1. Trang chủ
  2. » Khoa Học Tự Nhiên

Ebook cytochrome p450 phần 2 PGS TS nguyễn thị ngọc dao

139 388 1

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 139
Dung lượng 5,18 MB

Các công cụ chuyển đổi và chỉnh sửa cho tài liệu này

Nội dung

Cyt-P450 alk alkan terminal hydroxylase cHa n&m men a dMu hNa Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol.. h

Trang 1

4.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450 n m men và n m s i

S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b�l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith Cùng n�m

�ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�.Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 �

��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�utrúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong

Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là

Cyt-P450(14DM), lanosterol 14 – demethylase

Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�pth� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ãcung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con men S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c

Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b�

nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�itrong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào, còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn Tuy nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt P450 nh�t

��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b�sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450 T�ng s� các Cyt-P450 trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��igia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��

Trang 2

Nguy�n Th� Ng�c Dao80

�áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t

��nh �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n

ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a

vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao

- Kh� axít béo bão hòa acyl CoA

- Kh� axít béo bão hòa ergostadienol

- Kh� methyl c�a sterol

- Kh� methyl c�a lanosterrol

- Kh� bão hòa c�a ergostadienol

- Oxy hóa các xenobiotic Squalene epoxidate

Hình 4.1 H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng,

fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor

(y�u t� nh�y c�m v�i cyanide)

B ng 4.1 Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i

n�m men và n�m s�i

14 -demethyl hoá các sterol

22 kh� bão hoà ergosterol

Thu� phân kh�i mào các alkan

Thu� phân các axit béo

Chuy�n hoá các xenobiotic

T�o thành isobuten

P45014D P45022DS P450 alkan P450 alki,c B

a a a a P450 hpha P450RM

H�u h�t vi sinh v�t

Có th� h�u h�t N�m men tiêu th� Alkan

Candida tropical Saccharomyces cerevisiae Schizoscc pombe

Candida tropical Cunighamella elegan Cunighamella baireiri Aspergillus sp

Rhodotorula minuta

Trang 3

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 81Chuy�n hoá nitrat/nitrit

Demethyl hoá pisatin

Thu� phân m-cresol

Sinh t�ng h�p aflatoxin

Sinh t�ng ergot alkaloid

Thu� phân progesterone

P450dNIR P450(57)d a

a a a

Fusarium oxysporum Nectria haematococca Aspergillus parasitous

Claviceps purpurea Aspergillus Ocraceousrhizopusnigricas

Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác

��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a

nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein tương �ng chưa tách �ư�c

4.1.2 Cyt-P450 c a n m men

Cyt-P450 (14DM) (Lanosterol 14 -demethylase)

Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S cerevisiae và C albicans, trong �ó S cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong

các lo�i n�m men Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol

�� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá

Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh

Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S cerevisiae có TLPT 58.000 khi

�i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700) D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm, tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45 D�ng kh�- CO có b�ng h�p th� � 447nm Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�aferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I S�chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol, m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn B�ng cách s� d�ng s� bi�n

��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�pch�t này

Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác nhưpyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph�

��c trưng cho typ II Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t

Trang 4

Nguy�n Th� Ng�c Dao82

azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n

ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch�Cyt-P45014DM

Nh:ng thu;c tính xúc tác

Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4, demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPH-P450-reductase, O2và NADPH (hình 4.2) Ph�n �ng này bao g�m

3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l�chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32 H�ng s� Km

và Vmax c�a lanosterol 14 -demethylase c�a S cerevisiae tái t�o

�ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�othành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng Vì s� methyl hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� �trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác nhi�u quá trình oxy hoá /phút Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�nh�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k =20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s�kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min-1 �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch�s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh� Lanosterol 14 -demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14 , 24, 25 dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM) Vì không có

24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý Thêm vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�tlanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không b� chuy�n hóa Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�icholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá thu�c không �áng k�

Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó

và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14 -demethylase

Trang 5

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 83

Hình 4.2 S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác

b�i Cyt-P450 14DM

C&u trúc bEc 1

C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t�

nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S cerevisiae, C.albican

và C.tropical Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i

tr�ng lương phân t� là 60.700 (S cerevisiae) Xem xét c�u trúc b�c

1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, Cyt-P45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u N- t�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�.�áng chú ý là m�t

�o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng

�ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin � ��u M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh

là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n;

ví d�: - QR :::: RK - trong S cerevisiae Cyt-P45014DM �i�u �ó g�i

ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n

�ư�c cho là g�n màng S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong Cyt-P450alk Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho Cyt-P450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú Theo nghiên c�u c�aChen và cs nh�ng Cyt-P45014DM t� S cerevisiae và C.tropicals có

343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay

HO

Trang 6

Nguy�n Th� Ng�c Dao84

th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh M�t trong s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi

là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i

�i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G D) trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân

t� S cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a

Cyt-P45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI Trình t� axit amin c�a P45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp

Cyt-�ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam.S� d�ng máy tính có thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�iVi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t�Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này

(317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào

thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch �i�u �ó g�i ý r�ng vùng này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th�bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng

Cyt-P450 14DM nh là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng n&m Azole

M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như

là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m T�t c�nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14 -demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM

S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol

và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào Bi�n ��i trong s�t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát tri�n ho�c ch�t Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân azole kháng n�m S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn

có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n ��quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác

� nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch M�c dù nh�ng d�n xu�tazole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơc�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch� Tuy v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao

Trang 7

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 85

��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c Cơ s�cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t

��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t�tác nhân azole kháng n�m

Cyt-P450 (alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a dMu hNa

Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol Ph�n

�ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i P450 khác �ư�c g�i là P450alk Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�nnh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y

Cyt-trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp ho�c nh�ng

t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan P450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan

Cyt-c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng Genomic DNA

��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247 C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alkv�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như

là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs

Tính không PQng nh&t phân tS

Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a

vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C IAM maltosa

12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543 axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và

kho�ng 25% �ư�c b�o t�n Sanglard và Fiechter phát hi�n gen Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu �

trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ

enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk2 vàCyt-P450alk3, m�t cách tương �ng Seghezzi và cs công b� r�ng gen Cyt-P450alk2 là m�t protein ch�a 522 axit amin Kích thư�cphân t� c�a Cyt-P450alk2 có th� so sánh v�i kích thư�c c�a

-C.maltosa Cyt-P450alk Sanglard và cs xác ��nh r�ng TLPT trên

�i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn

�áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n trong S

cerevisiae Tuy nhiên, Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,

Trang 8

Nguy�n Th� Ng�c Dao86

g�i ý r�ng Cyt-P450alk2xúc tác s� th�y phân alkane Tóm l�i, P450alk2 tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a

Cyt-C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a C.maltosa �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals

bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau Sanglard và cs g�i ýr�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p

vì Cyt-P450alk và alk2 ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�ms�c th�

Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác

Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�tnhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n

và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr�methionin g�n � ��u �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che ch�n b�i các axit amin tích �i�n Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t�

C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450

spin th�p Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công

b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c 450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247 Phân tích quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên

tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t�ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�nd�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane M�c khác, Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c

công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�ihexadecane

M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và

NADPH-P450-reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a

hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�pc�a Cyt-P45014DM M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là Cyt-P450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�nph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�,b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng Cyt-P450alk1 �ư�cdòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk2 t� ra có s� ��c hi�u

cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên

Trang 9

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 87

M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn hóa hXc

Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�tgây ��t bi�n hóa h�c M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t

hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S cerevisiae Cyt-P450 này (còn �ư�c

g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500 Cyt-P450 này th�hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�iCyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh

nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c �áng chú ý là hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so v�i nh�ng Cyt-P45014DM Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt-P450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407, m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�utrúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng

M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU

tVo thành isobuten tY isovaleric acid

Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i

phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u

khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene Vì isobutene �ư�c t�othành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s�

�áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành isobutence (H.4.7) M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào

R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s�

chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�aNADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�ntr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450 Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit

isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta

�ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh M�i

�ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�tkhi �i�n di Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th�hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�iaxit isovaleric Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc tác c�a nó

Trang 10

Nguy�n Th� Ng�c Dao88

Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã

�ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�an�m men �ã �ư�c bi�t Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ngch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u Cyt-P450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�tmàng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên �i�unày g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�ctìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã

�ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này S�chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c Cyt-P450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh�carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14

�-lanosterol Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450

Cyt-P450 22DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^ trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol

S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2và b�

�c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men Tuy nhiên, ph�n

�ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng P450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome

Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o

ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ngnày �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t

�ư�c g�i là Cyt-P45022DS Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�ctách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa

�ư�c làm rõ

4.1.3 Cyt-P450 c a n m s i (Filamentous Fungi)

Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum

Shoun và cs �ã công b� r�ng F oxysporum ch�a Cyt-P450 c� �

microsome và phân �o�n hoà tan �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i

Trang 11

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 89màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t

�o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite Thêm n�a,

ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t

ngo�i lai

Cyt-P450 P ,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan

Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c

tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F oxysporum Hai s�n ph�m này h�u

h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng TLPT bi�u ki�nc�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000

và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y

S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000 D�ng oxy hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n �

��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm ��nh h�p th� c�a h�nh�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm C�n ph�i làm rõ li�unh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các

cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�ilaurate M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th�

��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate M�t khác, ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh�c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và447nm (m�t cách tương �ng) Như v�y, không có m�t ch�ng minh ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B

SU thu` phân acid béo

Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F oxysporum �ã chuy�n

hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3 S� tái l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch�c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�nchuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450 Trên phân �o�n t� bào, ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân

�o�n hoà tan Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c

Trang 12

Nguy�n Th� Ng�c Dao90

xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong quá trình phân hu� t� bào Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�ttính này v�n chưa �ư�c xác ��nh

Cyt-P450 hoà tan P ,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c Nitrit

S� phát tri�n c�a F oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và

m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�anh�ng t� bào này (b�ng 4.2)

B ng 4.2 S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit

trong F oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs)

Nitơ vô cơ

thêm vào

( 0,2%)

S�c khí Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein)

Phân �o�n tan Phân �o�n microsome

Kph 0,288 0,685 0,0035 0,013 kph

0,085 0,075 0,103 0,11 0,014 0,012

�ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450 hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�ttính xúc tác trên

Trang 13

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 91

Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450 cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14 trong sinh tbng h,p sterol

Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và

��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men,

�c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s�14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i S� dư th�asterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng

trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i

SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p

Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng

h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid

�ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p P450 b�i Phenobarbital B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�chi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin

Cyt-b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý

Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a

Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a

m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�ct�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin

�ư�c t�o ra b�i n�m này Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các

ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng

M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin:

Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là

Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá

c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin Pisatin là m�t ch�t ��c do

n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay

t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn Ho�ttính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao (20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin

Trang 14

Nguy�n Th� Ng�c Dao92

�ư�c coi là th�p (<5�M) Theo �ó, s� kh� ��c c�a pisatin �ư�ccoi là ch�c n�ng n�i t�i c�a Cyt-P450 này và s� t�ng h�p c�a nó

là m�t cơ ch� t� v� sinh h�c �� ch�ng l�i h�p ch�t kháng khu�n M�t gen (CYP57) mã hoá cho Cyt-P450 này �ã �ư�c dòng hoá

và ��c trình t�

SU chuy[n hoá các ch&t lV

Ho�t tính Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) �ã �ư�c th�y

trong Cunning hamella elegans, C bainierit và Asp Ochraceus TS

Ho�t tính AHH c�a nh�ng n�m này �ã �ư�c kích thích t�ng h�pb�i m�t s� arylhydrocarbon (hydrocacbon nhi�u vòng nhân thơm), b� �c ch� b�i nh�ng ch�t �c ch� ��c hi�u Cyt-P450 như là CO và SKF 525 A và ��nh v� trong phân �o�n microsomal Cerniglia và Gibson �ã ti�n hành phân tích ��u tiên nh�ng phân t� t�

benzo[a]pyrence do AHH xúc tác c�a C.elegans và ch� ra r�ng

AHH c�a n�m cho ra cùng m�t s�n ph�m như là s�n ph�m �ư�c t�othành b�i enzyme t� ��ng v�t có vú M�i �ây, m�t gene c�a Cyt-P450 �áp �ng cho s� chuy�n hóa c�a benzo[a]pyrence �ã �ư�c xác

��nh trong Asp.niger và �ư�c g�i là CYP53 Các microsomes c�a A ocraceus TS và Rhizopus nigrican �ã �ư�c công b� là có ho�t tính

thu� phân 11�- progesterone và ho�t tính này �ư�c coi là ph� thu�cvào Cyt-P450 d�a trên s� nh�y c�m c�a nó ��i v�i m�t s� ch�t �cch� Cyt-P450 ��c hi�u

Chloride peroxidase (chloro peroxidase) không phei là m;t thành viên cHa các Cyt-P450

Chloride peroxidase [EC.1.11.1.10] là m�t glycohemoprotein có m�t protoheme g�n v�i thiolate như là nhóm ngo�i �ư�c t�o ra b�i

Caldariomyces fumago,là m�t enzyme ngo�i bào C�u trúc

ligand và k�t qu� ��c trưng quang ph� phân t� enzyme này là r�tgi�ng v�i c�a các Cyt-P450 Tuy nhiên, c�u trúc protein c�a nókhác rõ r�t v�i c�a các Cyt-P450, dòng hoá cDNA và phân tích trình t� cho th�y r�ng apoprotein c�a Chloride peroxidase ch�a 321 axit amin v�i TLPT 35.202 và không tìm th�y s� tương ��ng gi�ac�u trúc b�c 1 c�a nó v�i c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450S TLPT bi�u ki�n c�a enzyme này �ã �ư�c xác ��nh là 42.000 v�i 25 – 30%carbonhydrate Như v�y, Chloride peroxidase không �ư�c x�p vào siêu gia �ình Cyt-P450 m�c dù thu�c tính quang ph� là tương t� v�icác enzyme này

Trang 15

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 93

4.1.4 +i,u hoà s- t.ng h p Cyt-P450 b i vi khu1n nhân th-c

Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào

�i�u ki�n phát tri�n Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t

��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng

�i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong

vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau Cyt-P450alk c�a Candida sp �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c

hi�u b�i n-alkane Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen P450alk b�i n-alkane S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk

S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�uc�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác Cyt-P450 t�o

thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó S�

thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng

h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F oxysporum S� t�ng h�p c�m

�ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph�thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i

M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng

O2th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y Vì n�ng

�� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�an�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nhhư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này Liên quan v�i �i�u này là nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�yc�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450 Như mô t� trong chương

5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh�n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoàbi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng Các Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp

�ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�tcho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u

Trang 16

Nguy�n Th� Ng�c Dao94

hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là m�t ��c trưng quan tr�ng Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�uhoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450 monooxygenase trong th� nhân th�t

4.2 Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn

4.2.1 Nh4ng enzyme Cyt-P450 c a vi khu1n: Cyt-P450cam

Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ

nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1)

4.2.2 Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam

N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�aCamphor như là ngu�n carbon duy nh�t S� oxy hoá Camphor �ư�cb�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ngmonooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh� H�th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3 enzyme tham gia là:

a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT 45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A

b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT 11,418) mã hoá b�i gen Cam B

c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538;

414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C S� t�o thành tính enzyme c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s�chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol

Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra 2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase (MW: 38,377; 361 axit amin) Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor

�ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�cg�i là CAM 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã

�ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor Nh�ng gen

Trang 17

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 95này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�tbúi gen và t�o thành Cam operon Cam R, m�t gen �i�u hoà âm,

��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�pv�i Cam operon

Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơnphân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB Ch�tkìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i

nó khi có m�t Camphor

Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t�

��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�pkhác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng h�p có tính enzyme

Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam

D và Cam R RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi

�y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT) Gen

�i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng)trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�aCam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator

này in vitro V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine

-Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D, AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B Mã kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A M�t c�utrúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và

m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các

gen A và B

M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã

�ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th�

�ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này

4.2.3 C u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450 cam

Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P putida �ó là m�t trong nh�ng

h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�aCyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�tlư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá Nh�ng

Trang 18

Nguy�n Th� Ng�c Dao96

nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam,không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này (xem Chương 2)

4.2.4 M:i liên quan gi4a c u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450 cam

Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v�trí ��c hi�u ��i v�i protein này Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ãthành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và c�a nh�ng Cyt-P450 khác Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�uhơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�ttinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh

�� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�nkhông th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�chi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i

hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng

t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th�m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein Cyt-P450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và PdR

Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và

cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu

� trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�idithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�uki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�aP450cam Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin O-dealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�tho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơch�t Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�ttính th� hai l�i r�t cao (250%) Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n

��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t

Trang 19

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 97

g;t biWn enh h %ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd (putidaredoxin)

Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác, nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�ienzyme t� nhiên) Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2

và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme

��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i

K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C protein t� Pd �ã b� khóa l�i B�ng phân tích stopped flow s� d�ng

Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c

�� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c ��phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là 40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5

Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��nenzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính enzyme Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p

�áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV)

Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2( 2) c�a guanidin và = NH( )c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�thình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2( 1) khác c�a các d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�anhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s�chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này

có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�ivi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh� Th�c ra, nhóm c�aSligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như

là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd Ngư�i ta c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�agia �ình Cyt-P450 Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên, g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t�n�i phân t� ��n s�t hem

S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs

�ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463), m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có

Trang 20

Nguy�n Th� Ng�c Dao98

th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase c�a nó Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136) c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam,m�t cách tương �ng

g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen

M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm (Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t�oxygen Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t�Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương

�ng M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t, phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng g�c acid amin � vùng này Trong s� nh�ng g�c không phân c�c, Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch�y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450 Thr 252 h�u nhưkhông bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�tcho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�nhóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase Thr 252 �ã bi�n

��i thành A, V ho�c S T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�tv�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous, oxygen hóa và CO-ferrous

Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�aenzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor

�ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy peroxide Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i

Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�pperoxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b�kh� 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�ttính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i.Nhưv�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân

Trang 21

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 99

�ôi liên k�t O-O c�a O2 trong ph�n �ng oxygenase Nh�ng nghiên

c�u gây ��t bi�n các v� trí c�a Cyt-P450 cam có th� xem thêm trong

Chương I và Chương II � cu�n sách này

Nh:ng P;t biWn % liên kWt c ch&t

Dùng phương pháp phân tích c�u trúc tinh th� tia X, ngư�i ta �ãti�n hành quan sát các v� trí axit amin b� bi�n ��i � các v� trí như t�o

ra các protein v�i Y96F, V247A, V295I, R186H, D251N, T101, I209L… so sánh ho�t tính enzyme bi�n ��i v�i typ d�i �� rút ra nh�n xét v� vai trò c�a các axit amin này trong s� liên k�t v�i cơch�t Bư�c ��u nh�n th�y vai trò thi�t y�u c�a các axit amin � các v�trí như 117, 209, 365 Ngư�i ta c�ng nh�n th�y là �� �áp �ng cho nhi�u cơ ch�t khác nhau, các axit amin tham gia vào s� liên k�t c�a

cơ ch�t thư�ng n�m � các v� trí trong vùng “m�m d�o” có kh� n�ng bi�n ��i cao

4.2.5 Nh4ng h< th:ng Cyt-P450 các vi khu1n khác

SU thu` phân axit béo: P450 (BM-1) , P450 (BM-2) và P450 (BM-3)

Bacillus megaterium ATCC 14581 �ư�c bi�t là có ch�a

Cyt-P450 th�y phân axit béo Fluco và cs s� d�ng ch�t chi�t không có t�bào c�a vi khu�n �ã phát hi�n Cyt-P450 th�y phân axit béo hòa tan, enzyme này xúc tác s� th�y phân �1, �2 và �3 c�a các acid béo bão hòa, các alcohol và các amide Enzyme �òi h�i m�t cách tuy�t

��i NADPH như là ch�t cho �i�n t� S� th�y phân nhóm methyl t�ncùng, �-1, �ã �ư�c quan sát �i�u này ngư�c v�i Cyt-P450 th�yphân acid béo � � ��ng v�t có vú, enzyme này c�ng th�y phân �-1 Các enzyme th�y phân acid béo này là m�t h�n h�p c�a 3 Cyt- P450 khác nhau, �ó là Cyt-P450 1, -2, và -3 Nhóm c�a Fluco �ãtinh ch� Cyt-P450(BM)này Cyt-P450(BM-1) tinh khi�t t� nó không có ho�t tính monooxygenase � m�c có th� phát hi�n �ư�c trong h�th�ng thí nghi�m chu�n ch�a NADPH v�i ho�c là myristate ho�cpalmitoleate làm cơ ch�t Tuy v�y, Cyt-P450(BM-1) xúc tác c� hai s�th�y phân epoxidation và hydroxylation c�a palmitoleate b�ng cách s� d�ng iodosyl benzene- diacetate, ch�t này �ư�c bi�t là m�t ch�tth� ph�, nó h� tr� s� th�y phân steroid và acid béo b�i m�t s� bi�n

��i c�a các lo�i Cyt-P450 khi không có NADPH, O2, ho�c các c�ut� reductase / redoxin M�i �ây, Fluco và cs �ã tách dòng gen Cyt-P450(BM-1) t� DNA nhi�m s�c th� c�a B.megaterim ATCC 14581

DNA Khung ��c m� mã hóa Cyt-P450(BM-1) mang 410 axit amin

Trang 22

Nguy�n Th� Ng�c Dao100

v�i TLPT là 47,439.Trình t� axit amin c�a Cyt-P450BM1 tương t�nhi�u v�i nh�ng Cyt-P450cam hơn là v�i b�t c� eukaryotes Cyt-P450 nào và gen c�a nó khác rõ r�t v�i gen c�a Cyt-P450(BM-3).Cyt- P450(BM-2) �ã �ư�c tách ra như là m�t c�u t� nh� hơn t�Cyt-P450(BM-3) trong quá trình tinh ch� Cyt-P450(BM-1) Cyt-P450(BM-2) �ã tinh ch� có kh�i lư�ng phân t� kho�ng 46 kDa và d�nhiên b�n thân nó không bi�u hi�n ho�t tính th�y phân axit béo trong h� th�ng thí nghi�m ch�a NADPH Ngư�i ta còn bi�t ít v�Cyt-P450(BM-2)

Cyt-P450(BM-3) th� 3 (là ch� y�u) có ��c trưng r�t thú v� có liên quan t�i c�u trúc và kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng

C� BM-1 và BM-2 ��u có th� �ư�c kích thích t�ng h�p nhi�uhơn 100 l�n b�i phenobarbital và nhi�u barbiturat khác �ây là trư�ng h�p ��u tiên �ư�c bi�t c�a monooxygenase ph� thu�c Cyt-P450 �ư�c t�ng h�p b�ng barbiturat trong prokaryotes Khi có m�tNADPH và O2, BM-3 xúc tác s� th�y phân �-2 c�a axit béo bão hòa, alcohols và amines và s� th�y phân c�ng như epoxi hóa axit béo có m�t liên k�t không bão hòa như là axit palmitic ��c trưng khác duy nh�t c�a Cyt-P450(BM-3) là ��c tính �ã �ư�c t�o ra b�i m�tpolypeptid �ơn l� (MW: 119 000) và có ho�t tính xúc tác ��c l�p.Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 có th� xúc tác s� oxygen hóa axit béo mà không c�n thêm b�t c� protein nào khác, và có ho�t tính xúc tác kho�ng 4.600nmol acid béo �ư�c thu� phân/nmol P450, làm cho

nó tr� thành Cyt-P450 monooxygenase ho�t ��ng nh�t �ư�c công b� cho t�i nay Ho�t tính cao c�a protein có th� �ư�c mô t� c�n c�vào n�ng �� c�a nó là 1 mole FAD và FMN/mole heme và vai trò c�a Cyt-P450 NADPH-reductase và Cyt-P450 trên s�i peptid �ơn.Cyt-P450(BM-3) �ư�c tiêu hoá h�n ch� b�ng trypsin d�n t�i 2 �o�npolypeptid kho�ng 66.000 và 55.000 Da, �o�n th� nh�t �ư�c t�o ra t� ��u C t�n c�a Cyt-P450(BM-3) ch�a c� FAD và FMN nhưng không

có hem và �o�n sau �ư�c xác ��nh là ch�a hem và có kh� n�ng g�nv�i acid béo Protein 55 kDa d�ng b� kh� g�n CO th� hi�n m�t peak

� 446 nm ��c hi�u cho Cyt-P450

Cu�i cùng, Fulco và cs �ã thành công trong vi�c tách dòng gen Cyt-P450(BM-3) nguyên v�n và �ã xác ��nh trình t� axit amin ��y ��c�a nó S� li�u v� trình t� d� ki�n là 1048 g�c axit amin v�i TLPT

là 117,641 Trình t� axit amin c�a �o�n Cyt-P450 có m�t � vùng N- t�n c�a Cyt-P450(BM-3) là tương t� nhi�u hơn (kho�ng 25%) v�i

Trang 23

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 101trình t� c�a Cyt-P450cam �o�n có NADPH – Cyt-P450- Reductase

có kho�ng 33% trình t� gi�ng v�i trình t� c�a gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú

S� d�ng m�t plasmid tái t� h�p mang gen mã hóa Cyt-P450(BM-3),Boddupalli và cs �ã bi�u hi�n Cyt-P450(BM-3) trong E.coli �� t�o ra kho�ng 20% protein hòa tan hoàn toàn và Cyt-P450(BM-3) tinh s�ch S� t�ng h�p Cyt- P450(BM-3) ti�n hành v�i ��i ch�ng dương tham gia vào ít nh�t 2 vùng �i�u hòa (R1 và R2) cái này b�ng qua kho�ng

1 Kb c�a vùng 5'-flanking c�a gen v�i vùng gen tương tác v�i

protein ho�t ��ng v� trí trans

Steroid Hydroxylase (15-j): Cyt-P450meg

Gustafson và cs �ã xác ��nh r�ng Steroid hydroxylase c�a d�ch

chi�t vô bào c�a ch�ng B.megatermin ATCC 13368 là Cyt- P450

ch� th�y phân 3-oxo-�4-steroids (như là progestesone) � v� trí 15�.Cyt-P450meg này �ã �ư�c tinh ch� hoàn toàn và TLPT là 52kDa �ã

�ư�c tính toán cho hemoprotein này 15�-Steroid Hydroxylase �òi h�i 3 c�u t� cho ho�t ��ng xúc tác: 1 Flavoprotein ch�a NADPH ph� thu�c FMN (megaredoxin reductase), 1 protein Fe-S (megaredoxin) và Cyt P450meg �� tìm ki�m các ch�t kích thích t�ng h�p, m�t s� lo�i như steroids, phenobarbital, axit béo… �ã

�ư�c kh�o sát nhưng chưa có ch�t nào có kh� n�ng kích thích t�ngh�p Cyt P450meg

M�t �i�u thú v� là c� megaredoxin và metochondrial adrenodoxin (t� ti th� tuy�n thư�ng th�n) cùng bi�u hi�n ho�t tính chéo trong h� th�ng khác nhau và r�ng megaredoxin reductase có th� �ư�c thay th� b�ng adrenodoxin reductase ho�c NADPH-Cyt P450- Reductase t� microsome gan th� Ví d�, megaredoxin reductase cho �i�n t� ��n Cyt P45011� và Cyt-P450LM-3 microsome gan th�, ch�ng t� r�ng chu�i v�n chuy�n �i�n t� c�a h� th�ng th�y

phân steroid trong B.megatermin ��c hi�u không cao, ngo�i tr� c�u

t� terminal Cyt-P450

Alkane Hydroxylase

Có hai loài vi sinh v�t s�n xu�t ra Alkane Hydroxylase ph�

thu�c Cyt-P450 �ã �ư�c bi�t cho ��n nay M�t là Rhodococcus rhodochrous ATCC 19067, �ã �ư�c x�p lo�i là Coryne bacterium, loài th� 2 là Acinetobacter calcoaceticus.

