Cyt-P450 alk alkan terminal hydroxylase cHa n&m men a dMu hNa Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol.. h
Trang 14.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450 n m men và n m s i
S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b�l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith Cùng n�m
�ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�.Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 �
��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�utrúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong
Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là
Cyt-P450(14DM), lanosterol 14 – demethylase
Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�pth� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ãcung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con men S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c
Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b�
nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�itrong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào, còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn Tuy nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt P450 nh�t
��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b�sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450 T�ng s� các Cyt-P450 trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��igia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��
Trang 2Nguy�n Th� Ng�c Dao80
�áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t
��nh �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n
ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a
vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao
- Kh� axít béo bão hòa acyl CoA
- Kh� axít béo bão hòa ergostadienol
- Kh� methyl c�a sterol
- Kh� methyl c�a lanosterrol
- Kh� bão hòa c�a ergostadienol
- Oxy hóa các xenobiotic Squalene epoxidate
Hình 4.1 H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng,
fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor
(y�u t� nh�y c�m v�i cyanide)
B ng 4.1 Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i
n�m men và n�m s�i
14 -demethyl hoá các sterol
22 kh� bão hoà ergosterol
Thu� phân kh�i mào các alkan
Thu� phân các axit béo
Chuy�n hoá các xenobiotic
T�o thành isobuten
P45014D P45022DS P450 alkan P450 alki,c B
a a a a P450 hpha P450RM
H�u h�t vi sinh v�t
Có th� h�u h�t N�m men tiêu th� Alkan
Candida tropical Saccharomyces cerevisiae Schizoscc pombe
Candida tropical Cunighamella elegan Cunighamella baireiri Aspergillus sp
Rhodotorula minuta
Trang 3Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 81Chuy�n hoá nitrat/nitrit
Demethyl hoá pisatin
Thu� phân m-cresol
Sinh t�ng h�p aflatoxin
Sinh t�ng ergot alkaloid
Thu� phân progesterone
P450dNIR P450(57)d a
a a a
Fusarium oxysporum Nectria haematococca Aspergillus parasitous
Claviceps purpurea Aspergillus Ocraceousrhizopusnigricas
Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác
��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a
nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein tương �ng chưa tách �ư�c
4.1.2 Cyt-P450 c a n m men
Cyt-P450 (14DM) (Lanosterol 14 -demethylase)
Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S cerevisiae và C albicans, trong �ó S cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong
các lo�i n�m men Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol
�� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá
Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh
Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S cerevisiae có TLPT 58.000 khi
�i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700) D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm, tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45 D�ng kh�- CO có b�ng h�p th� � 447nm Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�aferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I S�chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol, m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn B�ng cách s� d�ng s� bi�n
��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�pch�t này
Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác nhưpyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph�
��c trưng cho typ II Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t
Trang 4Nguy�n Th� Ng�c Dao82
azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n
ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch�Cyt-P45014DM
Nh:ng thu;c tính xúc tác
Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4, demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPH-P450-reductase, O2và NADPH (hình 4.2) Ph�n �ng này bao g�m
3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l�chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32 H�ng s� Km
và Vmax c�a lanosterol 14 -demethylase c�a S cerevisiae tái t�o
�ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�othành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng Vì s� methyl hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� �trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác nhi�u quá trình oxy hoá /phút Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�nh�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k =20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s�kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min-1 �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch�s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh� Lanosterol 14 -demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14 , 24, 25 dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM) Vì không có
24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý Thêm vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�tlanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không b� chuy�n hóa Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�icholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá thu�c không �áng k�
Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó
và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14 -demethylase
Trang 5Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 83
Hình 4.2 S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác
b�i Cyt-P450 14DM
C&u trúc bEc 1
C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t�
nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S cerevisiae, C.albican
và C.tropical Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i
tr�ng lương phân t� là 60.700 (S cerevisiae) Xem xét c�u trúc b�c
1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, Cyt-P45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u N- t�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�.�áng chú ý là m�t
�o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng
�ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin � ��u M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh
là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n;
ví d�: - QR :::: RK - trong S cerevisiae Cyt-P45014DM �i�u �ó g�i
ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n
�ư�c cho là g�n màng S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong Cyt-P450alk Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho Cyt-P450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú Theo nghiên c�u c�aChen và cs nh�ng Cyt-P45014DM t� S cerevisiae và C.tropicals có
343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay
HO
Trang 6Nguy�n Th� Ng�c Dao84
th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh M�t trong s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi
là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i
�i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G D) trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân
t� S cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a
Cyt-P45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI Trình t� axit amin c�a P45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp
Cyt-�ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam.S� d�ng máy tính có thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�iVi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t�Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này
(317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào
thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch �i�u �ó g�i ý r�ng vùng này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th�bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng
Cyt-P450 14DM nh là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng n&m Azole
M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như
là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m T�t c�nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14 -demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM
S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol
và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào Bi�n ��i trong s�t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát tri�n ho�c ch�t Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân azole kháng n�m S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn
có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n ��quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác
� nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch M�c dù nh�ng d�n xu�tazole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơc�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch� Tuy v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao
Trang 7Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 85
��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c Cơ s�cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t
��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t�tác nhân azole kháng n�m
Cyt-P450 (alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a dMu hNa
Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol Ph�n
�ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i P450 khác �ư�c g�i là P450alk Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�nnh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y
Cyt-trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp ho�c nh�ng
t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan P450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan
Cyt-c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng Genomic DNA
��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247 C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alkv�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như
là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs
Tính không PQng nh&t phân tS
Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a
vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C IAM maltosa
12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543 axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và
kho�ng 25% �ư�c b�o t�n Sanglard và Fiechter phát hi�n gen Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu �
trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ
enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk2 vàCyt-P450alk3, m�t cách tương �ng Seghezzi và cs công b� r�ng gen Cyt-P450alk2 là m�t protein ch�a 522 axit amin Kích thư�cphân t� c�a Cyt-P450alk2 có th� so sánh v�i kích thư�c c�a
-C.maltosa Cyt-P450alk Sanglard và cs xác ��nh r�ng TLPT trên
�i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn
�áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n trong S
cerevisiae Tuy nhiên, Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,
Trang 8Nguy�n Th� Ng�c Dao86
g�i ý r�ng Cyt-P450alk2xúc tác s� th�y phân alkane Tóm l�i, P450alk2 tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a
Cyt-C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a C.maltosa �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals
bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau Sanglard và cs g�i ýr�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p
vì Cyt-P450alk và alk2 ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�ms�c th�
Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác
Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�tnhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n
và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr�methionin g�n � ��u �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che ch�n b�i các axit amin tích �i�n Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t�
C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450
spin th�p Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công
b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c 450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247 Phân tích quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên
tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t�ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�nd�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane M�c khác, Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c
công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�ihexadecane
M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và
NADPH-P450-reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a
hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�pc�a Cyt-P45014DM M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là Cyt-P450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�nph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�,b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng Cyt-P450alk1 �ư�cdòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk2 t� ra có s� ��c hi�u
cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên
Trang 9Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 87
M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn hóa hXc
Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�tgây ��t bi�n hóa h�c M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t
hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S cerevisiae Cyt-P450 này (còn �ư�c
