xây dựng quy trình khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng thái lan bằng kĩ thuật long pcr và so sánh quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng thái lan và phú quốc

Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào trình tự các gen.. Tuy nh

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

Chuyên ngành: Sinh h ọc thực nghiệm

Mã s ố: 60 42 01 14

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Huỳnh Thị Bích Liễu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm

ơn sâu sắc đến TS Trần Hoàng Dũng – người Thầy đã tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất Trong suốt quá trình làm đề tài Thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy TS Chung Anh Dũng thuộc phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin trân trọng biết ơn quý Thầy, Cô thuộc Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo Sau Đại học – Trường Đại học Sư phạm Tp HCM đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập

Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam

và Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại Viện Cảm ơn các anh, chị, em, bạn bè thuộc phòng Genome & Bioinformatics - Viện Kĩ thuật Công nghệ cao - Trường ĐH Nguyễn Tất Thành và Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa

học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin gởi đến ba mẹ - người luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc khó khăn

nhất - lòng biết ơn sâu sắc Ba mẹ cho con niềm tin, nghị lực trong cuộc sống cũng như động viên và hỗ trợ cho con mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần

Tp Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014

Tác giả

Huỳnh Thị Bích Liễu

M ỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục hình ảnh

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

3.1 Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó Thái Lan 2

3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR 2

3.3 Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan 2

3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào trình tự các gen 2

4 Phạm vi nghiên cứu 3

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1.Giới thiệu về giống chó Phú Quốc-Nguồn gốc giống chó Phú Quốc Việt Nam 5

1.1.1 Phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm chung của chó có xoáy Phú Quốc 6

1.1.3 Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam 6

Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan 8

1.3 Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài dựa trên

trình tự hệ gen ty thể 10

1.3.1 Đặc điểm và cơ chế di truyền của hệ gen ty thể động vật hữu nhũ 10

1.3.2 Ứng dụng của hệ gen ty thể trong nghiên cứu tiến hóa và phát sinh chủng loài 11

1.3.3 Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài chó dựa trên toàn bộ trình tự hệ gen ty thể 12

Chương 2 VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu và hóa chất 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu mẫu và tách DNA tổng số 23

2.2.2 Phương pháp điện di trên gel agarose 27

2.2.3 Khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 27

2.2.4 Phương pháp giải trình tự 33

2.2.5 Hiệu chỉnh trình tự 33

2.2.6 So sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Thu thập mẫu 37

3.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số 37

3.3 Định loại kiểu đơn bội chó có xoáy Thái Lan bằng trình tự vùng kiểm soát 41

3.3.1 Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát 41

3.3.2 Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng kiểm soát 42

3.3.3 Định loại kiểu đơn bội cho chó có xoáy lưng Thái Lan 45

3.4 Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kĩ thuật Long-PCR 48

3.4.1 Xây dựng quy trình phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1 49

3.4.2 Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại mảnh 2 và mảnh 3 hệ gen ty thể

chó có xoáy lưng Thái Lan 51

3.5 Giải và phân tích trình tự hệ gen ty thể chó Thái Lan mang kiểu đơn bội A11

54

3.5.1 Thu nhận và hiệu chỉnh kết quả giải trình tự 56

3.5.2 Lắp ráp các trình tự đã hiệu chỉnh 58

3.5.3 Phân tích phát sinh loài 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 64

PH Ụ LỤC

Phụ lục 1 Phương pháp hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự các gen của hệ gen ty thể

Phụ lục 2 Phương pháp sơ bộ xác định tên loài của các trình tự DNA vùng D-loop

bằng thuật toán BLAST

FCI Federation Cynologique International

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

NCBI National Center for Biotechnology Information

rRNA Ribosomal RNA

SSC buffer Sodium clorua NaCl, Sodium Citrate C6H5Na

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Hóa chất tách chiết DNA 20

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong kĩ thuật PCR 21

Bảng 2.3 Hóa chất điện di 21

Bảng 2.4 Dụng cụ và thiết bị 22

Bảng 2.5 Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) 28

Bảng 2.6 Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) 29

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) 29

Bảng 2.8 Các cặp mồi khuếch đại cho phản ứng PCR 30

Bảng 2.9 Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes 30

Bảng 2.10 Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 1 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes 31

Bảng 2.11 Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 1 31

Bảng 2.12 Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2, mảnh 3 lần 1 31

Bảng 2.13 Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 2 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes 32

Bảng 2.14 Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 2 32

Bảng 2.15 Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2 lần 2 32

Bảng 2.16 Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 3 lần 2 33

Bảng 3.1 Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình FBI 38

Bảng 3.2 Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình có hiệu chỉnh 38

Bảng 3.3 Kết quả đo quang của 11 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu cho Thái Lan 40

Bảng 3.4 Ba cặp mồi để khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan 49

Bảng 3.5 Thông tin về năm gen mã hóa protein trong nghiên cứu 55

Bảng 3.6 Chín cặp mồi dành để giải trình tự các vùng gen trong nghiên cứu 55

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Chó có xoáy lưng Phú Quốc 5

Hình 1.2 Các dạng xoáy lông trên sống lưng chó Phú Quốc 6

Hình 1.3 Chó có xoáy lưng Thái Lan 9

Hình 1.4 Cấu trúc ty thể 11

Hình 1.5 Các trình tự hệ gen ty thể chó được đăng ký trên NCBI 14

Hình 2.1 Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R trên vùng kiểm soát (D-loop) 28

Hình 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của 14 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó Thái Lan 40

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của chó có xoáy lưng Thái Lan 42

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 8 mẫu chó có xoáy lưng Phú Quốc 42

Hình 3.4 Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 15412F 43

Hình 3.5 Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 16625R 43

Hình 3.6 Đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát chó có xoáy lưng Thái Lan 44

Hình 3.7 Đại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của 3/8 mẫu khảo sát 44

Hình 3.8 Kết quả BLAST của mẫu Thái Lan trên NCBI 45

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loài sử dụng phương pháp Neighbor-Joining Mô hình tiến hóa là Kimura hai thông số với phân bố Gamma là 4 Phép phân tích dựa trên 181 trình tự bao gồm 531 nucleotides 47