Cardini và Jurtshuk �ã tìm th�y m�t Hydroxylase n-octan ph�

thu�c vào Cyt-P450 t� rhodochrous m�c trong môi trư�ng ch�a

Trang 24

n-Nguy�n Th� Ng�c Dao102

octane như là ngu�n carbon duy nh�t cho s� phát tri�n Ho�t tính th�y phân �ư�c t�o ra b�i n-octane là 6 l�n cao hơn so v�i ch�t kích thích t�ng h�p là acetate D�ch chi�t vô bào t� nh�ng t� bào b� pháv� b�i siêu âm �ã th�y phân n-octane �� t�o ra 1-octanol như là m�ts�n ph�m duy nh�t trong s� có m�t c�a NADPH, O2và 1 phân �o�nriêng bi�t có s� kh� ��c hi�u th� hi�n quang ph� phân bi�t v�i CO xác ��nh r�ng h� th�ng này là 1�-Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450

H� th�ng th�y phân c�a R.rhodochrous �ư�c �ưa ra g�m m�t

NADPH- Cyt P450- Reductase (1 FAD-FMN protein) và m�t PP450 tương t� như h� th�ng � microsome ��ng v�t có vú Ngư�i

Cyt-ta nh�n th�y r�ng vi khu�n như v�y có kh� n�ng m�c trong môi trư�ng ch�a nh�ng n-alkane khác nhau t� C3 ��n C18 c�a nh�ng alkane không bão hòa dài hơn 10 carbon ho�c th�m chí c�chloroalkanes như là 1-chorooctane và 1 chlorooctadecane

Nghiên c�u m�i �ây cho th�y r�ng Cyt-P450 c�a A.celloacetius

th�y phân C t�n c�a n-alkane và r�ng h� th�ng Cyt-P450 Hydroxylase �ư�c t�o ra b�i 3 c�u t� NADH-feredoxin reductase, feredoxin và Cyt-P450

�-Benson và cs th�y s� có m�t c�a n-alkane Hydroxylase �- 1 mã

hóa b�i gen alkB trên OCT plasmid c�a P.putida Nh�ng enzyme

này không ph�i là protein ph� thu�c Cyt-P450 nhưng là m�t protein g�n màng v�i TLPT là 41kDa

Linalool 8-Methyl Hydroxylase: Cyt-P450lin

Lindalool 8-Methyl Hydroxylase (P450lin) và các c�u t� liên

quan c�a nó �ã �ư�c tinh ch� b�i Ulah và cs t� Pseudomonas putida (incognita), enzyme này �ã �ư�c tách b�i Madyastha và

cs H� th�ng P450lin ch�a 3 protein như là P450cam.TLPT c�a NADH-LIN-red là 44.000, c�a LIN-redoxin

Cyt-là 11.000 và c�a Cyt-P450lin Cyt-là 46.000, r�t g�n v�i s� li�u c�a h�th�ng th�y phân c�a Cyt-P450cam

Trang 25

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 103M�c dù có s� gi�ng nhau v� hóa h�c và v�t lý gi�a camphor và linalool c�a terpence, nhưng không có cái nào trong 3 lin-protein th� hi�n ho�c ho�t tính mi�n d�ch chéo ho�c ho�t tính xúc tác trong h� th�ng tái l�p d� h�p t� Các ch�t kích thích t�ng h�p các enzyme này là acyclic, ho�c cyclicterpenes như là linalool, geraniol, nerol, citronellol ho�c limonene và s� kích thích t�ng h�p c�a h� th�ngnày nh�y c�m v�i glucose, 8-methyl linalool �ư�c oxy hóa thành linalool-8-carboncylic acid qua 8-alcohol và 8-aldehyde c�a nó.Ngư�i ta nh�n th�y r�ng � vi khu�n, t�n t�i h� th�ng tương t� Cyt-P450 th�y phân m�t g�c methyl � v� trí 10 c�a linalool

p-Cymene-7- Hydroxylase: Cyt-P450 cym

Bhattacharyya và cs �ã phân l�p Pseudomonat, ch�ng PL,

ch�ng này lên men � và �-pinence Enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và nh�y v�i glucose Cyt-P450cym c�a Pseudomonas putida PL-W ho�c dòng JT-101 ( cùng m�t dòng như trên) có kh�

n�ng phát tri�n trên cymene (4-isopropyl-toluene) �ư�c coi là cymene-hydroxylase và enzyme th�y phân P-cymene t�o thành cumic alcohol (4-isopropyl-benzyl alcohol) P-putida JT-810 �ư�ctách b�i Ribbon và cs c�ng có kh� n�ng m�c trên P-cymene và bư�c kh�i ��u �ư�c xúc tác b�i m�t enzyme có th� là ph� thu�c

P-Cyt-P450

Dealkylase

Castwright và Broadbent �ã tách và tinh s�ch m�t O-dealkylase

ph� thu�c Cyt-P450 t� Nocrsdia srtain NHI Cyt-P450 kh� alkyl

c�a p-alkylphenyl ethers như là axit anisinic và isovarilate Enzyme này �ư�c t�o ra t� ít nh�t hai c�u t�: Reductase ch�a flavin ��c hi�uNADH (MW >70.000)và Cyt-P450pda (MW: 45,000) Dardas và cs

�ã phân l�p Moraxella SP, loài này có th� m�c trên guaiacol

(2 methoxy- phenol) ho�c 2-ethoxyphenol như là m�t ngu�ncarbon Loài vi khu�n này t�o ra m�t O-demethylase ph� thu�c Cyt-P450

P450 StY Rhizobium Japonicum

Appleby th�y r�ng Cyt P450 có � dòng vi khu�n Rhizobium c�

��nh ��m (dòng CC705), và �ã ti�n hành xác ��nh �ư�c 6 Cyt- P450(a,b,c1 - c4), tinh ch� �ư�c Cyt-P450a,b,c1 T�t c� các Cyt-P450

�ư�c tinh s�ch có TLPT 45,000 Phân tích axit amin c�a các

Trang 26

Cyt-Nguy�n Th� Ng�c Dao104

P450 ch� th�y 2 g�c Cys, ch�ng t� r�ng nó tương t� v�i Cyt-P450

microsom và Pseudomonas, và k�t qu� này �ã �ư�c �ng h� b�i

nh�ng nghiên c�u hóa mi�n d�ch Trong quang ph� h�p th�, nh�ng Cyt-P450 th� hi�n các tr�ng thái spin th�p, Cyt-P450 spin cao và nh�ng Cyt-P450 trung bình Trong t� bào phát tri�n y�m khí có Nitơ, các Cyt-P450 �ư�c t�o ra m�t cách rõ r�t Nh�ng Cyt-P450 này �ư�c g�i chung là nh�ng oxydase, peroxydase ho�c ch�t mang oxygen màng trong m�t con �ư�ng oxy hóa - phosphoryl hóa có hi�u xu�t cao

Nh:ng Cyt-P450 vi khufn khác

M�t Cyt-P450cb hòa tan (MW: 50.000) �ã thu �ư�c b�i

Yamamoto và cs t� Corynebacterin SP m�c trong m�t môi trư�ng

mu�i t�i thi�u ch�a cholesterol như là ngu�n carbon và ngu�n n�ng lư�ng duy nh�t T� �ó, �ã th�y r�ng có m�t s� bi�n ��i r�t r�ng c�acác lo�i Cyt P450 vi khu�n t�n t�i trên trái ��t M�t s� trong các genes P450 �ư�c k�t h�p ch�t ch� trong genom vi khu�n và m�t s�

� trên m�t plasmid v�n chuy�n và chuy�n m�t cách d� dàng t� loài

vi khu�n này sang loài vi khu�n khác, tái t� h�p l�i �� t�o ra nh�ng ch�c n�ng m�i

Cyt-P450-Monooxygenase là nh�ng enzyme khơi mào quan tr�ng cho vi�c b�t ��u các con �ư�ng chuy�n hóa, �ó là, kh� n�ng

�� xúc tác m�t kh�i lư�ng cơ ch�t khác nhau l�n �� t�o ra nh�ng ch�t chuy�n hóa có l�i m�i và kh� n�ng �� chuy�n hóa các cơ ch�tkhông c�n thi�t trong sinh thái h�c V� m�t nghiên c�u cơ b�n, �i�uc�n thi�t là t� ch�c nh�ng nghiên c�u th�c nghi�m nh�m s� d�ngcác Cyt-P450 c�a vi khu�n