g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500 Cyt-P450 này th�hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�iCyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh
nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c �áng chú ý là hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so v�i nh�ng Cyt-P45014DM Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt-P450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407, m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�utrúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng
M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU
tVo thành isobuten tY isovaleric acid
Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i
phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u
khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene Vì isobutene �ư�c t�othành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s�
�áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành isobutence (H.4.7) M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào
R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s�
chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�aNADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�ntr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450 Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit
isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta
�ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh M�i
�ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�tkhi �i�n di Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th�hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�iaxit isovaleric Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc tác c�a nó
Trang 10Nguy�n Th� Ng�c Dao88
Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã
�ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�an�m men �ã �ư�c bi�t Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ngch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u Cyt-P450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�tmàng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên �i�unày g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�ctìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã
�ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này S�chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c Cyt-P450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh�carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14
�-lanosterol Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450
Cyt-P450 22DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^ trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol
S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2và b�
�c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men Tuy nhiên, ph�n
�ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng P450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome
Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o
ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ngnày �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t
�ư�c g�i là Cyt-P45022DS Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�ctách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa
�ư�c làm rõ
4.1.3 Cyt-P450 c a n m s i (Filamentous Fungi)
Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum
Shoun và cs �ã công b� r�ng F oxysporum ch�a Cyt-P450 c� �
microsome và phân �o�n hoà tan �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i
Trang 11Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 89màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t
�o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite Thêm n�a,
ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t
ngo�i lai
Cyt-P450 P ,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan
Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c
tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F oxysporum Hai s�n ph�m này h�u
h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng TLPT bi�u ki�nc�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000
và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y
S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000 D�ng oxy hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n �
��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm ��nh h�p th� c�a h�nh�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm C�n ph�i làm rõ li�unh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các
cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�ilaurate M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th�
��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate M�t khác, ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh�c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và447nm (m�t cách tương �ng) Như v�y, không có m�t ch�ng minh ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B
SU thu` phân acid béo
Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F oxysporum �ã chuy�n
hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3 S� tái l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch�c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�nchuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450 Trên phân �o�n t� bào, ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân
�o�n hoà tan Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c
Trang 12Nguy�n Th� Ng�c Dao90
xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong quá trình phân hu� t� bào Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�ttính này v�n chưa �ư�c xác ��nh
Cyt-P450 hoà tan P ,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c Nitrit
S� phát tri�n c�a F oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và
m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�anh�ng t� bào này (b�ng 4.2)
B ng 4.2 S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit
trong F oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs)
Nitơ vô cơ
thêm vào
( 0,2%)
S�c khí Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein)
Phân �o�n tan Phân �o�n microsome
Kph 0,288 0,685 0,0035 0,013 kph
0,085 0,075 0,103 0,11 0,014 0,012
�ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450 hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�ttính xúc tác trên
Trang 13Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 91
Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450 cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14 trong sinh tbng h,p sterol
Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và
��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men,
�c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s�14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i S� dư th�asterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng
trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i
SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p
Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng
h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid
�ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p P450 b�i Phenobarbital B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�chi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin
Cyt-b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý
Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a
Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a
m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�ct�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin
�ư�c t�o ra b�i n�m này Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các
ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng
M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin:
Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là
Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá
c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin Pisatin là m�t ch�t ��c do
n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay
t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn Ho�ttính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao (20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin
Trang 14Nguy�n Th� Ng�c Dao92
�ư�c coi là th�p (<5�M) Theo �ó, s� kh� ��c c�a pisatin �ư�ccoi là ch�c n�ng n�i t�i c�a Cyt-P450 này và s� t�ng h�p c�a nó
là m�t cơ ch� t� v� sinh h�c �� ch�ng l�i h�p ch�t kháng khu�n M�t gen (CYP57) mã hoá cho Cyt-P450 này �ã �ư�c dòng hoá
và ��c trình t�
SU chuy[n hoá các ch&t lV
Ho�t tính Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) �ã �ư�c th�y
trong Cunning hamella elegans, C bainierit và Asp Ochraceus TS
Ho�t tính AHH c�a nh�ng n�m này �ã �ư�c kích thích t�ng h�pb�i m�t s� arylhydrocarbon (hydrocacbon nhi�u vòng nhân thơm), b� �c ch� b�i nh�ng ch�t �c ch� ��c hi�u Cyt-P450 như là CO và SKF 525 A và ��nh v� trong phân �o�n microsomal Cerniglia và Gibson �ã ti�n hành phân tích ��u tiên nh�ng phân t� t�
benzo[a]pyrence do AHH xúc tác c�a C.elegans và ch� ra r�ng
AHH c�a n�m cho ra cùng m�t s�n ph�m như là s�n ph�m �ư�c t�othành b�i enzyme t� ��ng v�t có vú M�i �ây, m�t gene c�a Cyt-P450 �áp �ng cho s� chuy�n hóa c�a benzo[a]pyrence �ã �ư�c xác
��nh trong Asp.niger và �ư�c g�i là CYP53 Các microsomes c�a A ocraceus TS và Rhizopus nigrican �ã �ư�c công b� là có ho�t tính
thu� phân 11�- progesterone và ho�t tính này �ư�c coi là ph� thu�cvào Cyt-P450 d�a trên s� nh�y c�m c�a nó ��i v�i m�t s� ch�t �cch� Cyt-P450 ��c hi�u
Chloride peroxidase (chloro peroxidase) không phei là m;t thành viên cHa các Cyt-P450
Chloride peroxidase [EC.1.11.1.10] là m�t glycohemoprotein có m�t protoheme g�n v�i thiolate như là nhóm ngo�i �ư�c t�o ra b�i
Caldariomyces fumago,là m�t enzyme ngo�i bào C�u trúc
ligand và k�t qu� ��c trưng quang ph� phân t� enzyme này là r�tgi�ng v�i c�a các Cyt-P450 Tuy nhiên, c�u trúc protein c�a nókhác rõ r�t v�i c�a các Cyt-P450, dòng hoá cDNA và phân tích trình t� cho th�y r�ng apoprotein c�a Chloride peroxidase ch�a 321 axit amin v�i TLPT 35.202 và không tìm th�y s� tương ��ng gi�ac�u trúc b�c 1 c�a nó v�i c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450S TLPT bi�u ki�n c�a enzyme này �ã �ư�c xác ��nh là 42.000 v�i 25 – 30%carbonhydrate Như v�y, Chloride peroxidase không �ư�c x�p vào siêu gia �ình Cyt-P450 m�c dù thu�c tính quang ph� là tương t� v�icác enzyme này
Trang 15Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 93
4.1.4 +i,u hoà s- t.ng h p Cyt-P450 b i vi khu1n nhân th-c
Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào
�i�u ki�n phát tri�n Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t
��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng
�i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong
vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau Cyt-P450alk c�a Candida sp �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c
hi�u b�i n-alkane Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen P450alk b�i n-alkane S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk
S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�uc�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác Cyt-P450 t�o
thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó S�
thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng
h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F oxysporum S� t�ng h�p c�m
�ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph�thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i
M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng
O2th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y Vì n�ng
�� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�an�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nhhư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này Liên quan v�i �i�u này là nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�yc�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450 Như mô t� trong chương
5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh�n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoàbi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng Các Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp
�ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�tcho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u
Trang 16Nguy�n Th� Ng�c Dao94
hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là m�t ��c trưng quan tr�ng Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�uhoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450 monooxygenase trong th� nhân th�t
4.2 Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn
4.2.1 Nh4ng enzyme Cyt-P450 c a vi khu1n: Cyt-P450cam
Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ
nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1)
4.2.2 Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam
N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�aCamphor như là ngu�n carbon duy nh�t S� oxy hoá Camphor �ư�cb�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ngmonooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh� H�th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3 enzyme tham gia là:
a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT 45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A
b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT 11,418) mã hoá b�i gen Cam B
c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538;
414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C S� t�o thành tính enzyme c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s�chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol
Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra 2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase (MW: 38,377; 361 axit amin) Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor
�ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�cg�i là CAM 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã
�ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor Nh�ng gen
Trang 17Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 95này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�tbúi gen và t�o thành Cam operon Cam R, m�t gen �i�u hoà âm,
��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�pv�i Cam operon
Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơnphân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB Ch�tkìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i
nó khi có m�t Camphor
Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t�
��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�pkhác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng h�p có tính enzyme
Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam
D và Cam R RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi
�y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT) Gen
�i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng)trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�aCam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator
này in vitro V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine
-Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D, AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B Mã kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A M�t c�utrúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và
m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các
gen A và B
M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã
�ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th�
�ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này
4.2.3 C u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450 cam
Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P putida �ó là m�t trong nh�ng
h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�aCyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�tlư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá Nh�ng
Trang 18Nguy�n Th� Ng�c Dao96
nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam,không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này (xem Chương 2)
4.2.4 M:i liên quan gi4a c u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450 cam
Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v�trí ��c hi�u ��i v�i protein này Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ãthành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và c�a nh�ng Cyt-P450 khác Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�uhơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�ttinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh
�� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�nkhông th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�chi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i
hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng
t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th�m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein Cyt-P450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và PdR
Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và
cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu
� trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�idithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�uki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�aP450cam Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin O-dealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�tho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơch�t Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�ttính th� hai l�i r�t cao (250%) Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n
��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t
Trang 19Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 97
g;t biWn enh h %ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd (putidaredoxin)
Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác, nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�ienzyme t� nhiên) Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2
và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme
��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i
K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C protein t� Pd �ã b� khóa l�i B�ng phân tích stopped flow s� d�ng
Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c
�� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c ��phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là 40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5
Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��nenzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính enzyme Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p
�áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV)
Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2( 2) c�a guanidin và = NH( )c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�thình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2( 1) khác c�a các d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�anhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s�chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này
có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�ivi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh� Th�c ra, nhóm c�aSligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như
là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd Ngư�i ta c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�agia �ình Cyt-P450 Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên, g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t�n�i phân t� ��n s�t hem
S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs
�ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463), m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có
Trang 20Nguy�n Th� Ng�c Dao98
th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase c�a nó Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136) c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam,m�t cách tương �ng
g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen
M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm (Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t�oxygen Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t�Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương
�ng M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t, phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng g�c acid amin � vùng này Trong s� nh�ng g�c không phân c�c, Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch�y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450 Thr 252 h�u nhưkhông bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�tcho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�nhóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase Thr 252 �ã bi�n
��i thành A, V ho�c S T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�tv�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous, oxygen hóa và CO-ferrous
Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�aenzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor
�ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy peroxide Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i
Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�pperoxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b�kh� 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�ttính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i.Nhưv�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân
Trang 21Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 99
�ôi liên k�t O-O c�a O2 trong ph�n �ng oxygenase Nh�ng nghiên
c�u gây ��t bi�n các v� trí c�a Cyt-P450 cam có th� xem thêm trong
Chương I và Chương II � cu�n sách này
Nh:ng P;t biWn % liên kWt c ch&t
Dùng phương pháp phân tích c�u trúc tinh th� tia X, ngư�i ta �ãti�n hành quan sát các v� trí axit amin b� bi�n ��i � các v� trí như t�o
ra các protein v�i Y96F, V247A, V295I, R186H, D251N, T101, I209L… so sánh ho�t tính enzyme bi�n ��i v�i typ d�i �� rút ra nh�n xét v� vai trò c�a các axit amin này trong s� liên k�t v�i cơch�t Bư�c ��u nh�n th�y vai trò thi�t y�u c�a các axit amin � các v�trí như 117, 209, 365 Ngư�i ta c�ng nh�n th�y là �� �áp �ng cho nhi�u cơ ch�t khác nhau, các axit amin tham gia vào s� liên k�t c�a
cơ ch�t thư�ng n�m � các v� trí trong vùng “m�m d�o” có kh� n�ng bi�n ��i cao
4.2.5 Nh4ng h< th:ng Cyt-P450 các vi khu1n khác
SU thu` phân axit béo: P450 (BM-1) , P450 (BM-2) và P450 (BM-3)
Bacillus megaterium ATCC 14581 �ư�c bi�t là có ch�a
Cyt-P450 th�y phân axit béo Fluco và cs s� d�ng ch�t chi�t không có t�bào c�a vi khu�n �ã phát hi�n Cyt-P450 th�y phân axit béo hòa tan, enzyme này xúc tác s� th�y phân �1, �2 và �3 c�a các acid béo bão hòa, các alcohol và các amide Enzyme �òi h�i m�t cách tuy�t
��i NADPH như là ch�t cho �i�n t� S� th�y phân nhóm methyl t�ncùng, �-1, �ã �ư�c quan sát �i�u này ngư�c v�i Cyt-P450 th�yphân acid béo � � ��ng v�t có vú, enzyme này c�ng th�y phân �-1 Các enzyme th�y phân acid béo này là m�t h�n h�p c�a 3 Cyt- P450 khác nhau, �ó là Cyt-P450 1, -2, và -3 Nhóm c�a Fluco �ãtinh ch� Cyt-P450(BM)này Cyt-P450(BM-1) tinh khi�t t� nó không có ho�t tính monooxygenase � m�c có th� phát hi�n �ư�c trong h�th�ng thí nghi�m chu�n ch�a NADPH v�i ho�c là myristate ho�cpalmitoleate làm cơ ch�t Tuy v�y, Cyt-P450(BM-1) xúc tác c� hai s�th�y phân epoxidation và hydroxylation c�a palmitoleate b�ng cách s� d�ng iodosyl benzene- diacetate, ch�t này �ư�c bi�t là m�t ch�tth� ph�, nó h� tr� s� th�y phân steroid và acid béo b�i m�t s� bi�n
��i c�a các lo�i Cyt-P450 khi không có NADPH, O2, ho�c các c�ut� reductase / redoxin M�i �ây, Fluco và cs �ã tách dòng gen Cyt-P450(BM-1) t� DNA nhi�m s�c th� c�a B.megaterim ATCC 14581
DNA Khung ��c m� mã hóa Cyt-P450(BM-1) mang 410 axit amin
Trang 22Nguy�n Th� Ng�c Dao100
v�i TLPT là 47,439.Trình t� axit amin c�a Cyt-P450BM1 tương t�nhi�u v�i nh�ng Cyt-P450cam hơn là v�i b�t c� eukaryotes Cyt-P450 nào và gen c�a nó khác rõ r�t v�i gen c�a Cyt-P450(BM-3).Cyt- P450(BM-2) �ã �ư�c tách ra như là m�t c�u t� nh� hơn t�Cyt-P450(BM-3) trong quá trình tinh ch� Cyt-P450(BM-1) Cyt-P450(BM-2) �ã tinh ch� có kh�i lư�ng phân t� kho�ng 46 kDa và d�nhiên b�n thân nó không bi�u hi�n ho�t tính th�y phân axit béo trong h� th�ng thí nghi�m ch�a NADPH Ngư�i ta còn bi�t ít v�Cyt-P450(BM-2)
Cyt-P450(BM-3) th� 3 (là ch� y�u) có ��c trưng r�t thú v� có liên quan t�i c�u trúc và kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng
C� BM-1 và BM-2 ��u có th� �ư�c kích thích t�ng h�p nhi�uhơn 100 l�n b�i phenobarbital và nhi�u barbiturat khác �ây là trư�ng h�p ��u tiên �ư�c bi�t c�a monooxygenase ph� thu�c Cyt-P450 �ư�c t�ng h�p b�ng barbiturat trong prokaryotes Khi có m�tNADPH và O2, BM-3 xúc tác s� th�y phân �-2 c�a axit béo bão hòa, alcohols và amines và s� th�y phân c�ng như epoxi hóa axit béo có m�t liên k�t không bão hòa như là axit palmitic ��c trưng khác duy nh�t c�a Cyt-P450(BM-3) là ��c tính �ã �ư�c t�o ra b�i m�tpolypeptid �ơn l� (MW: 119 000) và có ho�t tính xúc tác ��c l�p.Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 có th� xúc tác s� oxygen hóa axit béo mà không c�n thêm b�t c� protein nào khác, và có ho�t tính xúc tác kho�ng 4.600nmol acid béo �ư�c thu� phân/nmol P450, làm cho
nó tr� thành Cyt-P450 monooxygenase ho�t ��ng nh�t �ư�c công b� cho t�i nay Ho�t tính cao c�a protein có th� �ư�c mô t� c�n c�vào n�ng �� c�a nó là 1 mole FAD và FMN/mole heme và vai trò c�a Cyt-P450 NADPH-reductase và Cyt-P450 trên s�i peptid �ơn.Cyt-P450(BM-3) �ư�c tiêu hoá h�n ch� b�ng trypsin d�n t�i 2 �o�npolypeptid kho�ng 66.000 và 55.000 Da, �o�n th� nh�t �ư�c t�o ra t� ��u C t�n c�a Cyt-P450(BM-3) ch�a c� FAD và FMN nhưng không
có hem và �o�n sau �ư�c xác ��nh là ch�a hem và có kh� n�ng g�nv�i acid béo Protein 55 kDa d�ng b� kh� g�n CO th� hi�n m�t peak
� 446 nm ��c hi�u cho Cyt-P450
Cu�i cùng, Fulco và cs �ã thành công trong vi�c tách dòng gen Cyt-P450(BM-3) nguyên v�n và �ã xác ��nh trình t� axit amin ��y ��c�a nó S� li�u v� trình t� d� ki�n là 1048 g�c axit amin v�i TLPT
là 117,641 Trình t� axit amin c�a �o�n Cyt-P450 có m�t � vùng N- t�n c�a Cyt-P450(BM-3) là tương t� nhi�u hơn (kho�ng 25%) v�i
Trang 23Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 101trình t� c�a Cyt-P450cam �o�n có NADPH – Cyt-P450- Reductase
có kho�ng 33% trình t� gi�ng v�i trình t� c�a gen Cyt-P450 ��ng v�t có vú
S� d�ng m�t plasmid tái t� h�p mang gen mã hóa Cyt-P450(BM-3),Boddupalli và cs �ã bi�u hi�n Cyt-P450(BM-3) trong E.coli �� t�o ra kho�ng 20% protein hòa tan hoàn toàn và Cyt-P450(BM-3) tinh s�ch S� t�ng h�p Cyt- P450(BM-3) ti�n hành v�i ��i ch�ng dương tham gia vào ít nh�t 2 vùng �i�u hòa (R1 và R2) cái này b�ng qua kho�ng
1 Kb c�a vùng 5'-flanking c�a gen v�i vùng gen tương tác v�i
protein ho�t ��ng v� trí trans
Steroid Hydroxylase (15-j): Cyt-P450meg
Gustafson và cs �ã xác ��nh r�ng Steroid hydroxylase c�a d�ch
chi�t vô bào c�a ch�ng B.megatermin ATCC 13368 là Cyt- P450
ch� th�y phân 3-oxo-�4-steroids (như là progestesone) � v� trí 15�.Cyt-P450meg này �ã �ư�c tinh ch� hoàn toàn và TLPT là 52kDa �ã
�ư�c tính toán cho hemoprotein này 15�-Steroid Hydroxylase �òi h�i 3 c�u t� cho ho�t ��ng xúc tác: 1 Flavoprotein ch�a NADPH ph� thu�c FMN (megaredoxin reductase), 1 protein Fe-S (megaredoxin) và Cyt P450meg �� tìm ki�m các ch�t kích thích t�ng h�p, m�t s� lo�i như steroids, phenobarbital, axit béo… �ã
�ư�c kh�o sát nhưng chưa có ch�t nào có kh� n�ng kích thích t�ngh�p Cyt P450meg
M�t �i�u thú v� là c� megaredoxin và metochondrial adrenodoxin (t� ti th� tuy�n thư�ng th�n) cùng bi�u hi�n ho�t tính chéo trong h� th�ng khác nhau và r�ng megaredoxin reductase có th� �ư�c thay th� b�ng adrenodoxin reductase ho�c NADPH-Cyt P450- Reductase t� microsome gan th� Ví d�, megaredoxin reductase cho �i�n t� ��n Cyt P45011� và Cyt-P450LM-3 microsome gan th�, ch�ng t� r�ng chu�i v�n chuy�n �i�n t� c�a h� th�ng th�y
phân steroid trong B.megatermin ��c hi�u không cao, ngo�i tr� c�u
t� terminal Cyt-P450
Alkane Hydroxylase
Có hai loài vi sinh v�t s�n xu�t ra Alkane Hydroxylase ph�
thu�c Cyt-P450 �ã �ư�c bi�t cho ��n nay M�t là Rhodococcus rhodochrous ATCC 19067, �ã �ư�c x�p lo�i là Coryne bacterium, loài th� 2 là Acinetobacter calcoaceticus.