Hình 3.10 Sơ đồ hệ thống các cặp mồi khuếch đại các mảnh gen ty thể chó Thái Lan và vị trí các gen cần giải trình tự 49

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1 lần 1 hệ gen ty thể chó Thái Lan 50

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 2 hệ gen ty thể chó Thái Lan 51

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 1 52

Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 1 52

Hình 3.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 2 53

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 2 54

Hình 3.17 Dữ liệu DNA ty thể chó thuộc kiểu đơn bội A11 55

Hình 3.18 Biểu đồ huỳnh quang với các đỉnh huỳnh quang nền 57

Hình 3.19 Biểu đồ huỳnh quang có base không rõ ràng 58

Hình 3.20 Biểu đồ huỳnh quang có cường độ tín hiệu thấp 58

Hình 3.21 Trình tự đồng nhất của chó có xoáy lưng Thái Lan trên phần mềm SeaView 59

Hình 3.22 Cây tiến hóa dựng bằng thuật toán Maximum-Likehood từ trình tự 5 gen ND1, ND2, ATP8, ND4 và CYTB có tổng chiều dài 4832 bp của 77 trình tự 61

M Ở ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 400 loài chó, trong đó có ba giống chó có xoáy lưng là: chó lông xoáy Rhodesia ở Nam Phi, chó lông xoáy Thái Lan và chó lông xoáy Phú Quốc Việt Nam Chó Phú Quốc là giống chó đặc hữu của vùng biển Phú

Quốc tỉnh Kiên Giang, Việt Nam, là giống chó đẹp, thông minh, trung thành và dũng mãnh Nó từ xa xưa đã giúp đỡ con người trong việc đi săn và canh gác Tuy nhiên, chó xoáy Phú Quốc vẫn chưa có nguồn gốc rõ ràng, có rất nhiều tranh cãi xung quanh nguồn gốc của chó Phú Quốc

Các nhà khoa học nước ta có đưa ra những bằng chứng lịch sử để chứng minh chó lông xoáy Phú Quốc là loài chó đặc hữu của Việt Nam, nhưng điều này không có tính thuyết phục cao Vì các bằng chứng được đưa ra chỉ dựa vào những đặc điểm hình thái bên ngoài Do đó, việc xác định nguồn gốc chó xoáy Phú Quốc được các nhà khoa học rất quan tâm Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã trở thành công cụ

hữu hiệu trong việc xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền của các sinh vật

Từ năm 2012, Phòng Genomics & Bioinformatic, Trường Đại học Nguyễn Tất

Thành đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể chó Phú Quốc để

đánh giá độ đa dạng di truyền chó Phú Quốc giống tại Tp Hồ Chí Minh” cho ra nhiều

kết quả nổi bật Theo đó Chó lưng xoáy Phú Quốc mang kiểu gen đơn bội (haplotype)

dạng E là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều tiên Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty

thể chó sói xám Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả chưa phân tích hệ gen ty thể của chó lưng có xoáy Thái Lan để tìm hiểu quan hệ nguồn gốc giữa chó lưng có xoáy Thái Lan và lưng có xoáy Phú Quốc

Để có thêm những bằng chứng chứng minh sự phát triển song song của hai loài chó này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chó có xoáy Thái Lan Do vậy chúng tôi

thể chó lưng có xoáy Phú Quốc, nhằm tìm quan hệ phát sinh chủng loài của hai loài có hình thái bên ngoài tương cận nhau này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR để thu thập dữ liệu phân tử nhằm phân tích quan hệ di truyền

giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó

Thái Lan

3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể

chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR

- Nghiên cứu các cặp mồi phổ quát để khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó

có xóay Thái Lan

- Nghiên cứu chuẩn hóa điều kiện phản ứng khuếch đại các mảnh của hệ gen ty

thể chó có xoáy Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR

3.3 Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có

xoáy Thái Lan

- Giải trình tự của năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan

- Hiệu chỉnh kết quả giải trình tự

- Tích hợp các kết quả giải trình tự

3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan

hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh

chủng loài dựa vào trình tự các gen

- Thiết lập bộ cơ sở dữ liệu gồm các trình tự hệ gen ty thể chó cho phân tích

- Xác định tính đa hình dựa trên một nucleotide đơn lẻ (SNP) của các trình tự các gen của hệ gen ty thể chó Thái Lan đã giải trình tự

- Xây dựng cây phát sinh chủng loài bằng thuật toán Maximum-Likelihood, thuật toán Neighbour-Joining, thuật toán Maximum Parsimony, thuật toán Bayes

- Tổ hợp các kết quả phát sinh chủng loài và tính toán giá trị bootstrap

- Phân tích khoảng cách di truyền và hình dạng của cây phát sinh loài, xác định mối quan hệ di truyền giữa giống chó có xoáy Phú Quốc Việt Nam và giống chó có xoáy Thái Lan

4 Ph ạm vi nghiên cứu

- Chó lưng có xoáy Thái Lan thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh

- Hệ gen ty thể của chó lưng có xoáy Thái Lan

CHƯƠNG 1

Lớp: Mammalia (Thú)

Bộ: Carnivora (Ăn thịt)

Họ: Canidae (Chó)

Phân họ: Caninae (Chó) Giống: Canis Linnaeus, 1758 (Chó)

Loài: Canis lupus Linnaeus, 1758 (Chó) Phân loài: Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758 (Chó nhà)

Hình 1.1 Chó có xoáy lưng Phú Quốc (Ngu ồn: phongkhamthuyac.com)

1.1.2 Đặc điểm chung của chó có xoáy Phú Quốc

Chó Phú Quốc là một loại chó của đảo Phú Quốc thuộc tỉnh Kiên Giang Việt Nam Chó Phú Quốc là giống chó quý với nhiều đặc tính nổi bật mà những giống chó khác không có như: thông minh, nhanh nhẹn,trung thành, dũng mãnh, có khả năng đi săn và canh gác tốt Ngoại hình có tầm vóc trung bình, dáng cao thon, lông ngắn, dày

và sát, thân thường nổi lên những bắp cơ ở vùng đùi trước và đùi sau, đuôi vót thon và cong lên, chó có mõm dài, thường có màu đen, mắt sang, tai nhỏ và đứng Bốn chân cao, bàn chân có màng thích hợp cho việc bơi lội dưới nước