M�t s� h� th�ng vi sinh v�t �ã �ư�c nghiên c�u k� trong khi m�ts� khác thì chưa �ó là �i�u khó kh�n cho vi�c nghiên c�u s�n xu�t

�ư�c m�t lư�ng l�n enzyme Tuy nhiên, s� ti�n b� trong k� thu�t thao tác gen cung c�p cho chúng ta phương ti�n �� phát tri�n nh�ng h�th�ng h�u ích hơn ��i v�i c� nghiên c�u khoa h�c l�n áp d�ng th�c t�

4.3 Các enzyme Cytochrome – P450 % thUc vEt

4.3.1 Tính Aa dBng và ch c n8ng c a Cyt-P450 th-c vCt

Cách �ây kho�ng hơn 40 n�m �ã xu�t hi�n 2 công b� ��u tiên v�Cyt-P450 trong các phân �o�n c�a màng tách t� th�c v�t b�c cao, v�m�i liên quan c�a chúng m�t m�t v�i s� oxy hoá các cơ ch�t sinh h�c

Trang 27

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 105(Kaurene) (Murphy và West, 1969) và m�t khác là v�i thu�c tr� sâu (monuron) (Frear và cs, 1969) Ngày nay, �ã có nh�ng ch�ng c� k�tlu�n v� s� tham gia c�a chúng vào s� oxy hoá c�a ít nh�t 30 cơ ch�tsinh h�c và 20 ch�t ngo�i lai (Durst và Benveniste, 1993) T� nh�ng

nghiên c�u v� s� �c ch� và t�ng h�p invivo, s� d�ng m�t s� li�u c�a

nhi�u cơ ch�t khác nhau ngư�i ta th�y r�ng Cyt- P450 có l� tham gia vào m�t s� lư�ng �áng k� các ph�n �ng oxi hoá �òi h�i cho s� sinh t�ng h�p các ch�t chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t Ngư�i ta tin r�ng có nhi�u hơn 20.000 ch�t chuy�n hoá th� c�p mà nh�ng ch�t này �ư�cxác ��nh ��n nay ch� m�i chi�m 5-10% trong t�ng s� toàn b� cơ ch�t

có trong t� nhiên Theo ư�c tính có t�i 200.000 ��n 400.000 ch�tchuy�n hóa th� c�p có trong th�c v�t b�c cao S� lư�ng các ph�n �ng

do Cyt-P450 xúc tác có th� là r�t l�n Ph� r�ng các Cyt-P450 “sinh lý” nhi�u hơn so v�i s� t�n t�i c�a s� ��ng phân c�a enzyme và chúng có tính ��c hi�u cơ ch�t r�ng t� cơ ch�t sinh h�c ��n các ch�ttr� sâu và hoá ch�t môi trư�ng

SU Pa dVng cHa các phen Tng

T�t c� các Cyt-P450 monooxygenase th�c v�t �ư�c mô t� cho t�i nay là các microsomal Cyt-P450 H�u h�t các nghiên c�u v�phân �o�n dư�i t� bào �ã ch� ra r�ng Cyt-P450 g�n vào lư�i n�inguyên sinh m�c dù s� g�n k�t v�i màng bào tương và nh�ng phân

�o�n ti�n không bào c�ng �ã �ư�c công b� (Durst, 1991) Không có d� li�u ch�c ch�n v� Cyt-P450 ti th� hay th� di�p l�c trong th�c v�t S� phân b�, s� kích thích t�ng h�p và ch�c n�ng c�a nh�ng enzyme này �ã �ư�c t�p h�p b�i Durst 1991 Bên c�nh s� thu� phân và epoxi hoá, các Cyt-P450 th�c v�t còn xúc tác m�t s� lư�ng l�n các ph�n �ng ��ng phân hoá, ph�n �ng chuy�n hoá, vòng hoá c�p �ôi C-C và s� oxy hoá kh� bão hoà Nh�ng ho�t tính này ph� thu�c vào m�t s� tính ch�t ��c trưng ��c bi�t c�a hemoprotein th�c v�t nhưngc�ng ph� thu�c vào kh� n�ng ph�n �ng hoá h�c c�a cơ ch�t và c�acác ch�t chuy�n hoá trung gian xúc tác �ư�c sinh ra � v� trí ho�t

��ng M�t ngo�i l� �áng chú ý là enzyme allene oxide synthase (AOS), m�t hemoprotein ph� thu�c NADPH và O2 �ư�c tinh s�ch t� h�t lanh b�i Sony và Brash (1991) Enzym này xúc tác s� kh�hydrat hoá c�a 13-hydroperoxylinoleat (hình 4.3) �� t�o thành m�tallene oxide, ch�t này có th� b� vòng hoá thành axit jasmonic, m�thormon stress c�a th�c v�t ho�c b� thu� phân thành nh�ng �- và ��ketols tương �ng (1, 2 và 3 trong hình 4.3)

Trang 28

Nguy�n Th� Ng�c Dao106

Hình 4.3 Ph�n �ng �ư�c xúc tác b�i allene oxide synthase (AOS)

t� h�t lanh Trình t� peptid suy di�n t� cDNA c�a AOS (CYP 74) �ã �ư�cxác ��nh m�i �ây bi�u hi�n �� l�ch l�n kh�i c�u trúc bình thư�ng c�a Cyt-P450 trong helix L và K và trong vùng liên k�t hem �i�unày �nh hư�ng ��n “rãnh oxygen” �ư�c t�p trung xung quanh axit amin threonin �ư�c b�o t�n cao (T252 trong Cyt-P450cam), axit amin này �ã b� m�t trong AOS

H�u h�t các ho�t ��ng sinh lý �ư�c mô t� cho ��n nay ��u t�ptrung vào 3 con �ư�ng chính (hình 4.4) c�a cái �ư�c g�i là s�chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t: phenylpropanoids (ch�t màu, ch�tb�o v� kh�i tia UV, các phân t� �� kháng), terpenes (sterols, hormone, nh�ng ph�n t� �� kháng, aroma-ch�t thơm), acid béo (cutin và ti�n ch�t suberin, nh�ng ph�n t� �� kháng…)

Ngày càng có thêm nhi�u nh�ng d�n ch�ng rõ ràng là Cyt-P450 còn tham gia vào m�t s� �a d�ng hoá r�t l�n c�a các ch�t chuy�nhoá ��c hi�u loài như là s� th�y phân arginine trong nh�ng loài Cyanogenic (m�u xanh) hay ch�a cyanur (Halkier và Moller, 1991), s� c�p �ôi C-C para-ortho Trong nh�ng loài t�ng h�p opioid (Gerardy và zenk, 1993)… Bên c�nh nh�ng ph�n �ng sinh lý, Cyt-P450 còn �óng m�t vai trò quan tr�ng trong chuy�n hóa sinh h�cc�a các ch�t l�, thu�c tr� sâu, ch�t th�i ��i v�i m�t s� hóa ch�t di�tc� (herbicide) ngư�i ta �ã xác ��nh r�ng Cyt-P450 là y�u t� ��u tiên

�ư�c l�a ch�n �� nghiên c�u và nó c�ng �ư�c chú ý t�i trong s� ra

��i các lo�i ch�t di�t c� sinh h�c

Trang 29

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 107

Hình 4.4 M�t s� cơ ch�t ��c trưng c�a Cyt-P450 th�c v�t: axit

tr-cinnamic, digitoxin, axit oleic và tyrosine

Ghi chú: Fatty acids: Các axit béo; Others: Các ch�t khác

4.3.2 S- t.ng h p cEm ng Cyt-P450 th-c vCt

M�t s� nghiên c�u �ã ch�ng minh cho s� kích thích t�ng h�pch�n l�c m�t s� d�ng Cyt-P450 b�i các nhân t� hoá h�c, v�t lý và sinh lý (b�ng 4.3)

M�t nhóm ch�t �ư�c g�i là safener, là hóa ch�t �ư�c s� d�ng �� b�o v� m�t s� lo�i ng� c�c ch�ng l�i côn trùng Safener c�ng �ư�cs� d�ng trên các cánh ��ng Chúng �ư�c phát tri�n b�i s� sàng l�c, nhưng công trình m�i �ây do m�t s� nhóm, �áng chú ý là nhóm nghiên c�u � phòng thí nghi�m c�a S.Frear � Fargo, �ã g�i ý r�ng

cơ s� phân t� cho safener ho�t ��ng là s� kích thích t�ng h�p các

��ng phân Cyt-P450 Ví d� dư�i �ây �ư�c rút ra t� công trình c�aZeinmerlin và Durst (1992)… S� thanh th�i c�a lúa mì ��i v�i ch�tdi�t c� là do kh� n�ng c�a chúng xúc tác s� th�y phân vòng aryl c�acác c�u trúc hóa h�c khác nhau Ngư�i ta c�ng thu �ư�c s� kích thích t�ng h�p r�t cao b�ng cách k�t h�p, theo m�t trình t� x� lý