Cardini và Jurtshuk �ã tìm th�y m�t Hydroxylase n-octan ph�
thu�c vào Cyt-P450 t� rhodochrous m�c trong môi trư�ng ch�a
Trang 24n-Nguy�n Th� Ng�c Dao102
octane như là ngu�n carbon duy nh�t cho s� phát tri�n Ho�t tính th�y phân �ư�c t�o ra b�i n-octane là 6 l�n cao hơn so v�i ch�t kích thích t�ng h�p là acetate D�ch chi�t vô bào t� nh�ng t� bào b� pháv� b�i siêu âm �ã th�y phân n-octane �� t�o ra 1-octanol như là m�ts�n ph�m duy nh�t trong s� có m�t c�a NADPH, O2và 1 phân �o�nriêng bi�t có s� kh� ��c hi�u th� hi�n quang ph� phân bi�t v�i CO xác ��nh r�ng h� th�ng này là 1�-Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450
H� th�ng th�y phân c�a R.rhodochrous �ư�c �ưa ra g�m m�t
NADPH- Cyt P450- Reductase (1 FAD-FMN protein) và m�t PP450 tương t� như h� th�ng � microsome ��ng v�t có vú Ngư�i
Cyt-ta nh�n th�y r�ng vi khu�n như v�y có kh� n�ng m�c trong môi trư�ng ch�a nh�ng n-alkane khác nhau t� C3 ��n C18 c�a nh�ng alkane không bão hòa dài hơn 10 carbon ho�c th�m chí c�chloroalkanes như là 1-chorooctane và 1 chlorooctadecane
Nghiên c�u m�i �ây cho th�y r�ng Cyt-P450 c�a A.celloacetius
th�y phân C t�n c�a n-alkane và r�ng h� th�ng Cyt-P450 Hydroxylase �ư�c t�o ra b�i 3 c�u t� NADH-feredoxin reductase, feredoxin và Cyt-P450
�-Benson và cs th�y s� có m�t c�a n-alkane Hydroxylase �- 1 mã
hóa b�i gen alkB trên OCT plasmid c�a P.putida Nh�ng enzyme
này không ph�i là protein ph� thu�c Cyt-P450 nhưng là m�t protein g�n màng v�i TLPT là 41kDa
Linalool 8-Methyl Hydroxylase: Cyt-P450lin
Lindalool 8-Methyl Hydroxylase (P450lin) và các c�u t� liên
quan c�a nó �ã �ư�c tinh ch� b�i Ulah và cs t� Pseudomonas putida (incognita), enzyme này �ã �ư�c tách b�i Madyastha và
cs H� th�ng P450lin ch�a 3 protein như là P450cam.TLPT c�a NADH-LIN-red là 44.000, c�a LIN-redoxin
Cyt-là 11.000 và c�a Cyt-P450lin Cyt-là 46.000, r�t g�n v�i s� li�u c�a h�th�ng th�y phân c�a Cyt-P450cam
Trang 25Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 103M�c dù có s� gi�ng nhau v� hóa h�c và v�t lý gi�a camphor và linalool c�a terpence, nhưng không có cái nào trong 3 lin-protein th� hi�n ho�c ho�t tính mi�n d�ch chéo ho�c ho�t tính xúc tác trong h� th�ng tái l�p d� h�p t� Các ch�t kích thích t�ng h�p các enzyme này là acyclic, ho�c cyclicterpenes như là linalool, geraniol, nerol, citronellol ho�c limonene và s� kích thích t�ng h�p c�a h� th�ngnày nh�y c�m v�i glucose, 8-methyl linalool �ư�c oxy hóa thành linalool-8-carboncylic acid qua 8-alcohol và 8-aldehyde c�a nó.Ngư�i ta nh�n th�y r�ng � vi khu�n, t�n t�i h� th�ng tương t� Cyt-P450 th�y phân m�t g�c methyl � v� trí 10 c�a linalool
p-Cymene-7- Hydroxylase: Cyt-P450 cym
Bhattacharyya và cs �ã phân l�p Pseudomonat, ch�ng PL,
ch�ng này lên men � và �-pinence Enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và nh�y v�i glucose Cyt-P450cym c�a Pseudomonas putida PL-W ho�c dòng JT-101 ( cùng m�t dòng như trên) có kh�
n�ng phát tri�n trên cymene (4-isopropyl-toluene) �ư�c coi là cymene-hydroxylase và enzyme th�y phân P-cymene t�o thành cumic alcohol (4-isopropyl-benzyl alcohol) P-putida JT-810 �ư�ctách b�i Ribbon và cs c�ng có kh� n�ng m�c trên P-cymene và bư�c kh�i ��u �ư�c xúc tác b�i m�t enzyme có th� là ph� thu�c
P-Cyt-P450
Dealkylase
Castwright và Broadbent �ã tách và tinh s�ch m�t O-dealkylase
ph� thu�c Cyt-P450 t� Nocrsdia srtain NHI Cyt-P450 kh� alkyl
c�a p-alkylphenyl ethers như là axit anisinic và isovarilate Enzyme này �ư�c t�o ra t� ít nh�t hai c�u t�: Reductase ch�a flavin ��c hi�uNADH (MW >70.000)và Cyt-P450pda (MW: 45,000) Dardas và cs
�ã phân l�p Moraxella SP, loài này có th� m�c trên guaiacol
(2 methoxy- phenol) ho�c 2-ethoxyphenol như là m�t ngu�ncarbon Loài vi khu�n này t�o ra m�t O-demethylase ph� thu�c Cyt-P450
P450 StY Rhizobium Japonicum
Appleby th�y r�ng Cyt P450 có � dòng vi khu�n Rhizobium c�
��nh ��m (dòng CC705), và �ã ti�n hành xác ��nh �ư�c 6 Cyt- P450(a,b,c1 - c4), tinh ch� �ư�c Cyt-P450a,b,c1 T�t c� các Cyt-P450
�ư�c tinh s�ch có TLPT 45,000 Phân tích axit amin c�a các
Trang 26Cyt-Nguy�n Th� Ng�c Dao104
P450 ch� th�y 2 g�c Cys, ch�ng t� r�ng nó tương t� v�i Cyt-P450
microsom và Pseudomonas, và k�t qu� này �ã �ư�c �ng h� b�i
nh�ng nghiên c�u hóa mi�n d�ch Trong quang ph� h�p th�, nh�ng Cyt-P450 th� hi�n các tr�ng thái spin th�p, Cyt-P450 spin cao và nh�ng Cyt-P450 trung bình Trong t� bào phát tri�n y�m khí có Nitơ, các Cyt-P450 �ư�c t�o ra m�t cách rõ r�t Nh�ng Cyt-P450 này �ư�c g�i chung là nh�ng oxydase, peroxydase ho�c ch�t mang oxygen màng trong m�t con �ư�ng oxy hóa - phosphoryl hóa có hi�u xu�t cao
Nh:ng Cyt-P450 vi khufn khác
M�t Cyt-P450cb hòa tan (MW: 50.000) �ã thu �ư�c b�i
Yamamoto và cs t� Corynebacterin SP m�c trong m�t môi trư�ng
mu�i t�i thi�u ch�a cholesterol như là ngu�n carbon và ngu�n n�ng lư�ng duy nh�t T� �ó, �ã th�y r�ng có m�t s� bi�n ��i r�t r�ng c�acác lo�i Cyt P450 vi khu�n t�n t�i trên trái ��t M�t s� trong các genes P450 �ư�c k�t h�p ch�t ch� trong genom vi khu�n và m�t s�
� trên m�t plasmid v�n chuy�n và chuy�n m�t cách d� dàng t� loài
vi khu�n này sang loài vi khu�n khác, tái t� h�p l�i �� t�o ra nh�ng ch�c n�ng m�i
Cyt-P450-Monooxygenase là nh�ng enzyme khơi mào quan tr�ng cho vi�c b�t ��u các con �ư�ng chuy�n hóa, �ó là, kh� n�ng
