao của mùa hè, loài ruồi có vòng đời từ 12 - 14 ngày Trong điều kiện ấm áp, trong vòng một tháng sẽ có khoảng hai đến ba thế hệ ruồi được sinh ra Vì tốc độ sinh sản nhanh và với số lượng lớn ở mỗi lứa, lượng ruồi phát triển nhanh chóng Thường thì mật độ ruồi tăng và xuất hiện nhiều nhất là vào những tháng mùa thu

1.3.3 Ảnh hưởng của ruồi đối với sức khỏe cộng đồng

hay lui tới hay ăn bất kỳ thực phẩm rắn dễ hoá lỏng Chúng có thể làm ẩm những chất đang thối rữa hoặc thực phẩm được cất giữ cho sự tiêu dùng của con người Ruồi làm thực phẩm hóa thành chất lỏng do chúng tiết ra dịch tiêu hoá và chất chứa trong dạ dày của chúng lên trên thực phẩm Ruồi cái thường đẻ trứng ở những nơi có chất hữu cơ thối rữa, lên men hoặc mục nát có nguồn gốc từ động vật hoặc thực vật, như phân người và các loại động vật, rác

*/ Mức độ mang truyền dịch bệnh của ruồi nhà:

- Do ruồi sinh sản nhanh, dân số quá đông, nhà nào, nơi nào cũng có ruồi nên người

ta quá quen và xem thường chúng Một cặp ruồi, nếu có đủ môi sinh (phân, rác…) cho nó phát triển thì trong vòng 6 tháng, có thể tạo ra một lượng ruồi bao phủ khắp trái đất một lớp dày 50 cm

- Do cấu tạo cơ thể ruồi, nhất là các chùm lông ở ba cặp chân, khi ruồi di chuyển quét dính vi khuẩn ở các nơi bẩn rồi bám lên thức ăn, đồ dùng của người

- Do quá trình biến thái, vi trùng trong phân động vật nhiễm vào , khi biến thành ruồi mang theo các vi trùng ấy sẵn sàng truyền sang nơi

- Do chất ói của ruồi, đường dẫn thức ăn qua vòi liếm hút của ruồi có đường kính quá nhỏ, chỉ bằng 0,006 mm, nên ruồi chỉ nuốt được thức ăn li ti cỡ hạt phấn hoa

mà thôi Vì vậy, khi gặp thức ăn, ruồi phải tiết nước bọt ra rồi hút vào ói ra cho đến khi thức ăn mềm nhũn biến thành dịch lỏng mới liếm hút được Bằng cách đó, ruồi

đã truyền vi khuẩn vào thức ăn của ta

- Do phân ruồi, trong khi ăn ruồi còn luôn luôn thải phân ra ngoài môi trường Vi khuẩn ở nơi bẩn thỉu theo đường tiêu hóa của ruồi, sinh sôi nảy nở rồi theo phân ruồi bám lên thức ăn, vật dụng, vết thương hay khóe miệng người… Vì thế mà mầm bệnh, vi khuẩn ở xa hàng cây số vẫn được ruồi mang đến lây truyền

1.3.4 Một số phương pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay

Hiện nay có nhiều phương pháp diệt ruồi khác nhau, có thể diệt ruồi trực tiếp bằng hóa chất diệt côn trùng hoặc bằng các biện pháp vật lý như bẫy tấm dính,

vỉ đập, vỉ điện Dù bằng cách nào cũng cần phù hợp với điều kiện vệ sinh môi trường

-Vệ sinh môi trường:

Làm mất hoặc làm giảm nơi đẻ trứng của ruồi:Chuồng trại gia sức, gia cầm cần có rãnh thóat nước, phân; nền sàn nên làm bê tông và xối sạch hàng ngày Thu dọn phân thành đống và đậy lại bằng tấm nhựa và có điều kiện nên làm khô phân trước khi ruồi có thời gian đẻ và phát triển Làm tấm đậy các hố xí hở, và nên xây dựng những hố xí kín Rác rưởi và các chất thải hữu cơ cần làm sạch triệt để bằng cách thu dọn vào vật chứa, chuyên chở và xử lý đúng cách