Trang 30

Nguy�n Th� Ng�c Dao108

nh�t ��nh, k�t h�p nh�ng �nh hư�ng c�a Phenobarbital (PB) và naphtalic anhydride (NA), m�t safener �ã �ư�c bi�u hi�n t�t Trong thí nghi�m � hình 4.5, ngư�i ta �ã b�c h�t lúa mì b�ng NA và sau 48h n�y m�m, x� lý h�t v�i PB Quá trình k�t h�p này làm t�ng 20

��n 35 l�n s� oxy hóa diclofop- m�t diphenylether, chlorsulfuron- m�t sulfonylurea và chlortoluron- m�t phenylurea Hơn n�a, s� oxy hóa 2,4-D có th� �o �ư�c trong khi �ã không th� phát hi�n �ư�c �h�t ��i ch�ng

Manganese, cadmium, th�y ngân , clofibrate, (axit, ester và các ch�t tương t�), phenobarbital, aminopyrine, ethanol

Biphenyl, arochlor, -naphto flavone, isosaffrole, ch�t di�t c� (2,4-D, monurone, chlortoluron, mecoprof…) Safener (NA, cyometrinil, oxabetrinil, CGA, (133205…) azoles

Vi�c tìm ra nh�ng hóa ch�t gi�ng nhau ho�c tương t� có th�kích thích t�ng h�p Cyt-P450 � c� ��ng v�t và cây xanh làm xu�thi�n câu h�i li�u �ây là s� trùng h�p ng�u nhiên hay th�c t� có th�

là có m�t cơ ch� chung? Nh�ng nghiên c�u v� s� sinh t�ng h�p các enzym th�y phân axit béo th�c v�t do Salaun và c�ng s� ti�n hành (Benveniste và cs 1982, Salaun và cs 1981, Zimmerlin và cs.1992) g�i ý r�ng ít nh�t PB và clofibrate có th� ho�t ��ng ch�c n�ng theo m�t cách tương t� nhau � các t� ch�c ��ng v�t và th�c v�t K�t qu�c�a h� ch� ra r�ng PB và clofibrate kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c enzym th�y phân và ( -1) c�a axit béo chu�i dài và trung bình m�t cách tương �ng

Trong m�t s� loài th�c v�t, ch� y�u là � h� ��u, các axit béo

�ư�c th�y phân m�t cách riêng bi�t � ��u methyl t�n cùng (v� trí )b�i Cyt-P450 microsomal (Benveniste và cs., 1982) C�ng như �

��ng v�t có vú, clofibrate và nh�ng ch�t làm t�ng s� phân chia t�bào peroxisome kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c nh�ng -hydroxylase th�c v�t này (Salaun và cs 1987) và gây ra s� t�ng

Trang 31

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 109cư�ng phân chia peroxisome (cơ quan t� ch�a nhi�u peroxidase)

�áng k� là nh�ng microsome tách t� h�u h�t nh�ng loài th�c v�tkhác nhau ��u xúc tác s� oxy hóa bên trong chu�i � các microsome tách t� h�t lúa mì, axit lauric �ư�c th�y phân � cacbon s� 11, 10, và 9 b�i ( -1)-LAH (Zimmerlin và cs., 1992)

-hydroxylase ( -1)-hydroxylase ( -3)-hydroxylase

(Cây ��u t�m sativa) (Cây lúa mì) (cây artiso Jerusalem)

Hình 4.5 S� ch�n l�a vùng và s� kích thích t�ng h�p h� th�ng

3-laurate-hydroxylase � th�c v�t b�c cao

Như � hình 4.5, enzyme th�y phân ( -1) c�a laurate �ư�c kích thích t�ng h�p t�ng 11 l�n b�i PB Trong cây artiso jerusalem, acid 10-, 9-, và 8-hydroxylauric �ư�c t�o ra b�i IC-LAH, enzyme này c�ng �ư�c kích thích t�ng h�p m�nh b�i PB (Salaun và cs., 1981 và 1993) �i�u �áng chú ý là không có nh�ng phân �o�n microsome nào �ư�c phân tích cho t�i nay là có kh� n�ng th�y phân c� cacbon t�n cùng và g�n t�n cùng �i�u này trái ngư�c rõ v�i các h� th�ng c�a ��ng v�t nơi mà c� hai ph�n �ng ��u x�y ra trong cùng các phân �o�n microsome gi�ng nhau

SU Pa dVng hóa cHa các Cyt-P450 thUc vEt

Trong nh�ng n�m qua, nh�ng ph�n �ng ph� thu�c Cyt-P450 khác nhau �ư�c mô t� � th�c v�t bao g�m m�t s� các d�ng isozym Tuy nhiên, do r�t khó kh�n trong vi�c tinh s�ch các isozyme sao cho v�n gi� �ư�c ho�t tính, nên nh�ng th�c m�c v� tính ��c hi�u cơ ch�tc�a m�t isozyme Cyt-P450 th�c v�t v�n chưa �ư�c gi�i quy�t

M�i �ây, Vrerck-Reichart và cs, trong phòng thí nghi�m c�a h�,

�ã tinh s�ch (Gabriac và cs., 1991) và tách dòng (Teutsch và cs., 1993) �ư�c enzyme cinnamic acid 4-hydroxylase (CA4H), m�t Cyt-P450 ch� y�u � th�c v�t (hình 4.6) Con �ư�ng chuy�n hoá ��y ��này �ư�c kích thích m�nh b�i m�t lo�t các y�u t� sinh h�c và không

Trang 32

Nguy�n Th� Ng�c Dao110

sinh h�c và CA4H d� b� t�n thương m�t ph�n ��i v�i m�t s� th�như ánh sáng, v�t thương, côn trùng và s� ti�p xúc v�i nh�ng hoách�t khác nhau D Pompon (CNRS Gif) và M Kazmaier (Orsan, Paris) �ã bi�u hi�n �ư�c enzyme này v�i hi�u su�t r�t cao (turn-over=400) trong các t� bào n�m men K�t qu� này cung c�p m�t h�th�ng lý tư�ng cho s� phát hi�n cơ ch� chuy�n hoá nh�ng cơ ch�t

Hình 4.6 S� tham gia c�a CA4H và nh�ng Cyt- P450 khác nhau

vào con �ư�ng chuy�n hóa phenylpropanoid

Francis Durst và cs �ã nghiên c�u kh� n�ng xúc tác c�aCA4H ��i v�i t�t c� các cơ ch�t sinh lý c�a Cyt-P450 th�c v�t

�ư�c xác ��nh cho ��n nay và thêm c� m�t s� lư�ng l�n các ch�tngo�i lai �i�u thú v� là không có h�p ch�t sinh h�c nào trong s�

�ó, th�m chí c� phenylpropanoids-ch�t th� hi�n ki�u cinnamate,

là �ư�c chuy�n hoá Ngư�c l�i, 7-ethoxy và 7-methoxycoumarin, ch�t di�t c� chlortoluron và PCMA l�i là cơ ch�t c�a CA4H (b�ng 4.5)

Nh�ng k�t qu� này cho th�y r�ng enzyme, trong khi có s� ph�n

�ng phân bi�t rõ v�i các h�p ch�t n�i sinh có th� có m�t trong cùng nh�ng ng�n dư�i t� bào, l�i c�ng có kh� n�ng t�t �� thích �ng và xúc tác chuy�n hoá các ch�t ngo�i lai

- Các sqc t#

- Các phân tS beo v!

- Các b; phEn cHa thành tW bào

- Các thành phMn bi[u Bì

- Các ch&t beo v! tia

UV

Trang 33

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 111

�i�u thú v� là PCMA c�ng �ư�c chuy�n hoá b�i CYP71 c�a cây

lê tàu (Bozak và CS, 1992), �i�u �ó ch�ng t� r�ng cùng m�t hoá ch�t có th� là cơ ch�t c�a nh�ng ��ng phân khác nhau

B ng 4.4 Nh�ng ph�n �ng do Cyt-P450 xúc tác trong microsomes n�m

men �ư�c bi�n n�p CA4H t� Artiso Jerusalem

Ph n &ng ' #c th( nghi)m C ch t ph n &ng

CA4H

t, n m men

Hi�n nay, có r�t ít thông tin v� m�i liên quan gi�a các Cyt-P450 th�c v�t cùng tham gia trong cùng m�t con �ư�ng chuy�n hoá, nguyên nhân có th� là, m�c dù vi�c phân tích trình t� cDNA �ã tr�nên có th�, nhưng v�n r�t ít (cho t�i gi� m�i có 3) �ã �ư�c g�n v�im�t ph�n �ng sinh lý Trong hình 4.7: di�n t� s� gi�ng nhau gi�a

CA4H tách t� Artiso Jerusalem và 3 trình t� CYP73 khác t� lo�i

cây có t�n, cây ��u xanh và A.thaliana V� trí axit amin ��ng nh�t

>80% là r�t cao khi xét ��n kho�ng cách ti�n hoá gi�a ph�c h�p

fabaceae và brassicaceae �i�u này là b�ng ch�ng cho vai trò trung

tâm c�a CA4H, ch�t xúc tác bư�c oxy hoá ��u tiên trong con �ư�ng

Trang 34

Nguy�n Th� Ng�c Dao112

chuy�n hoá phenylpropanoid Dòng cu�i cùng trong hình 4.7 cho th�y s� gi�ng nhau gi�a cinnamate hydroxylase và 2 flavonoid 3’5’- hydroxylases (CYP 75), enzyme này oxy hoá nh�ng flavonoids ki�u cinnamate Tuy nhiên, ch� m�t ít g�c c�m l�i � m�t s� v� trí là