�� xúc tác m�t kh�i lư�ng cơ ch�t khác nhau l�n �� t�o ra nh�ng ch�t chuy�n hóa có l�i m�i và kh� n�ng �� chuy�n hóa các cơ ch�tkhông c�n thi�t trong sinh thái h�c V� m�t nghiên c�u cơ b�n, �i�uc�n thi�t là t� ch�c nh�ng nghiên c�u th�c nghi�m nh�m s� d�ngcác Cyt-P450 c�a vi khu�n
M�t s� h� th�ng vi sinh v�t �ã �ư�c nghiên c�u k� trong khi m�ts� khác thì chưa �ó là �i�u khó kh�n cho vi�c nghiên c�u s�n xu�t
�ư�c m�t lư�ng l�n enzyme Tuy nhiên, s� ti�n b� trong k� thu�t thao tác gen cung c�p cho chúng ta phương ti�n �� phát tri�n nh�ng h�th�ng h�u ích hơn ��i v�i c� nghiên c�u khoa h�c l�n áp d�ng th�c t�
4.3 Các enzyme Cytochrome – P450 % thUc vEt
4.3.1 Tính Aa dBng và ch c n8ng c a Cyt-P450 th-c vCt
Cách �ây kho�ng hơn 40 n�m �ã xu�t hi�n 2 công b� ��u tiên v�Cyt-P450 trong các phân �o�n c�a màng tách t� th�c v�t b�c cao, v�m�i liên quan c�a chúng m�t m�t v�i s� oxy hoá các cơ ch�t sinh h�c
Trang 27Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 105(Kaurene) (Murphy và West, 1969) và m�t khác là v�i thu�c tr� sâu (monuron) (Frear và cs, 1969) Ngày nay, �ã có nh�ng ch�ng c� k�tlu�n v� s� tham gia c�a chúng vào s� oxy hoá c�a ít nh�t 30 cơ ch�tsinh h�c và 20 ch�t ngo�i lai (Durst và Benveniste, 1993) T� nh�ng
nghiên c�u v� s� �c ch� và t�ng h�p invivo, s� d�ng m�t s� li�u c�a
nhi�u cơ ch�t khác nhau ngư�i ta th�y r�ng Cyt- P450 có l� tham gia vào m�t s� lư�ng �áng k� các ph�n �ng oxi hoá �òi h�i cho s� sinh t�ng h�p các ch�t chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t Ngư�i ta tin r�ng có nhi�u hơn 20.000 ch�t chuy�n hoá th� c�p mà nh�ng ch�t này �ư�cxác ��nh ��n nay ch� m�i chi�m 5-10% trong t�ng s� toàn b� cơ ch�t
có trong t� nhiên Theo ư�c tính có t�i 200.000 ��n 400.000 ch�tchuy�n hóa th� c�p có trong th�c v�t b�c cao S� lư�ng các ph�n �ng
do Cyt-P450 xúc tác có th� là r�t l�n Ph� r�ng các Cyt-P450 “sinh lý” nhi�u hơn so v�i s� t�n t�i c�a s� ��ng phân c�a enzyme và chúng có tính ��c hi�u cơ ch�t r�ng t� cơ ch�t sinh h�c ��n các ch�ttr� sâu và hoá ch�t môi trư�ng
SU Pa dVng cHa các phen Tng
T�t c� các Cyt-P450 monooxygenase th�c v�t �ư�c mô t� cho t�i nay là các microsomal Cyt-P450 H�u h�t các nghiên c�u v�phân �o�n dư�i t� bào �ã ch� ra r�ng Cyt-P450 g�n vào lư�i n�inguyên sinh m�c dù s� g�n k�t v�i màng bào tương và nh�ng phân
�o�n ti�n không bào c�ng �ã �ư�c công b� (Durst, 1991) Không có d� li�u ch�c ch�n v� Cyt-P450 ti th� hay th� di�p l�c trong th�c v�t S� phân b�, s� kích thích t�ng h�p và ch�c n�ng c�a nh�ng enzyme này �ã �ư�c t�p h�p b�i Durst 1991 Bên c�nh s� thu� phân và epoxi hoá, các Cyt-P450 th�c v�t còn xúc tác m�t s� lư�ng l�n các ph�n �ng ��ng phân hoá, ph�n �ng chuy�n hoá, vòng hoá c�p �ôi C-C và s� oxy hoá kh� bão hoà Nh�ng ho�t tính này ph� thu�c vào m�t s� tính ch�t ��c trưng ��c bi�t c�a hemoprotein th�c v�t nhưngc�ng ph� thu�c vào kh� n�ng ph�n �ng hoá h�c c�a cơ ch�t và c�acác ch�t chuy�n hoá trung gian xúc tác �ư�c sinh ra � v� trí ho�t
��ng M�t ngo�i l� �áng chú ý là enzyme allene oxide synthase (AOS), m�t hemoprotein ph� thu�c NADPH và O2 �ư�c tinh s�ch t� h�t lanh b�i Sony và Brash (1991) Enzym này xúc tác s� kh�hydrat hoá c�a 13-hydroperoxylinoleat (hình 4.3) �� t�o thành m�tallene oxide, ch�t này có th� b� vòng hoá thành axit jasmonic, m�thormon stress c�a th�c v�t ho�c b� thu� phân thành nh�ng �- và ��ketols tương �ng (1, 2 và 3 trong hình 4.3)
Trang 28Nguy�n Th� Ng�c Dao106
Hình 4.3 Ph�n �ng �ư�c xúc tác b�i allene oxide synthase (AOS)
t� h�t lanh Trình t� peptid suy di�n t� cDNA c�a AOS (CYP 74) �ã �ư�cxác ��nh m�i �ây bi�u hi�n �� l�ch l�n kh�i c�u trúc bình thư�ng c�a Cyt-P450 trong helix L và K và trong vùng liên k�t hem �i�unày �nh hư�ng ��n “rãnh oxygen” �ư�c t�p trung xung quanh axit amin threonin �ư�c b�o t�n cao (T252 trong Cyt-P450cam), axit amin này �ã b� m�t trong AOS
H�u h�t các ho�t ��ng sinh lý �ư�c mô t� cho ��n nay ��u t�ptrung vào 3 con �ư�ng chính (hình 4.4) c�a cái �ư�c g�i là s�chuy�n hoá th� c�p � th�c v�t: phenylpropanoids (ch�t màu, ch�tb�o v� kh�i tia UV, các phân t� �� kháng), terpenes (sterols, hormone, nh�ng ph�n t� �� kháng, aroma-ch�t thơm), acid béo (cutin và ti�n ch�t suberin, nh�ng ph�n t� �� kháng…)
Ngày càng có thêm nhi�u nh�ng d�n ch�ng rõ ràng là Cyt-P450 còn tham gia vào m�t s� �a d�ng hoá r�t l�n c�a các ch�t chuy�nhoá ��c hi�u loài như là s� th�y phân arginine trong nh�ng loài Cyanogenic (m�u xanh) hay ch�a cyanur (Halkier và Moller, 1991), s� c�p �ôi C-C para-ortho Trong nh�ng loài t�ng h�p opioid (Gerardy và zenk, 1993)… Bên c�nh nh�ng ph�n �ng sinh lý, Cyt-P450 còn �óng m�t vai trò quan tr�ng trong chuy�n hóa sinh h�cc�a các ch�t l�, thu�c tr� sâu, ch�t th�i ��i v�i m�t s� hóa ch�t di�tc� (herbicide) ngư�i ta �ã xác ��nh r�ng Cyt-P450 là y�u t� ��u tiên
�ư�c l�a ch�n �� nghiên c�u và nó c�ng �ư�c chú ý t�i trong s� ra
��i các lo�i ch�t di�t c� sinh h�c
Trang 29Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 107
Hình 4.4 M�t s� cơ ch�t ��c trưng c�a Cyt-P450 th�c v�t: axit
tr-cinnamic, digitoxin, axit oleic và tyrosine
Ghi chú: Fatty acids: Các axit béo; Others: Các ch�t khác
4.3.2 S- t.ng h p cEm ng Cyt-P450 th-c vCt
M�t s� nghiên c�u �ã ch�ng minh cho s� kích thích t�ng h�pch�n l�c m�t s� d�ng Cyt-P450 b�i các nhân t� hoá h�c, v�t lý và sinh lý (b�ng 4.3)
M�t nhóm ch�t �ư�c g�i là safener, là hóa ch�t �ư�c s� d�ng �� b�o v� m�t s� lo�i ng� c�c ch�ng l�i côn trùng Safener c�ng �ư�cs� d�ng trên các cánh ��ng Chúng �ư�c phát tri�n b�i s� sàng l�c, nhưng công trình m�i �ây do m�t s� nhóm, �áng chú ý là nhóm nghiên c�u � phòng thí nghi�m c�a S.Frear � Fargo, �ã g�i ý r�ng
