Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam l cơ quan nghiên cứu khoa học tự nhiên v công nghệ đa ng nh lớn nhất cả nớc, có thế mạnh trong nghiên cứu cơ bản, nghiên c u v phát triển công nghệ, đi
Trang 2Bé S¸CH CHUY£N KH¶O øng dông vµ ph¸t triÓn c«ng nghÖ cao
Trang 3Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam l cơ quan nghiên cứu khoa học tự nhiên v công nghệ đa ng nh lớn nhất cả n(ớc, có thế mạnh trong nghiên cứu cơ bản, nghiên c u v phát triển công nghệ,
điều tra t i nguyên thiên nhiên v môi tr(ờng Việt Nam Viện tập trung một đội ngũ cán bộ nghiên cứu có trình độ cao, cơ sở vật chất
kỹ thuật hiện đại đáp ứng các yêu cầu về nghiên cứu v thực nghiệm của nhiều ng nh khoa học tự nhiên v công nghệ
Trong suốt 35 năm xây dựng v phát triển, nhiều công trình v kết quả nghiên cứu có giá trị của Viện đC ra đời phục vụ đắc lực cho
sự nghiệp xây dựng v bảo vệ Tổ quốc Để tổng hợp v giới thiệu có
hệ thống ở trình độ cao, các công trình v kết quả nghiên cứu tới bạn đọc trong n(ớc v quốc tế, Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam quyết định xuất bản bộ sách chuyên khảo Bộ sách tập trung
v o bốn lĩnh vực sau:
ứng dụng v phát triển công nghệ cao;
T i nguyên thiên nhiên v môi tr(ờng Việt Nam,
Biển v Công nghệ biển,
Giáo trình đại học v sau đại học
Tác giả của các chuyên khảo l những nh khoa học đầu ng nh của Viện hoặc các cộng tác viên đC từng hợp tác nghiên cứu
Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam xin trân trọng giới thiệu tới các quý độc giả bộ sách n y v hy vọng bộ sách chuyên khảo sẽ
l t i liệu tham khảo bổ ích, có giá trị phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, ứng dụng công nghệ, đ o tạo đại học v sau đại học
Hội đồng Biên tập
Trang 5L I GI I THI U
Enzym h�c là m�t chuyên ngành c�a khoa h�c s� s�ng Các enzyme tham gia xúc tác h�u h�t các ph�n �ng hóa h�c trong c� th� s�ng
Nh� có enzyme xúc tác mà m�i giây m�i phút có hàng nghìn ph�n �ng hóa h�c x�y ra nhanh chóng và các ph�n �ng này l�i x�y
ra � nhi�t �� và áp su�t bình thư�ng c�a c� th� (37oC) Enzym có nhi�u lo�i trong �ó Cytochrome P450 là m�t lo�i enzyme quan tr�ng g�m m�t ��i gia �ình nh�ng protein ch�a hem có vai trò tham gia xúc tác các ph�n �ng oxy hóa r�t nhi�u các h�p ch�t khác nhau như các c� ch�t n�i sinh ưa m� g�m các steroid, các acid béo, các vitamin tan trong d�u m�, prostaglandin, leucotrien, thromboxane
và các ch�t ngo�i sinh thu�c men (xenobiotic)
Cytochrome P450 chuy�n th�ng �i�n t� ��n phân t� oxy và có sóng h�p th� c�c ��i � 450nm khi g�n v�i CO Chúng có ph� bi�n �microsome và ty th� c�a ��ng v�t, th�c v�t và vi sinh v�t Cytochrome P450 �ư�c nghiên c�u t�ng lên m�nh m� trong nh�ng n�m g�n �ây và hi�n nay là do vai trò c�a chúng trong chuy�n hóa các thu�c và ho�t hóa các ch�t gây ung thư
PGS.TS Nguy�n Th� Ng�c Dao t� nh�ng n�m 80 �ã �i theo hư�ng nghiên c�u này lúc làm nghiên c�u sinh � ��c b�o v� lu�n
án ti�n s� v� �� tài “Bi�n ��i hóa h�c ch�n l�c Cytochrome P450 b�ng Fluorescein isothiocyanate” t�i Vi�n nghiên c�u Trung tâm v�sinh h�c phân t�, Berlin – Buch Cho ��n khi v� nư�c g�n 30 n�mtác gi� v�n trung thành c�n m�n tìm tòi nghiên c�u xung quanh v�n
�� này, �ã công b� hàng ch�c công trình và hư�ng d�n �ào t�onhi�u ti�n s�, th�c s� theo hư�ng này m�t cách có h� th�ng B�i v�ychúng tôi th�y r�ng quy�n sách chuyên kh�o này mang tên Cytochrome P450 là quy�n sách vi�t b�ng tâm huy�t c�a tác gi� g�n
30 n�m, có n�i dung phong phú bao hàm nhi�u ý ngh�a khoa h�chi�n ��i và th�c ti�n �ng d�ng
Trang 6Sách vi�t h�n 200 trang g�m 6 chư�ng: l�ch s� nghiên c�uCytochrome P450, ��c �i�m c�u t�o và c� ch� ph�n �ng c�aCytochrome P450, h� th�ng oxygenase (cyt-P450) � các mô ��ng v�t, h� th�ng Cytochrome P450 � vi sinh v�t và th�c v�t, nh�ng gen Cyt-P450 và s� bi�u hi�n c�a chúng, nh�ng nghiên c�u �ng d�ng c�a Cytochrome P450 Sách vi�t có kho�ng vài tr�m tài li�u tham kh�o ph�n l�n là ti�ng Anh, phong phú Cái quý � �ây là ph�n l�ntài li�u nghiên c�u ��u �ang c�p nh�t trên th� gi�i v� l�nh v�cchuyên môn này �ây là quy�n sách chuyên sâu, có th� dùng �� �ào t�o th�c s�, ti�n s� trong ngànhsinh h�c và y dư�c
Chúng tôi �ánh giá cao cu�n sách c� v� n�i dung khoa h�c và tính th�c ti�n c�a nó trong y h�c hi�n ��i
Xin trân tr�ng gi�i thi�u cùng b�n ��c
GSVS.TSKH ái Duy Ban
Trang 7L I NÓI U
�� biên so�n cu�n sách chuyên kh�o này, ngoài vi�c tham kh�om�t s� tài li�u m�i công b� g�n �ây, chúng tôi �ã l�a ch�n m�t s�tài li�u có tính kinh �i�n c�a các tác gi� �ã nghiên c�u v� h� th�ng Cytochrome- P450 ngay t� nh�ng th�p niên ��u tiên c�a quá trình phát hi�n ra h� th�ng này và có th� nói h� là nh�ng tên tu�i n�iti�ng trên th� gi�i trong l�nh v�c nghiên c�u �ó là các tác gi�L.Lemberg; J.Barrett; T.Omura; R.Sato, Y.Imai; A.Y.H.Lu; Strobel H.W;F.P.Guengerich; K Ruckpaul; D Nelson; Y Ishimura; Y.Fujii-Kuriyama; M.J Coon; J.A.Gustafsson; W.Cohen ; R.W Estabrook; S.M.Rapoport; R.Bernhardt và m�t s� tác gi� khác… Trong �ó các giáo sư K Ruckpaul và R Bernhardt là nh�ng ngư�ith�y, nh�ng ngư�i giúp �� ��u tiên c�a chúng tôi khi b�t ��u làm quen v�i h� th�ng Enzym này cách �ây �ã hơn 30 n�m t�i ��c và hi�n nay h� v�n còn ti�p t�c say mê v�i Cytochrome- P450
GS.TSKH Hoàng Tích Huy�n trư�ng ��i h�c Dư�c Hà N�i có l� là m�t trong s� ít nh�ng ngư�i Vi�t Nam ��u tiên �ã có nh�ng nghiên c�u v� dư�c h�c có liên quan ��n Cytochrome-P450 trong th�i gian ông làm lu�n án TSKH t�i CHDC ��c và ông c�ng là ngư�i �ã g�i ý cho chúng tôi ti�p c�n v�n �� nghiên c�u r�t m�i m�
và h�p d�n này
Do vai trò to l�n c�a h� th�ng Enzym Cytochrome-P450 trong chuy�n hoá các ch�t n�i sinh thi�t y�u cho phát tri�n sinh lý bình thư�ng c�a cơ th�, ví d� như hormone steroid (sinh d�c-thư�ngth�n), acid m�t, ch�t béo, vitamin tan trong d�u m� và ��c bi�t là vai trò trong chuy�n hoá các thu�c và các ch�t l� ��i v�i cơ th�(xenobiotic), nên nh�ng nghiên c�u v� h� Enzym này có ý ngh�a
��c bi�t quan tr�ng, liên quan t�i nhi�u l�nh v�c c�a ��i s�ng như
y, dư�c h�c ( các b�nh liên quan ��n n�i ti�t, các thu�c �i�u tr�,tương tác thu�c, �i�u tr� ung thư, s�n xu�t thu�c…), ��c h�c (h�uh�t ch�t ��c h�i là cơ ch�t c�a h� Enzym này), môi trư�ng (các ch�tgây ô nhi�m môi trư�ng), quân s� (các ch�t ��c quân s�), công nông nghi�p và công ngh� sinh h�c (cây chuy�n gen kháng sâu b�,
Trang 8thu�c tr� sâu sinh h�c, các loài cây m�i, các h� vi sinh v�t m�i có gen Cyt-P450 phù h�p, s�n xu�t Cyt-P450 b�ng công ngh� tái t�h�p gen…)
Trên th� gi�i, theo hi�u bi�t c�a chúng tôi, H�i ngh� qu�c t� v�Cytochrome-P450 ��u tiên di�n ra n�m 1976, t� �ó ��n nay c�kho�ng 2 n�m m�t l�n các nhà nghiên c�u v� Cytochrome-P450 trên toàn th� gi�i l�i g�p nhau �� trao ��i k�t qu� và kinh nghi�mnghiên c�u S� phát tri�n c�a ngành khoa h�c v� Cyt-P450 ngày càng m�nh m� c�n c� vào s� lư�ng l�n các công trình �ư�c công b� t�ng lên hàng n�m
Tuy nhiên, � Vi�t Nam, nh�ng hi�u bi�t ��y �� v� h� th�ng Enzym này và vai trò quan tr�ng trong nghiên c�u c�ng như �ng d�ng chúng còn r�t h�n ch�, ngay c� v�i các nhà khoa h�c sinh h�c
và Qu�c gia v� �nh hư�ng c�a 2,3,7,8-TCDD(Dioxin), 20-MC, DEN, Wolfatox, Aflatoxin… trên ��ng v�t th�c nghi�m, c� trên m�t s� công nhân, b�nh nhân ti�p xúc v�i các ch�t ��c như phóng x�, thu�c n�, nhiên li�u l�ng tên l�a…
M�t s� nghiên c�u v� gen Cyt- P450 c�ng �ã và �ang �ư�c ti�nhành t�i Vi�n CNSH và m�t vài �ơn v� khác �� tìm ra nh�ng ch� th�phân t� giúp ch�n �oán s�m m�t s� lo�i ung thư như ung thư ph�i, gan, ti�n li�t tuy�n Hi�n t�i, Vi�n CNSH �ang có m�t s� cán b�tr� �ư�c c� �i nghiên c�u � nư�c ngoài, ti�n hành nh�ng nghiên c�u cơ b�n v� h� th�ng enzyme Cytochrome – P450, các phương pháp gây ��t bi�n �i�m c�a gen �� tìm hi�u cơ ch� tác ��ng c�a các ch�t ho�t hóa và �c ch� enzyme nh�m m�c �ích �ng d�ng vào l�nhv�c công nghi�p hóa dư�c và CNSH trong tương lai Xu�t b�ncu�n sách này, chúng tôi hy v�ng cung c�p �ư�c ph�n nào nh�ng thông tin, nh�ng khái ni�m cơ b�n v� h� th�ng Enzym Cyt-P450 �
��ng v�t (trong �ó có ngư�i), � vi sinh v�t và � th�c v�t, t�i b�n
Trang 9��c quan tâm và có ni�m say mê nghiên c�u v�i m�t l�nh v�c còn m�i m� nhưng ��y ti�m n�ng và tri�n v�ng
Ch�c ch�n là còn nhi�u thi�u sót c� v� néi dung c�ng như hình th�c trong l�n xu�t b�n ��u tiên nên r�t mong �ư�c b�n ��c h�t s�cthông c�m, quan tâm góp ý �� chúng tôi có th� s�a ch�a và hoàn thi�n thêm
Tác gi
Trang 10DANH M C CÁC T VI T T T
Tên vi�t t�t Tên ��y ��
bp Base pair (c�p base)
CCl4 Tetrachlorocarbon
13 C-NMR Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân cacbon 13 CPR Cytochrome P450 reductase
cs C�ng s�
2D-NMR Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân hai chi�u
DTNB 5,5 -dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
ECD-FT-MS Ph�ơng pháp phân c�t b�t gi� electron
ESI-MS Ph� kh�i l��ng ion hóa b�i electron
FAB-MS Ph� kh�i l��ng b�n phá nguyên t� nhanh FAD Flavin adenine dinucleotide
Trang 11FADH2 Flavin adenine dinucleotide (d�ng kh�)FMN Flavin mononucleotide (d�ng oxy hoá) GOT Glutamic oxaloacetic transaminase
GPT Glutamic pyruvic transaminase
GPx Glutathione peroxidase
HCA Hydroxycitric acid
HPLC High pressure liquid chromatography
(S�c ký l�ng cao áp) HMBC Heteronuclear Multipl Bond Connectivity
LU Lung cancer (ung th� ph�i)
M Marker (thang protein chu�n)
3-MC 3- Methylcholanthren
µM/mg Micromol/miligam
NAPB Sodium phenobarbital
NADP Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (d�ng oxy hóa) NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (d�ng kh�)NMR Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân
Trang 12P450 Cytochrome P450
PB Phenobarbital
PCN Pregnenolon Carbon Nitril
PCR Polymerase chain reaction
RP18 Reverse phase 18 HPLC column (c�t s�c
ký ng��c pha) ROS Reactive oxygen species (các g�c oxygen
ho�t ��ng) SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate -
polyacrylamide gel electrophoresis (�i�n
di gel polyacrylamid)
TAS Total antioxidant status (tr�ng thái ch�ng
oxy hóa toàn ph�n)TLPT Tr�ng l��ng phân t�
TEMED N,N ,N,N - tetramethyl ethylene diamine
H2O2 Dihydroperoxid
UI Unit International (�ơn v� qu�c t�)
Trang 13M�C L�C
Trang
L�I GI�I THI�U
L�I NÓI ��U
Ch��ng II: ��C �I�M C�U T�O VÀ CƠ CH� PH�N
2.2 Nh�ng g�c axit amin �ư�c b�o toàn và vai trò ch�c n�ng
2.3 Nh�ng ��c trưng v� trí hem c�a Cyt-P450 so v�i nh�ng
protein ch�a hem liên k�t oxygen khác 31 2.4 Cơ ch� ph�n �ng xúc tác b�i Cyt-P450 38
Trang 14Ch��ng III: H� TH�NG OXYGENASE (Cyt-P450) �
3.2 S� oxy hóa � acid béo và chuy�n hóa eicosanoid 51 3.3 Chuy�n hóa thu�c và các ch�t l� (xenobiotic)
3.5 Cyt-P450 chuy�n hóa trung gian các hóa ch�t gây ung thư
Ch��ng IV: H� TH�NG CYTOCHROME - P450 � VI
4.1 H� th�ng Cyt-P450 � n�m men và n�m s�i 79
4.3 Các enzym Cyt-P450 � th�c v�t 104
Ch��ng V: NH�NG GEN Cyt-P450 VÀ S� BI�U HI�N
5.2 Nh�ng Cyt-P450 �ư�c kích thích t�ng h�p b�i thu�c 135 5.3 Nh�ng gen bi�u hi�n lư�ng d�ng v� gi�i c�a Cyt-P450 142 5.4 Các Cyt-P450 trong chuy�n hóa steroid 154
Ch��ng VI: NH�NG NGHIÊN C�U �NG D�NG
Trang 156.5 Cây chuy�n gen 185 6.6 S� d�ng vi khu�n như là m�t trong nh�ng ch�t xúc tác sinh
Trang 16Ch ng I
L CH S NGHIÊN C U CYTOCHROME-P450
Danh t� Cytochrome có ngh�a là ch�t màu trong t� bào Nói ��nCytochrome, ngư�i ta thư�ng liên h� ngay t�i vai trò chính c�achúng trong chu�i hô h�p t� bào (Warburg g�i là các ferment hô h�p) Các Cytochrome �ã bi�t g�m có Cytochrome c, Cytochrome oxidase (aa3), Cytochrome b (ch� y�u là b5) g�n � màng ti th� N�m
1930, David Keilin phân bi�t 3 lo�i Cytochrome a, b, c theo ��c tính h�p th� ánh sáng khác nhau c�a chúng, s� khác nhau này là do các g�c khác nhau g�n vào hem Hem a có g�c formyl; hem b có Fe+2 –protoporphyrin; hem c có thiol hoá qua vinyl-este liên k�t v�i SH c�a apoenzym (Joan Keilin, 1969)
N�m 1961và sau �ó là vào n�m 1965, theo thông báo c�a U� ban enzyme h�i Hoá sinh qu�c t� thì Cytochrome là “nh�ng hemoprotein mà ch�c n�ng sinh h�c c�a nó là v�n chuy�n �i�n t�
và H2b�ng m�t s� thay ��i hoá tr� thu�n ngh�ch c�a s�t hem: Fe+3�
Fe+2 ” Ngư�i ta c�ng �ưa ra cách phân lo�i và g�i tên các Cytochrome như sau: Các Cytochrome �ư�c chia thành 4 nhóm c�nc� theo s� khác nhau c�a nhóm ngo�i (R.Lemberg F.R.S.and J.Barrett, 1973)
Nhóm 1: Cytochrome a có nhóm ngo�i là hem ch�a 1 chu�i bên formyl, g�i là hem a (hình 1a)
Nhóm 2: Cytochrome b có nhóm ngo�i là protohem (hình 1b) Nhóm 3: Cytochrome c có nh�ng liên k�t ��ng hoá tr� gi�a hem
và protein (hình 1c)
Nhóm 4: Cytochrome d có m�t s�t dihydroporphyrine (chlorine) (hình 1d)
Trang 17N N
N N
Fe
H3C
CH3 CH CH2
CH2 H2C CO2H
H2 C CH C CH3 CH3 HOH
CH3 H2C H2C C C CH3 C 2
H2 C CH C CH3 CH3 H
O
N N
Fe
H3C
CH3 CH CH2
CH2 H2C CO2H
CH3 CH CH2
CH2 H2C CO2H
CH2 H2C CO2H H3C
HC CH2
HH
or
N N Fe H3C
CH3 CH
CH2 H2C CO2H
CH2 H2C CO2H H3C
HC
S H3C
CH2 CHNH OC
C O H
CH COR1
NH CHR2 CO
CH3
S C2 CH CO NH
FIG 1a Haem a (Cytohaem a)
FIG 1b Protohaem (Cytohaem b) FIG 1d Cytohaem d
FIG 1c Haem c (Cytohaem c).
Hình 1 Phân lo�i và cách g�i tên các Cytochrome
Cytochrome - P450 là enzyme m�i �ư�c phát hi�n cách nay kho�ng 60 n�m �ây là m�t enzyme g�n màng, m�t terminal oxidase c�a h� th�ng monooxygenase, tham gia ph�n �ng oxy hoá r�t nhi�u h�p ch�t khác nhau và có vai trò r�t quan tr�ng trong chuy�n hoá nh�ng ch�t có nhân thơm (g�m c� ch�t n�i sinh), các acid amin, thu�c và nh�ng ch�t không do cơ th� t�ng h�p nên, các ch�t l� Cytochrome - P450 là enzyme nhóm b theo cách phân lo�ic�a D Keilin Các enzyme Cytochrome - P450 (vi�t t�t là Cyt-
Trang 18P450) là m�t ��i gia �ình nh�ng protein ch�a hem, xúc tác s�chuy�n hoá nhi�u cơ ch�t n�i sinh ưa m� như steroid, acid béo, nh�ng vitamin tan trong d�u m�, prostaglandin, leucotriene, thromboxane và các h�p ch�t ngo�i sinh (xenobiotics) Enzyme này �ã �ư�c phát hi�n t� nh�ng n�m 1940 trong khi các nhà khoa h�c �ang tìm cách gi�i thích cho m�t lo�i ph�n �ng không bình thư�ng có s� tham gia c�a phân t� oxy (02).Trong nh�ng ph�n
�ng này, m�t nguyên t� oxy liên k�t v�i 2 nguyên t� hydro (�ư�ccho t� 2 phân t� NADPH) �� t�o thành H2O, trong khi nguyên t�oxy th� 2 �ư�c g�n vào cơ ch�t (ký hi�u là RH) Ph�n �ng có th�
�ư�c bi�u di�n theo công th�c sau:
2NAD(P)H + O2+ RH > NAD(P)++ H2O + ROH
Cytochrome - P450 khác bi�t v�i các Cytochrome khác � ch�chúng chuy�n th�ng �i�n t� ��n phân t� oxy còn Cytochrome khác chuy�n �i�n t� ��n các protein, và có sóng h�p th� c�c ��i � 450nmkhi g�n v�i CO S� có m�t c�a m�t ch�t màu ph�n �ng v�i CO và
�i kèm v�i Cytochrome b5 trong microsome �ã �ư�c phát hi�n b�iG.R.Williams vào n�m 1955 và Garfinkel (1958) trong Qu� h�cb�ng Johnson và b�i Klingenberg (1958) Ch�t màu này �ư�c ��ctrưng b�i m�t b�ng h�p th� c�a h�p ch�t v�i CO � 450nm, vì v�y
�ư�c g�i là P450 Sau �ó, Sato và Omura (1961, 1962, 1964) �ãxác ��nh b�n ch�t hem c�a nhóm ngo�i c�a nó Lo�i protein ch�ahem có m�t trong microsome m�i �ư�c phát hi�n này có nh�ng thu�c tính riêng bi�t �ã �ư�c xác ��nh là m�t terminal oxidase c�anhi�u ph�n �ng oxy hoá khác nhau tham gia vào m�t s� quá trình chuy�n hoá quan tr�ng � cơ th� ��ng v�t: sinh t�ng h�p hormone steroid, acid m�t t� cholesterol và chuy�n hoá thu�c Cytochrome
- P450 c�ng �ư�c tìm th�y trong ti th� c�a thư�ng th�n chu�t c�ng (Harding và cs., n�m 1964 và 1966) và � ti th� v� thư�ng th�n bò (Kinoshita, 1966; Cammer và Estabrook, 1967; Whysner và Harding, 1968; Oldham và cs., 1968) Ngư�i ta c�ng phát hi�n ra r�ng Cyt-P450 không ch� có � microsome và � ti th� c�a ��ng v�t
có vú mà còn phân b� r�ng rãi � các d�ng t�n t�i khác nhau c�a s�s�ng bao g�m: ��ng v�t, th�c v�t và vi sinh v�t Nh�ng nghiên c�uv� Cyt-P450 t�ng lên ��c bi�t nhanh chóng trong n�a sau c�anh�ng n�m 1960, khi nh�ng nghiên c�u �ư�c t�p trung ch� y�u vào ch�c n�ng c�a Cyt-P450 trong chuy�n hoá các thu�c � microsome gan Vai trò c�a Cyt-P450 trong s� ho�t hoá các ch�t gây ung thưkhác nhau (carcinogens) �ã �ư�c kh�ng ��nh vào ��u nh�ng n�m
Trang 191970 và nhi�u nhà khoa h�c �ang nghiên c�u các hoá ch�t gây ung thư chuy�n sang nghiên c�u Cyt-P450, mang l�i s� phát tri�n vư�tb�c l�n th� hai trong l�nh v�c nghiên c�u này S� phát tri�n quan tr�ng ti�p theo là nh�ng nghiên c�u làm s�ch Cyt-P450 t�microsome và ti th� d�n t�i vi�c tinh ch� và ��c trưng �ư�c nhi�ud�ng khác nhau c�a Cyt-P450 ngu�n g�c ��ng v�t H�u h�t nh�ng d�ng �ã tinh ch� này ��u tham gia vào s� chuy�n hoá c�a nh�ng ch�t n�i sinh khác nhau, kh�ng ��nh vai trò thi�t y�u c�a Cyt-P450 trong s� chuy�n hoá bình thư�ng � ��ng v�t ��n cu�i nh�ng n�m
1980, c�u trúc b�c 1 c�a g�n 200 Cyt-P450 �ã �ư�c làm sáng t� vàcon s� này ti�p t�c t�ng lên theo th�i gian � �ây chúng tôi ch� tóm lư�c l�ch s� phát tri�n trong nh�ng n�m ��u tiên c�a quá trình nghiên c�u v� Cyt-P450
1.1 Phát hi#n Cyt-P450 trong microsome gan
L�ch s� nghiên c�u Cyt-P450 b�t ��u n�m 1955, khi mà G.F.Williams và M.Klingenberg � Trư�ng ��i h�c Pennsylvania (��c l�p v�i nhau), cùng lúc nh�n th�y có m�t ��nh quang ph� g�n
CO ��c bi�t c�a microsome gan l�n H� �ang trong quá trình nghiên c�u ��ng h�c ph�n �ng oxy hóa kh� c�a Cyt-b5 g�n v�imicrosome trong phòng thí nghi�m c�a B.Chance và quan sát th�yxu�t hi�n m�t b�ng h�p th� rõ � 450nm ph� thu�c vào s� s�c khí
CO khi có m�t dung d�ch NADH B�ng h�p th� này �ã t�ng lên khi thêm Dithionit vào dung d�ch trên B�i vì vi�c thêm CO �ã không
�nh hư�ng gì ��n các b�ng c�a Cyt-b5, nên b�ng h�p th� � 450nmkhông th� quy cho là thu�c tính c�a b5, hemoprotein duy nh�t �ư�cbi�t � th�i �i�m �ó Klingenberg lúc �ó là khách m�i khoa h�c ��nt� ��c, �ã c� g�ng làm rõ b�n ch�t c�a ch�t màu � microsom g�n
CO (microsomal CO - binding pigment) m�i m� này, cái mà ch�
�ư�c phát hi�n b�i ��c trưng quang ph� phân bi�t khi g�n v�i CO (hình 1.1)
S� g�n CO ch�t ch� g�i ý có s� t�n t�i c�a m�t nguyên t� kim lo�i n�ng trong vi�c t�o màu c�a s�c t� này, nhưng quang ph� c�a nó th� hi�n l�i không gi�ng v�i b�t c� màu c�a metalloprotein nào �ãbi�t bao g�m nh�ng hemoprotein khác nhau Klingenberg nh�n th�yr�ng s� lư�ng protohemin trong microsome gan nhi�u hơn 2 l�n s�li�u �ã tính toán cho Cyt-b5, nhưng ông không th� liên h� s� có m�tc�a protohemin th�a trong microsome v�i ch�t màu liên k�t CO
Trang 20Klingenberg r�i kh�i Qu� Johson (Johson foundation) n�m sau
�ó mà không h� công b� k�t qu� nghiên c�u c�a mình v�
“microsomal CO-binding pigment”, nh�ng nghiên c�u này �ư�cti�p t�c b�i D.Garfinkel, ông c�ng quan tâm ��n vi�c làm rõ b�nch�t c�a ch�t màu t� microsome gan có thu�c tính quang ph� ��cbi�t này
Hình 1.1 Quang ph� phân bi�t CO c�a microsome gan chu�t d�ng kh�
b�i NADH (�ư�ng v�ch ng�t quãng) và kh� b�i Dithionit
(�ư�ng li�n)
Garfinkel �ã s� d�ng microsome gan l�n �� thu nh�n ch�t màu này và c�ng th�y r�ng nó r�t không b�n ��i v�i nh�ng x� lý khác nhau mà Klingenberg trư�c �ó �ã ghi nh�n B�n ch�t hóa h�c c�ach�t màu này v�n chưa �ư�c bi�t và ��n n�m 1958, c� Klingenberg
và Garfinkel �ã ��c l�p công b� nh�ng nghiên c�u c�a mình Nhưng ph�i ��n t�n n�m 1962, T.Omura và R.Sato � vi�n nghiên c�u protein thu�c ��i h�c Osaka m�i có m�t s� gi�i thích ban ��uc�a h� v� ch�t màu này, trong �ó �ưa ra ch�ng c� v� quang ph�ch�ng minh b�n ch�t hemoprotein c�a nó H� cho r�ng �ó là m�tCytochrome nhóm b m�i và ��t tên “Cytochrome-P450” �� ch�
“m�t ch�t màu v�i 1 sóng h�p th� � 450nm” Sato c�ng là m�t
Trang 21khách m�i khoa h�c t�i Qu� Jonhson khi Klingenberg �ang nghiên c�u “microsomal CO-binding pigment” Như v�y, nghiên c�u c�aOmura �ã có s� g�n k�t v�i công trình ��u tiên c�a Klingenberg và Garfinkel
Omura và Sato b�t ��u nghiên c�u v�n �� này t� nh�ng n�m
1960 Quan sát ��u tiên c�a h� g�i ý v� b�n ch�t hemoprotein là quang ph� phân bi�t c�a ch�t màu d�ng kh� v�i ethyl isocyanide, trong �ó nh�ng b�ng và �ã �ư�c nh�n bi�t m�t cách rõ ràng là nh�ng b�ng r�t ��m trong vùng h�p th�, h� c�ng th�y r�ng ch�tmàu �ã không b� phân h�y khi x� lý microsome v�i ch�t t�y r�a,
mà �ã �ư�c chuy�n m�t cách ��nh lư�ng thành m�t d�ng h�p th�quang ph� riêng bi�t khác, d�ng này v�n còn l�i kh� n�ng liên k�tv�i CO t�o ra m�t ��nh h�p th� � 420nm thay cho 450nm ban ��uv�i nh�ng b�ng và r�t rõ, �i�u �ó kh�ng ��nh b�n ch�themoprotein c�a ch�t màu hòa tan này (hình1.2)
Hình 1.2 Quang ph� phân bi�t c�a P450 (a) và P420 (b)
Hơn n�a, Omura và Sato �ã �o �� chênh l�ch gi�a quang ph�d�ng oxy hóa và d�ng kh�, th�y nó không khác quang ph� c�a m�tCytochrome ��c hi�u nhóm b D�ng hòa tan �ư�c g�i là Cyt-P420
�� phân bi�t v�i d�ng g�n màng nguyên v�n Vì m�t s� bi�n ��ic�a d�ng Cyt-P450 thành d�ng Cyt-P420 có th� quan sát �ư�c khimicrosome �ư�c x� lý v�i ch�t t�y r�a ho�c v�i m�t dung d�ch
Trang 22phospholipase, �ã xác ��nh b�n ch�t hemoprotein c�a d�ng hòa tan
�i�u này kh�ng ��nh Cyt-P450 liên k�t màng nguyên v�n, c�ng là m�t hemoprotein
Omura và Sato công b� 2 bài báo vào n�m 1964, trong �ó thu�ctính cơ b�n c�a hemoprotein m�i này �ã �ư�c mô t� D�ng hòa tan
�ư�c tinh s�ch m�t ph�n �� lo�i b� nh�ng ch�t màu �i kèm như Cyt b5 H� �ã �o quang ph� h�p th� tuy�t ��i c�a Cyt-P420 Tính t�nglư�ng Cyt-P450 �ã chuy�n thành Cyt-P420, h� �ã tính toán và công b� m�t h� s� t�t ��i v�i quang ph� h�p th� ��c trưng c�a Cyt-P450 d�ng kh� là 91cm-1mmol-1 (chênh l�ch h�p th� gi�a 450nm và490nm) M�c dù h� s� t�t ��i v�i Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh l�n
��u tiên như v�y b�i m�t quá trình gián ti�p s� d�ng microsome, nhưng tính xác th�c c�a giá tr� này sau �ó �ã �ư�c kh�ng ��nh b�ng phép �o s� d�ng Cyt-P450 tinh s�ch S� xác ��nh h� s� t�t c�a Cyt-P450 �ã giúp Omura và Sato tính toán �ư�c hàm lư�ng c�a nótrong microsome và ch� ra r�ng s� lư�ng liên k�t c�a Cyt-P450 và Cyt-b5 trong microsome gan th� �ã phù h�p t�t v�i t�ng lư�ng c�aprotohemin trong microsome Như v�y, s� có m�t c�a hemin th�atrong microsome mà l�n ��u tiên Klingenberg nh�n th�y nhưng không th� quy cho Cyt b5 �ã �ư�c gi�i thích b�ng s� có m�t c�ahemoprotein m�i �ó là Cyt-P450
Trong khi Omura và Sato �ang nghiên c�u thu�c tính quang ph�c�a Cyt-P450 thì v�n �� này c�ng �ư�c ti�n hành � phòng thí nghi�m c�a H.S.Mason (��i h�c Oregon) V�i m�t m�c �ích nghiên c�u khác, Mason và c�ng s� �ã �o quang ph� c�ng hư�ng t� �i�n t� (ESR) c�a microsome gan th� và th�y m�t s� h�p th�
��c trưng m�i trong vùng g=2 v�i m�t tín hi�u � gm=2,25 r�t n�ib�t H� k�t lu�n r�ng ch�t làm phát tín hi�u này có th� là m�themoprotein ch�a s�t lư�ng t� th�p (low spin) m�i và ký hi�u là
“microsomal Fex” Tín hi�u ESR c�a microsomal Fexgi�m �áng k�khi cho thêm NADH ho�c NADPH vào microsome trong �i�u ki�ny�m khí, và khi thêm CO l�i gi�m �áng k� tín hi�u b�i NADPH
��c bi�t là s� lư�ng microsomal Fex �ư�c tính toán t� cư�ng ��c�a tín hi�u �ã hoàn toàn tương �ương v�i s� chênh l�ch gi�a hàm lư�ng c�a protohemin toàn ph�n v�i protohemin c�a Cyt b5 trong microsome Nh�ng quan sát này �ã �ng h� m�nh m� cho s� ��ng nh�t microsomal Fex v�i Cyt-P450, ch�t này cho ��n lúc b�y gi�ch� �ư�c xác ��nh b�i ��c tính quang ph� c�a nó, nh�ng công trình ti�p theo �ã kh�ng ��nh �i�u �ó
Trang 231.2 Phát hi#n ch.c n/ng sinh h0c c1a Cyt-P450
Quang ph� b�t thư�ng và tín hi�u ESR m�nh c�a Cyt-P450 �ư�ccông b� n�m 1962 �ã thu hút s� chú ý c�a nhi�u nhà hóa sinh �ang nghiên c�u v� ��c tính hoá lý c�a các hemoprotein và ��ng l�c thúc
��y h� d�n tâm s�c vào nghiên c�u lo�i hemoprotein ��c bi�t này còn m�nh m� hơn trong nh�ng n�m sau �ó khi ngư�i ta phát hi�n ra ch�c n�ng sinh lý c�a nó như là m�t terminal oxidase ho�t hoáoxygen trong nh�ng ph�n �ng oxy hoá quan tr�ng �i�u này �ã
�ư�c R.W Estabrook; D.Y Cooper và O Rosenthal � ��i h�cPennsylvania công b� H� �ã kh�o sát tính ch�t bi�n ��i quang h�cthu�n ngh�ch c�a s� �c ch� b�i CO trong ph�n �ng thu� phân � v�trí 21-Steroid xúc tác b�i microsome tuy�n thư�ng th�n, và quang ph� ph�n �ng thu �ư�c th� hi�n m�t cách rõ ràng s� tham gia c�aCyt-P450 vào ph�n �ng thu� phân
Hơn n�a, các nhà nghiên c�u còn ch�ng minh �ư�c vai trò chính c�a Cyt-P450 trong nhi�u ph�n �ng oxy hoá ch�c n�ng h�n h�pkhác, bao g�m nh�ng ph�n �ng thu� phân ho�c oxy hoá, dealkyl hoá các thu�c khác nhau b�i microsome gan Trong bài báo t�ng quan, Cooper �ã mô t� v� tác ��ng quan tr�ng c�a phát hi�n này S� �c ch� ph�n �ng thu� phân C21- steroid b�ng CO �ã �ư�cK.Ryan và L.Engel mô t� n�m 1957 Th�m chí b�ng phương pháp nhi�u x� ánh sáng tr�ng h� �ã ghi nh�n m�t s� �c ch� thu�n ngh�ch c�a CO Tuy nhiên h� �ã không có kh� n�ng �ưa ra �ư�c m�itương quan gi�a nh�ng quan sát quan tr�ng c�a h� v�i m�themoprotein g�n v�i CO có ch�c n�ng như là m�t terminal oxidase b�i vì ��n th�i �i�m �ó ch� có Cyt b5 �ư�c bi�t ��n là microsomal hemoprotein mà ch�t này l�i không liên k�t v�i CO Estabrook, Cooper và Rosenthal sau �ó �ã ti�n hành thí nghi�m v� quang ph�v�i microsome tách t� v� thư�ng th�n (adrenal cortex)
Vi�c phát hi�n ra ch�c n�ng c�a Cyt-P450 m� ra m�t l�nh v�cnghiên c�u r�ng l�n v� hemoprotein m�i �ư�c phát hi�n này Không ch� các nhà nghiên c�u mà c� các dư�c s� và các nhà n�iti�t h�c c�ng r�t quan tâm t�i thu�c tính quang ph� khác thư�ng c�a Cyt-P450 vì ch�c n�ng �ư�c phát hi�n c�a nó bao g�m m�t s�ph�n �ng chuy�n hoá quan tr�ng nh�t trong l�nh v�c nghiên c�uc�a h� Nh� nh�ng máy móc như quang ph� t� ghi split-beam nh�y
�ã xúc ti�n �áng k� các nghiên c�u v� Cyt-P450 Các phép �oquang ph� h�p th� ��c bi�t ��i v�i nh�ng m�u có �� ��c cao là r�t
Trang 24hi�u qu� �� phát hi�n và ��nh lư�ng hemoprotein này Ngư�i ta nh�n th�y s� ho�t hoá cho quá trình oxy hoá thu�c c�a microsome gan ��ng v�t có vú t�ng cao �áng k� khi cho ��ng v�t dùng nh�ng lo�i thu�c nh�t ��nh.
M�c dù b�n ch�t hemoprotein c�a Cyt-P450 và vai trò c�a nótrong ph�n �ng oxy hoá thu�c �ã �ư�c làm rõ nhưng mãi t�i nh�ng n�m 1962-1963 các nhà dư�c h�c m�i tích c�c nghiên c�u s�chuy�n hoá thu�c b�i microsome gan, ngh�a là hơn 10 n�m k� t�nh�ng công trình ��u tiên c�a J.A.Mueller và G.C.Miller công b�v� �i�u này S� t�ng �ào th�i, t�ng oxy hoá thu�c do ho�t ��ng chuy�n hoá � microsome gan l�n ��u tiên c�ng �ư�c phát hi�n b�iCorney và cs vào n�m 1956, sau �ó �ư�c ti�p t�c b�i H.Remmer
và R.Kato S� t�ng ho�t tính oxy hoá thu�c c�ng �ư�c gi�i thích b�i Remmer, L.Ernster và S.Orenius trên cơ s� m�t s� t�ng có ch�nl�a Cyt-P450 và reductase c�a nó (NADPH-Cyt-P450-reductase) trong microsome tách t� nh�ng ��ng v�t �ư�c dùng thu�c
1.3 Phân b5 c1a Cyt-P450 trong các d7ng khác nhau c1a s: s5ng
Do Cyt-P450 �ư�c phát hi�n l�n ��u tiên � microsome gan, nên ban ��u ngư�i ta ngh� là nó ch� có m�t � t� ch�c gan Nhưng nh�ng nghiên c�u sau �ó kh�ng ��nh s� phân b� r�ng rãi c�a Cyt-P450 ti th� trong các t� ch�c ��ng v�t Ngoài các cơ quan s�n xu�t steroid như �ã nêu � trên, gan, th�n c�ng có ch�a Cyt-P450 ti th� và ch�cn�ng c�a chúng trong sinh t�ng h�p acid m�t, ho�t hoá chuy�n hoávitamine D, �ã �ư�c kh�ng ��nh �i�u ��c bi�t là t�t c� các d�ng Cyt-P450 ti th� có ch�c n�ng chuy�n hoá cơ ch�t steroid n�i sinh v�i m�t s� ��c hi�u cơ ch�t nghiêm ng�t và không chuy�n hoá các ch�t ngo�i sinh Trong n�a sau c�a nh�ng n�m 1960 �ã có nh�ng công b� v� s� phát hi�n Cyt-P450 trong vi sinh v�t, ch�ng t�hemoprotein này phân b� r�ng hơn nhi�u so v�i suy ngh� ban ��u.Ngay t� 1964, A.Lindenmayer và L.Smith �ã công b� s� có m�t
c�a Cyt-P450 trong Saccharomycess cerevisia Ch�ng c� thuy�t
ph�c ��u tiên v� s� có m�t c�a hemoprotein này trong vi khu�n là �
vi khu�n c� ��nh ��m rhisobium japonicum (n�m 1967) Ngư�c l�i
v�i nh�ng Cyt-P450 trong th� Eukaryotic �ã �ư�c công b� trư�c �ó
��u là g�n vào màng các ti�u ph�n dư�i t� bào, Cyt-P450 c�a
rhizobium japonicum hoà tan trong d�ch t� bào vi khu�n và �ư�c
Trang 25thu nh�n t� ph�n d�ch n�i khi phá v� t� bào b�ng phương pháp cơh�c Sau �ó ngư�i ta c�ng phát hi�n ra nh�ng Cyt-P450 hoà tan trong nhi�u lo�i vi khu�n khác n�a Nh�ng Cyt-P450 vi sinh v�t
này bao g�m Cyt-P450 thu� phân camphor c�a pseudomonas
putida, Cyt-P450 hoà tan c�a cosyne bacterium sp., vi khu�n này �ã
m�c v�i n-octan như là ngu�n cacbon, Cyt-P450 thu� phân acid
béo c�a bacillus megaterium Nh�ng Cyt-P450 hoà tan này d�
dàng tinh s�ch hơn nhi�u so v�i lo�i liên k�t màng c�a các th�
Eukaryos Cyt-P450 c�a pseudomonas putida (P450cam) �ã �ư�c
tinh s�ch � m�c �� cao và �ã �ư�c k�t tinh, tr� thành nguyên li�ut�t nh�t cho các nghiên c�u sau này
Ngoài ra Cyt-P450 c�ng �ư�c tìm th�y trong rau qu� và n�mm�c � h�u h�t các trư�ng h�p, Cyt-P450 �ư�c tìm th�y trong ti�uph�n microsome, sau khi nghi�n ��ng th� các t� ch�c r�i ly tâm phân �o�n Vai trò sinh lý c�a chúng �ã �ư�c làm rõ, chúng có ch�c n�ng như là m�t monooxygenase, s� d�ng ho�c NADPH ho�cNADH làm ngu�n cung c�p �ương lư�ng kh� cho ph�n �ng oxygen hoá � cây xanh, nh�ng phát hi�n v� Cyt-P450 thư�ng �ikèm v�i nh�ng nghiên c�u v� sinh t�ng h�p ho�c chuy�n hoá c�acác thành ph�n c�u t�o t� bào như lignin, terpenes, alkaloid M�tkhác, trong nh�ng nghiên c�u � côn trùng và ��ng v�t b�c th�p,ngư�i ta r�t chú ý t�i vai trò c�a Cyt-P450 trong chuy�n hoá ch�tdi�t côn trùng ho�c các h�p ch�t ngo�i lai khác Như v�y, rõ ràng là Cyt-P450 phân b� r�t r�ng rãi trong các d�ng khác nhau c�a s�s�ng, t� vi khu�n nguyên thu� ��n ��ng v�t có vú phát tri�n cao và tham gia vào các ph�n �ng chuy�n hoá như là y�u t� ho�t hoáoxygen c�a h� th�ng monooxygenase � các th� eukaryotic Tr�ir�ng t� ��ng v�t có vú ��n n�m men và n�m m�c, Cyt-P450 là enzyme th�c s� c�n thi�t cho sinh t�ng h�p và chuy�n hoá nh�ng ch�t n�i sinh và ch�t l� Trong m�t s� loài vi khu�n, ch�c n�ng c�a
nó �ư�c tìm th�y như là ch�t xúc tác cho s� chuy�n hoá ch�t ngo�ilai �ư�c vi khu�n s� d�ng làm ngu�n carbon �� phát tri�n
Hai lo�i hemoprotein hoà tan có thu�c tính quang ph� “gi�ng như Cyt-P450” �ã �ư�c công b� là: chloroperoxidase-m�t enzym
ngo�i bào c�a caldarion fungo và m�t lo�i khác là hemoprotein
H-450- m�t cytosolic protein- t� t� ch�c ��ng v�t Lo�i ��u có m�t
��nh h�p th� quang ph� � 450nm khi liên k�t v�i CO gi�ng nhưP450, trong khi lo�i sau có cùng sóng h�p th� � d�ng kh� khikhông có CO C� hai hemoprotein này có c�u trúc phân t� r�t gi�ng
Trang 26v�i c�u trúc c�a Cyt-P450 nhưng c�u trúc b�c 1 c�a chúng l�ikhông gi�ng b�t k� d�ng Cyt-P 450 nào Chúng không �ư�c x�pvào ��i gia �ình các Cyt-P 450 nhưng �ư�c �ánh giá là có liên quan ti�n hoá v�i nh�ng hemoprotein
1.4 Vai trò c1a Cyt-P450 trong h# th5ng oxygenase
Vai trò thi�t y�u c�a Cyt-P450 trong nh�ng ph�n �ng oxygen hoá khác nhau �ã �ư�c ch�ng minh Bư�c nghiên c�u quan tr�ng ti�p theo là làm rõ cơ ch� c�a quá trình cung c�p �i�n t� t� NADPH
��n Cyt-P450, nơi mà s� ho�t hoá phân t� oxy x�y ra khi tiêu th�
�ương lư�ng kh� Tuy nhiên, h� th�ng oxygenase ch�a Cyt-P450 c�a microsome gan g�n r�t ch�t vào màng và r�t khó hoà tan H�th�ng oxygenase ch�a Cyt-P450 ��u tiên �ư�c làm rõ v� các c�u t�t�o thành là h� th�ng steroid 11 -hydroxylase c�a tuy�n thư�ng th�n do Omura và cs th�c hi�n
Trái v�i microsomal oxygenase, nơi mà t�t c� các c�u t� c�a h�th�ng ��u liên k�t ch�t ch� v�i màng, h� th�ng steroid 11 -hydroxylase c�a ti th� tuy�n thư�ng th�n có th� �ư�c tách ra b�isóng siêu âm thành nh�ng �o�n màng có ch�a Cyt-P450 và m�t h�th�ng NADPH-Cyt-P450 reductase hoà tan H� th�ng reductase l�iti�p t�c �ư�c phân �o�n b�ng s�c ký thành m�t protein sulfur ch�as�t và m�t flavo protein có kh� n�ng kh� protein Fe-S b�i NADPH T�t c� 3 c�u t� này là c�n thi�t cho s� tái t�o l�i ho�t tính thu�phân Protein Fe-S có quang ph� h�p th� tương t� v�i protein c�aferedoxin � th�c v�t và �ư�c g�i là adrenodoxin theo �� ngh� c�aK.Suzuki và T.Kimura
Ít n�m sau �ó M.Katagiri và cs �ã phát hi�n s� tham gia c�a
Cyt-P450 vào h� th�ng thu� phân camphor � pseudomonas putida.
H� th�ng oxygenase hoà tan này ch�a m�t Cyt- P450, m�t protein Fe-S có tên g�i “putidaredoxin”, và m�t flavo protein, ch�t này kh�putidaredoxin b�ng NADH H� th�ng Cyt-P450 vi khu�n này r�tgi�ng v� m�t c�u t�o v�i h� th�ng thu� phân steroid có Cyt-P450 c�a ti th� tuy�n thư�ng th�n, m�c dù adrenodoxin có th� không thay th� �ư�c putidaredoxin trong h� th�ng thu� phân camphor tái t�o
��i v�i h� th�ng oxygenase ch�a microsomal Cyt-P450 c�n ph�i
có NADPH ch� không ph�i NADH cho ph�n �ng oxygenase, �i�unày g�i ý r�ng có s� tham gia c�a m�t NADPH reductase ��c hi�u
Trang 27B�ng cách gián ti�p, trong nh�ng n�m 1960 ngư�i ta �ã ch�ng minh s� tham gia c�a NADPH-cytochrom reductase trong vi�ccung c�p �ương lư�ng kh� t� NADPH ��n terminal oxydase P450 N�m 1968, A.Y.H.Lu và M.J.Coon công b� �ã tái t�o thành công h� th�ng microsomal oxydase t� các y�u t� hoà tan M�t trong nh�ng c�u t� c�n thi�t là reductase Th� nghi�m tái t�o này sau �ó
�ã �ư�c l�p l�i b�ng nh�ng s�n ph�m tinh s�ch và �ã c�ng c� cho quan ni�m v� 2 c�u t� protein g�n màng, Cyt-P450 và reductase, là c�n thi�t cho s� tái t�o ho�t ��ng Reductase này hi�n nay �ư�c g�i
�óng góp c�a b5 vào vi�c cung c�p �i�n t� cho Cyt-P450 là khác nhau ��i v�i m�i d�ng Cyt-P450 khác nhau và còn ph� thu�c vào cơch�t c�a ph�n �ng M�t s� d�ng c�a Cyt- P450 �ư�c tinh ch� t�microsom gan cho th�y có s� �òi h�i tuy�t ��i v�i b5 cho m�t s� cơch�t nh�t ��nh K�t qu� này và nh�ng nghiên c�u sau �ó kh�ng ��nhr�ng �i�n t� ��u tiên cho s� kh� c�a Fe trong Cyt-P450 thư�ng �ư�ccung c�p t� CPR, còn �i�n t� th� 2 cho s� ho�t hoá nguyên t� oxy g�n v�i hem có th� t� CPR ho�c t� Cyt-b5 d�ng kh� (hình 1.3) NADH fPD Cyt b5
NADPH fPT CYP450 O2
Hình 1.3 H� th�ng P450 monooxygenase c�a microsome gan ��ng v�t có vú
Con ���ng chuy�n �i�n t� th� nh�t (v�ch li�n) và �i�n t� th� 2 (v�ch gián �o�n); fpD là NADH-Cyt-b5 reductase; fpT là NADPH-
RH ROH
Trang 28Cyt-P450 reductase Ph�n �ng monooxxygenase ���c bi�u th� b�ng
cơ ch�t RH chuy�n thành d�ng oxy hoá c�a nó ROH
Như v�y, chúng ta �ã có 2 lo�i h� th�ng oxygenase ch�a P450 khác nhau M�t lo�i �ư�c tìm th�y trong ti th� c�a t� ch�c
Cyt-��ng v�t và c� � vi sinh v�t (hình 1.4), g�m 3 c�u t� protein là: 1 flavo protein liên k�t NADPH, 1 protein Fe-S và Cyt-P450 Lo�ikia thư�ng �ư�c tìm th�y dư�i d�ng các h�t ti�u th� (microsomes) g�n vào màng lư�i n�i nguyên sinh (Smooth Reticulum Endoplasmic-SRE), và ph� bi�n r�ng rãi trong các cơ th�eukaryotic khác nhau
Hình 1.4 Hai lo�i h� th�ng monooxygenase khác nhau
A: H� th�ng g�n màng lư�i n�i sinh ch�t B: H� th�ng � màng ti th�
1.5 Các thu>c tính phân tA c1a Cyt-P450
Khi mà b�n ch�t hemoprotein c�a Cyt-P450 �ư�c kh�ng ��nh(n�m 1962) nh�ng nhà hóa sinh h�c �ang nghiên c�u v�hemoprotein �ã r�t quan tâm v� tr�ng thái liên k�t ph�i h�pprotohem c�a hemoprotein m�i này, vì t�t c� nh�ng protohem c�ahemoprotein khác �ã bi�t ��u ch� có m�t ��nh h�p th� � quanh 420nm (khi d�ng kh� c�a nó liên k�t v�i CO) Nh�ng quan sát m�i
�ây th�y r�ng Cyt-P450 microsome gan d� dàng chuy�n sang d�ng Cyt-P420 khi x� lý v�i 1 ch�t t�y r�a (PCMS) và s� chuy�n này �ã
�ư�c ph�c h�i b�i glutathiol (GSH), g�i ý m�t s� tham gia c�anhóm SH trong s� xu�t hi�n c�a quang ph� � 450nm Ngư�i ta c�ng �ã th� v�i mô hình nh�ng h�n h�p protohem khác có nh�ng thu�c tính quang ph� tương t� Cyt-P450 và �ã thành công (J.O.Sterm và J.Peisach, 1974)
Trang 29Mô hình h�n h�p c�a h� �ã �ư�c t�o ra b�ng cách thêm mercaptoethanolamin protohem Fe2+ khi có m�t m�t bazơ m�nh-tetramethyl amonium hydroxide, xác ��nh nhóm thiol b� ion hóa (thiolatanion) như là m�t trong nh�ng liên k�t tr�c c�a hem Nh�ng nghiên c�u lý hóa sau �ó v�i Cyt-P450 tinh s�ch c�ng �ng h� cho s� có m�t c�a m�t thiolate anion như là m�t trong nh�ng liên k�ttr�c (axial ligands) c�a hemoprotein S� ph�i h�p nhóm thiol c�a 1g�c cystein v�i nguyên t� Fe c�a hem �ã �ư�c ch�ng minh b�ng
phân tích c�u trúc tinh th� tia X trên tinh th� Cyt-P450cam Vì vi�c
làm rõ thu�c tính phân t� c�a Cyt-P450 ph� thu�c nhi�u vào ch�ph�m tinh ch�, ngư�i ta �ã c� g�ng �� hòa tan và tinh ch�hemoprotein này t� microsome gan, nơi ��u tiên phát hi�n ra nó
M�t Cyt-P450 hòa tan tìm th�y trong vi khu�n- Cyt-P450cam- �ã
�ư�c tinh s�ch dư�i d�ng ��ng th� n�m 1970 và �ư�c s� d�ng m�tcách thu�n ti�n trong nh�ng nghiên c�u hoá lý v� Cyt-P450 Nh�ng Cyt-P450 c�a microsome và ti th� r�t d� bi�n d�ng t�o thành Cyt-P420 khi x� lý như hòa tan b�ng ch�t t�y r�a Vi�c hòa tan hoàn toàn Cyt-P450 t� microsome ho�c t� ti th� ph�i ch� s� phát tri�n k�thu�t m�i �� làm b�n và ch�ng l�i tác ��ng c�a các ch�t t�y r�a Y.Ichikawa và T.Yamato �ã t�o m�t s� c�i cách, m�t bư�c ngo�tth�c s� vào n�m 1967, khi �ưa ra m�t cách làm b�n hi�u qu� là dùng glycerol và glutathional kh� Phát hi�n quan tr�ng này tr�thành y�u t� không th� thi�u trong t�t c� các quá trình tinh ch� Cyt-P450 g�n màng �ư�c công b� trong nh�ng n�m ti�p theo �� tinh s�ch P450, c�n ph�i làm t�ng hàm lư�ng hemoprotein microsome gan b�ng cách tiêm các lo�i thu�c nh�t ��nh vào ��ng v�t th�cnghi�m Phenobarbital và 3-methylcholanthren (3-MC) là nh�ng ch�t gây t�ng h�p c�m �ng (inducers) thư�ng �ư�c s� d�ng cho m�c �ích này
Nh�ng công b� ��u tiên c�a N.E.Sladek và G.J.Manmoing trong n�m 1966 v� Cyt-450 t�o ra b�i 3-MC là khác h�n v�i Cyt-P450 t�o ra b�i phenobarbital Hi�n tư�ng này làm n�y sinh các cu�ctranh lu�n trong n�a sau nh�ng n�m 1960 Sau �ó, tranh lu�n �ãl�ng xu�ng khi tinh s�ch Cyt-P450 thành công vào n�m 1974-1975 K�t qu� nghiên c�u ch� ra r�ng các hóa ch�t này kích thích s� t�ng h�p nh�ng lo�i phân t� khác nhau c�a hemoprotein �� tinh s�ch Cyt-P450 ti th�, ngư�i ta �ã ch�n ti th� tuy�n thư�ng th�n làm nguyên li�u, b�i vì hàm lư�ng Cyt-P450 cao M�t nghiên c�uquang ph� trong n�m 1968 �ã xác ��nh s� t�n t�i 2 d�ng khác nhau
Trang 30c�a Cyt-P450 trong ti th� thư�ng th�n và sau �ó �ã tinh s�ch thành công 2 d�ng này (S.Takemori, 1975)
S� tinh ch� thành công Cyt-P450 t� microsome và ti th� �ã t�o
ra m�t s� phát tri�n nhanh trong nghiên c�u hóa sinh và hóa lý c�aCyt- P450 N�m 1980, s� phát tri�n c�a m�t k� thu�t m�i - k� thu�tgen - �ã kích thích s� phát tri�n m�nh trong nghiên c�u hoá sinh Tinh s�ch và ��c trưng �ư�c nhi�u d�ng m�i c�a Cyt-P450 t�nhi�u ngu�n ��ng v�t khác nhau c�ng �ã �ư�c công b� trong nh�ng n�m sau, và danh sách các thành viên c�a gia �ình Cyt-P450 nh� �óv�n ti�p t�c t�ng lên Ch�c ch�n r�ng �ang t�n t�i m�t s� lư�ngkh�ng l� c�a các lo�i phân t� Cyt-P450 trong cơ th� ��ng v�t có vú
và nh�ng sinh v�t khác mà chúng ta chưa bi�t S� chuy�n hóa các ch�t l�, ch�c ch�n là 1 ch�c n�ng ch� y�u và quan tr�ng c�a Cyt-P450 trong ��ng vât, nhưng ph�n l�n các lo�i Cyt-P450 trong cơth� ��ng v�t là tham gia vào nh�ng con �ư�ng chuy�n hóa khác c�nthi�t cho vi�c duy trì s� s�ng bình thư�ng
Vi�c tách và ��c trưng nhi�u lo�i phân t� Cyt-P450 t� ��ng v�t, cây xanh và vi sinh v�t �ã gây ra nh�ng b�i r�i trong vi�c ��t tên c�a chúng Khi ch�c n�ng sinh h�c c�a m�t Cyt-P450 trong t� bào
�ư�c hi�u rõ, ngư�i ta �� xu�t m�t tên theo ch�c n�ng c�a chúng Cyt-P450 xúc tác phân c�t chu�i bên c�a cholesterol có th� �ư�cg�i là P450scc, và Cyt-P450 xúc tác thu� phân vòng nhân thơm c�asteroid có th� �ư�c g�i là Cyt-P450arom Tuy nhiên, tên c�a nh�ng lo�i Cyt-P450 có tính ��c hi�u r�ng v�i cơ ch�t và xúc tác s�oxygen hóa nhi�u ch�t l� khác nhau thì khó kh�n hơn Nebert và c�ng s� g�i ý m�t cách th�c chung cho Cyt-P450, trong �ó t�t c�các lo�i Cyt-P450 mà trình t� axit amin b�c m�t c�a nó �ã �ư�cbi�t rõ �ư�c x�p vào gia �ình ho�c dư�i gia �ình tu� theo m�c ��
tương t� trong trình t� (xem Ph� tr�ơng)
Trang 31Ch ng II
C I M C U T O VÀ C CH PH N NG
C A CYTOCHROME-P450
2.1 (c *i,m c.u t1o c3a Cytochrome-P450
Thành t�u thu �ư�c nh�ng n�m g�n �ây �ã cho phép tinh s�ch,
��c trưng �ư�c tính ch�t �a d�ng c�a Cyt-P450 và cho th�y r�ng enzym này r�t linh ho�t, có kh� n�ng thu� phân �ư�c h�u h�t các phân t� h�u cơ khác nhau, mà nh�ng ch�t này không có liên quan
gì v�i nhau v� c�u trúc �� hi�u v� c�u t�o c�a cơ ch�t ��c hi�u vàb�n ch�t hoá h�c c�a ph�n �ng thu� phân là m�t trong nh�ng m�ctiêu tr�ng tâm trong nghiên c�u Cyt-P450
Trong s� nh�ng Cytochrome �ã �ư�c tách chi�t, Cyt-P450cam,
d�ng enzym hoà tan chi�t t� pseudomonas putida là ví d� ��u tiên
�ã �ư�c mô t� c�u trúc b�c m�t m�t cách hoàn ch�nh Nh�ng thành t�u m�i �ây c�a k� thu�t gen �ã t�o �i�u ki�n cho vi�c xác ��nh toàn b� trình t� axit amin c�a Cyt-P450 g�n màng qua phân tích trình t� ADN V�i s� xác ��nh thành công l�n ��u tiên th� t� b�cm�t c�a Cyt-P450 g�n màng tách t� gan chu�t, trình t� b�c m�thoàn ch�nh c�a nhi�u Cyt-P450 th� eukaryotic c�ng �ã �ư�c làm
rõ Khi phân tích trình t� �ã bi�t c�a các Cytochrome, trong �ó m�t
là t� vi khu�n còn nh�ng Cytochrome khác là t� các lo�i ��ng v�t
có vú khác nhau, ngư�i ta th�y có t�n t�i m�t s� vùng tương ��ng trong trình t� axit amin Vi�c gi�i trình t� axit amin cùng v�inh�ng k�t qu� nghiên c�u c�u trúc tinh th� c�a Cyt-P450cam �ã
cung c�p m�t b�ng ch�ng ch�c ch�n v� m�t g�c cysteine có m�ttrong vùng tương ��ng như m�t ph�i t� liên k�t tr�c v�i s�t hem, và v� m�t g�c threonin trong vùng b�o toàn khác �óng vai trò then ch�t trong s� t�o thành v� trí liên k�t oxygen
Trang 32��n nay, ngư�i ta �ã thu �ư�c m�t s� k�t qu� trong vi�c gây ��tbi�n tr�c ti�p chu�i oligonucleotid, làm bi�n ��i nh�ng g�c axit amin riêng l� � nh�ng v� trí nh�t ��nh, nh�ng ��t bi�n này giúp chúng ta hi�u hơn v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng c�aCyt-P450
C.u trúc tinh th, c3a Cyt-P450cam
Khái quát v= c.u trúc 3 chi=u: C�u trúc 3 chi�u c�a Cyt-P450cam
k�t tinh �ư�c Poulos và cs xác ��nh thành công S� li�u bao g�ms� b� trí chính xác c�a túi liên k�t oxygen, hình �nh chi ti�t m�itương tác protein-cơ ch�t và vùng liên k�t hem C�u trúc 3 chi�uc�a Cyt-P450cam và c�u t�o b�c 1 c�a nó �ư�c ch� ra trong hình 2.1
và hình 2.2
Hình d�ng t�ng th� c�a Cyt-P450cam tương t� 1 hình l�ng tr� tam
giác v�i �ư�ng kính c�c ��i kho�ng 60� (hình 2.1)
C�u trúc ch�a nhi�u helix và các phi�n không song song n�mv� n�a bên trái (hình 2.1)13 helix (ký hi�u các ch� cái t� A ��n L)
là 1 c�u trúc b�c 2 chi�m ưu th� hơn và bao g�m 50% các g�c axit amin Kho�ng 20% các g�c tham gia t�o thành 5 phi�n không song song
Trang 33Chu i helix c ký hi u b i nh ng hình th i (bars) và c%u trúc bi'u th( b)ng hình m*i tên, vùng b( che khu%t là vùng búi phình ch.a liên k/t tr0c Cysteine, cys 35 (J.Mol.Biol.195,689,1987) Copyright 1987 by academie press inc (London ltd.)
Nh�ng helix dài I và L g�n như song song v�i nhau, trong khi helix E, F và G t�o ra 1 bó helix không song song Helix D và L c�ng s�p x�p song song th�ng hàng Trình t� axit amin n�m gi�a
song song, (vùng b� che khu�t trong hình 2.1)
Vùng có 2 g�c ngay sát sau Leu 356 �ư�c g�i là vòng xo�n liên k�t Cystein, ch�a liên k�t tr�c thiolate hem, Cys 357 Trình t� c�utrúc b�c1 xung quanh Cys 357 �ư�c b�o toàn cao trong các lo�iCyt-P450 Các g�c axit amin t� 186-192 và 215-218 là nh�ng vùng b� m�t không ��u trong �ó các g�c 186-192 ti�p xúc v�i helix G và
H, các g�c t� 215-218 ti�p xúc v�i helix F và G Nh�ng vòng xo�nnày �ư�c gi� b�n b�i nh�ng liên k�t hydro ho�c c�u mu�i M�tvùng b� m�t không ��u tương t� c�ng �ư�c tìm th�y gi�a g�c 337
và Arg �ư�c tìm th�y trong chu�i bên xa c�a hem
Cơ ch�t camphor �ư�c ��nh v� � v� trí 4� trên m�t ph�ng hem và n�m trong 1 h�c �ư�c bao quanh b�i các g�c axit amin k� nư�c:
Trang 34Phe87, Tyr96, Leu244, Val247 và Val295 Phe87 n�m trong vòng tròn liên k�t v�i helix và B và Tyr96 là ��u C t�n c�a m�t helix B’ ng�n Nh�ng g�c axit amin k� nư�c Leu244 và Val247 tham gia vào helix I và Val295 n�m trong phi�n 3 Nguyên t� cacbon c�acamphor ti�p xúc v�i chu�i bên c�a nh�ng g�c này (Tyr96, Leu244, Val 247 và Val295) trong kho�ng 4� ho�c ít hơn.Carbonyl oxygen c�a camphor tương tác v�i Leu244, Phe87 và Tyr96 Trong s� nh�ng ti�p xúc này gi�a carbonyl camphor và chu�i bên axit amin, liên k�t hydro c�a camphor carbonyl v�i nhóm
OH c�a Tyr96 là quan tr�ng cho s� ki�m soát tính ��c hi�u l�p th�
và ��c hi�u vùng c�a ph�n �ng thu� phân camphor, hơn n�a, nó chi ph�i n�ng lư�ng t� do trong s� liên k�t cơ ch�t Liên k�t v�icamphor h�u h�t �ư�c che khu�t hoàn toàn phía sau phân t� mà không có s� t�o thành m�t khe m� � b� m�t phân t� �i�u này làm n�y sinh th�c m�c là phân t� camphor làm th� nào vào �ư�c v� trí liên k�t b� che ph�? M�t khe m� nh� � phía trên v� trí liên k�tcamphor dư�ng như là thích h�p cho kênh d�n �� cơ ch�t �i vào v�trí ho�t ��ng c�a enzyme Khe m� này g�n v�i vòng xo�n liên k�tv�i helix F và G, s� quay l�i liên k�t strand c�a 5 �ã �ư�c t�ptrung � Ile395 và ��u N- t�n c�a helix B’ M�c dù kích thư�c c�akhe m� không �� r�ng �� ch�a phân t� camphor, nhưng m�t s�kh�i ��ng nhi�t c�a nh�ng vùng g�n v�i khe m� �ư�c phát hi�n là
t�ng lên trong Cyt-P450cam không có camphor Như v�y là xu�t
hi�n s� t�ng �� linh ho�t m�m d�o trong vùng này d�n t�i m� khe
và cho phép cơ ch�t �i vào v� trí ho�t ��ng
V trí liên k t ph i t
Như �ã nêu � ph�n trên, cơ ch�t camphor liên k�t vào v� trí �kho�ng 4� phía trên b�n hem trong chu�i bên xa Vì s� thu� phân c�a camphor ch� x�y ra � v� trí C5 c�a phân t� camphor �� t�othành 5-exo-hydro camphor là s�n ph�m ph�n �ng, nói lên r�ng C5 ti�p xúc v�i 1 nguyên t� oxy c�a phân t� oxygen liên k�t v�i s�them Các phép �o c�ng hư�ng t� Raman và quang ph� h�ng ngo�ic�a h�n h�p Cyt-P450-CO �ã �ng h� cho g�i ý trên K�t qu� thí nghi�m thu �ư�c b�ng cách phân tích �nh hư�ng c�a s� liên k�tcamphor lên �� c�ng c�a m�i liên k�t C-O và Fe-CO, �ã cung c�pm�t quan �i�m ch�c ch�n r�ng phân t� CO �ã liên k�t b� c�n tr� v�m�t không gian b�i camphor, do v�y làm nghiêng tr�c liên k�t Fe-
CO phía bên trên b�n hem �i�u này có ngh�a là m�t ph�n c�a
Trang 35camphor liên k�t ti�p xúc v�i CO �ã liên k�t Nh�ng phân tích c�utrúc tinh th� tia X g�i ý s� có m�t c�a m�t vùng liên k�t oxygen trong helix I Phân �o�n helix dài này b�t ��u � g�c 234, bao g�m
34 g�c axit amin, các g�c �ó � trong hình xo�n �c bình thư�ng, tr�các g�c t� 248 ��n 252 (Gly248-Gly249-Leu250-Asp251-Thr252) Helix I l�ch m�t cách rõ r�t kh�i ki�u liên k�t hydrogen c�a -helix bình thư�ng Sai l�ch này là do s� t�o thành m�t liên k�t hydro không bình thư�ng gi�a Gly248 và Thr252 gây ra, trong �ó nhóm
OH chu�i bên c�a Thr252 liên k�t hydrogen v�i nguyên t� carbonyl oxygen peptid c�a Gly248 Trong -helix bình thư�ng, nguyên t�carbonyl oxygen liên k�t hydro v�i nhóm NH peptid c�a Thr252 V�i liên k�t hydrogen duy nh�t t�o thành, nh�ng nguyên t�cacbonyl oxygen c�a Gly249 cho t�i Asp251 liên k�t hydrogen v�ichu�i bên c�a Lys178 và Asn225 Do có ki�u liên k�t hydrogen b�tthư�ng, helix L xo�n l�i trong vùng t� g�c 248 ��n 252 S� bi�nd�ng c�c b� c�a helix L d�n t�i 1 b� m�t m� gi�a Gly249 và Val253 và �ư�c ti�p t�c làm b�n b�i các c�p ion gi�a Arg186 và Lys178, Asp251 Cái túi �ư�c t�o thành do s� bi�n d�ng này �ư�ccho là túi liên k�t v�i oxygen c�a enzym
Th�c v�y, phân tích c�u trúc tinh th� c�a h�p ch�t v�i CO c�a
Cyt-P450cam ch� ra r�ng phân t� CO t�o thành m�t cái � trong túi
liên k�t oxygen M�t �i�u thú v� là phân t� CO �ư�c liên k�t vào �ã
ép phân t� camphor l�ch kho�ng 0,8� ��i v�i Phe87 V�i s� d�ch chuy�n Phe87 trong túi g�n cơ ch�t do �nh hư�ng c�a s� g�n k�tv�i CO, làm bi�n ��i c�u trúc không gian c�a hem S� d�ch chuy�nkho�ng 0,02� c�a ion s�t t� lõi c�a porphyrin vào trong ph�c h�pCO-Fe-2+ (ferrous) và kho�ng cách này là ng�n khi so sánh v�i giá tr� là 0,43� trong tr�ng thái Fe3+ (ferric) c�a Cyt-P450 Như v�y, do s� kh� và liên k�t CO, s�t hem chuy�n d�ch vào b�n hem pyrol nitrogen v�i kho�ng 0,41� chi�u dài c�a liên k�t Fe-S (kho�ng cách gi�a s�t hem và nguyên t� S b� g�n) c�ng b� kéo c�ng t� 2.20
��n 2,41� do s� t�o thành h�p ch�t v�i CO Thr252 ch�u trách nhi�m cho s� t�o thành túi liên k�t oxygen �ư�c b�o t�n cao trong h�u h�t các Cyt-P450 c�a ��ng v�t có vú B�i v�y, s� bi�n d�ng do xo�n c�c b� c�a helix xa �ư�c coi là m�t ki�u c�u trúc thông thư�ng trong h�u h�t các lo�i Cyt-P450 khi t�o thành túi liên k�toxygen
Trang 36Nh ng i m "c bi$t c u trúc c'a Cyt-P450cam không g0n camphor
�� làm rõ s� khác nhau trong c�u trúc tinh th� gi�a nh�ng d�ng liên k�t camphor và không liên k�t camphor, m�t b�n �� m�t ��
�i�n t� chênh l�ch �ã �ư�c tính toán và phân tích �i�m ��c bi�tn�i lên cao nh�t trong b�n �� này là m�t lobe hình c�u c�a m�t ��chênh l�ch dương � phía trên v� trí liên k�t tr�c Phân tích chi ti�ts� khác nhau v� m�t �� cho th�y v� trí liên k�t tr�c và túi camphor b� chi�m b�i nh�ng phân t� nư�c S� khác nhau �áng k� khác trong tr�ng thái liên k�t �ư�c quan sát � chu�i bên c�a Phe87 và Tyr96, nơi ti�p xúc tr�c ti�p v�i phân t� camphor S� bi�n ��i tr�ng thái spin c�a s�t hem t� tr�ng thái spin th�p lên tr�ng thái spin cao do liên k�t v�i camphor kèm theo v�i vi�c m�t m�t phân t� nư�c �ãg�n k�t, nhưng không có s� d�ch chuy�n �áng k� c�a nguyên t� s�tkh�i nhân lõi porphyrin
2.2 Nh?ng g@c axit amin * Bc bDo toàn và vai trò chGc nHng c3a chúng
Nh ng vùng ch4a Cystein 7c b8o t9n
Cyt-P450cam là phân t� ��u tiên �ư�c phân tích toàn b� trình t�axit amin Sau �ó, Cyt-P450 tách t� gan chu�t, là Cyt-P450 ��u tiên c�a ��ng v�t có vú �ư�c phân tích trình t� axit amin b�ng cách suy di�n t� trình t� nucleotide cDNA (Fujii-Kuriyama và cs), t� �ó c�utrúc b�c 1 c�a hơn 50 lo�i khác nhau c�a eukaryotic CYP450 �ã
�ư�c công b� Trình t� s�p x�p trong c�u trúc b�c m�t �ã bi�tch�ng t� r�ng có 3 vùng ch�a Cys �ư�c b�o t�n cao trong các Cytochrome tách t� microsome ��ng v�t có vú, nh�ng vùng b�ot�n này ch�a Cys152, Cys180 và Cys436 theo s� �ánh s� c�aCYP450 Trình t� này �ã �ư�c s� d�ng �� d� �oán s� ��nh v� c�acác g�c Cystein như là proximal thiolate ligand ��i v�i hem G�cCystein th� 1 và th� 3 n�m trong vùng b�o t�n cao nh�t trong s�nh�ng c�u trúc �ã bi�t c�a các Cyt-P450, trong khi s� tương ��ng v� c�u trúc trong vùng c�a Cys180 � m�c �� kém hơn Vùng
Cys180 không �ư�c b�o t�n trong Cyt- P450cam ho�c Cyt-P450scc
ti th�, không th�y có vùng Cys152 �ư�c b�o t�n � Cyt-P450scc Ch� có vùng Cys 436 là �ư�c b�o t�n cao trong t�t c� các c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450 th� eukaryotic và proeukaryotic �ã �ư�cbi�t cho ��n nay Phát hi�n này g�i ý r�ng Cys436 trong Cyt-P450b
Trang 37và g�c Cys tương �ng trong nh�ng Cyt-P450 khác có th� là ligand thiolat hoá v�i hem Nghiên c�u tinh th� tia X trên Cyt-P450cam �ãch�c ch�n r�ng Cys357 (tương �ương v�i Cys436 � Cyt-P450b) trong vòng xo�n Cys-ligand là ligand th� 5 g�n � trung tâm
Vùng ch4a threonin trong helix I
Trình t� tương ��ng cao �ư�c tìm th�y trong vùng helix I Trình t� s�p x�p các g�c 243 và 259 �ã �ư�c ch� ra trong hình 2.2 Trình t� này �ư�c ��nh v� trong vùng lân c�n c�a hem và t�o ra túi liên k�t oxygen như �ã mô t� � trên Các g�c 248-249 thư�ng là Gly-Gly ho�c Ala-Gly Nguyên nhân vì sao các g�c có chu�i bên nh�
�ư�c b�o toàn cao trong v� trí này có th� là vì các g�c này ti�p xúc ch�t ch� v�i hem �i�u quan tr�ng nh�t là Thr252, g�c t�o thành liên k�t hydro v�i Gly248 là không bi�n ��i trong s� 53 trình t�, tr�m�t ngo�i l�
Như �ã mô t� trư�c �ây, liên k�t hydrogen gi�a Gly248-Thr252
�ã phá v� ki�u liên k�t hydro � helix bình thư�ng và t�o ra s� bi�nd�ng c�c b� trong helix I ��ng th�i t�o ra túi oxygen Như �ã ch� ra
� hình 2.2, s� ngo�i l� là Cyt-P450 ch�a proline trong v� trí tương
�ng v�i Thr252 M�t Cyt-P450PCN2 có 89% các g�c axit amin tương ��ng v�i Cyt-P450PCN1, nhưng g�c � v� trí 310 c�a Cyt-P450- PCN2 là Thr Tuy v�y, m�t s� bi�n d�ng trình t� tương t� trong helix
�ã �ư�c Poulos và cs phát hi�n � Cyt-P450-PCN1, vì g�c Pro c�ng
có th� ho�t ��ng như là 1 liên k�t hydro C�u trúc -helix trong vùng c�ng �ư�c d� �oán là � trong 52 lo�i Cyt-P450 g�n màng khác Như v�y, s� bi�n d�ng helix c�c b� c�a helix xa là m�t lo�ic�u trúc chung cho t�t c� các Cyt-P450 trong khi t�o thành v� trí liên k�t oxygen Vai trò c�u trúc cho xúc tác c�a nh�ng g�c axit amin �ư�c b�o toàn này s� �ư�c mô t� � ph�n sau
Nghiên c4u gây <t bi n tr=c ti p các v trí c'a Cyt-P450
Hi�n nay, nh� các k� thu�t sinh h�c phân t�, ngư�i ta có th�thay th� các g�c axit amin này b�ng nh�ng axit amin khác Gây ��tbi�n tr�c ti�p oligonucleotid c�a Cyt-P450 �ã �ư�c ti�n hành � Cyt-P450 tách t� gan chu�t do Shimuru và cs và � Cyt-P450 tách t�gan th� do nhóm c�a Sliga ti�n hành Shimuru và cs �ã t�o ra m�ts� enzym ��t bi�n v�i v� trí His và Tyr thay cho Cys465 không bi�n
��i và th�y r�ng CO-complex c�a enzym ��t bi�n không xu�t hi�n
� sóng h�p th� 450nm là v� trí ��c trưng cho Cyt-P450, s� li�u ch�
Trang 38ra m�t cách tr�c ti�p r�ng g�c Cys chi�m v� trí liên k�t tr�c � P450 � ��ng v�t có vú Dư�i �ây là m�t s� ví d� v� nh�ng nghiên c�u gây ��t bi�n gen tr�c ti�p ��i v�i nh�ng axit amin có vai trò
Cyt-ch�c n�ng trên P450cam.
Gây <t bi n tr=c ti p v trí trong túi liên k t c ch t
C�u trúc tinh th� c�a Cyt- P450cam xác ��nh s� t�n t�i m�t s�
axit amin ��c bi�t (Tyr 96, Phe87, Val247 và Val295), chúng có th� �nh hư�ng ��n n�ng lư�ng liên k�t và s� ��nh hư�ng c�a phân t� camphor Nh�ng tác ��ng qua l�i gi�a protein-cơ ch�t này ph�cv� cho vi�c ��nh hư�ng v� trí C5c�a camphor ngay phía trên c�a s�them S� th�y phân ��c hi�u vùng và ��c hi�u không gian này t�o ra 5-exo-hydroxycamphor Atkins và Sligar gây ��t bi�n 3 g�c: Tyr96, Val295 và Val247 và th�y có s� bi�n ��i trong tính ��c hi�uvùng c�a ph�n �ng thu� phân gây ra do nh�ng enzym ��t bi�n này
��t bi�n Tyr 96 thành Phe gây ra s� r�i lo�n trong liên k�t hydro c�a Tyr 96 v�i cacbonylcamphor, d�n t�i t�ng �áng k� s� t�o thành
3 và 6-hydroxycamphor Nh�ng k�t qu� này g�i ý v� s� tham gia tr�c ti�p c�a liên k�t hydro vào s� duy trì tính ch�n l�c Sau �ó h�c�ng ki�m tra tính ��c hi�u vùng c�a Val 295 Nh�ng g�c này ti�pxúc v�i các nhóm 10-carbon-8,9-dimethyl c�a camphor Trong thí nghi�m này, ngư�i ta �ã s� d�ng norcamphor và 1-methylcamphor
và camphor như là cơ ch�t Camphor có 2 nhóm methyl � C7 và m�t nhóm methyl � v� trí C1 Norcamphor thi�u t�t c� các nhóm methyl và 1 methyl camphor thi�u m�t các nhóm 8-9 dimethyl Vi�c �ưa m�t nhóm methyl vào Val 295 (Val295 thành Ile) không gây �nh hư�ng gì ��n tính ��c hi�u vùng c�a s� thu� phân camphor, nhưng nh�ng bi�n ��i tính ��c hi�u vùng l�i ph� thu�cvào c�u trúc c�a cơ ch�t Tóm l�i s� thu� phân c�a norcamphor x�y
ra � v� trí C5 và C6 v�i �ương lư�ng g�n ngang nhau, trong khi �ó,v�i 1-methyl-norcamphor, s�n ph�m thu� phân chính l�i là d�n xu�t5-hydroxyl Bi�n ��i trong s� ��c hi�u vùng g�i ý r�ng nhóm methyl �ư�c thêm vào � v� trí 295 h� tr� cho s� ��nh hư�ng v� trí C5 vào s�t hem M�t khác, ��t bi�n Val 247 thành Ala v�i s� làm m�t �i m�t nhóm methyl l�i t�o ra m�t s�n ph�m hơi khác v�i s�nph�m thu �ư�c t� enzym t� nhiên, s�n ph�m m�i �ư�c quan sát th�y có t�ng tính ��c hi�u ��i v�i v� trí C3 trong c� norcamphor và 1-methylnorcamphor Tính ��c hi�u vùng c�a s� thu� phân nh�ng ch�t tương t� cơ ch�t này b� �nh hư�ng nhi�u hơn cơ ch�t camphor
Trang 39t� nhiên, bi�u hi�n vai trò quan tr�ng c�a hi�u �ng k� nư�c c�a các g�c trong s� ��nh hư�ng c�a cơ ch�t
@<t bi n thuAn ngh ch i vBi tính "c hi$u c ch t
M�c dù các microsomal Cyt-P450 có chi�u hư�ng có tính ��chi�u cơ ch�t r�ng do yêu c�u �òi h�i b�i ch�c n�ng c�a chúng �� chuy�n hoá nh�ng thu�c và các xenobiotic khác nhau, tính ��c hi�uc�a nh�ng enzym riêng bi�t v�n có gì �ó khác nhau Furuya và cs
có ý ��nh c�i t�o tính ��c hi�u cơ ch�t c�a microsomal Cyt-P450 thành ��c hi�u cơ ch�t c�a Cyt-P450c ho�c Cyt- P450 LM4, b�ng cách thay th� m�t s� axit amin trong helix I (helix xa) S� khác nhau trong trình t� axit amin so v�i Cyt-P450d là có 5 g�c � Cyt-P450c trong khi � Cyt-P450LM4 l�i có 4 g�c axit amin Cyt-P450c th� hi�n ho�t tính hơi cao ��i v�i benzphetamine và ��i v�i ho�ttính thu� phân 7-ethoxy coumarin m�nh hơn là Cyt-P450d M�tkhác, ho�t tính c�a Cyt-P450LM4 ��i v�i B2 và 7-ethoxy coumarin
là có th� so sánh b�ng ho�c kém hơn ho�t tính c�a Cyt-P450d, m�tcách tương �ng Khi �o ho�t tính c�a c� 2 th� ��t bi�n ��i v�i B2
và 7-ethoxycoumarin, không th�y có t�ng gi�m �áng k� do ��t bi�ngây ra �i�u này g�i ý r�ng các g�c trong vùng helix xa không ph�i
là duy nh�t ch� huy s� ��c hi�u cơ ch�t
Lindenberg và Negishi �ã thu �ư�c s� bi�n ��i trong ��c hi�u cơch�t khi gây ��t bi�n 1 g�c axit amin c�a Cyt- P450 15 và Cyt-P450coh Cyt-P45015 xúc tác riêng cho s� thu� phân 15 c�a 4-
3 keton steroid như là testosterone còn Cyt-P450coh thu� phân hydroxy c�a coumarin M�c dù ho�t tính xúc tác khác nhau nhưng các enzyme này ch� khác nhau có 11 trong t�ng s� 494 g�c axit amin Lindenberg và Negishi bi�n ��i m�t trong 11 g�c chìa khoá c�a Cyt-P450coh và Cyt-P45015� �� xác ��nh �âu là g�c ch�utrách nhi�m cho ��c hi�u cơ ch�t S� thay ��i quan tr�ng nh�t trong ho�t tính �ã �ư�c th�y khi ��t bi�n v� trí 209, nơi mà Cyt-P450coh
7-có g�c Phe còn Cyt-P45015� 7-có g�c Leu ��t bi�n Cyt-P450coh v�i Phe 209-Leu bi�u hi�n m�t s� t�ng �áng k� ho�t tính thu� phân
15 -testosterone và gi�m t�i 50% ho�t tính thu� phân coumarin, là ho�t tính nguyên thu� c�a nó ��t bi�n ngư�c l�i, trong �ó Leu209 trong Cyt-P45015� �ư�c thay th� b�ng Phe, enzyme không có kh�n�ng thu� phân coumarin, có s� gi�m �áng k� trong ho�t tính thu�phân steroid nguyên thu�
Trang 40Gây <t bi n trong liên k t oxygen
Thr 252 trong helix I c�a Cyt-P450cam �ư�c b�o toàn cao trong
các Cyt-P450 ��ng v�t có vú (ví d�: Thr 319 � Cyt-P450d gan chu�t, Thr 301 trong c� Cyt-P450coh và Cyt-P450 16 � chu�t) và là m�taxit amin ch�u trách nhi�m cho s� t�o thành c�a túi liên k�t oxygen Imai và Nakamura công b� l�n ��u tiên v� vi�c gây ��t bi�n v� trí tr�c ti�p g�c axit amin chìa khoá (Thr 301) trong Cyt- P450 -1 và Cyt-P45016 gan th� C�u trúc c�a c� 2 enzym chia s� 81% c�a toàn b� các g�c và �ư�c xác ��nh trong vùng c�a g�c 252 và 319 M�c dù trình t� tương ��ng cao, tính ��c hi�u cơ ch�t c�a các Cytochrom b�h�n ch�; Cyt-P450 -1 bi�u hi�n m�t ho�t tính thu� phân -1 cao ��iv�i laurate và caprate, trong khi Cyt-P45016 xúc tác s� thu� phân
16 c�a testosterone và progesterone Các tác gi� trên �ã phân tích t�m quan tr�ng c�a Thr 301 ��i v�i s� thu� phân cơ ch�t, vì ��t bi�nThr 301 His c�a c� 2 enzym gây ra m�t s� m�t hoàn toàn ho�t tính
�ây là phát hi�n có tính th�c nghi�m ��u tiên th� hi�n r�ng Thr �ư�cb�o toàn có t�m quan tr�ng ch�c n�ng trong s� thu� phân do Cyt-P450 xúc tác Ho�t tính b� m�t c�a c� 2 enzym �ã �ư�c l�y l�i m�tph�n ho�c t�ng cao hơn ho�t tính ban ��u c�a enzym t� nhiên khi thay th� b�ng Ser ho�c Asp Nh�ng ��t bi�n Val bi�u hi�n m�t ho�ttính th�p Nh�ng k�t qu� này xác ��nh r�ng ho�c nhóm OH ho�cnhóm NH2 � v� trí �ó là quan tr�ng ��i v�i ho�t tính thu� phân c�aCyt-P450 S� thay th� Thr 252 b�i g�c axit amin khác gây ra 1 s�thay ��i tuy�t v�i trong m�c �� phân nhánh c�a ho�t tính oxygenase
và oxydase Cyt- P450cam Nh�ng ��t bi�n Thr thành Ala, Val, Cys
và Gly bi�u hi�n s� thay ��i không th� phát hi�n �ư�c trong quang ph� c�a các d�ng ferric, ferrous, ferrous-CO và d�ng oxy hoá và s�tiêu th� oxygen � m�t t�c �� có th� so sánh v�i t�c �� c�a enzym t�nhiên Tuy nhiên, s� t�o ra s�n ph�m trên s� tiêu th� oxygen gi�mm�t cách �áng k� trong các enzyme ��t bi�n trong khi s�n ph�m t�o
ra là 100% trong enzym t� nhiên (b�ng 2.1) Trong nh�ng ��t bi�nnày, v�i s� lo�i tr� ��t bi�n Val 252, quá 85% oxygen b� tiêu th�
�ư�c tìm th�y là �ư�c ph�c h�i khi H2O2t�o �ư�c do s� không c�p
�ôi do h�p nh�t vào cơ ch�t, ch� ra r�ng Cyt-P450cam �ã chuy�n
thành m�t oxydase do ��t bi�n