Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể thông lá dẹt (pinus krempfii lecomte) ở tây nguyên loài đặc hữu của việt nam

Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể Thông lá dẹt tự nhiên Pinus krempfii Lecomte ở Tây Nguyên - loài đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ LIỄU

“NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN

THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY

NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2014

.TSGS TS Lê Xuân

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ LIỄU

Đề tài :

“NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN

THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY

NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

MỞ ĐẦU

Tây Nguyên là một trong những vùng giàu loài lá kim nhất Việt Nam Hầu hết những loài lá kim ở Tây Nguyên đều là những loài có giá trị khoa học và kinh tế cao Nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng, trong đó có loài

Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) hay còn gọi là Thông hai lá dẹt, Thông Sri,

Thông Sré, là loài đặc hữu hẹp của Việt Nam [4] Đây là nguồn gen quý và độc đáo của với lá hình dải mác không hình kim như các loài Thông khác [32], [33] Gỗ Thông lá dẹt mềm, ít nhựa, màu từ trắng đến vàng nhạt, nhẹ, có nhiều đặc tính kỹ thuật tốt Hiện nay các rừng Thông lá dẹt đang bị đe dọa nghiêm trọng do tình trạng phá rừng làm nương rẫy, nhiều cây bị mất môi trường sinh sống tối ưu nên chết rụi, một số cây quá già cũng tự đổ gãy dẫn đến suy giảm số lượng loài nghiêm trọng Tái sinh tự nhiên hầu như chỉ hạn chế ở giai đoạn cây mầm, lại gặp chủ yếu ở nơi có khoảng trống, ven đường Mặt khác lại thiếu vắng các cây tái sinh ở tuổi trung gian, nên khó đủ sức thay thế những cánh rừng Thông lá dẹt cổ thụ đang tồn tại [5], [6] Theo Quỹ Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2013 Thông lá dẹt được xếp vào bậc sắp bị tuyệt chủng VU A2c, B1ab (iii) [65] Vì vậy, việc bảo tồn hiệu quả nguồn gen Thông lá dẹt là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, còn các nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen vẫn rất hạn chế và mới chỉ tập trung cho một số loài [7], [8], [46] Đặc biệt các dẫn liệu về đa dạng nguồn gen di truyền, các trình tự nucleotide đặc trưng cho loài Thông lá dẹt hầu như chưa được nghiên cứu

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ thị phân tử đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở cho nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tượng sinh vật nói chung và ở các loài cây lá kim nói riêng [7], [10], [29], [34], [56], [68] Trong các loại chỉ thị thì chỉ thị ISSR (Internal Sequence Simple Repeat) và SSR (Sequence Simple Repeat) đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở

cả mức độ quần thể và loài Hơn nữa, phân tích phân tử và nhận dạng vùng gen đặc

trưng cũng được sử dụng rộng rãi trên thế giới và cả ở Việt Nam để đánh giá các mô hình đa dạng di truyền ở thực vật và kỹ thuật này có lợi thế tiềm năng cho việc điều tra thực vật quý hiếm Vì thế đến nay đã có một số công trình nghiên cứu công bố

về hiệu quả cao của phân tích phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định trình tự nucletide vùng gen đặc trưng cho một số loài lá kim của Việt Nam [2], [3], [7] Điển hình là công bố của Vũ Đình Duy và cộng sự (2010) về việc sử dụng chỉ thị ISSR và SSR đánh giá đa dạng di truyền của 4 loài lá kim là Pơ mu

(Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii), Hoàng đàn hữu liên (Cupressus tonkinesis) Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) và giải mã

trình tự vùng gen 18S đã chỉ ra hai loài Pơ mu và Sa mộc dầu có mức độ suy giảm cao hơn loài Thủy tùng và Hoàng đàn hữu liên Kết quả giải mã trình tự vùng gen

18S còn cho phép giải quyết vấn đề tồn tại về taxon của Sa mộc dầu (Cunninghamia

lanceolata var konishii) Tương tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009), Vũ Thi Thu

Hiền và cộng sự (2009) cũng đã sử dụng chỉ thị thị RAPD, ISSR và cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài Pơ mu, Bách xanh phục vụ cho cho công tác bảo tồn Hiện nay trong ngân hàng Genbank (2014) đã lưu giữ trên 884.000 trình tự nucleotide cho các loài lá kim (conifers), tập trung vào hai vùng gen chính là nhân

(ITS) và vùng gen lục lạp (cpDNA), làm cơ sở cho xác định trình tự nucleotide đặc

trưng cho loài Thông lá dẹt

Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể Thông lá dẹt tự nhiên (Pinus

krempfii Lecomte) ở Tây Nguyên - loài đặc hữu của Việt Nam” với các mục tiêu

và nội dung nghiên cứu sau:

- Xác định mức độ đa dạng nguồn gen di truyền cho 4 quần thể Thông lá dẹt

tự nhiên thu tại các tỉnh ở Tây Nguyên bằng chỉ thị SSR và ISSR

- Xác định trình tự nucleotide đặc trưng tại 3 vùng gen (2 vùng gen lục lạp và

1 vùng gen nhân) cho loài Thông lá dẹt ở Tây Nguyên

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quát về loài Thông lá dẹt

1.1.1 Vị trí phân loại

Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) còn gọi là Thông hai lá dẹt hay

Thông Sri, Thông Sré, là loài đặc hữu của Việt Nam, phân bố ở các tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng, Đắc Lắc và Ninh Thuận Theo phân loại khoa học, Thông lá dẹt thuộc:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (phylum): Pinophyta

Lớp (class): Pinopsida

Bộ (order): Pinales

Họ (familia): Pinaceae

Chi (genus): Pinus

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Thông lá dẹt

Theo đánh giá của các nhà khoa học trong và ngoài nước, Thông lá dẹt là loài cổ sinh vật hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay, với chiều cao lên đến 30 m, đường kính có thể đạt 1,5 - 1,6 m, đôi khi tới 2 m [47] Tán của cây thường khá rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ quạt Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như không có cành nhánh, tròn đều và mọc thẳng lên (Hình 1.1) Nón xuất hiện vào tháng 4 - 5 và tồn tại trên cây trong một thời gian dài Hạt chín vào tháng 7- 10, màu nâu nhạt và

có cánh trắng Khi chín, hạt có thể phát tán trong một phạm vi tương đối rộng Cây mầm thường có khoảng 10 - 13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn cong về một hướng như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2 - 3 cm, sau đến là các lá nhỏ mọc quanh thân, dài 1,5

- 2,5 cm Khi cây còn non, lá dài và rộng bản (dài 10 - 15 cm) xếp như hai lưỡi kéo

ở phần đầu cành Khi cây trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4 - 5 cm), màu sẫm, mọc tập trung ở đầu cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn Đặc điểm đặc trưng nhất là lá hình dải mác nhọn đầu, dẹt [32], [33]

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thông lá dẹt ở Lâm Đồng (A: cây trưởng thành; B: nón

quả; C: cây tái sinh) (ảnh Nguyễn Tiến Hiệp)

Gỗ Thông lá dẹt mềm, ít nhựa, màu từ trắng đến vàng nhạt, nhẹ, có nhiều đặc tính kỹ thuật tốt có thể sử dụng trong công nghiệp và xây dựng Theo IUCN (2013), Thông lá dẹt được đánh giá mức sắp bị tuyệt chủng (VU A2c B1ab (iii) Hiện nay, các rừng Thông lá dẹt đang bị đe dọa nghiêm trọng do tình trạng phá rừng làm nương rẫy, nhiều cây bị mất môi trường sinh sống tối ưu nên chết rụi, một số cây quá già cũng tự đổ gãy Tái sinh tự nhiên hầu như chỉ hạn chế ở giai đoạn cây mầm, lại gặp chủ yếu ở nơi có khoảng trống, ven đường Mặt khác lại thiếu vắng các cây tái sinh ở tuổi trung gian, nên khó đủ sức thay thế những cánh rừng Thông lá dẹt cổ thụ đang tồn tại [5], [6]

1.1.3 Tình hình phân bố Thông lá dẹt ở Tây Nguyên

Phân bố trong nước: Loài đặc hữu hẹp của tiểu vùng địa lý thực vật Nam Trường Sơn, phân bố chủ yếu tại tỉnh Lâm Đồng và một số vùng giáp ranh thuộc các tỉnh lân cận như Đắc Lắc, Khánh Hòa và Ninh Thuận

B

Phân bố thế giới: không gặp bất kỳ nơi nào trên thế giới ngoài Việt Nam Thông lá dẹt thường mọc ở độ cao từ 1000 đến 2000 m so với mực nước biển, trong những khu rừng khép tán thường xanh, xen với những cây họ Đậu và họ Long não Loài thường mọc trên đỉnh hoặc sườn núi nơi có lớp đất ẩm và tầng mùn dày [4], [36] Căn cứ vào các dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn rừng nguyên sinh ở hầu khắp nước ta và đối chiếu với tiêu chuẩn của các thứ hạng trong Danh lục đỏ của IUCN, thoạt đầu thấy vài tiêu chuẩn loài chưa đến mức bị đe dọa tuyệt chủng (sự suy giảm quần thể trong quá khứ, hiện tại nhiều nhất

các tiểu quần thể đều nằm trong các Khu bảo tồn thiên nhiên, Khu du lịch sinh thái hay ở các vùng núi xa xôi chưa bị lâm tặc vào chặt trộm) Tuy nhiên trong khoảng 5 năm gần đây ở hai tiểu quần thể quan trọng nhất đều thuộc VQG Bi Đúp - Núi Bà gồm các cây gỗ to lớn ở dọc đường giao thông mới xây dựng từ Khánh Hòa đi lên

Đà Lạt qua VQG Bi Đúp - Núi Bà và đường giao thông đang xây dựng ở Đông Trường Sơn (từ Đà Lạt ra Quảng Nam) xuất hiện nguy cơ bị lâm tặc chặt hạ và vận

xuất nên ở thời điểm hiện tại việc xếp loài vào thứ hạng sẽ nguy cấp VU A2a,c,d,

A3a,c,d, B2a,c, C1 là hợp lý nhất [4]

1.2 Đa dạng di truyền quần thể thực vật

1.2.1 Khái niệm về quần thể thực vật

Quần thể được định nghĩa là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong một nơi sống cụ thể, chúng độc lập với các quần thể khác về quan hệ sinh sản [1] Di truyền quần thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả năng sống sót, phương phức sinh sản, trao đổi và đột biến di truyền Kích thước quần thể là kết quả của sự tương tác phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc tính quần thể của loài Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương thức sinh sản, di truyền và tiến hoá Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế

hệ tiếp theo) trong quần thể và loài Thụ phấn chéo có thể sản sinh những cá thể lai

đa dạng Cấu trúc di truyền của những cá thể này đóng góp vào tính đa dạng trong

quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao của quần thể trong nhiều môi trường sống

Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc quần thể hình thành những quần thể nhỏ, cô lập và dẫn đến làm suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống Trong quần thể, thế hệ sau được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác biệt về di truyền giữa các quần thể là lớn và làm tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ

1.2.2 Tính đa dạng di truyền quần thể thực vật

Đa dạng sinh học thường đề cập đến mức độ khác nhau của các dạng sống bao gồm các cá thể động vật, thực vật, vi sinh vật và được biểu hiện từ mức độ phân tử đến

hệ sinh thái Công ước quốc tế về Đa dạng sinh học (1994) đã xác định đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp: (i) đa dạng trong loài (đa dạng di truyền hay đa dạng nguồn gen), (ii) đa dạng giữa các loài (đa dạng về thành phần loài hay đa dạng loài) và (iii) đa dạng

hệ sinh thái Đa dạng sinh học là kết quả của quá trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao gồm cả 3 mức độ hệ sinh thái, loài và di truyền Lý thuyết tiến hoá trên

cơ sở chọn lọc tự nhiên của Darwin đã dự đoán rằng đa dạng di truyền là thành phần chính của đa dạng sinh học Đa dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng gen (đa dạng DNA), là tập hợp những biến đổi của các gen và các kiểu gen trong nội bộ của một loài Đây là sự đa dạng quan trọng nhất, quyết định một loài có thể tồn tại lâu dài trong

tự nhiên hay không Tính đa dạng này, vì thế đã và đang là nguồn cung cấp vật liệu cho các chương trình chọn tạo và cải tiến giống [1] Đa dạng di truyền cho phép các cá thể và loài xử lý trước những biến đổi bất lợi của môi trường sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trường sống của chúng Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như là mức độ đa hình của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc được phản ánh bởi số alen của quần thể tại một vị trí địa lý trong một khoảng thời gian cụ thể hoặc số alen của một loài trong phạm vi phân bố địa lý và lịch sử tồn tại của nó

1.2.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật

a) Kỹ thuật isozyme

Kỹ thuật isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme Phương pháp này được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, sau đó Harris hoàn thiện vào năm

1966 và bắt đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay Mặc dù hiện nay

có nhiều kỹ thuật phân tử phát triển nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường [9]

b) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD được hai nhóm nghiên cứu của Welsh và Clelland (1991) và Williams và cộng sự (1990) đồng thời xây dựng [70], [71] Kỹ thuật này dựa trên ứng dụng kỹ thuật PCR sử dụng các mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên gồm khoảng 10 nucleotide Số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome Sự đa hình của kỹ thuật RAPD nói chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi làm ngăn trở đến việc bắt cặp của mồi Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD – PCR sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn DNA được nhân bản Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình chiều dài sản phẩm PCR

Kỹ thuật RAPD thao tác nhanh, đơn giản, giá thành thấp, dễ thực hiện do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, sử dụng lượng nhỏ DNA khuôn, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao Tuy nhiên chỉ thị RAPD là chỉ thị trội do đó những kiểu gen lặn quy định tính trạng nào

đó sẽ khó phát hiện sự đa hình khi điện di sản phẩm [13], [72] Kỹ thuật RAPD có

độ chính xác không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) [9], [10]

c) Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Đây là kỹ thuật dựa trên tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, do Botstein và cộng sự (1980) xây dựng vào năm 1980 để lập bản đồ di truyền ở người [15] Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên

các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ Số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết của enzyme giới hạn trong hệ gen, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng một số loại enzyme giới hạn Tính đa hình độ dài được phát hiện nhờ đánh dấu phóng xạ các mẫu dò DNA bổ sung tạo ra từ cùng một locus Chỉ thị RFLP thường được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: nghiên cứu sự đa dạng của bộ genome, xây dựng bản đồ di truyền, xác định mức độ liên kết với các tính trạng nông sinh học, xác định con lai F1 trong lai hữu tính và lai tế bào trần, cũng như khả năng có chứa gen bất dục tế bào chất, bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ và ánh sáng, tìm dãy alen tự bất hợp, gen phục hồi và gen duy trì Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm

là quy trình phức tạp, cồng kềnh, tốn kém và sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho người thao tác thí nghiệm

d) Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi các enzyme giới hạn Nguyên tắc của kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật RAPD nhưng mồi được sử dụng ở đây bao gồm một phần cố định dài hơn (5bp) chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi ngắn (2-4bp) Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm được nhân lên, phần thay đổi ngắn sẽ tạo ra nhiều locus, có thể lên đến hơn 100 locus được nhân lên với mồi AFLP đơn AFLP phát hiện sự khác nhau của các đoạn DNA bởi sự nhân có chọn lọc các trình tự DNA hệ gene đã được cắt (bởi enzyme giới hạn) và được gắn với đoạn tiếp hợp (adapter) Phương pháp cho phép sàng lọc đồng thời một số lượng lớn các chỉ thị không có nghĩa Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hoặc không

có mặt của một phân đoạn DNA Phương pháp AFLP kết hợp được những ưu điểm của RFLP và RAPD nên có hiệu quả trong phát hiện và phân tích đa hình một cách nhanh chóng, ổn định và đáng tin cậy Tuy nhiên chi phí và yêu cầu chuyên môn kỹ thuật để thực hiện phân tích AFLP là rất cao nên phương pháp này ít được sử dụng

để nghiên cứu phân loại học phân tử mà chủ yếu được sử dụng trong việc thiết lập bản đồ di truyền các tính trạng số lượng [72]

e) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật SSR hay microsaterlite (vi vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản trên genome của sinh vật, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ, ví dụ (AT)n; (AG)n; (AGTC)n) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ 2 đến 40 đơn vị Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn, phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài [9]

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên

là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA ở hai đầu của các đoạn lặp lại và thiết kế mồi Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR Mồi SSR sau đó được sử dụng tương tự như các mồi RAPD Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khác mà không xác định được bằng các chỉ thị khác như RAPD và AFLP Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hoá chất Vì vậy SSR là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cũng như lập bản đồ hệ gen ở sinh vật [53] Mồi sử dụng trong kỹ thuật SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng của loài, vì thế độ tin cậy cao hơn so với kỹ thuật RAPD Hơn nữa mồi SSR là các locus đặc trưng, nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm SSR là loại chỉ thị đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế chỉ thị AFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền

Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao và khó khăn trong việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho một locus đa hình Để xây dựng cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA hệ gen chứa đoạn lặp lại Một vấn đề khác cũng thường gặp trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các alen với các chỉ thị phân tử là rất khó SSR có thể được phân bố ngẫu nhiên trong genome nhưng cũng có khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus trong phân tích liên kết

di truyền và nghiên cứu quần thể [9]

f) Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật do Zietkiewicz và cộng sự phát hiện năm 1994 [76] Trong cấu trúc

hệ gen của vi sinh vật nhân thật tồn tại một loại các trình tự nucleotide lặp lại, chúng thường đặc trưng cho loài Trình tự này gồm từ 2 đến 5 nucleotide lặp lại nhiều lần, ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n và nằm rải rác trong hệ genome của thực vật bậc cao Kỹ thuật ISSR dựa trên kỹ thuật PCR và dùng một mồi đơn có độ dài

từ 20 đến 30 nucleotide để nhân bản các trình tự đơn giản ở giữa các trình tự lặp lại cho loài Đoạn mồi được thiết kế là đoạn oligonucletide có trình tự bổ sung với trình

tự lặp Khoảng cách giữa các trình tự lặp khác nhau làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau và đặc trưng cho mỗi cá thể Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra chỉ thị ISSR phản ánh mức độ phân nhóm di truyền của quy luật Mendel [66] Chỉ thị này cũng được sử dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng DNA ở một số đối tượng cây trồng [24], [35], [43], [48]

1.3 Ý nghĩa của nghiên cứu cứu xác định trình tự nucleotide ở thực vật

1.3.1 Ý nghĩa của nghiên cứu giải mã trình tự nucleotide ở thực vật

Nghiên cứu giải mã một số vùng gen bảo thủ cho mục đích phân loại, nhận dạng một số nguồn gen quý là hướng nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới trong những năm gần đây Cơ sở của phương pháp này là dựa trên kỹ thuật phân tích DNA còn được gọi là “dấu vân DNA- DNA fingerprint” Ứng dụng hướng nghiên cứu này giúp nhận biết ranh giới các loài (giám định gen); đánh giá sự phát sinh chủng loại giữa các loài (tiến hóa loài) [28] Phương pháp được xây dựng dựa trên thành phần và cấu trúc của các vùng gen đặc hữu của các taxon sinh vật, tập

trung vào hai vùng gen chính là gen nhân (ITS) và vùng gen lục lạp (cpDNA, nên có

hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài Với các giá trị khoa học nêu trên, đến nay việc xác định trình tự nucleotide vùng gen đặc trưng đang là công cụ

hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan

hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực vật và vi sinh vật Hiện nay, ở Việt Nam hướng nghiên cứu này đang được sử dụng trong nghiên cứu phân

loại, định loại, tiến hóa,… trên nhiều đối tượng sinh vật ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…

1.3.2 Giới thiệu tổng quát về ba vùng gen giải mã trình tự nucleotide

a) Vùng gen thuộc hệ gen lục lạp

Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ [55] Hệ gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản ánh đúng mức độ tiến hóa của loài Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 - 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại Hiện nay, các vùng

gen matK, trnL - trnF, vùng đệm psbA - trnH, rpoC2…hay được sử dụng trong

nghiên cứu hệ thống học phân tử thực vật Tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2 % giữa các loài lân cận

- Vùng psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại [58]

Vùng này có kích thước xấp xỉ 450 bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100 % với các loài đã được nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài trung bình là 1,24 % và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0 – 0,08 % [31]

Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác

nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản

- Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có

kích thước khoảng 440-750 bp Gen này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử [30], [42], [59] Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc

phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho phân

loại

b) Vùng gen nhân (ITS)

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của gen mã hoá cho ribosome nhân gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S Giữa các đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và

ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản Các nhóm gen như vậy

lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer)

Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là locus

được xác định trình tự phổ biến nhất, được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho

thực vật [12], [14] Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6 %

giữa các loài gần gũi), nhưng lại có mức độ biến đổi thấp bên trong loài [14] Với sự

hiện diện của trên 70.000 trình tự ITS được công bố trên ngân hàng Genbank năm

2011 đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định

1.4 Một số thành tựu nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử ở các loài lá kim

và được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm [25]

Năm 2010, Wang và Hao đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di

truyền của 13 quần thể thông tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.)

[69] Kết quả chỉ ra rằng tổng số biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể Sự đa dạng di tuyền có xu hướng giảm từ quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên Cả hai yếu tố phân bố

tự nhiên và hoạt động của con người đều ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này Hay như nhóm tác giả Mariette và cộng sự (2001) bằng việc phân tích hai chỉ thị AFLP và SSR đã đánh giá đa dạng di truyền của 23 quần thể

Pinus pinaster xuất xứ từ Aquitaine và Corsican thuộc nước Pháp [39] Kết quả chỉ

ra rằng những quần thể Pinus pinaster xuất xứ từ Aquitaine có sự đa dạng di truyền

cao hơn so với những quần thể xuất xứ từ Corsican Ngoài ra còn nhiều nhóm tác khác trên thế giới cũng đã quan tâm và nghiên cứu vấn đề này như Kadermir và

cộng sự (2004) đã nghiên cứu đa dạng di truyền loài thông đỏ Thổ Nhĩ Kỳ [29];

Ledig và cộng sự (2005) nghiên cứu trên loài Picea breweriana [34]; Clark và cộng

sự (2000) đã nghiên cứu trên những loài thuộc chi Abies trong họ Thông [20],… Đặc biệt thông qua việc phân tích cấu trúc di truyền sử dụng chỉ thị ISSR, AFLP, của một số loài lá kim bị đe doạ tuyệt chủng cho thấy mức độ đa dạng di truyền bị suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ và hẹp Những nghiên cứu đó cũng chỉ ra mức độ đa dạng giữa các quần thể là rất lớn và đồng thời đưa ra một số biện pháp hiệu quả để phục hồi nguồn gen một số loài lá kim bị đe dọa tuyệt chủng [18], [73]

Riêng đối với loài Thông lá dẹt, công bố mới nhất về tính đa dạng nguồn gen quần thể Thông lá dẹt của Việt Nam được xác định bởi nhóm nghiên cứu của Wang

và cộng sự (2014) [68] Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng 57 mẫu được lấy

từ sáu quần thể Thông lá dẹt tại Vườn Quốc gia (VQG) Bi Đúp để phân tích sự thay đổi trình tự nucleotide tại mười vùng gen nhân (~ 9 kb), 14 vùng gen ti thể (~10 kb)

và bảy vùng gen lục lạp (cpSSR) Kết quả cho thấy mức độ đa dạng nucleotide rất thấp tại các vùng gen nhân (0,0020) Trong khi đó, mức độ đa dạng gen dị hợp (haplopype) của các vùng gen cpSSR tương đối cao (0,911), nhưng lại không có

tính đa hình nucleotide khi phân tích với tất cả 14 vùng gen ty thể (mtDNA) Trong

nghiên cứu này, các tác giả cũng đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền quần thể ở 10 vùng gen nhân phân tích là rất thấp (5,2%) [68]

1.4.2 Trong nước

Việt Nam hiện được xếp vào một trong 10 điểm nóng nhất trên thế giới về bảo tồn Thông nên việc nghiên cứu bảo tồn các loài lá kim cần được coi trọng [4],

[5] Vì vậy, việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền các loài lá kim có giá trị khoa

học, kinh tế, các loài đặc hữu, quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam là hết sức cần thiết Tuy nhiên ở Việt Nam hiện có rất ít công trình nghiên cứu đánh giá mức đa dạng di truyền một số loài lá kim Hiện nay ở Việt Nam chỉ có nhóm nghiên cứu của Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (BTTNVN) là đơn vị đã và đang có những nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền nguồn gen một số loài Thông trên cơ sở phân tích phân tử

Chẳng hạn như Vũ Đình Duy và cộng sự (2010) đã sử dụng chỉ thị ISSR và SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 4 loài thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae) là Pơ mu

(Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii), Hoàng đàn hữu liên (Cupressus tonkinesis) và Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) đã chỉ ra

hai loài Pơ mu và Sa mộc dầu có mức độ suy giảm cao hơn Thủy tùng và Hoàng đàn hữu liên, sự suy giảm đều liên quan đến hoạt động của con người, đặc biệt nơi sống bị phân cắt Ngoài ra, bằng việc giải mã vùng gen 18S, nhóm tác giả đã giải

quyết vấn đề tồn tại về taxon của Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var

konishii) [2] Hay Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2010) đã giải mã vùng gen rpoC,

gen rbcL và gen matK để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 15 loài lá kim

thuộc lớp Thông (Thủy tùng, Thông đỏ bắc, Bách xanh núi đá, Bách xanh núi đất, Hồng tùng, Thông Pà cò, Thông tre lá dài, Thông đà lạt, Thông nàng, Thông tre lá ngắn, Thông ba lá, Kim giao nam, Kim giao bắc, Dẻ tùng vân nam và Thông đỏ nam) và đã chỉ ra mối quan hệ gần gũi của các loài [8] Để nghiên cứu mối quan hệ

họ hàng giữa các taxon trong thực vật, Tam và Trang (2012) đã sử dụng vùng gen 18S để xác định mối quan hệ tiến hoá của 6 chi thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae)

ở Việt Nam [58] Kết quả chỉ ra 2 nhánh tiến hoá có quan hệ mật thiết với nhau,

Xanthocyparis vietnamesis/Cupressus tonkinensis và Fokienia hodginsii/Cupressus rupestris/C formasana Xanthocyparis noothatensis có quan hệ gần gũi với loài

thuộc chi Cupressus Fokienia hodginsii cùng nhánh tiến hoá với chi Calocedrus

Tương tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009), Vũ Thi Thu Hiền và cộng sự (2009) cũng đã sử dụng chỉ thị thị RAPD, ISSR và cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền cho Pơ mu, Bách xanh phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn [3], [7] Đến nay có thể nói, các dẫn liệu về đa dạng di truyền, các trình tự nucleotide đặc trưng cho một

số loài lá kim đặc hữu, có giá trị kinh tế cao và có nguy cơ tuyệt chủng hầu như chưa được nghiên cứu hoặc rất hạn chế nên cần được quan tâm nghiên cứu để có kế hoạch bảo tồn cũng như khai thác nguồn tài nguyên quý giá này

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu:

- Gồm 70 mẫu lá và gỗ của 70 cá thể từ 4 quần thể loài Thông lá dẹt (Pinus

krempfii) thu tại 2 tỉnh Lâm Đồng và Đắc Lắc Các mẫu do TS Nguyễn Tiến Hiệp,

cộng tác viên của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp Mẫu lá, gỗ sau khi thu được bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng Thông tin chi tết các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong bảng 2.1

- Bốn mẫu (Pk5; Pk8; Pk18 và Pk45) đại diện của 4 quần thể Thông lá dẹt để xác định trình tự nucleotide 01 vùng gen nhân và 02 gen lục lạp

Bảng 2.1 Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử

Kí kiệu mẫu

so mặt nước biển (m)

Vĩ độ bắc (◦N)

Kinh độ đông (◦E)

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu:

- Hai mươi sáu mồi ISSR và 17 cặp mồi SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền quần thể Thông lá dẹt Các cặp mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technology, Mỹ), có ký hiệu và trình tự nucleotide như trong bảng 2.2 và

bảng 2.3

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 26 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu

mồi

Trình tự nucleotide

Tham

Trình tự nucleotide

Tham khảo

Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.4 Kích thước lý thuyết của các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

lý thuyết (bp)

Nhiệt độ bắt cặp (Tm)C

Nguồn gốc tổng hợp

ITS ITSF/

ITSR

CCTGCGGAAGGATCATTGTC TTAAACTCAGCGGGTAGTC

1100 50 Thiết kế

dựa vào trình tự nucleotide loài

Elleanthus conife mã

số EU490666 Genbank

600 51 Sang et al.,

(1997) [50]

Tate et al.,

(2003) [64]

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

Hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch genomic, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, poly acrylamide, TE, ; các hóa chất dùng trong

phẩm PCR và xác định trình tự nucleotide: Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye Teminator Cycle Sequencing Kit,… Các hóa chất sử dụng đều là của các hãng

Fermentas, Biobasis, QIAGEN,

:

), máy ly tâm ), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức)

Genetic Analyzer (Applied Biosystems),.…

Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn các loại,…của các hãng Canada, Mỹ, Trung Quốc và Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định và phân tích các thông số di truyền của 4 quần thể Thông lá dẹt sử dụng chỉ thị ISSR và SSR

- Xác định, phân tích và so sánh trình tự nucleotide của 03 vùng gen (01 vùng gen nhân và 02 vùng gen lục lạp) với các trình tự liên quan trên ngân hàng Genbank

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Thông lá dẹt

DNA tổng số được tách chiết từ lá hoặc vỏ cây bằng phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) [51] Kiểm tra độ sạch trên gel agarose 0,9 % và đo nồng độ DNA tổng số trên máy UVS 2700, Labomed, Hoa Kỳ

2.4.2 Thiết kế cặp mồi

Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu Chúng tôi đã khai thác các dữ liệu trong ngân hàng gen Genbank để

tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho vùng gen ITS đối với loài lá kim Sau đó sử

dụng phần mềm BioEdit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng để thiết kế cặp

mồi Cặp mồi ITSF/ITSR nhân bản vùng gen ITS được thiết kế dựa vào trình tự

trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar Hai cặp mồi

psbA3'f/trnHf và trnLF/trnFR được tổng hợp dựa trên những nghiên cứu của Sang

và cộng sự (1997), Tate và cộng sự (2003) và Taberlet và cộng sự (2006)

2.4.3 Nhân bản DNA

Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) với các chỉ thị ISSR và SSR:

Phản ứng nhân gen được thực hiện trên máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng

2 mM; mồi 100 nM; 50 ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase Chu trình

nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94°C trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: biến tính 94°C trong 1 phút; gắn mồi 50 - 58°C trong 1 phút

4°C Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 5 % cùng với thang DNA chuẩn 100 bp (của hãng Fermentas), và gel agarose 1,5 % với thang chuẩn 1kb (của hãng Fermentas) sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV

Nhân bản DNA và đọc trình tự: phản ứng PCR được tiến hành với thể tích

2.4.4 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình

tự Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 %, cắt lấy phân đoạn DNA quan tâm trên bàn soi UV và tinh sạch bằng bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9 % Chụp ảnh sản phẩm thôi gel và xác định hàm lượng DNA để gửi đi xác định trình tự

2.4.5 Giải trình tự nucleotide các đoạn DNA

Các sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gửi sang công ty Macrogen (Hàn Quốc) để xác định trình tự nucleotide theo hai chiều (xuôi và ngược)

2.5 Phân tích số liệu

- Phân tích đa dạng di truyền

Các thông số đa dạng di truyền ở mức độ quần thể và loài của loài Thông lá

dẹt: số alen trung bình (Na), số alen hiệu quả (Ne), và các thông số đa dạng di

truyền quần thể như phần trăm lô cút đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He), được xác định cho cả chỉ thị ISSR

và SSR bằng phần mềm GenAlex 6.3 [50]

Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của mỗi chỉ thị ISSR được xác định theo

kiểm tra Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn) Chỉ số

đa dạng di truyền (h) theo Nei (1973) của mỗi quần thể Thông lá dẹt với chỉ thị

Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment) được tạo cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor

- Joining (NJ) với các thông số phân tích như sau:

- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là 1000 lần

- Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra): được xoá bỏ theo cặp (pairwise deletion)

- Mô hình đột biến: mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột biến được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A

↔ G, T ↔ C, T↔ G)

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Thông lá dẹt

DNA tổng số của 70 cá thể từ 4 quần thể Thông lá dẹt (Pinus krempfii) được

tách chiết theo phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) có cải tiến một số bước cho phù hợp với phòng thí nghiệm [51] Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9 % (hình 3.1) cho thấy mỗi giếng chỉ cho một băng vạch duy nhất, các băng đậm, sắc nét, thể hiện DNA tách chiết được có độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy Kết quả này một lần nữa khẳng định chất lượng DNA tách chiết được hoàn

toàn đủ điều kiện cho những nghiên cứu tiếp theo

Hình 3.1 Hình ảnh DNA tổng số đại diện của một số mẫu Thông lá dẹt (các giếng

từ 1 đến 36 là thứ tự các mẫu Thông lá dẹt như bảng 2.1)

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra hàm lượng và độ sạch bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Kết quả thu được cho thấy, nồng độ DNA của 70 mẫu Thông lá dẹt dao động từ 640 đến 1000

đến 2 (số liệu không chỉ ra ở đây) Kết quả trên khẳng định các mẫu DNA tách chiết được hoàn toàn đủ tiêu chuẩn cho những phân tích tiếp theo

3.2 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Thông lá dẹt

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 26 mồi ISSR và 17 cặp mồi SSR để đánh giá tính đa dạng di truyền của bốn quần thể Thông lá dẹt thu ở Yang

Ly, Cổng Trời, Hòn Giao của tỉnh Lâm Đồng và Chư Yang Sin của tỉnh Đắc Lắc

3.2.1 Tính đa dạng di truyền quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị ISSR Tính đa hình DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt

Hai mươi sáu mồi ISSR đã được sử dụng để phân tích cho 70 cá thể thuộc bốn quần thể Thông lá dẹt thu tại Yang Ly, Cổng Trời, Hòn Giao và Chư Yang Sin

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

thì có 23/26 mồi ISSR chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu Tổng số có 137 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước dao động trong khoảng 250 - 1800

bp, trong đó có 98 phân đoạn đa hình Hàm lượng thông tin đa hình của các mồi dao động từ 0 (mồi ISSR5, ISSR18, ISSR10) đến 0,515 (mồi UBC843) Các mồi ISSR cho tỉ lệ phân đoạn đa hình cao giữa các mẫu nghiên cứu, sáu mồi (ISSR3, ISSR6, ISSR67, UBC834, UBC843 và UBC854) có số phân đoạn đa hình chiếm 100%, 16 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50 % (Bảng 3.1) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 70 mẫu Thông lá dẹt với mồi UBC834 đại diện cho 26 mồi ISSR được thể hiện

trong hình 3.2

Bảng 3.1 Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Thông lá dẹt phân tích

với 26 mồi ISSR

Kích thước phân đoạn (bp)

PIC

Phân đoạn

đa hình

Phân đoạn đồng hình

Tổng phân đoạn

% phân đoạn

Hình 3.2 Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Thông lá dẹt phân tích với mồi

UBC834 trên gel agarose 1,5 % (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Thông lá dẹt như bảng 1, M: marker phân tử 1 kb)

Mồi UBC834: Đây là một trong những mồi thể hiện rõ nét nhất tính đa hình

DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt nghiên cứu Có tổng số 10 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước từ 250 bp đến 1350 bp thì cả 10 phân đoạn đều thể hiện sự sai khác về mặt di truyền giữa các mẫu (hình 3.2) Chẳng hạn ở vị trí 1350 bp (hình

←) chỉ có duy nhất mẫu Pk70 (tương ứng với giếng số 70) không xuất hiện phân đoạn DNA, 69 mẫu còn lại đều xuất hiện phân đoạn DNA Hay như tại vị trí 400 bp

(hình →) có 3 mẫu Pk43, Pk44 và Pk45 (tương ứng các giếng 43, 44 và 45) xuất hiện phân đoạn DNA, các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn DNA

Đa dạng di truyền của 4 quần thể Thông lá dẹt

Các thông số di truyền của quần thể Thông lá dẹt được đánh giá ở cả mức độ quần thể và loài Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 cho thấy theo cả ba cách tính

đa dạng di truyền của Nei (1973) [45], Shannon (1949) [57] và phần trăm phân đoạn đa hình của bốn quần thể đã chỉ ra quần thể Thông lá dẹt ở Chư Yang Sin có

tính đa dạng di truyền cao nhất (h = 0,117; I = 0,239 và PPB = 62,04) và thấp là quần thể Yang Ly (h = 0,070; I = 0,086 và PPB = 13,87) Kết quả này cho thấy, dù

tính theo phương pháp nào cũng vẫn phản ánh đúng thực trạng về tính đa dạng nguồn gen di truyền của mỗi quần thể Kết quả phân tích trong bảng 3.2 cũng chỉ ra

tính đa dạng nguồn gen trung bình 4 quần thể Thông lá dẹt đạt h = 0,082 và I = 0,137, ở mức độ loài đạt h = 0,094 và I = 0,245

Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị

Chƣ Yang Sin

Trung bình

số đa dạng Nei, I: Chỉ số đa dạng Shannon

So sánh mức độ đa dạng di truyền của loài Thông lá dẹt với một số loài Thông khác trên thế giới cho thấy loài Thông lá dẹt của Việt Nam có mức độ đa

dạng di truyền thấp hơn (PPB = 30,11% và I = 0,137) so với loài Pinus nigra của Trung Quốc (PPB = 51,04 % và I = 0,262) và loài Pinus sylvestris của Đức và Tây Ban Nha khi phân tích với chỉ thị ISSR (PPB = 99,76 % và I = 0,690) [19], [41]

Các thông số di truyền: số alen hiệu quả (Ne), số alen quan sát trung bình (Na) và hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) được tìm tìm thấy ở quần thể Chư Yang Sin đạt cao nhất (Ne = 1,226; Na = 1,599 và He = 0,151), tiếp đến là quần thể Hòn Giao (Ne = 1,135; Na = 1,073 và He = 0,084), xếp thứ 3 là quần thể Cổng Trời (Ne

= 1,112; Na = 0,854 và He = 0,063) và cuối cùng là quần thể Yang Ly (Ne = 1,111;

Na = 10,810 và He = 0,060) Kết quả phân tích về các thông số này cũng phù hợp

với kết quả của các thông số đa dạng di truyền theo cách tính (h) của Nei (1973) [45], chỉ số I của Shannon (1949) [57] và phần trăm phân đoạn đa hình ở mức độ

quần thể theo thứ tự từ cao đến thấp là Chư Yang Sin, Hòn Giao, Cổng Trời và Yang Ly

Mức độ đa dạng di truyền trong quần thể loài Thông lá dẹt nghiên cứu rất

thấp (He = 0,151) khi so sánh với một số loài Thông trên thế giới Chẳng hạn quần thể Pinus tabuleaformis (He = 0,415), Pinus koraiensis (He = 0,348), Pinus sibirica (He = 0,267), Pinus sylvestris (He = 0,262) [26], [36], [69], [74] Kết quả này cho

thấy loài Thông lá dẹt của Việt Nam có nguy cơ suy giảm đa dạng di truyền rất cao

Bảng 3.3 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Thông lá dẹt

phân tích với chỉ thị ISSR

Bên cạnh đó, phân tích về mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể ở bảng 3.3 cũng cho thấy, tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (20,28 %) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (79,82 %) với giá trị p<0,001

Thành phần biến đổi

Tổng sự biến đổi (%)

Giá trị

p Giữa các

<0,001

Trong các

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt nhận được sau khi so sánh các cặp quần thể với nhau và được ghi nhận ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền (dưới) và khoảng cách di truyền(trên) theo

Nei (1973) giữa các quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị ISSR

Mối quan hệ di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt

Phân tích NJ (Neighbor Joining) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Nei (1973) đã tìm thấy mối quan hệ giữa các quần thể Thông lá dẹt với nhau (hình 3.3) Kết quả từ hình 3.3 cho thấy các quần thể Thông lá dẹt hình thành 2 nhóm riêng biệt Nhóm thứ nhất gồm 2 quần thể Yang Ly và Cổng Trời với khoảng cách di truyền 0,034 Nhóm thứ hai gồm 2 quần thể còn lại (Hòn Giao và Chư Yang Sin) với khoảng cách di truyền 0,031

Hình 3.3 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 4 quần thể Thông lá

Cặp mồi Pt30204: Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Thông lá

dẹt với cặp mồi Pt30204 được thể hiện trong hình 3.4 Tổng số 4 phân đoạn DNA nhân bản được thì cả 4 phân đoạn đa hình (chiếm tỷ lệ 100 %) Đây là một trong hai cặp mồi có 100 % phân đoạn đa hình Các phân đoạn DNA nhân bản được có kích thước dao động từ 120 đến 205 bp Sự đa hình DNA giữa các mẫu Thông lá dẹt được thể hiện tương đối rõ khi phân tích với cặp mồi Pt30204, ở vị trí 120 bp (hình

→) có 5 mẫu Pk7, Pk30, Pk43, Pk44 và Pk45 (tương ứng các giếng số 7, 30, 43, 44

và 45) xuất hiện phân đoạn DNA, 65 mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn

DNA Hay tại vị ví 160 bp (hình ←) tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA trừ các mẫu Pk14, Pk17, Pk24, Pk25, Pk26, pk54 và Pk59 (tương ứng các giếng số

14, 17, 24, 25, 26, 54 và 59) Như vậy kết quả phân tích với cặp mồi Pt30204 đã chỉ

ra sự đa dạng DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt nghiên cứu

Hình 3.4 Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Thông lá dẹt phân tích với cặp mồi

Pt30204 trên gel poly acrylamide 5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Thông lá dẹt như trong bảng 1, M: marker phân tử 100bp)

Đa dạng di truyền của 4 quần thể Thông lá dẹt

Đa dạng di truyền trong bốn quần thể Thông lá dẹt với chỉ thị SSR được chỉ ra

ở bảng 3.5 Giá trị alen quan sát trung bình (Na) thay đổi từ 1,765 (quần thể Yang

Ly) đến 2,118 (quần thể Chư Yang Sin) với giá trị trung bình của 4 quần thể là

1,912 Số alen hiệu quả (Ne) dao động từ 1,455 (quần thể Hòn Giao) đến 1,667

(quần thể Cổng Trời) với giá trị trung bình là 1,529

Số alen hiếm trên một locus (Ap) chỉ tìm thấy ở ba quần thể Yang Ly (0,059),

Cổng Trời (0,118) và quần thể Chư Yang Sin (0,294) Cụ thể đã tìm thấy alen hiếm

ở lô cút RPE24 và PRS2 tại Cổng Trời; locus PtTX3020 tại Yang Ly; locus PtTX3020, PtTX3026, Pt26081 và PRS2 tại Chư Yang Sin Không tìm thấy alen hiếm tại quần thể Hòn Giao

Giá trị của hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể,

trung bình 0,303 dao động từ 0,271 ở quần thể Yang Ly đến 0,332 ở quần thể Chư

Yang Sin Trong khi đó giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) dao động từ 0,200

ở quần thể Hòn Giao đến 0,250 ở quần thể Cổng Trời Giá trị Ho và He cao được

tìm thấy ở mức độ loài, với giá trị 0,310 và 0,234, tương ứng Kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg đã chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa giữa hệ số gen dị hợp tử quan sát và mong đợi tại locus PRE24, PtTX3020, Pt9383, Pt26081, Pt30204, RPS2 và Pt71936 (p<0,001) và locus Pt36480 (p<0,05) Sự khác nhau có ý nghĩa giữa hệ số gen dị hợp tử quan sát và mong đợi cũng được tìm thấy ở một số locus ở mức độ quần thể của loài Thông lá dẹt Sự khác nhau này được tìm thấy ở locus Pt71936 (p<0,05) cho quần thể Yang Ly; locus PtTX3020, Pt71936 (p<0,001), locus Pt36480, Pt26081, Pt30204 (p<0,05) cho quần thể Cổng Trời; locus PRE24, PtTX3020, Pt9383, RPS2, Pt71936 (p<0,001) và locus Pt30204 (p<0,05) cho quần thể Hòn Giao; locus PRE24, Pt30204, RPS2, Pt71936 (p<0,001), locus Pt2030 (p<0,05), locus Pt9383 (p<0,01) cho quần thể Chư Yang Sin (Số liệu không chỉ ra ở đây)

Bảng 3.5 Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Thông lá dẹt phân

tích với chỉ thị SSR

Quần thể

Mức độ quần thể

Mức độ loài Yang

Ly

Cổng Trời

Hòn Giao

Chƣ Yang Sin

Trung bình

Giá trị chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) được tính toán cao nhất ở quần thể Cổng Trời (I = 0,415), sau đó đến quần thể Chư Yang Sin (I = 0,390), tiếp theo

là quần thể Yang Ly (I = 0,373) và thấp nhất là quần thể Hòn Giao (I = 0,330) Tuy

nhiên xét về khía cạnh đa hình của các phân đoạn DNA cho thấy tính đa dạng di

truyền quần thể không khác biệt nhau nhiều ở cả ba quần thể Yang Ly (PPB = 52,93 %), Cổng Trời (PPB = 52,95 %) và Chư Yang Sin (PPB = 52,94 %), và thấp hơn cả vẫn là quần thể ở Hòn Giao (PPB = 47,06 %)

Thông qua kết quả trong bảng 3.5 cho thấy tính đa dạng di truyền thấp đối với quần thể Hòn Giao và cao ở quần thể Chư Yang Sin Trong bốn quần thể nghiên cứu thì quần thể Chư Yang Sin thuộc tỉnh Đắc Lắc, còn ba quần thể Yang Ly, Cổng Trời và Hòn Giao thuộc tỉnh Lâm Đồng (khoảng cách giữa quần thể Hòn Giao và Cổng Trời là 54 km; Hòn Giao và Yang Ly 4 km, Cổng Trời và Yang Ly là 50 km; Chư Yang Sin và Hòn Giao, Yang Ly, Cổng Trời là 74; 70 và 40 km, tương ứng) Điều này cũng có thể liên quan tới khác biệt địa lý, sự thay đổi khí hậu, sự trao đổi

di truyền của mỗi quần thể,… [41] Hơn nữa trong quá trình điều tra thực địa, chúng tôi cũng nhận thấy quần thể Thông lá dẹt ở Cổng Trời có số lượng cây trưởng thành nhiều nhất (có 10 cây với đường kính 1,5 - 2 m, cao 30 - 40 m) so với các quần thể

ở Hòn Giao và Yang Ly (thường là cây tái sinh có chiều cao khoảng trên 10 m) Kết quả này cho phép nhận định việc giao phấn (pollilation) ở Cổng Trời cao hơn hai quần thể Yang Ly và Hòn Giao

Để có thêm cơ sở về tính đa dạng di truyền loài Thông lá dẹt, chúng tôi cũng

đã phân tích thêm một số thông số di truyền của quần thể Thông lá dẹt với mỗi cặp mồi SSR và được thể hiện trong bảng 3.6 cho thấy, 8 trong số 17 cặp mồi SSR phân tích (PRE24, PtTX3020, Pt36480, Pt9383, PtTX3026, Pt26081, Pt30204 và RPS2)

đã chỉ ra tính đa hình Trong đó, giá trị alen trung bình (Na) cao nhất là cặp mồi

PRE24 (4,5) và thấp nhất là cặp mồi Pt26081 (1,75) Kết quả phân tích SSR cũng

cho thấy mức độ di nhập gen (Nm) tương đối cao của quần thể Thông lá dẹt khi phân tích với cặp mồi Pt9383 (Nm = 10,796 và Fst = 0,023) và thấp nhất là cặp mồi Pt26081 (Nm = 1,813 và Fst = 0,121) Kết quả này cho phép nhận xét việc di nhập

gen rất cao trong quần thể Thông lá dẹt

Bảng 3.6 Thông số di truyền chính của quần thể Thông lá dẹt phân tích với từng

Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể ở bảng 3.7 đã chỉ ra, tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (11,94 %) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (88,06 %) với giá