Làm giảm những nguồn thu hút ruồi từ nơi khác đến: Ruồi thường được thu hút bởi mùi phát ra từ các ổ đẻ của chúng, mùi sinh ra từ thức ăn cá, xương, đường mía, sữa, hoa quả lên men …Cần giảm và làm sạch những chất này

Đề phòng sự tiếp xúc giữa ruồi và mầm bệnh: Nguồn mầm bệnh của người và động vật bao gồm phân của người và động vật, rác thải, cống rãnh, mắt đau, chỗ lở loét, vết thương mổ …

Bảo vệ không cho ruồi tiếp xúc với thức ăn, đồ dùng nhà ăn và với người: Đậy kín chén bát, thức ăn Làm lưới cửa ra vào và cửa sổ, chụp màn để bảo vệ trẻ con khi ngủ để không cho ruồi và các côn trùng khác vào

Tuy nhiên, trong điều kiện việt nam hiện nay để thực hiện được những yêu cầu trên

là điều rất khó Vì vậy cấn sử dụng các biện pháp diệt và phòng trừ hiệu quả

-Phương pháp vật lý:

Chúng ta có thể sử dụng những lọai bẫy ruồi như: bẫy ruồi, bẫy dính, bẫy điện…Sử dụng các chất hấp dẫn ruồi đến ăn và ruồi sẽ bị nhốt trong bẫy ruồi, bị dính vào các chất dính hoặc bị điện giật chết

-Phương pháp hóa học:

Một số biện pháp hóa học như sử dụng hộp Dichlorvos bốc hơi, bả diệt ruồi, phun tồn lưu, phun không gian, phun hóa chất diệt giòi vào ổ đẻ của ruồi …Những biện pháp này diệt ruồi rất nhanh, được áp dụng khi có dịch tả, kiết lỵ, đau mắt, nhưng hạn chế sử dụng vì ruồi phát triển tính kháng hóa chất rất nhanh

Một số hóa chất sử dụng làm bả diệt ruồi như các hợp chất phospho hữu cơ (dichlovos, diazinon, malathion …); hợp chất carbamat (propoxur, formaldehyd ).Các hóa chất sử dụng để phun tồn lưu hoặc phun không gian như các hóa chất nhóm pyrethroid: Alphacypermethrin, cyfluthrin,deltamethrin, permethrin, lambdacyhalothrin …

-Phương pháp dân gian:

Ruồi thích ánh sáng nên thường xuất hiện ban ngày Do ruồi có mắt kép phản xạ nhanh với ánh sáng phản chiếu bởi loại gương cầu Vì vậy người ta cho nước sạch vào túi nylon, treo trong nhà, ruồi bay qua bay lại gặp phải ánh sáng phản quang từ các túi nylon đựng nước, ruồi sợ và bay xa Đây là biện pháp các quán hàng ăn uống thường sử dụng rất có hiệu quả

- Ấu trùng ruồi nhà tuổi 1,2,3

- Bã bia thu nhận tại Công ty Bia rượu Hà Nội để phục vụ nhân nuôi ấu trùng và thử hoạt tính

- Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gen cry2A

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A

Kích thước (bp)

Cry2AaF 5’….ATGGATCCATGAATAATGTATTGAATAG….3’ 1902 Cry2AaR 5’ TACTCGAGTTAATAAAGTGGTGGAAGAT….3’

- Vector tách dòng pCR2.1 do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp

- Enzyme: enzyme giới hạn EcoRI, enzyme nối T4 - ligase, Taq- polymerase…

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

- Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Cao thịt, Pepton, Trypton, cao men, agar…

- Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin axit, fushin bazơ

- Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris- base, TAE…

- t sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Buffer, Nước khử ion…

2.1.2.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật và phòng máy chung về công nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học, gồm có:

Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

Sanyo, Nhật hoặc Gilson, Pháp Electrolux, Nhật

Frigor, Đan Mạch Friocell, Đức

2.1.2.3 Môi trường và dung dịch

*/ Môi trường: Trong quá trình thí nghiệm có sử dụng các loại môi trường:

- Môi trường phân lập và giữ chủng MPA

H2O : 1 lít Agar : 16 g pH : 7 - 7,2

- Môi trường lỏng MPB

H2O : 1 lít pH : 7 - 7,2

- Môi trường Craige dùng phân lập chủng có khả năng chuyển động:

Glucose 0,72 g H2O khử ion tới 80 ml

- Dung dịch Sol II:

Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 µl

CH3COOH 28,6 µl H2O khử ion tới 50 ml

- Thuốc nhuộm bào tử (fushin axit)

Fushin axit 1 g

- Thuốc nhuộm tinh thể (fushin bazơ)

Phenol 3 % 90 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch

Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn được thu nhận từ các chủng Bt chuẩn theo

phương pháp của Barjac và Bonnefoi, 1962 [15]

Các chủng Bt được cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, được cắm thẳng

đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280

C trong 24 - 48 giờ Những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường giữa ống Craige và ống nghiệm Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trường LB, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong 12 giờ

Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2 µl dịch nuôi cấy nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng)

và quan sát dưới kính hiển vi [6] Thử lần lượt với các typ huyết thanh khác, cho đến khi vi khuẩn mất khả năng chuyển động tức là phản ứng ngưng kết xảy ra

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Đặt các khay bã bia ở nơi có xuất hiện nhiều ruồi nhà khoảng 1- 2 ngày Lớp

bã bia trong khay dày 5 – 8cm, độ ẩm bã bia được duy trì ở 65- 70%

trường, con trưởng thành sẽ nở sau 3 ngày cho đến 4 tuần

Chủng Bt phân lập được được đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trường

MPA và nuôi trong tủ ấm 28o

C trong 3-4 ngày sau đó thu lại toàn bộ sinh khối Sinh khối được xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút Dịch đã xử lý nhiệt được pha loãng ở các nồng độ 10-6

đến 10-9, lấy 100µl mỗi nồng độ pha loãng được cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA Nuôi ở 28 0C sau 24h đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất Số lượng bào tử được tính theo công thức [49]:

CFU= n.a.10 (CFU - Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc là số lượng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy)

n : Số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng

a : nồng độ pha loãng

2.2.2.3 Thử hoạt tính trên ấu trùng ruồi nhà

Ấu trùng ruồi nhà thử nghiệm: Sử dụng ấu trùng Musca domestica tuổi 1, 2, 3

Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng nghiên cứu,

chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng ấu trùng ruồi nhà Musca domestica

theo phương pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107

và 109 bào tử/ml [55] Mỗi nồng độ được thử nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng)

Chuẩn bị:

Các chủng Bacillus thuringiensis được cấy trang trên môi trường MPA, nuôi

lắc ở 28 0C trong 72 giờ Sau đó, thu sinh khối tế bào vào ống eppendoft có chứa 1ml nước cất vô trùng Tiếp theo, tiến hành pha loãng đến mật độ 107 và 109 bào tử/ml để thử hoạt tính Cơ chất để thử hoạt tính được sử dụng giống với cơ chất trong quá trình nhân nuôi ấu trùng ruồi nhà (bã bia) Nuôi ở nhiệt độ phòng, ở nơi thoáng mát, độ ẩm của thức ăn cần được duy trì ổn định Theo dõi tỉ lệ

chết trong 3 - 5 ngày

Tỉ lệ ấu trùng chết được tính theo công thức Abbott [13]: A=(C-T).100/C Trong đó: A: % ấu trùng ruồi nhà chết

C: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu đối chứng

T: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu thí nghiệm

2.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở

37oC

- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút)

- Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa

- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)

- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)

- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên

- Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200

C

2.2.4 Phương pháp tinh sạch plasmid của E coli

- Đẩy nước trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl

- Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi

- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi)

- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm

- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa

- Rửa bằng 300 µl cồn 70oC, ly tâm 12000 vòng/phút Thu cặn, làm khô tự nhiên

- Bổ sung 45 µl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20o

C

2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A

*/ Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích 20µl là:

2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như

định lượng của acid nucleic Phương pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó