Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy cao chiết cồn và cao chiết nước từ nấm linh chi vàng Ganoderma colossum có hoạt tính chống oxy hóa in vitro, làm giảm sự tăng hàm lượng malonyl diald
Trang 1NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA THEO HƯỚNG
BẢO VỆ GAN CỦA POLYSACCHARID
CHIẾT XUẤT TỪ NẤM LINH CHI VÀNG (GANODERMA COLOSSUM)
Ngô Quốc Hận*, Nguyễn Thị Thu Hương*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Những công trình nghiên cứu đã chứng minh các triterpenoid, polysaccharid là
những nhóm hoạt chất quyết định dược tính của nấm linh chi Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy cao chiết cồn và cao chiết nước từ nấm linh chi vàng (Ganoderma colossum) có hoạt tính chống oxy hóa in vitro, làm giảm
sự tăng hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan bị gây tổn thương oxy hóa bởi cyclophosphamid Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của polysaccharid thô
chiết từ nấm linh chi vàng trên thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan bằng cyclophosphamid
Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu: Polysacharid thô được chiết bằng phương pháp đun hồi lưu bột nấm với nước (1:20) trong 6 giờ và tủa bằng cồn 96% (tỷ lệ 1:5) Nghiên cứu in vitro: Khảo sát hoạt tính dập tắt
gốc tự do bằng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid bằng thử
nghiệm MDA Nghiên cứu in vivo: Polysaccharid thô được cho uống liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm phúc
mạc liều duy nhất cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng Vào ngày thứ 8, mổ tách lấy gan chuột đem định
lượng MDA và glutathion (GSH)
Kết quả: Polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng có hoạt tính chống oxy hóa in vitro yếu Ở liều uống
100 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày, polysaccharid làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan và phục hồi sự giảm hàm lượng GSH nội sinh trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid Polysaccharid thô ở liều uống 50 mg/kg không làm thay đổi hàm lượng MDA và GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy liều này chưa thể hiện tác dụng trên sự thay đổi hàm lượng MDA hoặc hàm
lượng GSH trong gan gây bởi cyclophosphamid
Kết luận: Polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng có tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid
Từ khóa: Nấm linh chi vàng, polysaccharid thô, cyclophosphamid, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng
bảo vệ gan
ABSTRACT
STUDY ON ANTIOXIDANT EFFECTS OF GANODERMA COLOSSUM
ON CYCLOPHOSPHAMIDE-INDUCED HEPATOTOXICITY
Ngo Quoc Han, Nguyen Thi Thu Huong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 50 - 55
Objectives: It has been reported that triterpenoid and polysaccharide compounds derived from Ganoderma
lucidum (Lingzhi or Reishi) play an important role in pharmacological effects of Lingzhi Recently, it has been determined that both ethanol extract and aqueous extract of Ganoderma colossum had antioxidant activity and produced the protective effect against cyclophosphamide-induced liver damage The purpose of this study was to evaluate the antioxidant activity and hepatoprotective effect of crude polysaccharide extracted from Ganoderma
colossum on liver damage induced by cyclophosphamide in mice
* Trung Tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu
Trang 2Material and Method: Mushroom powders were immersed with 20-folds volume water and refluxed for 6
h at the temperature of 100 o C The aqueous extract was precipitated with 96% ethanol (1:5) and the precipitate thus obtained was dried For in vitro study, the free radical scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) test and the anti-lipid peroxidation effect on malonyl dialdehyde (MDA) test of crude polysaccharide were examined For in vivo study, the model of cyclophosphamide-induced liver damage (single dose of 150 mg/kg, intraperitoneal injection) was applied to study on the hepatoprotective effect of crude
polysaccharide via measuring liver MDA content and liver glutathione content
Results: The free radical scavenging effect on DPPH test and the anti-lipid peroxidation effect on MDA test
of crude polysaccharide were not high when compared with positive control Crude polysaccharide at the oral dose
of 100 mg/kg for 8 days alleviated the increase of hepatic MDA content and restored the decrease of hepatic glutathione content caused by cyclophosphamide Crude polysaccharide at the oral dose of 50 mg/kg had no effect
on the MDA content or GSH content as compared with respective control
Conclusion: Crude polysaccharide extracted from Ganoderma colossum produced the hepatoprotective effect against cyclophosphamide-induced liver damage
Key words: Ganoderma colossum, crude polysaccharide, cyclophosphamide, antioxidant activity,
hepatoprotective effect
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng
minh nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.)
Karst) có tác dụng chống oxy hóa, kích thích
hoạt động của hệ miễn dịch và có hiệu quả trị
liệu tốt cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như
bị các bệnh về gan Các triterpenoid,
polysaccharid đã được chứng minh là những
nhóm hoạt chất quyết định dược tính của linh
chi(3) Nấm linh chi vàng (Ganoderma colossum) là
một trong lục bảo linh chi, tuy nhiên cho đến
nay có rất ít báo cáo về tác dụng sinh học của
loài nấm này Kleinwatcher P & cs và El Dine
R.S & cs đã phân lập và xác định cấu trúc của
các lanostan triterpen lacton (colossolacton I, II,
III, IV) trong Ganoderma colossum của Việt
Nam(5,6) Ngoài tác dụng kháng viêm, kháng
khuẩn và độc tế bào, các colossolacton còn có tác
dụng kháng HIV và kháng virus gây viêm gan
siêu vi C(4) Kết quả nghiên cứu gần đây của
Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM cho thấy
cao chiết cồn và cao chiết nước từ nấm linh chi
vàng có tác dụng dập tắt gốc tự do và ức chế quá
trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm sự tăng
hàm lượng MDA trong gan bị gây tổn thương
oxy hóa bởi cyclophosphamid(8) Tuy nhiên các
nghiên cứu về polysaccharid chiết từ nấm linh
chi vàng chưa được nghiên cứu Do đó, đề tài
“Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của polysaccharid chiết từ
nấm linh chi vàng Ganoderma colossum” được
thực hiện với các mục tiêu sau:
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro
của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng bằng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA)
- Khảo sát tác dụng của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trên thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa ở gan chuột nhắt trắng bằng cyclophosphamid, thông qua chỉ tiêu xác định hàm lượng MDA và glutathion (GSH) trong gan
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Nấm linh chi vàng được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm Dược liệu Polysacharid thô được chiết bằng phương pháp đun hồi lưu bột nấm với nước (tỷ lệ 1:20) trong 6 giờ và tủa bằng cồn 96% (tỷ lệ 1:5) Hiệu suất chiết là 4,66% Hàm lượng đường hòa tan là 47,39% và hàm lượng đường khử là 10,67%
Trang 3Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 5-6
tuần tuổi, trọng lượng trung bình
22 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh
phẩm Y tế – TP Nha Trang và được để ổn định
ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm Chuột
được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên, rau
xanh và nước uống đầy đủ Thể tích cho uống
mẫu thử nghiệm hay tiêm phúc mạc
cyclophosphamid là 10 ml/kg thể trọng chuột
Thuốc thử nghiệm
Endoxan® chứa 534,5 mg cyclophosphamid
monohydrat tương đương với 500 mg
cyclophosphamid khan (Baxter Oncology
GmbH, Germany) Lô sản xuất 9F615E, ngày
sản xuất: 06/2009; hạn dùng 06/2012 Các thuốc
đối chiếu: Acid ascorbic (Merck, Germany);
Trolox (Calbiochem Ltd Co.); Silymarin
(Sigma Co.Ltd, USA)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu in vitro
Phương pháp xác định khả năng dập tắt gốc tự do
(thử nghiệm DPPH) (2,8)
0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được
cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH
0,8 mM pha trong MeOH Hỗn hợp sau khi pha
được để ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang ở
bước sóng λ = 515 nm Acid ascorbic được sử
dụng làm chất đối chiếu
Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxy hóa
lipid (thử nghiệm MDA) (8,9)
0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm
được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não
và thêm đệm phosphat vừa đủ 2 ml Ủ hỗn hợp
phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản
ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10% Sau khi ly
tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid
thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ
100oC Làm lạnh và đo quang ở bước sóng λ =
532 nm Trolox, đồng phân của vitamin E được
sử dụng làm chất đối chiếu
Tính toán kết quả
Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa
(HTCO):
HTCO% = [(OD C – OD T ) / OD C ] x 100
ODC: Mật độ quang của chứng dung môi
(DMSO hay MeOH)
ODT: Mật độ quang của mẫu thử
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau
Phương pháp nghiên cứu in vivo
Gây mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid (7,8)
Chuột thí nghiệm được chia thành hai nhóm:
- Nhóm bình thường, ký hiệu CY (-):
Lô chứng: uống nước cất
Lô thử: uống polysaccharid thô được hòa tan trong nước cất liều 100 mg/kg thể trọng.