Về màu lông, chó Phú Quốc có nhiều màu sắc khác nhau như: đen, nâu, vàng,

vện, xám và các màu khác Nhưng màu phổ biến nhất là đen và vàng chiếm đến 60% Điểm nổi bật nhất của chó Phú Quốc là các xoáy lông trên sống lưng, có nhiều hình dạng các xoáy lưng khác nhau như hình kim, hình mũi tên, hình quả lựu….(như hình 1.2)

Hình 1.2 Các d ạng xoáy lông trên sống lưng chó Phú Quốc (http://dogsinvietnam.com/diendan/showthread.php?p=36847 )

1.1.3 Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam

Chó Phú Quốc là một trong 3 dòng chó có xoáy lưng trên thế giới Hai loại chó

có xoáy lưng còn lại là chó xoáy Rhodesia Châu Phi và chó xoáy Thái Lan Tuy nhiên,

hiện nay chó có xoáy lưng trên thế giới chỉ có hai giống đó là Rhodesia Châu Phi và chó xoáy Thái Lan được Liên đoàn Các hiệp hội nuôi chó giống quốc tế (Federation

Cynologique International - FCI) công nhận, trong đó chó Phú Quốc được đề cập chung với chó xoáy Thái Lan, được xem là có nguồn gốc từ chó xoáy Thái Lan [1], [39]

Giống chó có xoáy lưng gần nước ta nhất là chó xoáy Thái Lan Chó xoáy Thái Lan là giống chó đã có từ rất lâu đời, được ghi nhận xuất hiện từ 350 năm trước Nó có nguồn gốc xuất phát từ miền Đông Thái Lan và nó được dùng để đi săn thú, dẫn đường

và giữ nhà Chó này cho đến nay vẫn giữ được kiểu hình gốc do điều kiện lưu thông ở khu vực này một thời rất khó khăn, nên chúng rất ít có điều kiện lai với các giống chó khác Chó xoáy Thái Lan có tầm vóc vừa, lông ngắn và có một xoáy trên lưng, chó có chiều dài dài hơn chiều cao, mũi đen, với chó màu lông nâu vàng thì có mõm đen, đuôi vót và cong lên như cái liềm Các cơ bắp phát triển tốt, cấu trúc cơ thể phù hợp cho

việc hoạt động Chó có nhiều màu lông khác nhau như đỏ hạt dẻ, đen tuyền, bạc hay nâu vàng Khối lượng bình quân chó đực 25 kg, con cái 22 kg [1]

Chó Rhodesia có nguồn gốc từ Châu Phi, giống chó rất lớn con, khối lượng trung bình 38 kg ở con đực, 31 kg ở con cái, người ta chưa thấy bằng chứng nào có liên hệ giữa chó Rhodesian và chó Phú Quốc ngoài xoáy trên lưng [1]

Đối với chó Phú Quốc thì cho tới nay có rất ít tư liệu ghi chép lại Đào Văn Tiến,

1977 cho rằng chó Phú Quốc (Canis dingo) có nguồn gốc của chó Dingo ở Châu Úc,

nhưng hiện nay có lẽ đã tuyệt chủng Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây của Oskarsson năm 2012 [22] cho thấy chó hoang Dingo Úc và chó Polynesia có nguồn gốc từ chó ở Châu Á du nhập vào, nên chó hoang Dingo không thể là tổ tiên của chó Phú Quốc Hai nhà khoa học người Mỹ là Merle Wood và Merle Hidinger cho rằng trong quá khứ chỉ

có chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian của Nam Phi là có dải lông xoáy trên lưng, vì vậy chó Phú Quốc phải có nguồn gốc từ có xoáy Thái Lan Họ còn nói hơn

400 năm trước, các ngư dân Thái Lan đã mang chó xoáy Thái Lan đến đảo Phú Quốc

và đã trở thành tổ tiên của chó Phú Quốc ngày nay [40] Giáo sư Dư Thanh Khiêm, Viện trưởng Viện giáo dục Woluwe SaintPierre ở Brussel (Bỉ), một chuyên gia tìm

hiểu về chó xoáy Phú Quốc hơn 30 năm không đồng ý với giả thuyết này Ông cho

biết tất cả các cuộc hành trình của người Thái Lan đều được mô tả lại trong cuốn sách

‘Abrégé del‘histoire Générale des Voyages’ bởi Jean-Francoise de la Harpe, một thành

viên của hội các học giả Pháp, xác nhận rằng việc các ngư dân Thái có đến đảo Phú

Quốc không thấy ghi chép trong quyển sách này

Ngoài ra, khi so sánh về đặc điểm hình thái cho thấy có sự khác biệt giữa chó xoáy Thái Lan và chó Phú Quốc Chó Thái có khối lượng trung bình khoảng 23 kg, cao 55 cm, trong khi chó Phú Quốc có khối lượng lớn nhất chỉ 18 kg và cao 48 cm Nếu suy luận theo giả thuyết nguồn gốc của chó Phú Quốc là từ những con có xoáy Thái Lan do ngư dân Thái Lan mang đến và để lại trên đảo Phú Quốc, thì với điều kiện

tự nhiên của đảo Phú Quốc, một hòn đảo có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn tài nguyên rừng nhiệt đới với nhiều giống loài đa dạng thì nguồn thức ăn cho chó xoáy Thái Lan lưu lại trên Phú Quốc là dồi dào, và chó xoáy Thái Lan sẽ không có sự biến đổi về hình dáng nhỏ gọn hơn để phù hợp với việc săn mồi trên đảo Phú Quốc như hình dáng của chó Phú Quốc hiện nay Vì vậy, giả thuyết trên là không phù hợp Rất

có thể, với những nghiên cứu sâu hơn nữa, cho biết được chó Phú Quốc có thể có một

sự phát triển song song với chó xoáy Thái Lan, và muốn biết chính xác hơn thì phải phân tích DNA mới có thể xác định được mối quan hệ của các giống chó này [40], [41], [42]

1.2 Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan

Chó có xoáy lưng Thái Lan có kích thước trung bình, với lông ngắn và có một

dải lông mọc ngược trên lưng Chúng có dáng cao, chiều dài thân dài hơn so với chiều cao tới vai, cơ thể lực lưỡng, gọn gàng Về kích thước, con đực cao khoảng 56 - 60

cm, nặng 23 - 34 kg, con cái cao từ 51 - 56 cm Đây là giống chó rất khỏe mạnh, sống lâu khoảng 12-13 năm

Xương sọ phẳng ở khu vực giữa hai tai nhưng hơi cong nhẹ khi nhìn từ bên cạnh, trán có nếp nhăn, điểm tiếp giáp giữa sống mũi và trán rõ ràng, gập vừa phải, mũi có màu đen, sống mũi thẳng và dài, mõm có hình chữ V, hơi ngắn so với chiều dài sọ, hàm trên và hàm dưới đều rất khỏe, răng trắng và khỏe, răng cắn hình cắt kéo, tai to

rộng, vểnh lên, hình tam giác và hướng về phía trước, mắt có hình quả hạnh, có màu nâu tối Chúng có lưng thẳng, hông rộng, ngực sâu tới khuỷu chân trước, xương sườn

rất sít Cổ dài vừa phải, mạnh mẽ làm cho đầu ngẩng cao, đuôi hơi cong

Hình 1.3 Chó có xoáy lưng Thái Lan (http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%B3_l%C3%B4ng_xo%C3%A1y_Th%C3%A1i_

trong cũng như ra ngoài, do đó làm cho bước chạy dài và rất mạnh mẽ

Da mềm, mượt và căng Cổ không có diềm cổ Lông ngắn và mượt Có các màu:

đỏ, đen, xanh xám và vàng nhạt Bờm lưng ở trên sống lưng được tạo thành từ dải lông

mọc ngược so với phần lông còn lại Do đó nó nổi bật rất rõ trên lưng [44]

1.3 Các nghiên c ứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài dựa

trên trình tự hệ gen ty thể

Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỷ lệ từ 1 – 5% DNA của tế bào Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần

lớn động vật hữu nhũ vào khoảng 16 đến 17,5 kb Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết

về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ (α-proteobacterium), sống cộng sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn

Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn Với số lượng bản sao lớn như vậy nên có thể thu được DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một

số lượng ít tế bào [24]

DNA ty thể có những đặc điểm cơ bản sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 10 - 25 lần so với hệ gen nhân

- Số lượng bản sao lớn

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài

Hình 1.4 Cấu trúc ty thể (http://biology.tutorvista.com/animal-and-plant-cells/mitochondria.html)

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 10 – 25 lần so với các gen nhân do

cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị DNA trong

ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó, mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do

có cấu trúc dạng vòng, nên mtDNA được sử dụng như một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi [24]

loài

MtDNA của hầu hết các loài động vật được di truyền theo dòng mẹ thông qua tế bào chất của noãn bào, không tái tổ hợp và tiến hóa nhanh chóng Trong quá trình hình thành hợp tử, tinh trùng cung cấp cho trứng hệ gen nhân của nó, không cung cấp hoặc đóng góp rất ít tế bào chất, mtDNA vào hợp tử Kết quả là hầu như tất cả ty thể trong phôi đều có nguồn gốc từ trứng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi vào trứng Một số cơ chế được đưa ra nhằm giải thích hiện tượng thú vị này đó là: do sự phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin, do hiện tượng pha loãng, phân hủy mtDNA của tinh trùng, do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng Tuy nhiên, những cơ chế này vẫn chưa phải là những lời giải thích thỏa đáng và thật

sự thuyết phục

Ty thể là bào quan dưới mức độ tế bào của gần như tất cả các sinh vật nhân chuẩn, nó có nguồn gốc từ α-Proteobacteria đã cư trú bên trong tế bào của một dòng sinh vật nhân chuẩn đầu tiên nào đó [16] Ty thể còn chứa bộ gen riêng biệt đã bị thu nhỏ đi rất nhiều của chúng; chúng vẫn còn có hệ thống phiên mã, xử lý thông tin, và

dịch mã tách biệt với phần còn lại của tế bào chất Đối với động vật, các bộ gen ty thể hầu như luôn luôn ở dạng vòng Chúng thường chứa một tập hợp gồm 37 gen mã hóa

13 gen protein, 2 rRNAs và 22 tRNA Thông thường chúng có kích thước khoảng 16

kb, và vì thế có mật độ gen dày đặc và không có các intron ngoại trừ Canidarians có thêm 1 gen ngoại lệ, tương đồng với gen mutS vi khuẩn Ở một số loài tất cả các gen đều nằm trên một mạch, ở một số hệ gen ty thể khác chúng phân bố ở cả hai mạch Trong vài trường hợp, người ta nhận thấy sự phiên mã tạo đã ra một bản sao cho mỗi mạch DNA để sau đó chúng bị enzym cắt thành các gen RNA đặc biệt [10]

trên toàn bộ trình tự hệ gen ty thể

Kể từ năm 1998, khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể chó được giải mã và công bố

lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể chó đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi với hơn 250 trình tự được đăng ký trên GenBank (Hình 1.5) Trình tự hệ gen

ty thể chó đã được sử dụng thành công trong ngành khoa học pháp y, xác định nguồn

gốc của chó và nhiều ứng dụng khác Những dữ liệu này góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống chó Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể được tiến hành trên một số loài thuộc Họ Chó (Caniae)

Trình tự toàn bộ hệ gen ty thể chó đầu tiên đã được Kim và cộng sự xác định và công bố năm 1998 và được đăng ký trên GenBank với số đăng ký là NC-002008 Chiều dài của hệ gen ty thể chó là 16.728 bp Tuy nhiên, chiều dài này là không tuyệt đối do biến thể (heteroplasmy) gây ra bởi số lần lặp lại khác nhau của motif 5’-GTACACGT(A/G)C-3’ trong vùng điều khiển Tổ chức bộ gen, thành phần gen và sự

sử dụng codon giống với những bộ gen ty thể của động vật có vú khác Hai rRNA và

13 gen mã hóa protein từ mèo, chó và hải cẩu được so sánh để xác định sự khác biệt có thể có giữa các mtDNA trong động vật ăn thịt Những khác biệt trong sự kết hợp phân

tử trong hai gen rRNA cũng như trong các trình tự acid amine được suy đoán của 13 gen mã hóa protein của ty thể, cho thấy mối quan hệ giữa chó và hải cẩu gần hơn so với mối quan hệ giữa một trong hai con này với mèo Dựa trên sự khác biệt phân tử

của mtDNA, sự phân kỳ tiến hóa giữa mèo, chó và hải cẩu được xác định niên đại khoảng 50 ± 4 triệu năm trước Sự đa dạng về các đặc điểm như kích thước, cấu tạo và

bộ lông của chó nhà phản ánh không chỉ cường độ lựa chọn nhân tạo mà còn về cơ

bản là đa dạng di truyền trong cấu trúc quần thể

Hình 1.5 Các trình tự hệ gen ty thể chó được đăng ký trên NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Chó nhà có lẽ là động vật được thuần hóa đầu tiên, và là động vật duy nhất lan truyền sang tất cả các châu lục trong thời cổ đại Chó là một trong những loài động vật

có kiểu hình đa dạng nhất, một kết quả của sự lựa chọn nhân tạo trong suốt chiều dài

lịch sử của nó Những nghiên cứu về nguồn gốc di truyền và sự lan truyền ban đầu của chó nhà không chỉ rất quan trọng để thu thập thông tin về cơ chế sinh học và văn hóa sau thuần hóa mà còn để điều tra lịch sử ban đầu của nhân loại [22]

Năm 1999, Vila và cộng sự nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài, sự tiến hóa

và đa dạng di truyền của chó nhà Ở nghiên cứu này, dữ liệu di truyền phân tử trong quá khứ có liên quan được xem xét để tìm hiểu nguồn gốc và các mối quan hệ phát sinh loài của con chó Dữ liệu lai DNA – DNA cho thấy rằng họ chó Candidae tách ra

khoảng 50 triệu năm trước từ các loài động vật ăn thịt khác Ngược lại, các Canid hiện

tại có liên quan chặt chẽ và phân tách từ một tổ tiên chung khoảng 10 triệu năm trước Các bằng chứng xác minh mối quan hệ thân thiết của con chó với con sói xám là rất nhiều Tuy vậy, con chó có sự khác nhau đáng kể trong gen ty thể và gen nhân của chúng Phân tích DNA ty thể cho thấy nguồn gốc của chó cổ xưa hơn so với thời điểm được xác định bởi các hóa thạch Ngoài ra, chó có nguồn gốc từ con sói hoặc giao phối

với những con sói trong lịch sử của chúng tại những thời điểm khác nhau và tại những

nơi khác nhau Tiến hành phân tích sự đa dạng mtDNA trong quần thể chó Xoloitzcuintli (một loài chó không lông có nguồn gốc Mêxicô) để kiểm tra khả năng thuần hóa độc lập của giống chó này Giống chó hiếm này được cho là đã được giữ cách ly trong hàng ngàn năm và có thể là một trong những giống chó cổ xưa nhất ở Bắc Mỹ Kết quả thu được không ủng hộ sự một thuần hóa tại Châu Mỹ của chó Xoloitzcuintli, cũng không ủng hộ một sự kết hợp giữa chó Xoloitzcuintli với những

giống chó không có lông khác Mặc dù có kiểu hình giống nhau, quần thể chó Xoloitzcuintli có một mức độ thay đổi trình tự mtDNA cao đáng ngạc nhiên Các

giống chó khác cũng rất đa dạng về mặt di truyền, cho thấy các giống chó thường được hình thành với một số lượng lớn các con chó từ các quần thể giao phối xa [33]

Nguồn gốc của chó nhà từ chó sói đã được xác định, nhưng số lượng các sự kiện hình thành, cũng như ở đâu và khi nào những việc này xảy ra thì không được biết đến

Để giải quyết những câu hỏi này, năm 2002, Savolainen và cộng sự đã kiểm tra những biến đổi trình tự DNA ty thể (mtDNA) trong 654 con chó nhà đại diện cho tất cả các

quần thể chó lớn trên toàn thế giới Các dữ liệu cho thấy nguồn gốc chó nhà bắt nguồn

từ vài con sói cái, hơn 95% của tất cả các trình tự mtDNA thuộc về ba nhóm phát sinh loài phổ biến điển hình ở những tần số tương tự nhau, cho thấy tất cả các quần thể chó đều có một nguồn gốc chung Tính toán cho thấy, sự đa dạng di truyền của quần thể chó ở Đông Á khá lớn so với các vùng khác và phân tích phát sinh loài cho thấy giả thuyết là chó nhà có nguồn gốc từ Đông Á, cách đây 15.000 năm [29]

Năm 2005, Asch và cộng sự thực hiện nghiên cứu phân tích sự đa dạng mtDNA

giữa 4 giống chó bản địa Bồ Đào Nha gồm Chó Castro Laboreiro, Chó núi Serra da

Estrela, chó chăn cừu Bồ Đào Nha và chó chăn gia súc Azores Với mong muốn thu được một bức tranh chi tiết hơn về hình ảnh của sự đa dạng mtDNA của chó từ khu

vực lấy mẫu rộng nhưng với một số ít cá thể trong một khu vực hoặc giống, việc lấy

mẫu như vậy sẽ tiết lộ mối quan hệ địa lý yếu và mức độ chia sẻ kiểu gen đơn bội cao giữa các giống rất xa nên việc lấy mẫu bốn giống chó bản địa Bồ Đào Nha được thực

hiện rộng rãi (n=143) và phân tích lại một các tương đối các dữ liệu đã được công bố