�ư�c b�o t�n gi�a 2 gia �ình C�ng r�t hay là v�i c�u trúc tinh th�m�i �ây c�a Cyt-P450BM 3 và Cyt-P450 scc, có th� xác ��nh �ư�ccái gì quy�t ��nh trong s� nh�n d�ng cơ ch�t

Hình 4.7 Hàng trên cùng (CYP73.Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các

CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, A thaliana, cây ��u xanh

và cây d�ng t�n, hàng dư�i (pheprop Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a

các CYP73 và CYP75 Hình 4.8 bi�u di�n m�i liên quan ki�u t�ng �ôi m�t trong s� 26Cyt- P450 th�c v�t Ch� có 4 CYP73 (cinnamate hydroxylase) và flavonoid 3’5’-hydroxylase mã hóa cho m�t ch�c n�ng sinh lý xác

��nh 16C rõ r�ng là m�t thành viên m�i c�a gia �ình CYP73

�áng chú ý là không có m�t cá th� nào c�a các Cyt-P450 này là tương t� v�i m�t Cyt-P450 nào khác � ��ng v�t ho�c vi sinh v�t

Trình t� t� 1C t�i 16C �ã thu �ư�c t� Catharantus roseus b�ng

ph�n �ng PCR s� d�ng m�t m�i suy di�n vùng liên k�t hem (Meijer và cs., 1993) Vì trình t� t� 1C ��n 16C là r�t riêng bi�t(t� Cys liên k�t hem t�i ��u carboxy t�n), nên cây ph� h� �ư�cd�a trên m�t trình t� r�t cá bi�t

Trang 35

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 113

Hình 4.8 Cây ph� h� c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 không

��ng nh�t t� C roseus 1,2,3 4: CYP 73 t� 4 loài; 5: flavonoid 3’ 5’ hydroxylase; 6: CYP 71; 7,8,9: nh�ng Cyt-P450 không xác ��nh

Theo D Nelson (http://dnelson.ulmen.edu/cytochrome P450.html), ��n nay ngư�i ta �ã ghi nh�n �ư�c ít nh�t 249 gen CYP

ho�t ��ng � cây mù t�c Arabidopsis thaliana chi�m kho�ng 1%

genome c�a nó

Arabidopsis Cyt-P450 xúc tác bư�c ��u tiên c�a s� sinh t�ngh�p Indol-3-acetic acid ph� thu�c tryptophan (Annak et al.2000) Th�c v�t t�ng h�p m�t lư�ng l�n các ch�t chuy�n hóa th� c�p t�các axit amin và nucleotide Nhi�u ch�t trong s� �ó có vai trò quan tr�ng trong s� phát tri�n c�a th�c v�t và như là nh�ng ch�t �� kháng ch�ng l�i các y�u t� gây b�nh Ch�t chuy�n hóa th� c�p là d�n xu�tc�a tryptophane bao g�m carnalexin, indole glucosinolates và indole -3-acetic acid (IAA) Tuy nhiên nh�ng bư�c �� t�ng h�p ra chúng �i t� tryptophan ho�c nh�ng ti�n ch�t c�a nó v�n còn chưa

rõ Ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c 2 lo�i Arabidopsis Cyt-P450 (CYP 79B2 và CYP 79B3) có th� chuy�n hóa tryptophan thành indole-3-acetaldoxine (IAO x), m�t ti�n ch�t c�a IAA và indole glucosinolates

Arabidopsis CYP 85A2 là m�t Cyt-P-450 tham gia chuy�n hóatrong s� oxy hóa Baeyer-Villiger c�a Castasterone thành Brassinolide trong quá trình sinh t�ng h�p Brassinosteroid (Tae-Wuk Kim et al.2005).S� chuy�n hóa t� castasteron(CS) sang brassinolide(BL), s� oxy hóa ki�u Baeyer-Villiger, là bư�c cu�i

Trang 36

Nguy�n Th� Ng�c Dao114

cùng và là bư�c h�n ch� t�c �� trong s� sinh t�ng h�p BL � cây

xanh Cyt-P450 85A2 c�a Arabidopsis thaliana �ư�c bi�u hi�n d�

th� trong n�m men �ã chuy�n hóa CS thành BL c�ng như là s� oxy hóa v� trí C6 c�a brassinosteroids (BRs) �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450 85A2 là m�t enzyme hai ch�c n�ng v�a oxy hóa BR C6 v�a ho�t ��ng như BL synthase Nh�ng nghiên c�u v� sinh lý, hóa sinh và di truy�n phân t� c�a nh�ng dòng bi�u hi�n m�t ch�c n�ng ho�c bi�u hi�n quá m�c Arabidopsis CYP 85A2 �ã ch�ng minh r�ng castasteron ph�i là m�t brassinosteroid ho�t ��ng sinh h�c,

ch�t này ki�m soát s� m�c và phát tri�n chung c�a cây Arabidopsis.

Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n c�ng cho th�y r�ng BL (brassinolide) có th� không ph�i lúc nào c�ng c�n thi�t cho s� m�c

và l�n lên bình thư�ng nhưng c�ng ch�ng minh r�ng cây

Arabidopsis ��t �ư�c s� m�c và phát tri�n t�t hơn khi có m�t BL

Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n thi�u h�t BR c�a m�t s� tác gi� như

Li và cs 1996, Fujioka và cs,1997, Choe và cs 1998, Bishop và cs 1999… �ã ch� ra r�ng thi�u h�t BR gây ra s� gi�m chi�u dài c�ach�i, gi�m �� phì nhiêu, ch�m già, làm bi�n ��i s� v�n chuy�n các mao m�ch và s� phát sinh quang hình thái Ngư�i ta �ã xác d�nh

�ư�c nh�ng gen bi�u th� cho s� sinh t�ng h�p BR CYP 85A1, CYP

85A2, CYP90A1, CYP90B1 �ư�c tìm th�y trong Arabidopsis CYP

90D2 và CYP92A6 �ư�c xác ��nh có m�t trong lúa g�o và ��u m�tcách tương �ng

Ngư�i ta c�ng ch�ng minh �ư�c r�ng m�t Arabidopsis

Cyt-P450, CYP85A2, m�t BR-C-6 oxidase, c�ng có kh� n�ng ho�t ��ng như m�t BL synthase trong s� chuy�n hóa CS thành BL

CYP 85A1 và CYP85 A2 có ho�t tính ��c hi�u cơ ch�t khác nhau Arabidopsis CYPP450 cà chua ch�a 2 lo�i CYP 85 (CYP85A1 và CYP85A2) tương t� nhau, chúng chuy�n hóa 6-deoxo CS thành CS,6-deoxoTY thành TY,6-deoxo 3DHT thành 3-DHT và 6-deoxoTE thành TE CYP85A1 và 85A2 �ư�c bi�u hi�nd� th� trong n�m men c�ng xúc tác ph�n �ng oxy hóa C-6 c�a BRs

và cho th�y r�ng c� 2 lo�i CYP 85A1 và A2 ��u có th� ho�t ��ng

như BR C-6 oxydase T�i sao Arabidopsis l�i có 2 b� gen mã hóa

nh�ng enzyme có cùng ch�c n�ng thì cho ��n nay ngư�i ta v�nchưa gi�i thích �ư�c

G�n �ây ngư�i ta �ã ch�ng minh �ư�c r�ng CS �ư�c sinh t�ng h�p t� cholesterol (CHR) qua các C27-BR, nh�ng ch�t này có cùng

Trang 37

Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 115khung cacbon như là 28-norcastasterone (28-nor CS) trong cây cà chua non Hơn n�a ngư�i ta còn ch�ng minh �ư�c r�ng 28-nor CS

có th� �ư�c chuy�n hóa thành CS b�i m�t lo�i enzyme xúc tác là sterolmethyltransferase ph� thu�c S-adenosyl-L-Methionine trong

cây cà chua Trong Arabidopsis s� chuy�n hóa t� CHR thành

cholestanol �ã �ư�c ch�ng minh (Nakajima và cs 2002) Ngư�i ta c�ng xác ��nh �ư�c r�ng s� chuy�n hóa t� 28-nor CS thành CS

c�ng x�y ra � Aradopsis �i�u này g�i ý r�ng con �ư�ng sinh t�ng

h�p C27-BR t� CHR �� t�o ra CS c�ng di�n ra trong th�c v�t Các k�t qu� nghiên c�u ch� ra r�ng CYP85A1 và CYP85A2 có

ái l�c khác nhau v�i các cơ ch�t C27-BRs và C28-BRs, m�c dùchúng cùng có kh� n�ng ho�t ��ng như BR C-6 oxidase (Tae-Wuk Kim et al 2005)

Trang 38

Ch ng V

NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BI U HI N

C A CHÚNG

5.1 C"u trúc c'a gen Cyt-P450

Gia �ình gen Cyt-P450 bao g�m m�t s� l��ng l�n các thành viên phân b� r�ng rãi trong t� nhiên Cho ��n nay �ã có hơn 270 gia

�ình gen CYP (Cyt-P450) khác nhau v�i 18 gia �ình gen ���c ghi nh�n � ��ng v�t có vú (Nelson, 2006) � ng��i, có 57 gen CYP phân b� trong 18 gia �ình và 42 d��i gia �ình M�t genom ��ng v�t

có vú ch�a nh�ng gen Cyt-P450 �a d�ng và nhi�u nhánh S� l��ngcác gen Cyt-P450 � genom ��ng v�t có vú ch�a ���c xác ��nh m�tcách chính xác, nh�ng nh�ng gì �ã bi�t v� các gene mRNAs, protein và ho�t tính enzym g�i ý r�ng m�i m�t genom �ơn b�i c�a

��ng v�t linh tr��ng hay ��ng v�t g�m nh�m có l� ��u ch�a 50-100 gen Cyt-P450

Thành t�u l�n lao trong k� thu�t sinh h�c phân t� nh�ng n�mg�n �ây bao g�m vi�c tách dòng gen, ��c trình t�, và bi�u hi�ngen trong nh�ng t� bào d� th� c�ng ch�a làm rõ h�t ���c m�t s�các ��c �i�m quan tr�ng và cơ b�n c�a nhi�u thành viên trong gia

�ình �a gen này C�u trúc exon-intron c�a g�n 50 gen ��ng v�t

có vú �ã ���c làm rõ Thông tin này cung c�p cơ s� h�p lý �� x�p lo�i gia �ình gen Cyt-P450 Chúng ta c�ng �ã có nh�ng hi�ubi�t v� các gen Cyt-P450 trong các cơ th� b�c th�p nh� vi khu�n

và n�m Trình t� cDNA t� 6 lo�i n�m và 7 gia �ình gen vi khu�n

�ã ���c công b� m�i �ây Phân tích so sánh trình t� cho th�y có s� t�ơng t� l�n gi�a các gen CYP � ng��i và vi khu�n g�i ý v�m�t t� tiên chung c�a ��i gia �ình CYP vào kho�ng 3 t� n�mtr��c �ây

Trang 39

Nguy�n Th� Ng�c Dao118

5.1.1 Gia ình và d i gia ình gen Cyt-P450 (CYP)

Các gen Cyt-P450 ���c x�p lo�i thành các gia �ình và d��i gia

�ình theo s� gi�ng nhau trong trình t� các axit amin do chúng mã hoá

và m�t danh pháp có tính h� th�ng d�a trên s� phân lo�i này �ã ���c

��a ra Nói chung, các thành viên trong m�t gia �ình v� cơ b�n có cùng m�t c�u trúc gen và trình t� axit amin do chúng mã hoá khác nhau ít hơn 40% Nh�ng CYP có trình t� gi�ng nhau 40% ���c

��a vào m�t gia �ình, ký hi�u b�ng m�t s� � R�p, n�u gi�ng nhau 55% là thành viên c�a m�t d��i gia �ình, ký hi�u b�ng m�t ch�cái, ví d� CYP 7A và CYP 7B N�u thêm 1 thành viên m�i vào CYP 7A thì s� ���c g�i là CYP 7A2 B�t c� m�t c�p gen nào trong m�tdu�i gia �ình c�ng mã hóa nh�ng axit amin nh�t ��nh v�i s� t�ơng

��ng l�n hơn 55%, các v� trí mã hóa t�ơng �ng và các gen c�a cùng m�t loài ���c liên k�t ch�t ch� trong m�t nhi�m s�c th�(chromosome) Tuy nhiên, c�ng có m�t s� ngo�i l� ��i v�i quy t�ctrên Nebert và cs �ã có m�t �� xu�t v� cách x�p lo�i ��y �� và danh pháp cho các gen P450 (xem ph�n Ph� tr�ơng)

5.1.2 Các c m gen "ng v#t có vú

Nh�ng nghiên c�u nh�m xác ��nh v� trí � NST c�a các gen

��ng v�t có vú �ã ���c t�p trung vào genom c�a ng��i và chu�tnh�t Trong kho�ng 20 d��i gia �ình Cyt-P450 ��ng v�t có vú, 16 gen �ã ���c xác ��nh � nh�ng NST ��c hi�u � ng��i ho�c chu�t(B�ng 5.1) Nh� � b�ng 5.1, các gen CYP �ã phân tán qua nhi�uNST khác nhau, �ôi khi t�o thành nh�ng búi gen Cho t�i lúc này các gen ng��i và chu�t �ã ���c b�n �� hóa Búi th� nh�t ��nh v�trên nhánh dài c�a NST 19 � ng��i, NST 7 � chu�t nh�t và NST 1

� chu�t c�ng và bao g�m kho�ng 10 trình t� gen ho�c t�ơng t�gen c�a CYP2A, CYP2B và CYP2F (d��i gia �ình) Simmon và Kasper (theo Osamu Gotoh) tìm th�y s� liên k�t ch�t ch� gi�anh�ng búi gen này và locus Coh (Coumarin hydroxylase) c�achu�t nh�t Sau �ó, Negishi và cs �ã kh�ng ��nh r�ng gen Coh th�c ra ���c mã hóa b�i CYP2A5 Ho�t tính th�y phân coumarin v� trí s� 7 � ng��i c�ng ���c mã hóa b�i 1 gen CYP2A Búi gen CYP21A � ng��i ho�c chu�t nh�t bao g�m 1 gen th�t và 1 gi� gen c�a nó Nh�ng gen (và gi� gen) này ���c s�p x�p m�t cách ng�unhiên trong h�n h�p phù h�p t� ch�c c�a HLA trên NST 6P �ng��i và NST 17 c�a chu�t nh�t

Trang 40

Ch ng V Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 119

B ng 5.1 V� trí trên NST c�a các gen Cyt-P450 � ��ng v�t có vú

(theo Osamu Gotoh)

Chu�t nh�t CYP1a2 1 9 c�nh Mpi-1 SH, RI

Chu�t nh�t CYP2a >6 7 c�nh Col 1 , Gpi-1 SH, RI, BC Chu�t nh�t CYP2c >7 19 c�nh Gol-1 SH, IS

Chu�t nh�t CYP2d >5 1517 cm 55 kDa SH, RI

Ngày đăng: 06/12/2015, 11:30

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng, - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng, (Trang 2)
Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác (Trang 5)
Hình 4.3. Ph�n �ng �ư�c xúc tác b�i allene oxide synthase (AOS) - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.3. Ph�n �ng �ư�c xúc tác b�i allene oxide synthase (AOS) (Trang 28)
Hình 4.4. M�t s� cơ ch�t ��c trưng c�a Cyt-P450 th�c v�t: axit - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.4. M�t s� cơ ch�t ��c trưng c�a Cyt-P450 th�c v�t: axit (Trang 29)
Hình 4.5. S� ch�n l�a vùng và s� kích thích t�ng h�p h� th�ng - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.5. S� ch�n l�a vùng và s� kích thích t�ng h�p h� th�ng (Trang 31)
Hình 4.6. S� tham gia c�a CA4H và nh�ng Cyt- P450 khác nhau - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.6. S� tham gia c�a CA4H và nh�ng Cyt- P450 khác nhau (Trang 32)
Hình 4.7. Hàng trên cùng (CYP73.Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các  CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, A - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.7. Hàng trên cùng (CYP73.Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, A (Trang 34)
Hình 4.8. Cây ph� h� c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 không - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 4.8. Cây ph� h� c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 không (Trang 35)
Hình 5.1. Bi�u �� d�ng c�t c�a exon (A) và intron (B) (các kích c� c�a - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 5.1. Bi�u �� d�ng c�t c�a exon (A) và intron (B) (các kích c� c�a (Trang 41)
Hình 5.2. Bi�u �� d�ng c�t c�a hàm lư�ng G+C � v� trí codon th� 3 ��i v�i 52 gen Cyt-P450 loài g�m nh�m (A)  và 52 gen Cyt-P450 ��ng v�t có - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 5.2. Bi�u �� d�ng c�t c�a hàm lư�ng G+C � v� trí codon th� 3 ��i v�i 52 gen Cyt-P450 loài g�m nh�m (A) và 52 gen Cyt-P450 ��ng v�t có (Trang 42)
Hình 5.4. S� ��nh v� c�a các intron trong m�i liên quan v�i trình t� protein - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 5.4. S� ��nh v� c�a các intron trong m�i liên quan v�i trình t� protein (Trang 51)
Hình 5.5.  Nh�ng y�u t� �i�u hoà DNA phía trư�c c�a gen Cyt-P450 - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 5.5. Nh�ng y�u t� �i�u hoà DNA phía trư�c c�a gen Cyt-P450 (Trang 57)
Hình 5.6. S� phiên mã ��c hi�u gi�i c�a các gen Cyt-P450 15 - Ebook cytochrome   p450  phần 2   PGS TS  nguyễn thị ngọc dao
Hình 5.6. S� phiên mã ��c hi�u gi�i c�a các gen Cyt-P450 15 (Trang 69)

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

🧩 Sản phẩm bạn có thể quan tâm