cơ s� phân t� cho safener ho�t ��ng là s� kích thích t�ng h�p các
��ng phân Cyt-P450 Ví d� dư�i �ây �ư�c rút ra t� công trình c�aZeinmerlin và Durst (1992)… S� thanh th�i c�a lúa mì ��i v�i ch�tdi�t c� là do kh� n�ng c�a chúng xúc tác s� th�y phân vòng aryl c�acác c�u trúc hóa h�c khác nhau Ngư�i ta c�ng thu �ư�c s� kích thích t�ng h�p r�t cao b�ng cách k�t h�p, theo m�t trình t� x� lý
Trang 30Nguy�n Th� Ng�c Dao108
nh�t ��nh, k�t h�p nh�ng �nh hư�ng c�a Phenobarbital (PB) và naphtalic anhydride (NA), m�t safener �ã �ư�c bi�u hi�n t�t Trong thí nghi�m � hình 4.5, ngư�i ta �ã b�c h�t lúa mì b�ng NA và sau 48h n�y m�m, x� lý h�t v�i PB Quá trình k�t h�p này làm t�ng 20
��n 35 l�n s� oxy hóa diclofop- m�t diphenylether, chlorsulfuron- m�t sulfonylurea và chlortoluron- m�t phenylurea Hơn n�a, s� oxy hóa 2,4-D có th� �o �ư�c trong khi �ã không th� phát hi�n �ư�c �h�t ��i ch�ng
Manganese, cadmium, th�y ngân , clofibrate, (axit, ester và các ch�t tương t�), phenobarbital, aminopyrine, ethanol
Biphenyl, arochlor, -naphto flavone, isosaffrole, ch�t di�t c� (2,4-D, monurone, chlortoluron, mecoprof…) Safener (NA, cyometrinil, oxabetrinil, CGA, (133205…) azoles
Vi�c tìm ra nh�ng hóa ch�t gi�ng nhau ho�c tương t� có th�kích thích t�ng h�p Cyt-P450 � c� ��ng v�t và cây xanh làm xu�thi�n câu h�i li�u �ây là s� trùng h�p ng�u nhiên hay th�c t� có th�
là có m�t cơ ch� chung? Nh�ng nghiên c�u v� s� sinh t�ng h�p các enzym th�y phân axit béo th�c v�t do Salaun và c�ng s� ti�n hành (Benveniste và cs 1982, Salaun và cs 1981, Zimmerlin và cs.1992) g�i ý r�ng ít nh�t PB và clofibrate có th� ho�t ��ng ch�c n�ng theo m�t cách tương t� nhau � các t� ch�c ��ng v�t và th�c v�t K�t qu�c�a h� ch� ra r�ng PB và clofibrate kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c enzym th�y phân và ( -1) c�a axit béo chu�i dài và trung bình m�t cách tương �ng
Trong m�t s� loài th�c v�t, ch� y�u là � h� ��u, các axit béo
�ư�c th�y phân m�t cách riêng bi�t � ��u methyl t�n cùng (v� trí )b�i Cyt-P450 microsomal (Benveniste và cs., 1982) C�ng như �
��ng v�t có vú, clofibrate và nh�ng ch�t làm t�ng s� phân chia t�bào peroxisome kích thích t�ng h�p m�t cách ch�n l�c nh�ng -hydroxylase th�c v�t này (Salaun và cs 1987) và gây ra s� t�ng
Trang 31Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 109cư�ng phân chia peroxisome (cơ quan t� ch�a nhi�u peroxidase)
�áng k� là nh�ng microsome tách t� h�u h�t nh�ng loài th�c v�tkhác nhau ��u xúc tác s� oxy hóa bên trong chu�i � các microsome tách t� h�t lúa mì, axit lauric �ư�c th�y phân � cacbon s� 11, 10, và 9 b�i ( -1)-LAH (Zimmerlin và cs., 1992)
-hydroxylase ( -1)-hydroxylase ( -3)-hydroxylase
(Cây ��u t�m sativa) (Cây lúa mì) (cây artiso Jerusalem)
Hình 4.5 S� ch�n l�a vùng và s� kích thích t�ng h�p h� th�ng
3-laurate-hydroxylase � th�c v�t b�c cao
Như � hình 4.5, enzyme th�y phân ( -1) c�a laurate �ư�c kích thích t�ng h�p t�ng 11 l�n b�i PB Trong cây artiso jerusalem, acid 10-, 9-, và 8-hydroxylauric �ư�c t�o ra b�i IC-LAH, enzyme này c�ng �ư�c kích thích t�ng h�p m�nh b�i PB (Salaun và cs., 1981 và 1993) �i�u �áng chú ý là không có nh�ng phân �o�n microsome nào �ư�c phân tích cho t�i nay là có kh� n�ng th�y phân c� cacbon t�n cùng và g�n t�n cùng �i�u này trái ngư�c rõ v�i các h� th�ng c�a ��ng v�t nơi mà c� hai ph�n �ng ��u x�y ra trong cùng các phân �o�n microsome gi�ng nhau
SU Pa dVng hóa cHa các Cyt-P450 thUc vEt
Trong nh�ng n�m qua, nh�ng ph�n �ng ph� thu�c Cyt-P450 khác nhau �ư�c mô t� � th�c v�t bao g�m m�t s� các d�ng isozym Tuy nhiên, do r�t khó kh�n trong vi�c tinh s�ch các isozyme sao cho v�n gi� �ư�c ho�t tính, nên nh�ng th�c m�c v� tính ��c hi�u cơ ch�tc�a m�t isozyme Cyt-P450 th�c v�t v�n chưa �ư�c gi�i quy�t
M�i �ây, Vrerck-Reichart và cs, trong phòng thí nghi�m c�a h�,
�ã tinh s�ch (Gabriac và cs., 1991) và tách dòng (Teutsch và cs., 1993) �ư�c enzyme cinnamic acid 4-hydroxylase (CA4H), m�t Cyt-P450 ch� y�u � th�c v�t (hình 4.6) Con �ư�ng chuy�n hoá ��y ��này �ư�c kích thích m�nh b�i m�t lo�t các y�u t� sinh h�c và không
Trang 32Nguy�n Th� Ng�c Dao110
sinh h�c và CA4H d� b� t�n thương m�t ph�n ��i v�i m�t s� th�như ánh sáng, v�t thương, côn trùng và s� ti�p xúc v�i nh�ng hoách�t khác nhau D Pompon (CNRS Gif) và M Kazmaier (Orsan, Paris) �ã bi�u hi�n �ư�c enzyme này v�i hi�u su�t r�t cao (turn-over=400) trong các t� bào n�m men K�t qu� này cung c�p m�t h�th�ng lý tư�ng cho s� phát hi�n cơ ch� chuy�n hoá nh�ng cơ ch�t
Hình 4.6 S� tham gia c�a CA4H và nh�ng Cyt- P450 khác nhau
vào con �ư�ng chuy�n hóa phenylpropanoid
Francis Durst và cs �ã nghiên c�u kh� n�ng xúc tác c�aCA4H ��i v�i t�t c� các cơ ch�t sinh lý c�a Cyt-P450 th�c v�t
�ư�c xác ��nh cho ��n nay và thêm c� m�t s� lư�ng l�n các ch�tngo�i lai �i�u thú v� là không có h�p ch�t sinh h�c nào trong s�
�ó, th�m chí c� phenylpropanoids-ch�t th� hi�n ki�u cinnamate,
là �ư�c chuy�n hoá Ngư�c l�i, 7-ethoxy và 7-methoxycoumarin, ch�t di�t c� chlortoluron và PCMA l�i là cơ ch�t c�a CA4H (b�ng 4.5)
Nh�ng k�t qu� này cho th�y r�ng enzyme, trong khi có s� ph�n
�ng phân bi�t rõ v�i các h�p ch�t n�i sinh có th� có m�t trong cùng nh�ng ng�n dư�i t� bào, l�i c�ng có kh� n�ng t�t �� thích �ng và xúc tác chuy�n hoá các ch�t ngo�i lai
- Các sqc t#
- Các phân tS beo v!
- Các b; phEn cHa thành tW bào
- Các thành phMn bi[u Bì
- Các ch&t beo v! tia
UV
Trang 33Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 111
�i�u thú v� là PCMA c�ng �ư�c chuy�n hoá b�i CYP71 c�a cây
lê tàu (Bozak và CS, 1992), �i�u �ó ch�ng t� r�ng cùng m�t hoá ch�t có th� là cơ ch�t c�a nh�ng ��ng phân khác nhau
B ng 4.4 Nh�ng ph�n �ng do Cyt-P450 xúc tác trong microsomes n�m
men �ư�c bi�n n�p CA4H t� Artiso Jerusalem
Ph n &ng ' #c th( nghi)m C ch t ph n &ng
CA4H
t, n m men
Hi�n nay, có r�t ít thông tin v� m�i liên quan gi�a các Cyt-P450 th�c v�t cùng tham gia trong cùng m�t con �ư�ng chuy�n hoá, nguyên nhân có th� là, m�c dù vi�c phân tích trình t� cDNA �ã tr�nên có th�, nhưng v�n r�t ít (cho t�i gi� m�i có 3) �ã �ư�c g�n v�im�t ph�n �ng sinh lý Trong hình 4.7: di�n t� s� gi�ng nhau gi�a
CA4H tách t� Artiso Jerusalem và 3 trình t� CYP73 khác t� lo�i
cây có t�n, cây ��u xanh và A.thaliana V� trí axit amin ��ng nh�t
>80% là r�t cao khi xét ��n kho�ng cách ti�n hoá gi�a ph�c h�p
fabaceae và brassicaceae �i�u này là b�ng ch�ng cho vai trò trung
tâm c�a CA4H, ch�t xúc tác bư�c oxy hoá ��u tiên trong con �ư�ng
Trang 34Nguy�n Th� Ng�c Dao112
chuy�n hoá phenylpropanoid Dòng cu�i cùng trong hình 4.7 cho th�y s� gi�ng nhau gi�a cinnamate hydroxylase và 2 flavonoid 3’5’- hydroxylases (CYP 75), enzyme này oxy hoá nh�ng flavonoids ki�u cinnamate Tuy nhiên, ch� m�t ít g�c c�m l�i � m�t s� v� trí là
�ư�c b�o t�n gi�a 2 gia �ình C�ng r�t hay là v�i c�u trúc tinh th�m�i �ây c�a Cyt-P450BM 3 và Cyt-P450 scc, có th� xác ��nh �ư�ccái gì quy�t ��nh trong s� nh�n d�ng cơ ch�t
Hình 4.7 Hàng trên cùng (CYP73.Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a các
CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, A thaliana, cây ��u xanh
và cây d�ng t�n, hàng dư�i (pheprop Con) th� hi�n s� tương ��ng gi�a
các CYP73 và CYP75 Hình 4.8 bi�u di�n m�i liên quan ki�u t�ng �ôi m�t trong s� 26Cyt- P450 th�c v�t Ch� có 4 CYP73 (cinnamate hydroxylase) và flavonoid 3’5’-hydroxylase mã hóa cho m�t ch�c n�ng sinh lý xác
��nh 16C rõ r�ng là m�t thành viên m�i c�a gia �ình CYP73
�áng chú ý là không có m�t cá th� nào c�a các Cyt-P450 này là tương t� v�i m�t Cyt-P450 nào khác � ��ng v�t ho�c vi sinh v�t
Trình t� t� 1C t�i 16C �ã thu �ư�c t� Catharantus roseus b�ng
ph�n �ng PCR s� d�ng m�t m�i suy di�n vùng liên k�t hem (Meijer và cs., 1993) Vì trình t� t� 1C ��n 16C là r�t riêng bi�t(t� Cys liên k�t hem t�i ��u carboxy t�n), nên cây ph� h� �ư�cd�a trên m�t trình t� r�t cá bi�t
Trang 35Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 113
Hình 4.8 Cây ph� h� c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 không
��ng nh�t t� C roseus 1,2,3 4: CYP 73 t� 4 loài; 5: flavonoid 3’ 5’ hydroxylase; 6: CYP 71; 7,8,9: nh�ng Cyt-P450 không xác ��nh
Theo D Nelson (http://dnelson.ulmen.edu/cytochrome P450.html), ��n nay ngư�i ta �ã ghi nh�n �ư�c ít nh�t 249 gen CYP
ho�t ��ng � cây mù t�c Arabidopsis thaliana chi�m kho�ng 1%
genome c�a nó
Arabidopsis Cyt-P450 xúc tác bư�c ��u tiên c�a s� sinh t�ngh�p Indol-3-acetic acid ph� thu�c tryptophan (Annak et al.2000) Th�c v�t t�ng h�p m�t lư�ng l�n các ch�t chuy�n hóa th� c�p t�các axit amin và nucleotide Nhi�u ch�t trong s� �ó có vai trò quan tr�ng trong s� phát tri�n c�a th�c v�t và như là nh�ng ch�t �� kháng ch�ng l�i các y�u t� gây b�nh Ch�t chuy�n hóa th� c�p là d�n xu�tc�a tryptophane bao g�m carnalexin, indole glucosinolates và indole -3-acetic acid (IAA) Tuy nhiên nh�ng bư�c �� t�ng h�p ra chúng �i t� tryptophan ho�c nh�ng ti�n ch�t c�a nó v�n còn chưa
rõ Ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c 2 lo�i Arabidopsis Cyt-P450 (CYP 79B2 và CYP 79B3) có th� chuy�n hóa tryptophan thành indole-3-acetaldoxine (IAO x), m�t ti�n ch�t c�a IAA và indole glucosinolates
Arabidopsis CYP 85A2 là m�t Cyt-P-450 tham gia chuy�n hóatrong s� oxy hóa Baeyer-Villiger c�a Castasterone thành Brassinolide trong quá trình sinh t�ng h�p Brassinosteroid (Tae-Wuk Kim et al.2005).S� chuy�n hóa t� castasteron(CS) sang brassinolide(BL), s� oxy hóa ki�u Baeyer-Villiger, là bư�c cu�i
Trang 36Nguy�n Th� Ng�c Dao114
cùng và là bư�c h�n ch� t�c �� trong s� sinh t�ng h�p BL � cây
xanh Cyt-P450 85A2 c�a Arabidopsis thaliana �ư�c bi�u hi�n d�
th� trong n�m men �ã chuy�n hóa CS thành BL c�ng như là s� oxy hóa v� trí C6 c�a brassinosteroids (BRs) �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450 85A2 là m�t enzyme hai ch�c n�ng v�a oxy hóa BR C6 v�a ho�t ��ng như BL synthase Nh�ng nghiên c�u v� sinh lý, hóa sinh và di truy�n phân t� c�a nh�ng dòng bi�u hi�n m�t ch�c n�ng ho�c bi�u hi�n quá m�c Arabidopsis CYP 85A2 �ã ch�ng minh r�ng castasteron ph�i là m�t brassinosteroid ho�t ��ng sinh h�c,
ch�t này ki�m soát s� m�c và phát tri�n chung c�a cây Arabidopsis.
Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n c�ng cho th�y r�ng BL (brassinolide) có th� không ph�i lúc nào c�ng c�n thi�t cho s� m�c
và l�n lên bình thư�ng nhưng c�ng ch�ng minh r�ng cây
Arabidopsis ��t �ư�c s� m�c và phát tri�n t�t hơn khi có m�t BL
Nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n thi�u h�t BR c�a m�t s� tác gi� như
Li và cs 1996, Fujioka và cs,1997, Choe và cs 1998, Bishop và cs 1999… �ã ch� ra r�ng thi�u h�t BR gây ra s� gi�m chi�u dài c�ach�i, gi�m �� phì nhiêu, ch�m già, làm bi�n ��i s� v�n chuy�n các mao m�ch và s� phát sinh quang hình thái Ngư�i ta �ã xác d�nh
�ư�c nh�ng gen bi�u th� cho s� sinh t�ng h�p BR CYP 85A1, CYP
85A2, CYP90A1, CYP90B1 �ư�c tìm th�y trong Arabidopsis CYP
90D2 và CYP92A6 �ư�c xác ��nh có m�t trong lúa g�o và ��u m�tcách tương �ng
Ngư�i ta c�ng ch�ng minh �ư�c r�ng m�t Arabidopsis
Cyt-P450, CYP85A2, m�t BR-C-6 oxidase, c�ng có kh� n�ng ho�t ��ng như m�t BL synthase trong s� chuy�n hóa CS thành BL
CYP 85A1 và CYP85 A2 có ho�t tính ��c hi�u cơ ch�t khác nhau Arabidopsis CYPP450 cà chua ch�a 2 lo�i CYP 85 (CYP85A1 và CYP85A2) tương t� nhau, chúng chuy�n hóa 6-deoxo CS thành CS,6-deoxoTY thành TY,6-deoxo 3DHT thành 3-DHT và 6-deoxoTE thành TE CYP85A1 và 85A2 �ư�c bi�u hi�nd� th� trong n�m men c�ng xúc tác ph�n �ng oxy hóa C-6 c�a BRs
và cho th�y r�ng c� 2 lo�i CYP 85A1 và A2 ��u có th� ho�t ��ng
như BR C-6 oxydase T�i sao Arabidopsis l�i có 2 b� gen mã hóa
nh�ng enzyme có cùng ch�c n�ng thì cho ��n nay ngư�i ta v�nchưa gi�i thích �ư�c
G�n �ây ngư�i ta �ã ch�ng minh �ư�c r�ng CS �ư�c sinh t�ng h�p t� cholesterol (CHR) qua các C27-BR, nh�ng ch�t này có cùng
Trang 37Ch ng IV H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 115khung cacbon như là 28-norcastasterone (28-nor CS) trong cây cà chua non Hơn n�a ngư�i ta còn ch�ng minh �ư�c r�ng 28-nor CS
có th� �ư�c chuy�n hóa thành CS b�i m�t lo�i enzyme xúc tác là sterolmethyltransferase ph� thu�c S-adenosyl-L-Methionine trong
cây cà chua Trong Arabidopsis s� chuy�n hóa t� CHR thành
cholestanol �ã �ư�c ch�ng minh (Nakajima và cs 2002) Ngư�i ta c�ng xác ��nh �ư�c r�ng s� chuy�n hóa t� 28-nor CS thành CS
c�ng x�y ra � Aradopsis �i�u này g�i ý r�ng con �ư�ng sinh t�ng
h�p C27-BR t� CHR �� t�o ra CS c�ng di�n ra trong th�c v�t Các k�t qu� nghiên c�u ch� ra r�ng CYP85A1 và CYP85A2 có
ái l�c khác nhau v�i các cơ ch�t C27-BRs và C28-BRs, m�c dùchúng cùng có kh� n�ng ho�t ��ng như BR C-6 oxidase (Tae-Wuk Kim et al 2005)
Trang 38Ch ng V
NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BI U HI N
C A CHÚNG
5.1 C"u trúc c'a gen Cyt-P450
Gia �ình gen Cyt-P450 bao g�m m�t s� l��ng l�n các thành viên phân b� r�ng rãi trong t� nhiên Cho ��n nay �ã có hơn 270 gia
�ình gen CYP (Cyt-P450) khác nhau v�i 18 gia �ình gen ���c ghi nh�n � ��ng v�t có vú (Nelson, 2006) � ng��i, có 57 gen CYP phân b� trong 18 gia �ình và 42 d��i gia �ình M�t genom ��ng v�t
có vú ch�a nh�ng gen Cyt-P450 �a d�ng và nhi�u nhánh S� l��ngcác gen Cyt-P450 � genom ��ng v�t có vú ch�a ���c xác ��nh m�tcách chính xác, nh�ng nh�ng gì �ã bi�t v� các gene mRNAs, protein và ho�t tính enzym g�i ý r�ng m�i m�t genom �ơn b�i c�a
��ng v�t linh tr��ng hay ��ng v�t g�m nh�m có l� ��u ch�a 50-100 gen Cyt-P450
Thành t�u l�n lao trong k� thu�t sinh h�c phân t� nh�ng n�mg�n �ây bao g�m vi�c tách dòng gen, ��c trình t�, và bi�u hi�ngen trong nh�ng t� bào d� th� c�ng ch�a làm rõ h�t ���c m�t s�các ��c �i�m quan tr�ng và cơ b�n c�a nhi�u thành viên trong gia
�ình �a gen này C�u trúc exon-intron c�a g�n 50 gen ��ng v�t
có vú �ã ���c làm rõ Thông tin này cung c�p cơ s� h�p lý �� x�p lo�i gia �ình gen Cyt-P450 Chúng ta c�ng �ã có nh�ng hi�ubi�t v� các gen Cyt-P450 trong các cơ th� b�c th�p nh� vi khu�n
và n�m Trình t� cDNA t� 6 lo�i n�m và 7 gia �ình gen vi khu�n
�ã ���c công b� m�i �ây Phân tích so sánh trình t� cho th�y có s� t�ơng t� l�n gi�a các gen CYP � ng��i và vi khu�n g�i ý v�m�t t� tiên chung c�a ��i gia �ình CYP vào kho�ng 3 t� n�mtr��c �ây
Trang 39Nguy�n Th� Ng�c Dao118
5.1.1 Gia ình và d i gia ình gen Cyt-P450 (CYP)
Các gen Cyt-P450 ���c x�p lo�i thành các gia �ình và d��i gia
�ình theo s� gi�ng nhau trong trình t� các axit amin do chúng mã hoá
và m�t danh pháp có tính h� th�ng d�a trên s� phân lo�i này �ã ���c
��a ra Nói chung, các thành viên trong m�t gia �ình v� cơ b�n có cùng m�t c�u trúc gen và trình t� axit amin do chúng mã hoá khác nhau ít hơn 40% Nh�ng CYP có trình t� gi�ng nhau 40% ���c
��a vào m�t gia �ình, ký hi�u b�ng m�t s� � R�p, n�u gi�ng nhau 55% là thành viên c�a m�t d��i gia �ình, ký hi�u b�ng m�t ch�cái, ví d� CYP 7A và CYP 7B N�u thêm 1 thành viên m�i vào CYP 7A thì s� ���c g�i là CYP 7A2 B�t c� m�t c�p gen nào trong m�tdu�i gia �ình c�ng mã hóa nh�ng axit amin nh�t ��nh v�i s� t�ơng
��ng l�n hơn 55%, các v� trí mã hóa t�ơng �ng và các gen c�a cùng m�t loài ���c liên k�t ch�t ch� trong m�t nhi�m s�c th�(chromosome) Tuy nhiên, c�ng có m�t s� ngo�i l� ��i v�i quy t�ctrên Nebert và cs �ã có m�t �� xu�t v� cách x�p lo�i ��y �� và danh pháp cho các gen P450 (xem ph�n Ph� tr�ơng)
5.1.2 Các c m gen "ng v#t có vú
Nh�ng nghiên c�u nh�m xác ��nh v� trí � NST c�a các gen
��ng v�t có vú �ã ���c t�p trung vào genom c�a ng��i và chu�tnh�t Trong kho�ng 20 d��i gia �ình Cyt-P450 ��ng v�t có vú, 16 gen �ã ���c xác ��nh � nh�ng NST ��c hi�u � ng��i ho�c chu�t(B�ng 5.1) Nh� � b�ng 5.1, các gen CYP �ã phân tán qua nhi�uNST khác nhau, �ôi khi t�o thành nh�ng búi gen Cho t�i lúc này các gen ng��i và chu�t �ã ���c b�n �� hóa Búi th� nh�t ��nh v�trên nhánh dài c�a NST 19 � ng��i, NST 7 � chu�t nh�t và NST 1
� chu�t c�ng và bao g�m kho�ng 10 trình t� gen ho�c t�ơng t�gen c�a CYP2A, CYP2B và CYP2F (d��i gia �ình) Simmon và Kasper (theo Osamu Gotoh) tìm th�y s� liên k�t ch�t ch� gi�anh�ng búi gen này và locus Coh (Coumarin hydroxylase) c�achu�t nh�t Sau �ó, Negishi và cs �ã kh�ng ��nh r�ng gen Coh th�c ra ���c mã hóa b�i CYP2A5 Ho�t tính th�y phân coumarin v� trí s� 7 � ng��i c�ng ���c mã hóa b�i 1 gen CYP2A Búi gen CYP21A � ng��i ho�c chu�t nh�t bao g�m 1 gen th�t và 1 gi� gen c�a nó Nh�ng gen (và gi� gen) này ���c s�p x�p m�t cách ng�unhiên trong h�n h�p phù h�p t� ch�c c�a HLA trên NST 6P �ng��i và NST 17 c�a chu�t nh�t
Trang 40Ch ng V Nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng 119
B ng 5.1 V� trí trên NST c�a các gen Cyt-P450 � ��ng v�t có vú
(theo Osamu Gotoh)
Chu�t nh�t CYP1a2 1 9 c�nh Mpi-1 SH, RI
Chu�t nh�t CYP2a >6 7 c�nh Col 1 , Gpi-1 SH, RI, BC Chu�t nh�t CYP2c >7 19 c�nh Gol-1 SH, IS
Chu�t nh�t CYP2d >5 1517 cm 55 kDa SH, RI