được tìm thấy trong các giống, trong đó năm kiểu gen đơn bội mới được báo cáo Chó Castro Laboreiro mang 95% kiểu gen đơn bội mới loại A, trong khi tất cả các giống chó khác có một nguồn chung đa dạng của những dòng đang tồn tại, Chó núi Serra de Estrela, giống chó không đồng nhất nhất trong bốn giống chó Bồ Đào Nha, chia sẻ kiểu gen đơn bội với các giống chó ở đại lục khác, trong khi chó chăn gia súc Azores không chia sẻ kiểu gen đơn bội với các giống Bồ Đào Nha khác Xem xét các kiểu gen đơn bội của mtDNA trong những con chó trên toàn thế giới cho thấy: (a) các giống có

xu hướng mang những kiểu gen đơn bội thuộc các haplogroup khác nhau, (b) halogroup A hiện diện trong tất cả các giống và thậm chí các haplogroup không phổ

biến đang phân tán cao giữa các giống và các khu vực thuộc lục địa, (c) kiểu gen đơn bội chia sẻ giữa các giống của cùng một khu vực thấp hơn giữa các giống của các vùng khác nhau và (d) khoảng cách di truyền giữa các giống không tương quan với vị trí địa

lý Kết luận được đưa ra là sự chia sẻ kiểu gen đơn bội mtDNA xảy ra giữa chó núi Serre da Estrela (với giả định là nguồn gốc ở trung tâm của Bồ Đào Nha) và hai giống

ở phía bắc và phía nam của quốc gia với chó Castro Laboreiro (mà cách hoạt động, ở cấp độ mtDNA, như một mẫu phụ của chó núi Serra de Estrela và chó chăn cừu Bồ Đào Nha ở phía Nam Ngược lại, chó chăn gia súc Azores không chia sẻ bất kỳ kiểu gen đơn bội nào với các giống Bồ Đào Nha khác, nhưng lại chia sẻ với những con chó lấy mẫu ở Bắc Âu Điều này cho thấy những con chó chăn gia súc Azores được kế

thừa theo dòng mẹ từ những con chó Bắc Âu hơn là từ những con chó của lục địa Bồ Đào Nha Một sự đánh giá các kiểu gen đơn bội mtDNA được công bố đã xác định mười ba giống chó này và bốn giống Bồ Đào Nha, đã chứng minh kiểu gen đơn bội chia sẻ rộng rãi, với sự đa dạng lớn nhất trong những con chó Châu Á, theo vai trò trung tâm của Châu Á trong việc thuần hóa chó [31]

Hiện nay, giống chó Ngao Tây Tạng là giống chó lâu đời nhất và dữ tợn nhất trên

thế giới Tuy nhiên, nguồn gốc của giống chó Ngao Tây Tạng và mối quan hệ phát sinh loài của nó với những giống chó kích thước lớn khác như Saint Bernard là không

rõ ràng Năm 2008, Li và cộng sự tiến hành nghiên cứu phân tích nguồn gốc và sự phát sinh loài của giống chó Ngao Tây Tạng dựa trên trình tự DNA ty thể Trong

nghiên cứu này, các tác giả phân tích vùng hệ gen ty thể dài 2.525 bp, chứa toàn bộ trình tự của Cytochrome b, tRNA-Thr, tRNA-Pro và vùng CR (Control Region) của

giống chó Ngao Tây Tạng đã thu được Sử dụng con sói xám và chó sói bắc Mỹ như

những nhóm tham khảo Kết quả cho thấy chó Ngao Tây Tạng, những giống chó nhà,

và con sói xám được nhóm lại thành một nhóm và chó sói Bắc Mỹ đã được nhóm trong một nhóm riêng Điều này cho thấy giống chó Ngao Tây Tạng và những con chó nhà khác có nguồn gốc từ con sói xám, và giống chó Ngao Tây Tạng nằm trong nhóm

Carnivora, Canidae, Canis, Canis lupus và là Canis lupus familiaris [17] Năm 2010,

nhóm tác giả tiếp tục tiến hành nghiên cứu sâu hơn với việc giải trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của mtDNA chó Ngao Tây Tạng là 16.710

bp, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, 13 gen mã hóa protein và một vùng không mã hóa (vùng D-loop), tương tự như bộ gen ty thể động vật có vú khác Các đặc tính của các gen mã hóa protein, khu vực không mã hóa, các gen tRNA và rRNA trong

Canidae được phân tích chi tiết Sử dụng các phương pháp neighbor – joining và maximum parsimony tree dựa trên việc sử dụng 12 gen mã hóa protein của ty thể một lần nữa chứng minh rằng chó Ngao Tây Tạng có nguồn gốc từ sói xám Ngoài ra còn xác định được chó Ngao Tây tạng thuộc nhóm A (là một trong bốn nhóm từ A đến D

của chó, ngụ ý có bốn nguồn gốc từ mẹ) và dường như có liên quan chặt chẽ với chó Saint Bernard và chó chăn cừu Anh cổ [18]

Nhằm xác định nguồn gốc của các giống chó phía nam sông Dương Tử, năm

2009, Pang và cộng sự tiến hành phân tích toàn bộ mtDNA của 169 con chó để xây dựng cây phát sinh loài với độ tin cậy tối đa và phân tích vùng điều khiển (control region – CR) của 1.543 con chó trên toàn Cựu Thế giới (Châu Á, Châu Âu, Châu Phi)

để xác lập một bức tranh toàn diện về sự đa dạng địa lý Các phân tích cho thấy các con chó chia sẻ một nguồn gen đồng nhất chung chứa mười haplogroup lớn, nhưng sự

đa dạng di truyền giảm dần từ Á sang Âu: tất cả mười haplogroup được tìm thấy ở Đông Nam Á về phía nam sông Dương Tử, giảm còn bảy haplogroup ở miền Trung Trung Quốc và năm ở Bắc Trung Quốc và Tây Nam Á và chỉ còn bốn haplogroup ở Châu Âu Khoảng cách trung bình các nhánh kiểu gen đơn bội chỉ ra rằng chó nhà có

nguồn gốc ở miền Nam Trung Quốc từ ít hơn 16.300 năm trước, từ vài trăm con sói Địa điểm và thời gian trùng với nguồn gốc của nông nghiệp lúa nước, gợi ý rằng con chó nhà có thể được bắt nguồn từ việc thuần hóa chó sói để phục vụ cho việc săn bắt hái lượm của con người thời xưa [23]