Lô thuốc đối chiếu: uống silymarin liều
100 mg/kg thể trọng.
- Nhóm bệnh lý, ký hiệu CY(+): chuột được tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamid
150 mg/kg thể trọng
Lô chứng: uống nước cất
Lô thử: uống polysaccharid thô được hòa tan trong nước cất liều 50 và 100 mg/kg thể trọng.
Lô thuốc đối chiếu: uống silymarin liều
100 mg/kg thể trọng.
Thời gian cho uống hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng
mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH.
Phương pháp xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột (8)
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt
Trang 4độ 0-5 0C Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm vào 1 ml
dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) Ủ hỗn hợp phản
ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng
bằng 1 ml acid tricloacetic 10% Sau khi ly tâm
lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid
thiobarbituric 0,8 % ở 100 0C trong 15 phút và đo
quang ở λ = 532 nm Hàm lượng MDA (nM/ml)
được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính
của chất chuẩn MDA
Phương pháp xác định hàm lượng glutathion (GSH)
trong gan chuột (7)
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong
dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 ở
nhiệt độ 0-5 0C Lấy 1 ml dịch đồng thể gan và
thêm đệm Tris (pH = 7,4) vừa đủ 2 ml Ủ hỗn
hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng
phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10% Sau
khi ly tâm lấy 1 ml dịch trong cho phản ứng
với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5’–dithiobis–
(2–nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA
phosphat vđ 3 ml Để 3 phút ở nhiệt độ phòng
và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ =
412 nm Hàm lượng GSH (nM/g protid) được
tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của
chất chuẩn GSH
Đánh giá kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung
bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai
số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống
kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và
Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel
Scientific SigmaStat) Kết quả thử nghiệm đạt ý
nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so
với lô chứng
KẾT QUẢ-BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu in vitro
Bảng 1 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của
polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trong
thử nghiệm DPPH
Chứng 0,775 -
2000 0,277 64,23
1500 0,370 52,23
1000 0,477 38,41
100 0,721 6,97
Bảng 2 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của
polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trong thử nghiệm MDA
NỒNG ĐỘ µg/ml
ΔOD
Chứng 0,431 -
Nhận xét và bàn luận
Trong thử nghiệm DPPH, DPPH là gốc tự
do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi, nhưng sau khi phản ứng với oxy nguyên tử của chất dập tắt gốc tự do sẽ bị giảm màu tím Hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH, dẫn đến giảm độ hấp thu ở bước sóng 515 nm
Trong thử nghiệm MDA, MDA là chất được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo ra phức hợp trimethin có màu hồng Hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid thể hiện qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm lượng MDA có trong mẫu dẫn đến giảm độ hấp thu ở bước sóng 532 nm
Bảng kết quả 1 và 2 cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid trong hai thử nghiệm DPPH và MDA ở nồng độ 2000 μg/ml là cao nhất, tuy nhiên hoạt tính này yếu khi so sánh với giá trị IC50 của các chất đối chiếu dương (bảng 3)
Trang 5Bảng 3 Giá trị IC 50 của polysaccharid chiết từ nấm linh chi vàng
IC 50 (µg/ml) DPPH MDA
1462,6 46,2 1603,2 860
Kết quả nghiên cứu in vivo
Bảng 4 Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan
Nhóm Lô (n = 10) Liều uống (mg/kg) (nM/ml dịch đồng thể) Hàm lượng MDA Hàm lượng MDA (nM/g Protid)
CY(-)
Polysaccharid
CY(+)
CY(-) : Nhóm chuột bình thường, không tiêm cyclophosphamid; CY(+): Nhóm chuột bị gây stress oxy hóa, có tiêm
cyclophosphamid; # P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY (-); * P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng
CY(+) tương ứng
Bảng 5 Kết quả khảo sát hàm lượng GSH trong gan
CY(-) : Nhóm chuột bình thường, không tiêm cyclophosphamid; CY(+): Nhóm chuột bị gây stress oxy hóa, có tiêm