Năm 2013, Đinh Trần Mỹ Đức đã thực hiện đề tài tốt nghiệp “Bước đầu nghiên

cứu tính đa dạng di truyền của Chó Phú Quốc ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh dựa trên trình tự 16S genome ty thể” trên chín mẫu chó Phú quốc và 10 mẫu chó không

phải Phú Quốc nhằm khảo sát tính đa dạng di truyền của chó Phú Quốc thuộc khu vực thành phố Hồ Chí Minh để thiết lập cơ sở cho việc xây dựng hệ thống mã vạch DNA

có khả năng nhận biết nhanh các cá thể của loài dựa trên các marker phân tử đặc trưng cho chó Phú quốc Kết quả phân tích cho thấy vùng 16S chỉ đủ cơ sở để xác định các

mẫu đang nghiên cứu thuộc loài nào mà không đủ cơ sở để phân định các cấp độ dưới loài, do vậy không đủ khả năng xây dựng hệ thống mã vạch DNA mang những trình tự bảo tồn riêng của chó Phú Quốc [4]

Với mong muốn góp phần vào việc xác định lại nguồn gốc chó có xoáy lưng Phú Quốc, năm 2013, Trương Nguyễn Thị Như Mai và cộng sự đã tiến hành đề tài “Định

dạng haplotype và truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc bằng trình tự vùng CR và bộ gen

ty thể” Có thể nói đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về mặt di truyền của chó Phú

Quốc tại Việt Nam và cũng là đề tài đầu tiên giải thành công hệ gen ty thể chó Phú

Quốc Trong nghiên cứu này tác giả đã giải thành công hệ gen ty thể các cá thể chó Phú Quốc với chiều dài 16.760 bp ở chó PQ1 và 16.731 ở chó PQ2, riêng chó PQ8 đã giải được 13.149 bp Phân tích các SNP của vùng kiểm soát cho ra nhiều kết quả nổi

bật , các mẫu chó Phú Quốc trong nghiên cứu mang các kiểu đơn bội A (A19, A65), B (B1) và E (E1, E4) cho thấy chó Phú Quốc có độ đa dạng di truyền cao Trong đó, kiểu đơn bội E là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều tiên Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty

thể chó sói xám [5]

Chương 2

tế công nhận

Thu nhận 2 mL mẫu máu, cho vào ống EDTA vacutainer để bảo quản và trữ mẫu

ở nhiệt độ - 20 oC cho đến khi sử dụng

2.1.1.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất và thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong việc: lấy mẫu, tách chiết DNA tổng số, kĩ thuật PCR, điện di…đều đạt chuẩn trong sinh học phân tử thể

hiện cụ thể ở bảng 2.1 - 2.4

B ảng 2.1 Hóa ch ất tách chiết DNA

Tên Mã hàng hóa Hãng sản xuất

Đệm citrate tiêu chuẩn

1X (SSC 1X) pH 7.0

+ NaCl 0.15M

+ Natri citrate 15mM

1107NBUC21EZBI GB/T 16493-1996

Bio Basic Inc – Canada Trung Quốc

EDTA 0.5M, pH 8.0 1101SHLS1206B110L Bio Basic Inc – Canada NaOAc(CH3COONa) 0.2M 1012NBTI27EAC Bio Basic Inc – CanadaNaOAc (CH3COONa) 2M 1012NBTI27EAC Bio Basic Inc – Canada

Proteinase K (20mg/mL) 1103PE3271C508 Bio Basic Inc – Canada

Đệm TE 10X

+ Tris – HCl 1M, pH 7.5

+ EDTA 0.5M, pH 8.0

1009SHLS0708B1210L 1101SHLS1206B110L

Bio Basix Inc – Canada Bio Basix Inc – Canada

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong kĩ thuật PCR

Tên Mã hàng hóa Hãng sản xuất

MasterAmp™ Extra-Long DNA Polymerase

Epicentre

MasterAmp™ Extra-Long PCR 2X Premixes

Epicentre

Nước cất 2 lần

Bảng 2.3 Hóa chất điện di

Tên Mã hàng hóa Nhà s ản xuất

Đệm TBE 0,5X (Tris – Borate – EDTA) 111031BB024 Bio Basic Inc- Canada Đệm nạp mẫu DNA: loading buffer 6X APOD007102 GenOn – Đức

Máy ủ ổn nhiệt WiseTherm Witeg Labortechnik

Máy PCR Esco Swift Minipro

Thermo Cycler

Esco Micro Pte Ltd Mỹ

chỉnh sửa và lưu các tập tin thuộc nhiều dạng khác nhau, đặc biệt là các trình tự được

giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đồ huỳnh quang

các tính năng hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp xếp gióng cột các trình tự

Tree View: phiên bản 1.6.6 (Roderic, 2001), phần mềm miễn phí dùng để xem và hiệu chỉnh cây tiến hóa

PAUP *: phiên bản 4.0b10 (Swofford, 2003), phần mềm có trả phí, dùng để xây

dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp tiết giảm tối đa (Maximum MP), khả năng tối đa (Maximum likehood-ML), kết nối-kế cận (Neighbor joining-NJ)

dựng cây phát dinh loài theo các phương pháp tiết giảm tối đa, khả năng tối đa, kết nối

kế cận

để xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp khả năng tối đa

tìm mô hình tiến hóa tối ưu

phí, dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp xác suất hậu nghiệm Bayes

phí, dùng để xử lý hình ảnh đồ họa cho cây phát sinh loài, làm nổi bật các nhóm quan tâm

Tất cả các thí nghiệm của đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh

học phân tử của Phòng Genomics & Bioinformatic của trường Đại học Nguyễn Tất Thành, và Phòng Công nghệ Sinh học của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, từ ngày 1/1/2014 đến ngày 15/9/2014

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu máu được thu nhận bởi bác sỹ thú y, trước khi lấy mẫu cần chuẩn bị các

dụng cụ sau: kéo, kim tiêm, cồn 70%, bông gòn, viết, ống EDTA vacutainer, thùng

xốp, đá khô Quá trình thu nhận và bảo quản mẫu được thực hiện như sau:

- Sát trùng vùng lấy máu bằng bông có thấm cồn 70%

- Dùng kim tiêm vô trùng rút 2 mL máu từ tĩnh mạch chân trước của chó, chuyển nhanh vào ống EDTA vacutainer, lắc đều để máu hòa tan hoàn toàn với EDTA để tránh tình trạng máu bị đông

- Ghi thông tin của mẫu lên thành ống EDTA vacutainer và chụp ảnh của các con chó vừa lấy mẫu

- Cho mẫu vào thùng xốp giữ nhiệt có túi đá khô để giữ lạnh mẫu trong quá trình vận chuyển, cần nhanh chóng chuyển mẫu vào tủ lạnh – 20 oC để mẫu được bảo quản

tốt nhất

2.2.1.2 Phương pháp tách DNA tổng số

Nguyên tắc chung: Màng tế bào được phá vỡ bằng chất tẩy mạnh, DNA trong và

ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein Sau đó protein được tinh sạch bằng proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol Cuối cùng DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm

Yêu cầu: DNA tách chiết cần phải đảm bảo về độ tinh sạch và độ nguyên vẹn về

cấu trúc để thực hiện cho các thí nghiệm về sinh học phân tử

DNA tổng số được tách chiết từ những mẫu máu đã chống đông bằng EDTA theo quy trình của FBI (Roe, 1995) Mẫu máu thường được thu là 1 – 2 mL máu toàn

bộ được lưu trữ trong ống EDTA vacutainer đông lạnh ở -20 oC Quy trình tách chiết DNA tổng số được thực hiện như sau:

Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và mỗi 1V mẫu thêm vào 0,8V dung dịch

đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút

Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng

Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi

Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian

ngắn Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005 V proteinase K (20 mg/mL H2O), vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 o

C trong 1 giờ

Bước 5: Thêm 0,12V dung dịch hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol

(25:24:1) và vortex trong 30 giây Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút

Bước 6: Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một cách cẩn thận

Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều và ủ ở -20 o

C trong 15 phút

Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55 o

C trong 10 phút

Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch

EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút

Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm

12000 rpm trong 1 phút

Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa

Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer

10:1 Ủ qua đêm ở 55 o

C, vortexing định kỳ để làm tan toàn bộ DNA bộ gen Trữ mẫu

ở -20 o

C

Quy trình tách chiết DNA tổng số hiệu chỉnh được thực hiện như sau:

Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và thêm 0,002V β-mercaptoethanol vào mỗi

1V mẫu Thêm vào 0,8V dung dịch đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút

Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng

Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi

Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian

ngắn Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005V proteinase K (20 mg/mL H2O), vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 oC trong 1 giờ

Bước 5: Thêm hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) với thể

tích tương đương với thể tích dung dịch có trong ống và vortex trong 30 giây Ly tâm

12000 rpm trong 20 phút Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một cách cẩn thận (lặp lại 2-3 lần)

Bước 6: Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều

Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch

EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút

Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm

12000 rpm trong 1 phút

Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa ở nhiệt độ phòng

Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer

10:1, trộn đều Trữ mẫu ở -20 o

C

2.2.1.3 Kiểm tra dịch chiết bằng quang phổ kế

Pha loãng dịch chiết DNA trong nước cất để đạt độ pha loãng 200 lần Tiến hành

đo quang ở 3 bước sóng: 230nm (A230), 260nm (A260), và 280nm (A280)

Cách tính n ồng độ DNA khi đo quang:

A260=1 tương ứng với 50 ng/µL

Nồng độ DNA (ng/µL) = Số đơn vị A260 x 50 x độ pha loãng

Vậy: Nồng độ DNA (ng/µL) = A260 x 10000

DNA tinh sạch được bảo quản ở -20 oC đến khi dùng

Đổ gel: cân 0,5g agarose vào 50 mL đệm TBE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắc đều và làm nguội đến 50 oC, thêm Ethidium bromide đạt nồng độ cuối là 1 μg/mL, trộn đều và đổ vào khuôn, gắn lược vào, để yên trong khoảng 30 phút cho thạch đông Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TBE sao cho dung dịch đệm ngập trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản thạch đặt về phía cực âm

Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải loading dye 10X, nạp mẫu vào các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn Chạy ở dòng điện 120V, 20

- 60 phút Quan sát các băng DNA trên hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm

2.2.3 Khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.3.1 Ph ản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng kiểm soát (D-loop)

Vùng kiểm soát có kích thước 1.270 bp, bắt đầu từ cặp base ở vị trí 15.458 và kéo dài đến cặp base ở vị trí 16.727, được khuếch đại bằng cặp mồi 15412F và 16625R Vị trí bắt cặp và các thông số của cặp mồi 15412F và 16625R được thể hiện

rõ qua hình 2.1 và bảng 2.5

Hình 2.1 V ị trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R trên vùng kiểm soát (D-loop)

Bảng 2.5 Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát loop)

(D-Hút các thành phần ExPrime Taq PreMix (2X): ExPrime Taq DNA polymerase 0.1 U/µL, 2X reaction buffer, 4mM MgCl2, enzyme stabilizer, sediment, loading dye,

pH 9.0, 0,5 mM mỗi dATP, dCTP, dGTP, dTTP, các cặp mồi, DNA khuôn và nước

cất hai lần cho vào các eppendorf 0,2 mL, nhẹ nhàng hút nhả để trộn đều các thành

phần phản ứng , sau đó ly tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf vào các khuôn ủ nhiệt của máy PCR

Nồng độ ExPrime Taq PreMix (2X) và mồi được thực hiện theo quy trình của GENT BIO Trong đó chúng tôi tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn bằng cách điều chỉnh thể tích cho vào phản ứng theo bảng 2.6 Sau đó, chúng tôi tiến hành chạy với chu trình nhiệt của từng giai đoạn theo bảng 2.7 để bắt đầu phản ứng khuếch đại trình tự vùng D-loop (Barbara Elizabeth Goodson, 2007)

Tên Trình tự mồi số Nu Tổng Tm

( o C)

Chiều dài đoạn khuếch đại

Nhà cung cấp