cyclophosphamid; # P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(-) ; *P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng
CY(+) tương ứng
Nhận xét và bàn luận bảng kết quả 4 và 5
Lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống
nước cất trong 8 ngày có hàm lượng MDA tăng
đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình
thường, chứng tỏ cyclophosphamid gây tổn
thương peroxy hóa màng tế bào dẫn đến việc
làm tăng hàm lượng MDA trong gan
Cyclophosphamid được biến đổi sinh học tại
gan trở thành 4-hydroxycyclophosphamid và
aldophosphamid có tính alkyl hóa, dẫn đến sự
hình thành các tác nhân gây độc tế bào như
acrolein, chloroacetaldehyd(1) Ngoài ra, nghiên
cứu trước đây của nhóm cũng đã chứng minh
cyclophosphamid làm giảm hàm lượng
glutathion, chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý
ở ngày thứ 8 sau khi tiêm cyclophosphamid(7) Kết quả thực nghiệm của đề tài cũng ghi nhận kết quả tương tự, cho thấy có sự giảm hàm lượng glutathion ở lô chứng tiêm cyclophosphamid đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý Điều này cho thấy glutathion và những nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein và N-acetylcystein) với chức năng giải độc đã thông qua hệ thống cytocrom P-450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của cyclophosphamid trong cơ thể(1) Độc tính của cyclophosphamid tăng kéo theo sự suy giảm
Trang 6glutathion nội sinh trong gan, do đó gián tiếp
làm tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào
dẫn đến hàm lượng MDA tăng
Lô bình thường không tiêm
cyclophosphamid và uống polysaccharid thô
chiết từ nấm linh chi vàng trong 8 ngày có hàm
lượng MDA và GSH không thay đổi đạt ý nghĩa
thống kê so với lô chứng, chứng tỏ
polysaccharid không có tác dụng trên cơ thể
chuột bình thường Lô tiêm cyclophosphamid
và uống polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi
vàng ở liều 50 mg/kg thể trọng chuột trong 8
ngày không làm thay đổi hàm lượng MDA và
GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương
ứng, cho thấy liều này chưa thể hiện tác dụng
trên sự thay đổi hàm lượng MDA hoặc hàm
lượng GSH trong gan gây bởi cyclophosphamid
Lô tiêm cyclophosphamid và uống
polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng ở
liều 100 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày có
tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA và
làm tăng hàm lượng GSH trong gan đạt ý nghĩa
thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy
polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng ở
liều này thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thực
nghiệm gây tổn thương oxy hóa bằng
cyclophosphamid Thuốc đối chiếu dương
silymarin, hoạt chất được chiết xuất từ cây
Silybum marianum (Cúc gai) cũng thể hiện tác
dụng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn
thương oxy hóa bằng cyclophosphamid
KẾT LUẬN
Polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng
có tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa
bằng cyclophosphamid
Cám ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh
phí của Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM
TÀI LIỆU THAM KHẢO
activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: a defense mechanism? Exp
Toxicol Pathol., 59(5):301-306
Weil J.A (2004) Free radical scavenging capacity and antioxidant
activity of selected plant species from the Canadian prairies, Food
Chemistry, 84: 551-562
lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol
Annu Rev., 265-301
Anti-HIV-1 protease activity of lanostane triterpenes from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum J Nat Prod., 71(6): 1022-1026
Chao-Mei MA, Hattori M (2008) New lanostane triterpene lactones
from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum (FR.)C.F.BAKER., Chem Pharm Bull., 56(5): 642-646
Hartl A., Grafe U (2001) Colossolactones, new triterpenoid
metabolistes from a Vietnamese mushroom Ganoderma colossum J
Nat Prod., 64(2): 236-239
Hương, Trần Công Luận (2008) Tác dụng của Xuyên tâm liên
(Andrographis paniculata Burm F Nees, Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophospamid”, Y học TP
Hồ Chí Minh, tập 12, phụ bản của số 4: 142-147
tác dụng chống oxy hóa của nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum, Ganodermataceae) Tạp chí Dược liệu, tập 14(6):
302-306
peroxidation rate in tissue homogenate laboratory In: Manual in
Biochemistry, Moscow, 243 -256
